CN108841891B - 芦丁衍生物降低红曲菌液态和固态发酵产桔霉素能力的方法 - Google Patents

芦丁衍生物降低红曲菌液态和固态发酵产桔霉素能力的方法 Download PDF

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Abstract

一种芦丁衍生物降低红曲菌液态和固态发酵产桔霉素能力的方法，向红曲菌液态发酵培养基和红曲菌固态发酵培养基中添加芦丁衍生物，灭菌和接种后于摇床振荡或静置培养。本发明操作简单，安全可靠，工艺稳定，降低桔霉素效果优良，可用于工业生产。

Description

芦丁衍生物降低红曲菌液态和固态发酵产桔霉素能力的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域。涉及微生物的液态发酵。
背景技术
红曲，又称作“丹曲”，是以大米为原料，红曲菌发酵而获得的发酵制品。红曲作为我国传统的特色发酵食品，已有上千年的应用历史，早在明代时期，李时珍在《本草纲目》中就记载了红曲具有“消食活血，健脾燥胃”等功效。红曲菌在生长过程中产生多种次级代谢产物，包括红曲色素、莫纳可林K、γ-氨基丁酸、桔霉素等。红曲色素作为红曲菌代谢产生的一种天然食用色素，相比于其它化学合成色素有许多独特的优点，其不但安全性高，着色效果好，容易合成，且生物活性更高，营养更丰富，已广泛应用于食品和药品及化妆品行业。1979年，远藤章教授首次从红色红曲菌中分离出具有抑制HMG-CoA还原酶活性的物质，并命名为莫纳可林K，其作为降脂药用于临床。1987年，美国FDA正式批准美降脂药洛伐他丁（Monacolin K）用于临床。至今，国外已经研制开发出一系列的他汀类降脂药物，其主要成分为Monacolin K，我国也通过红曲开发和研制出许多用于治疗高血脂症的药物及保健品，如：血脂康等。
然而，红曲菌在发酵过程中也可能产生一种真菌毒素-桔霉素，其毒性较大，主要作用的靶器官为肾脏，不仅具有肾毒性和肝毒性，还具有潜在的致癌风险。由于桔霉素的存在，国内外消费者对红曲产品的安全性产生了质疑，使得其广泛应用受到了限制。为了解决这个问题，国内外学者已经从筛选低产或不产桔霉素的优良菌株、菌种诱变、对菌种基因改造、优化发酵工艺、化学法除桔霉素等方面进行了大量的研究，并取得了巨大的成就。其中优化发酵工艺降低红曲菌产桔霉素主要是通过选择不同的碳源、氮源、营养因子、pH及控制发酵参数和培养条件，优化发酵工艺来控制桔霉素的生成。
芦丁，又称芸香苷，是从植物中提取的一种黄酮类化合物，在植物界分布广泛，通常存在于植物的种子、根、花、叶和果实中，一些植物，如苦荞麦、槐米、芦荟、山楂、银杏、大枣等都有芦丁成分存在，其中槐木中含量较高。芦丁具有广泛的生理及药理活性，包括清除自由基、抗炎、抗肿瘤、抗过敏、抗衰老、降低血清胆固醇、抗心律失常、抑制结肠癌等。其在食品、医药、化妆品等领域都具有很大的应用价值。曲克芦丁系芦丁经羟乙基化制成的半合成黄酮化合物，主要成分3′，4′，7-三羟乙基芦丁，分子式为：C33H42O19，分子量为：742.68，具有抑制红细胞和血小板凝聚作用，防止血栓形成，同时能增加血中氧的含量，改善微循环，促进新血管生成以增进侧支循环循环。α-葡糖基芦丁为芦丁的另外一种衍生物，具有较好的抗氧化活性等，其与曲克芦丁一样具有较好的水溶解性。目前，尚未见有关芦丁衍生物用于红曲菌发酵降低桔霉素产量的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种芦丁衍生物降低红曲菌产桔霉素的方法，通过向发酵培养基中添加芦丁衍生物达到降低红曲菌产桔霉素能力的方法。
为达到以上目的，本发明采用如下技术方案。
以橙色红曲菌AS3.4384为发酵菌株，通过红曲菌孢子的制备，红曲种子液的制备，添加芦丁衍生物的液态和固态发酵培养基的制备，红曲菌经过液态和固态发酵后，得到桔霉素含量明显降低的液态和固态发酵产物。
本发明所述的芦丁衍生物降低红曲菌液态和固态发酵产桔霉素能力的方法，其特征在于：向红曲菌液态发酵培养基和红曲菌固态发酵培养基中添加芦丁衍生物，灭菌和接种后于摇床振荡或静置培养。
本发明所述的红曲菌液态发酵培养基成分：按照每1000 mL发酵培养基中添加10.0-50.0 g 可溶性淀粉，1.0-20.0 g蛋白胨，0.1-1.0 g KH2PO4，0.1-2.0 g K2HPO4，0.1-1.0 g MgSO4·7H2O，1.0-20.0 g 的芦丁衍生物。
本发明所述的红曲菌固态发酵培养基成分：按照每1000 mL发酵培养基中添加10.0-50.0 g 可溶性淀粉，1.0-20.0 g蛋白胨，0.1-1.0 g KH2PO4，0.1-2.0 g K2HPO4，0.1-1.0 g MgSO4·7H2O，在每1000 mL培养基中添加10.0-50.0 g的琼脂，并添加1.0-20.0 g 的芦丁衍生物。
具体步骤如下。
（1）制备红曲菌孢子所需的培养基。
首先配制麦芽汁（MES）固体培养基：取200.0-500.0 g的干麦芽，用粉碎机磨成粉末，以质量体积比（m/v）为1:4的麦芽和水充分混合，于60℃水浴糖化后，过滤，加入蛋清，搅匀，继续煮沸，再过滤，即得到麦芽汁。将麦芽汁用蒸馏水稀释到6波美度，按每1000 mL麦芽汁中加入20.0 g 琼脂，121℃灭菌30 min，分装在培养皿中，冷却凝固后，得到用于制备红曲菌孢子的MES固体培养基。
配制MPPY培养基：按照每1000 mL种子培养基中添加1.0-2.0 g酵母浸粉，20.0-40.0 g葡萄糖，0.1-0.5 g KCl，1.0-3.0 g NaNO3，pH值6.5，分装在250 mL的三角瓶中，于121℃灭菌30 min。
（2）制备红曲菌孢子悬浮液。
取1接种环斜面保存的红曲菌菌种到MPPY液体培养基中，于150-250 rpm，28-32℃恒温震荡培养36-48 h。取1.0 mL培养液涂布接种到步骤（1）中制备的MES固体培养基上，于28 ℃静置培养10-16 d，待MES培养基上长出大量红曲菌孢子后，用无菌的孢子洗脱液对孢子进行洗脱，过滤，获得均一的孢子悬浮液。
（3）制备红曲菌种子液。
配制红曲菌种子培养基：按照每1000 mL培养基中添加20.0-40.0 g葡萄糖，1.0-3.0 g KH2PO4，2.0-4.0 g NaNO3，0.1-1.0 g KCl，0.1-1.0 g MgSO4·7H2O，分装在250 mL的三角瓶中，于121℃灭菌30 min。
采用无菌水将步骤（2）中制备的孢子悬浮液中的孢子浓度稀释到5.0×105-5.0×107个/mL，取1.0 mL孢子液接种到含有100.0 mL无菌的种子培养基的三角瓶中，于150-250rpm，28-32℃恒温震荡培养36-48 h，得到红曲菌种子液。
（4）制备红曲菌液态和固态发酵培养基。
按照每1000 mL发酵培养基中添加10.0-50.0 g 可溶性淀粉，1.0-20.0 g蛋白胨，0.1-1.0 g KH2PO4，0.1-2.0 g K2HPO4，0.1-1.0 g MgSO4·7H2O，1.0-20.0 g 的芦丁衍生物，分装在250 mL的三角瓶中，于121℃灭菌30 min，得到液态发酵培养基。
按照上述制备的液态发酵培养基的方法，在每1000 mL培养基中添加10.0-50.0 g的琼脂，并添加1.0-20.0 g 的芦丁衍生物，分装在250 mL的三角瓶中，于121℃灭菌30min，然后分装在培养皿中，冷却凝固后，得到固态发酵培养基。
采用不添加芦丁衍生物的发酵培养基进行对照研究。
（5）红曲菌发酵。
将步骤（3）中得到的红曲菌种子液按照2-10%（v/v)接种于步骤（4）中的液态发酵培养基中，混匀后于150-250 rpm 转速和28-32℃恒温震荡培养6-28 d，得到红曲菌液态发酵液。
将步骤（3）中得到的红曲菌种子液按照0.5-2.0 mL接种涂布于步骤（4）中的含固态发酵培养基的培养皿中，涂匀后于25-32℃恒温培养箱中静置培养6-16 d，得到红曲菌固态发酵产物。
本发明的优点：本发明向配制的红曲菌液态和固态发酵培养基中添加芦丁衍生物（曲克芦丁或α-葡糖基芦丁），操作简单，安全可靠，工艺稳定，降低桔霉素效果优良，可用于工业生产。
本发明中红曲菌液态和固态发酵产物中桔霉素的测定方法：取3.0~5.0 mL的过滤后的发酵液加入2倍体积的甲醇，充分混匀后置于60℃水浴1 h，溶液经6000 rpm，离心15min，上清液用0.45 μm的滤膜过滤后进行HPLC分析；固态发酵产物于60℃烘干，研钵研碎，称取1.0 g固态发酵产物粉末，加入5.0 mL甲醇，超声波提取30 min，6000 rpm，离心15min，上清液稀释10-100倍，用0.45 μm的滤膜过滤后进行HPLC分析，并按照下列条件对桔霉素进行测定。
色谱柱：ZORBAX SB-C18(4.6×15 mm，3.5 μm I.D)；
流动相：乙腈﹣水（40:60，v/v），磷酸调节pH至2.6；
检测波长：λex=331 nm，λem=500 nm；
柱温：30℃；
流速：1.0 mL/min；
进样量：20.0 μL。
附图说明
图1为不同添加量的曲克芦丁对红曲菌在高淀粉量（5.0%）的蛋白胨（0.5%）培养基中发酵不同时间的桔霉素的影响。
图2为不同添加量的曲克芦丁对红曲菌在低淀粉量（1.0%)的蛋白胨(0.5%）培养基中发酵不同时间的桔霉素的影响。
具体实施方式
本发明将通过以下实施例作进一步说明。
实施例1。
1）制备MPPY培养基：按每1000 mL培养基中含2.0 g酵母浸粉，40.0 g葡萄糖，0.5g KCl，3.0 g NaNO3，pH值6.5，加入二次蒸馏水溶解后，分装在250 mL的三角瓶中，于121℃灭菌30 min。
2）制备种子培养基：按每1000 mL培养基中添加30.0 g葡萄糖，2.0 g KH2PO4，3.0g NaNO3，0.5 g KCl，0.5 g MgSO4·7H2O，分装在250 mL的三角瓶中，于121℃灭菌30 min。
3）制备种子液：取1.0 mL孢子浓度为1.0×106个/mL的孢子液接种到含有100 mL无菌的种子培养基的三角瓶中，于180 rpm，30℃恒温震荡培养48 h，得到红曲菌种子液。
4）制备发酵培养基：按每1000 mL培养基中添加50.0 g可溶性淀粉，5.0 g 蛋白胨，0.5 g KH2PO4，1.0 g K2HPO4，1.0 g MgSO4·7H2O，0-20.0 g曲克芦丁（每个浓度至少重复四次），分装在250 mL的三角瓶中，于121℃灭菌30 min。
5） 将红曲菌种子液以5 %的接种量接至发酵培养基中，于30℃，180 rpm条件下摇瓶培养12-28 d，得到红曲菌发酵液。
本发明所涉及的芦丁衍生物降低红曲菌液态和固态发酵产桔霉素能力的方法中上述实施例得到的发酵液中桔霉素产生较晚，在发酵12 d时才大量合成，之后随着发酵时间迅速增加，对照组发酵20 d时桔霉素产量达到稳定，约92.75 μg/mL，而添加了曲克芦丁的剂量组在发酵20 d时桔霉素产量达到最大值，其中，5.0 g/L的低剂量组20 d时约为58.95 μg/mL，相比对照组桔霉素产量约降低36.4%；20.0 g/L的高剂量组在发酵20 d桔霉素产量为37.75 μg/mL，相比对照组降低了59.3%。之后，随着时间的延长，添加了曲克芦丁的剂量组桔霉素产量呈现下降趋势，经28 d 发酵，20.0 g/L的高剂量组桔霉素产量相比对照组下降了74.7%。（附图1）
实施例2。
1）制备MPPY培养基：按每1000 mL培养基中含2.0 g酵母浸粉，40.0 g葡萄糖，0.5g KCl，3.0 g NaNO3，pH值6.5，加入二次蒸馏水溶解后，分装在250 mL的三角瓶中，于121℃灭菌30 min。
2）制备种子培养基：按每1000 mL培养基中添加30.0 g葡萄糖，2.0 g KH2PO4，3.0g NaNO3，0.5 g KCl，0.5 g MgSO4·7H2O，分装在250 mL的三角瓶中，于121℃灭菌30 min。
3）制备种子液：取1.0 mL孢子浓度为1.0×106个/mL的孢子液接种到含有100 mL无菌的种子培养基的三角瓶中，于180 rpm，30℃恒温震荡培养48 h，得到红曲菌种子液。
4）制备发酵培养基：按每1000 mL培养基中添加10.0 g可溶性淀粉，5.0 g 蛋白胨，0.5 g KH2PO4，1.0 g K2HPO4，1.0 g MgSO4·7H2O，0-15.0 g曲克芦丁（每个浓度至少重复四次），分装在250 mL的三角瓶中，于121℃灭菌30 min。
5）将红曲菌种子液以5 %的接种量接至发酵培养基中，于30℃，180 rpm条件下摇瓶培养6-14 d，得到红曲菌发酵液。
本发明所涉及的芦丁衍生物降低红曲菌液态和固态发酵产桔霉素能力的方法中上述实施例得到的发酵液中红曲菌在低淀粉量的淀粉蛋白胨培养基中发酵前6 d，桔霉素产量较低，6 d后发酵液中桔霉素含量随着发酵时间逐渐增加，10 d时，桔霉素含量达26.0μg/mL，发酵10 d之后，增长缓慢，基本趋于稳定；而添加了不同量的曲克芦丁的实验组，在发酵8 d后，发酵液中桔霉素含量出现不同程度降低。在曲克芦丁添加量分别为5.0 g/L和10.0 g/L的实验组，在发酵第10 d，发酵液中桔霉素最大含量分别为14.39 μg/mL和12.66μg/mL，相比对照组，分别降低了44.6%和51.3%；而曲克芦丁的添加量为15.00 g/L的实验组，在发酵到第8 d，桔霉素产量达到最大值，为6.99 μg/mL，相比对照组第8 d桔霉素产量20.99 μg/mL，降低了66.69%。当发酵时间延长至14 d时，曲克芦丁添加量为15.0 g/L的实验组中桔霉素含量为3.44 μg/mL，相比对照组发酵14 d的桔霉素含量28.52 μg/mL，降低了87.94%。当曲克芦丁的添加量达到15.0 g/L时，对红曲菌产桔霉素有较好的抑制作用。（附图2）
实施例3。
1）制备MPPY培养基：按每1000 mL培养基中含2.0 g酵母浸粉，40.0 g葡萄糖，0.5g KCl，3.0 g NaNO3，pH值6.5，加入二次蒸馏水溶解后，分装在250 mL的三角瓶中，于121℃灭菌30 min。
2）制备种子培养基：按每1000 mL培养基中添加30.0 g葡萄糖，2.0 g KH2PO4，3.0g NaNO3，0.5 g KCl，0.5 g MgSO4·7H2O，分装在250 mL的三角瓶中，于121℃灭菌30 min。
3）制备种子液：取1.0 mL孢子浓度为1.0×106个/mL的孢子液接种到含有100 mL无菌的种子培养基的三角瓶中，于180 rpm，30℃恒温震荡培养48 h，得到红曲菌种子液。
4）制备发酵培养基：按每1000 mL培养基中添加10.0 g可溶性淀粉，5.0 g 蛋白胨，0.5 g KH2PO4，1.0 g K2HPO4，1.0 g MgSO4·7H2O，0-15.0 g α-葡糖基芦丁（每个浓度至少重复四次），分装在250 mL的三角瓶中，于121℃灭菌30 min。
5） 将红曲菌种子液以5 %的接种量接至发酵培养基中，于30℃，180 rpm条件下摇瓶培养6-14 d，得到红曲菌发酵液。
本发明所涉及的芦丁衍生物降低红曲菌液态和固态发酵产桔霉素能力的方法中上述实施例得到的发酵液中，当在发酵培养中添加15.0 g/L 的α-葡糖基芦丁时，与未添加α-葡糖基芦丁的发酵液相比，桔霉素含量降低了95.40%。
实施例4。
1）制备MPPY培养基：按每1000 mL培养基中含2.0 g酵母浸粉，40.0 g葡萄糖，0.5g KCl，3.0 g NaNO3，pH值6.5，加入二次蒸馏水溶解后，分装在250 mL的三角瓶中，于121℃灭菌30 min。
2）制备种子培养基：按每1000 mL培养基中添加30.0 g葡萄糖，2.0 g KH2PO4，3.0g NaNO3，0.5 g KCl，0.5 g MgSO4·7H2O，分装在250 mL的三角瓶中，于121℃灭菌30 min。
3）制备种子液：取1.0 mL孢子浓度为1.0×106个/mL的孢子液接种到含有100 mL无菌的种子培养基的三角瓶中，于180 rpm，30℃恒温震荡培养48 h，得到红曲菌种子液。
4）制备固态发酵培养基：按每1000 mL培养基中添加10.0 g可溶性淀粉，5.0 g 蛋白胨，0.5 g KH2PO4，1.0 g K2HPO4，1.0 g MgSO4·7H2O，0-20.0 g α-葡糖基芦丁（每个浓度至少重复四次），20.0 g琼脂，于121℃灭菌30 min，然后分装在培养皿中，冷却凝固后，得到固态发酵培养基。
5） 取1.0 mL种子液接种涂布到固态发酵培养基中，于28℃恒温静置培养6-16 d，得到红曲菌固态发酵物。
本发明所涉及的芦丁衍生物降低红曲菌液态和固态发酵产桔霉素能力的方法中上述实施例得到的固态发酵产物中，当发酵培养基中添加20.0 g/L的曲克芦丁或α-葡糖基芦丁时，与未添加曲克芦丁或α-葡糖基芦丁的固态发酵产物相比，桔霉素含量分别降低了81%和96%。

Claims (1)

1.一种芦丁衍生物降低红曲菌液态和固态发酵产桔霉素能力的方法，其特征在于：向红曲菌液态发酵培养基和红曲菌固态发酵培养基中添加芦丁衍生物，灭菌和接种后于摇床振荡或静置培养；
所述的红曲菌液态发酵培养基成分：按每1000 mL培养基中添加10.0 g可溶性淀粉，5.0 g 蛋白胨，0.5 g KH2PO4，1.0 g K2HPO4，1.0 g MgSO4·7H2O，15.0 g芦丁衍生物，分装在250 mL的三角瓶中，于121℃灭菌30 min；
所述的红曲菌固态发酵培养基成分：按每1000 mL培养基中添加10.0 g可溶性淀粉，5.0 g 蛋白胨，0.5 g KH2PO4，1.0 g K2HPO4，1.0 g MgSO4·7H2O，20.0 g 芦丁衍生物，20.0g琼脂，于121℃灭菌30 min，然后分装在培养皿中，冷却凝固后，得到固态发酵培养基；
所述的红曲菌为橙色红曲菌AS3.4384；
所述芦丁衍生物为曲克芦丁或α-葡糖基芦丁。
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CN106967665B (zh) * 2017-05-24 2020-09-01 福州大学 一种外源添加抗氧化剂液态发酵红曲霉低产桔霉素的方法

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