CN104871973A - 采用两种诱导子促进人参不定根中皂苷积累的方法 - Google Patents

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高文远
王娟
李金鑫
李静
李建丽
刘书杰
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Abstract

本发明公开了采用两种诱导子促进人参不定根中皂苷积累的方法，包括以下步骤:挑选生长良好的人参不定根接种到改造的3/4MS液体培养基中，培养28～30天，加入作为诱导子的水解乳蛋白水溶液母液和茉莉酸甲酯乙醇溶液母液，使水解乳蛋白终浓度为98～100mg/L，使茉莉酸甲酯终浓度为8-10mg/L，继续培养2-7天，收获，干燥。实验证明水解乳蛋白和茉莉酸甲酯两种诱导子能发挥协同作用，对人参不定根次级代谢产生影响，皂苷含量高，为人参的大规模生产提供依据，实现人参皂苷的工业化生产，满足人们日益增长的需求。

Description

采用两种诱导子促进人参不定根中皂苷积累的方法
技术领域
本发明属于作物生物技术领域，特别是涉及一种采用两种诱导子促进人参不定根中皂苷积累的方法。
背景技术
人参为五加科人参属多年生双子叶植物，具有增强免疫力、预防及治疗心血管疾病、保肝护肝、调节血糖、抗肿瘤、延缓衰老、增强学习机记忆能力等作用。常用于药品、保健药品与化妆品行业。
人参皂苷作为人参中的一类主要活性成分，其产量低，目前尚未人工合成。目前，人参主要依赖大田培养，然而栽培的人参栽培技术复杂，生长周期长，“老参地”加之生态环境破坏等问题一直难以解决，使人参的市场呈现供不应求的状态，为了解决这个问题，满足人们的需要，人们尝试通过各种途径来提高人参次级代谢产物的含量，如组织培养及反应器扩大培养，补料培养、两步培养、前体饲喂、毛状根的诱导、诱导子的添加等。
目前，采用水解乳蛋白和茉莉酸甲酯这两种诱导子的协同作用在人参不定根培养中尚未报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种采用两种诱导子促进人参不定根中皂苷积累的方法。
本发明的技术方案概述如下：
采用两种诱导子促进人参不定根中皂苷积累的方法，包括以下步骤:
挑选生长良好的人参不定根接种到改造的3/4MS液体培养基中，培养28～30天，加入作为诱导子的水解乳蛋白水溶液母液和茉莉酸甲酯乙醇溶液母液，使水解乳蛋白终浓度为98～100mg/L，使茉莉酸甲酯终浓度为8-10mg/L，继续培养2-7天，收获，干燥：所述改造的3/4MS液体培养基用下述方法制成：在3/4MS液体培养基中加入蔗糖使终浓度为30～40g/L，加入吲哚丁酸使终浓度为3～5mg/L，加入激动素使终浓度为0.05～0.1mg/L，调节pH为5.8～6.0，灭菌。
优选地，水解乳蛋白水溶液母液用下述方法制成：将水解乳蛋白用蒸馏水溶解配制成浓度为1mg/ml的溶液，经0.22μm滤膜过滤灭菌。
优选地，茉莉酸甲酯乙醇溶液母液用下述方法制成：将茉莉酸甲酯用无水乙醇配制成浓度为1mg/ml的溶液，经0.22μm滤膜过滤灭菌。
培养的条件优选为：无菌、23±2℃、无菌空气通气量为0.3～0.5vvm。
本发明的优点：
实验证明水解乳蛋白和茉莉酸甲酯两种诱导子能发挥协同作用，配合改造的3/4MS液体培养基的作用，对人参不定根次级代谢产生影响，皂苷含量高，为人参的大规模生产提供依据，实现人参皂苷的工业化生产，满足人们日益增长的需求。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
表1 MS培养基配方表
(1L3/4MS液体培养基的配制:取上述MS培养基配方中的3/4质量份加水至1L)
实施例1
水解乳蛋白水溶液母液的制备：将水解乳蛋白用蒸馏水溶解配制成浓度为1mg/ml的溶液，经0.22μm滤膜过滤灭菌。
茉莉酸甲酯乙醇溶液母液的制备：将茉莉酸甲酯用无水乙醇配制成浓度为1mg/ml的溶液，经0.22μm滤膜过滤灭菌。
实施例2
采用两种诱导子促进人参不定根中皂苷积累的方法，包括以下步骤:
挑选生长良好的人参不定根接种到2.5L改造的3/4MS液体培养基中，在无菌、23±2℃、调节通气量为0.3vvm，自然光照条件下培养29天，加入作为诱导子的实施例1制备的水解乳蛋白水溶液母液和茉莉酸甲酯乙醇溶液母液，使水解乳蛋白终浓度为98mg/L，使茉莉酸甲酯终浓度为8mg/L，再以无菌、23±2℃，调节通气量为0.3vvm，自然光照条件下培养2天，收获，干燥。
改造的3/4MS液体培养基的制备：在3/4MS液体培养基中加入蔗糖使终浓度为35g/L，加入吲哚丁酸使终浓度为3mg/L，加入激动素使终浓度为0.05mg/L，调节pH为6，在121℃，0.1MP压力下灭菌25分钟，冷却至常温，备用。
与实施例2相同的步骤，仅将水解乳蛋白和茉莉酸甲酯的终浓度分别调节为：0mg/ml，0mg/ml(第一对照组)；98mg/ml，0mg/ml(实验1组)；0mg/ml，8mg/ml(实验2组)。
对上面的各个产物进行总皂苷含量测定与分析。
人参不定根培养中皂苷含量的HPLC定量分析:
实验仪器及试药:
安捷伦1200高效液相色谱仪，包括在线脱气机和四元泵。人参皂苷Rg1、Rg2、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re对照品购于中国药品生物制品检定所，色谱纯甲醇，色谱纯乙腈，超纯水。
方法:
1)色谱条件
色谱柱为Kromasil C18(4.6mm×250mm,5μm)；流动相(A)为乙腈，流动相(B)为超纯水；梯度洗脱程序：0→35min，A:20％；35→40min，A：20％→30％；40→50min,A：30％→32％；50→57min，A:32％→33％；57→65min，A：33％→45％。流速1.0mL/min；进样体积为20μL；柱温35℃；检测波长203nm。
2)供试品溶液的制备
精密称取0.2g干燥的不定根样品置于100mL具塞三角瓶中，加入20mL甲醇，60℃水浴1h，趁热抽滤，重复抽提一次，合并滤液。挥干滤液，再加入10mL蒸馏水溶解，用20mL正丁醇萃取两次，收集正丁醇层，再经旋转蒸发处理后，甲醇定容至1mL。用0.22μm微孔滤膜过滤，得样品供试品。
3)皂苷对照品溶液的制备
精密称取经减压干燥24小时以上的人参皂苷Rg1、Rg2、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re标品各1mg，置于5mL容量瓶中，少量甲醇超声溶解，再用甲醇定容至刻度，配成0.2mg/L的人参皂苷混合标准品储备液，密封置冰箱4℃保存。检测结果见表2。
表2
实施例3
采用两种诱导子促进人参不定根中皂苷积累的方法，包括以下步骤:
挑选生长良好的人参不定根接种到2.5L改造的3/4MS液体培养基中，在无菌、23±2℃、调节通气量为0.4vvm，自然光照条件下培养30天，加入作为诱导子的实施例1制备的水解乳蛋白水溶液母液和茉莉酸甲酯乙醇溶液母液，使水解乳蛋白终浓度为99mg/L，使茉莉酸甲酯终浓度为9mg/L，再以无菌、23±2℃，调节通气量为0.4vvm，自然光照条件下培养5天，收获，干燥。
改造的3/4MS液体培养基的制备：在3/4MS液体培养基中加入蔗糖使终浓度为30g/L，加入吲哚丁酸使终浓度为3mg/L，加入激动素使终浓度为0.1mg/L，调节pH为5.9，在121℃，0.1MP压力下灭菌25分钟，冷却至常温，备用。
与实施例3相同的步骤，仅将水解乳蛋白和茉莉酸甲酯的终浓度分别调节为：0mg/ml，0mg/ml(第二对照组)；99mg/ml，0mg/ml(实验3组)；0mg/ml，9mg/ml(实验4组)。
对上面的各个产物进行总皂苷含量测定与分析，检测结果见表3。
表3
实施例4
采用两种诱导子促进人参不定根中皂苷积累的方法，包括以下步骤:
挑选生长良好的人参不定根接种到2.5L改造的3/4MS液体培养基中，在无菌、23±2℃、调节通气量为0.5vvm，自然光照条件下培养28天，加入作为诱导子的实施例1制备的水解乳蛋白水溶液母液和茉莉酸甲酯乙醇溶液母液，使水解乳蛋白终浓度为100mg/L,茉莉酸甲酯的终浓度为10mg/L，再以无菌、23±2℃，调节通气量为0.5vvm，自然光照条件下培养7天,收获，干燥。
改造的3/4MS液体培养基的制备：在3/4MS液体培养基中加入蔗糖使终浓度为40g/L，加入吲哚丁酸使终浓度为5mg/L，加入激动素使终浓度为0.1mg/L，调节pH为5.8，在121℃，0.1MP压力下灭菌25分钟，冷却至常温，备用。
与实施例4相同的步骤，仅将水解乳蛋白和茉莉酸甲酯的终浓度分别调节为：0mg/ml，0mg/ml(第三对照组)；100mg/ml，0mg/ml(实验5组)；0mg/ml，10mg/ml(实验6组)。
对上面的各个产物进行总皂苷含量测定与分析，检测结果见表4。
表4
实验表明，本发明的方法培养的人参不定根，培养周期要比原根短，并且其活性次生代谢产物的产率高且比较稳定，培养物均一。

Claims (4)

1.采用两种诱导子促进人参不定根中皂苷积累的方法，其特征在于包括以下步骤:挑选生长良好的人参不定根接种到改造的3/4MS液体培养基中，培养28～30天，加入作为诱导子的水解乳蛋白水溶液母液和茉莉酸甲酯乙醇溶液母液，使水解乳蛋白终浓度为98～100mg/L，使茉莉酸甲酯终浓度为8-10mg/L，继续培养2-7天，收获，干燥：所述改造的3/4MS液体培养基用下述方法制成：在3/4MS液体培养基中加入蔗糖使终浓度为30～40g/L，加入吲哚丁酸使终浓度为3～5mg/L，加入激动素使终浓度为0.05～0.1mg/L，调节pH为5.8～6.0，灭菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述水解乳蛋白水溶液母液用下述方法制成：将水解乳蛋白用蒸馏水溶解配制成浓度为1mg/ml的溶液，经0.22μm滤膜过滤灭菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述茉莉酸甲酯乙醇溶液母液用下述方法制成：将茉莉酸甲酯用无水乙醇配制成浓度为1mg/ml的溶液，经0.22μm滤膜过滤灭菌。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述培养的条件为：无菌、23±2℃、无菌空气通气量为0.3～0.5vvm。
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