CN112980901B - 一种利用槐耳、槐耳及云芝发酵培养制备甲酰苯胺类化合物的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用槐耳单独发酵培养以及利用槐耳、云芝发酵共培养制备甲酰苯胺类化合物的方法。本发明利用槐耳和云芝两种药用真菌混合发酵培养得到的两个甲酰苯胺类化合物，相比于槐耳单独发酵培养产量分别提高了46.2和2.1倍。本发明通过槐耳单独发酵培养以及利用槐耳、云芝发酵共培养得到的两个甲酰苯胺类化合物具有显著的抗氧化活性，可应用于抗衰老药物研发，也可应用于保健药食方面的研究。本发明所述的制备方法为抗氧化、抗衰老领域内制备新的抗氧化制剂开辟了新的途径。

Description

一种利用槐耳、槐耳及云芝发酵培养制备甲酰苯胺类化合物 的方法及应用

技术领域

本发明涉及生物材料发酵培养领域，具体涉及一种利用槐耳单独发酵培养以及槐耳、云芝发酵共培养制备甲酰苯胺类化合物的方法及其应用。

背景技术

槐耳又名槐檽、槐菌、槐鸡、赤鸡等，是一种珍稀的药用真菌，为多孔菌科真菌槐栓菌的子实体。槐耳性平，味苦、辛，主要分布于陕西、山东、河北等地。槐耳的功效在历代医书中早有记载，如槐耳能治风，破血，益力、治大便血、五痔、脱肛等。作为在中国已应用了1600余年的传统中药槐耳，无论是单味药物及其提取物在近年来都受到了学术界和医药学界的广泛关注，尤其是抗肿瘤、抗氧化、抗衰老方面。

云芝是最具药用价值的真菌之一，为多孔菌科真菌彩绒革盖菌的子实体，具有清热、解毒、消炎、抗癌、保肝等功效。根据相关研究发现云芝的发酵浓缩提取物中，含有大量对自由基具有清除能力的抗氧化活性成分。

基于此，本发明通过单独接种、培养、发酵槐耳的方式，对槐耳的发酵浓缩液进行了化学分析；同时，本发明还通过以槐耳、云芝发酵共培养的方式，对其混合发酵浓缩液进行了化学分析；经研究发现采用以上两种发酵培养的方式，均可以得到不同产量的两种具有抗氧化活性的甲酰苯胺类化合物。这种具有抗氧化活性的甲酰苯胺类化合物可应用于抗衰老药物研发，也可应用于保健药食方面的研究，继而为抗氧化、抗衰老领域内抗氧化制剂的研究开辟了新的途径。

发明内容

基于槐耳、云芝的医药价值以及所具有的抗氧化活性，本发明所要解决的技术问题是提供一种以发酵共培养槐耳、云芝的方式制备具有抗氧化活性的甲酰苯胺类化合物的方法，继而为抗氧化制剂的制备开辟了新的途径。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种利用槐耳、云芝发酵共培养制备甲酰苯胺类化合物的方法，所述甲酰苯胺类化合物的结构式如式I、式II所示；

其中，式I、式II所示化合物的具体制备步骤如下：

S1，将槐耳、云芝分别接种至固体平面培养基上，培养6-8天；

S2，取部分步骤S1中培养得到的槐耳及云芝，将其分别接种至装有培养基的培养容器中，分别发酵培养6-8天；

S3，将步骤S2中发酵培养得到的槐耳培养液及云芝培养液进行混合，去除部分上清液，再进行发酵共培养12-14天；

S4，采用有机溶剂提取步骤S3发酵培养得到的发酵混合液；

S5，对步骤S4中得到的粗提取物，进行分离纯化得到式I、式II所示化合物。

作为优选，步骤S2中，所述槐耳和云芝的接种比例为1∶0.5～1∶1.5。

作为优选，步骤S2中所述的培养基由以下质量含量的组份组成：甘露醇18.0～22.0g/L，味精8.0～12.0g/L，麦芽糖18.0～22.0g/L，酵母膏2.0～4.0g/L，葡萄糖8.0～12.0g/L，蛋白胨4.0～6.0g/L，MgSO₄·7H₂O0.2～0.4g/L，KH₂PO₄0.4～0.6g/L，余量为水。

作为进一步优选，步骤S2中所述的培养基由以下质量含量的组份组成：甘露醇20.0g/L，味精10.0g/L，麦芽糖20.0g/L，酵母膏3.0g/L，葡萄糖10.0g/L，蛋白胨5.0g/L，MgSO₄·7H₂O0.3g/L，KH₂PO₄0.5g/L，余量为水。

作为进一步优选，所述槐耳和云芝的接种比例为1∶1。

作为优选，步骤S2中，槐耳、云芝单独发酵培养的温度为26～28℃，所述槐耳、云芝单独发酵培养可在摇床上进行，摇床的转速为180～200rpm；步骤S3中，槐耳、云芝发酵共培养的温度为26～28℃。

进一步地，步骤S5中，式I、式II所示化合物通过HPLC分离纯化得到，HPLC所用流动相为乙腈和2/1000的三氟乙酸水溶液。

作为优选，采用HPLC进行分离纯化时，流动相梯度淋洗方法如下：0-2min，5％乙腈，95％三氟乙酸水溶液；2-30min，由5％乙腈，95％三氟乙酸水溶液逐渐调整至50％乙腈，50％三氟乙酸水溶液。

本发明还提供了一种利用槐耳单独发酵培养制备甲酰苯胺类化合物的方法，所述甲酰苯胺类化合物的结构式如式I、式II所示；

其中，式I、式II所示化合物的具体制备步骤如下：

步骤(1)，将槐耳接种至固体平面培养基上，培养6-8天；

步骤(2)，取部分步骤(1)中培养得到的槐耳，将其接种至装有培养基的培养容器中，在26～28℃，发酵培养18-22天；其中，所述的培养基由以下质量含量的组份组成：甘露醇18.0～22.0g/L，味精8.0～12.0g/L，麦芽糖18.0～22.0g/L，酵母膏2.0～4.0g/L，葡萄糖8.0～12.0g/L，蛋白胨4.0～6.0g/L，MgSO₄·7H₂O0.2～0.4g/L，KH₂PO₄0.4～0.6g/L，余量为水；

步骤(3)，采用有机溶剂提取步骤(2)发酵培养得到的发酵液；

步骤(4)，对步骤(3)中得到的粗提取物，通过HPLC分离纯化得到式I、式II所示化合物。

作为优选，步骤(2)中所述的培养基由以下质量含量的组份组成：甘露醇20.0g/L，味精10.0g/L，麦芽糖20.0g/L，酵母膏3.0g/L，葡萄糖10.0g/L，蛋白胨5.0g/L，MgSO₄·7H₂O0.3g/L，KH₂PO₄0.5g/L，余量为水。

进一步，利用上述制备方法制备得到的式I、式II所示化合物可作为天然的抗氧化制剂，也可应用于制备新型的抗氧化制剂。

本发明同现有技术相比具有以下优点及效果：

1、本发明通过单独发酵培养槐耳的方式以及发酵共培养槐耳、云芝的方式，分别对其发酵浓缩物进行了化学分析，得到了式I、式II所示两种甲酰苯胺类化合物，并通过抗氧化测试发现式I、式II所示两种化合物具有较好的抗氧化活性，可作为天然的抗氧化制剂，也可作为新型抗氧化制剂的制备原料。

2、本发明通过对比单独发酵培养槐耳，以及发酵共培养槐耳、云芝制备式I、式II所示化合物这两种方式确定：以发酵共培养得到的两个甲酰苯胺类化合物的产量相比槐耳单培养时的产量分别提高了46.2和2.1倍。因此，采用发酵共培养槐耳、云芝制备式I、式II所示两种甲酰苯胺类化合物的方法，为进一步研发新的抗氧化制剂创造了条件。

3、本发明开辟了一种除化学合成外新的制备具有抗氧化活性的甲酰苯胺类化合物的方法，为首次从天然物质中获得，该方法与传统化学合成相比，具有原料易得，制备过程简单、安全，对环境友好，易于扩大生产等优点，此外，制备甲酰苯胺类化合物后剩余的槐耳、云芝提取物可继续用于其他活性物质的制备，如多糖制品等。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。

实施例1：一种利用槐耳单独发酵培养制备甲酰苯胺类化合物的方法，所述甲酰苯胺类化合物的结构式如式I、式II所示；

其中，式I、式II所示化合物的具体制备步骤如下：

步骤(1)，取槐耳适量，并将其接种至PDA固体平面培养基上，在28℃的培养箱中，培养6-8天，优选7天。

步骤(2)，取部分步骤(1)中培养得到的槐耳3块，每块取直径约0.6mm，将其接种至装有200ml培养基的500ml锥形瓶中，在28℃，发酵培养18-22天，优选20天；其中，所用培养基各组分及组份含量如下：甘露醇18.0～22.0g/L，味精8.0～12.0g/L，麦芽糖18.0～22.0g/L，酵母膏2.0～4.0g/L，葡萄糖8.0～12.0g/L，蛋白胨4.0～6.0g/L，MgSO₄·7H₂O0.2～0.4g/L，KH₂PO₄0.4～0.6g/L，余量为水；优选：甘露醇20.0g/L，味精10.0g/L，麦芽糖20.0g/L，酵母膏3.0g/L，葡萄糖10.0g/L，蛋白胨5.0g/L，MgSO₄·7H₂O0.3g/L，KH₂PO₄0.5g/L，余量为水。

步骤(3)，将步骤(2)所得发酵液采用等量乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相，减压浓缩，得粗浸膏。

步骤(4)，对步骤(3)中得到的粗提取物，采用反相半制备高效液相色谱进行分离纯化，其中流动性为乙腈(A)和含2/1000的三氟乙酸的水(B)，流动相梯度淋洗方法如下：0-2min，5％A，95％B；2-30min，5％A，95％B～50％A，50％B，得到式I化合物和式II化合物，其结构通过MS及¹H NMR分析确定：

式I所示化合物为浅黄色油状，分子式C₇H₇NO₂，ESI-MS m/z：138.1[M+H]⁺。¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)数据如下：δ(旋转异构体)9.89(s，1H)，8.13(d，J＝2.1Hz，1H)，7.35(dt，J＝8.9，3.5Hz，2H)，7.13(dt，J＝8.7，3.7Hz，2H)，6.82(dt，J＝8.8，3.5Hz，2H)，6.68(dt，J＝8.8，3.5Hz，2H)。

式II所示化合物为浅黄色油状，分子式C₈H₉NO₂，ESI-MS m/z：152.1[M+H]⁺。¹H-NMR(500MHz，CDCl₃)数据如下：δ(旋转异构体)8.49(d，J＝11.5Hz，1H)，8.33(d，J＝0.7Hz，1H)，7.44(dt，J＝9.0，3.7Hz，2H)，7.03(dt，J＝8.9，3.8Hz，2H)，6.93-6.83(m，4H)，3.80(s，3H)，3.79(s，3H)。

实施例2：一种利用槐耳、云芝发酵共培养制备甲酰苯胺类化合物的方法，所述甲酰苯胺类化合物的结构式如式I、式II所示；

其中，式I、式II所示化合物的具体制备步骤如下：

S1，取槐耳、云芝适量分别接种至PDA固体平面培养基上，在28℃培养箱中，培养6-8天，优选培养7天。

S2，设置接种比例为1∶1，分别取部分步骤S1中培养得到的槐耳及云芝各3块，每块直径约0.6mm，将其分别接种至装有200ml培养基的500ml锥形瓶中，在28℃，200rpm条件下的摇床上培养7天；其中，所用培养基各组分及组份含量如下：培养基由以下质量含量的组份组成：甘露醇18.0～22.0g/L，味精8.0～12.0g/L，麦芽糖18.0～22.0g/L，酵母膏2.0～4.0g/L，葡萄糖8.0～12.0g/L，蛋白胨4.0～6.0g/L，MgSO₄·7H₂O0.2～0.4g/L，KH₂PO₄0.4～0.6g/L，余量为水；优选：甘露醇20.0g/L，味精10.0g/L，麦芽糖20.0g/L，酵母膏3.0g/L，葡萄糖10.0g/L，蛋白胨5.0g/L，MgSO₄·7H₂O0.3g/L，KH₂PO₄0.5g/L，余量为水。

S3，将步骤S2中发酵培养得到的槐耳培养液及云芝培养液进行混合，舍弃200ml上清液，再进行发酵共培养12-14天，优选13天，混合培养至总计4.2L；

S4，浸膏的获得：将步骤S3所得发酵液直接用等量乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相，减压浓缩，得粗浸膏，共1.5克。

S5，化合物分离精制：取步骤S4得到的粗浸膏180mg用甲醇溶解后，利用反相半制备高效液相色谱进行分离，其中流动相为乙腈(A)和含2/1000的三氟乙酸的水(B)＝75∶25，流动相梯度淋洗方法如下：0-2min，5％A，95％B；2-30min，5％A，95％B～50％A，50％B，获得化合物I(16mg)和化合物II(13mg)，其结构通过MS及¹HNMR分析确定：。

化合物I浅黄色油状，分子式C₇H₇NO₂，ESI-MS m/z：138.1[M+H]⁺。¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)数据如下：δ(旋转异构体的混合物)9.89(s，1H)，8.13(d，J＝2.1Hz，1H)，7.35(dt，J＝8.9，3.5Hz，2H)，7.13(dt，J＝8.7，3.7Hz，2H)，6.82(dt，J＝8.8，3.5Hz，2H)，6.68(dt，J＝8.8，3.5Hz，2H)。

化合物II浅黄色油状，分子式C₈H₉NO₂，ESI-MS m/z：152.1[M+H]⁺。¹H-NMR(500MHz，CDCl₃)数据如下：δ(旋转异构体的混合物)8.49(d，J＝11.5Hz，1H)，8.33(d，J＝0.7Hz，1H)，7.44(dt，J＝9.0，3.7Hz，2H)，7.03(dt，J＝8.9，3.8Hz，2H)，6.93-6.83(m，4H)，3.80(s，3H)，3.79(s，3H).

步骤S6，式I、式II所示化合物产量的确定。

获得纯品后，利用高效液相来制作质量与峰面积的标准曲线，从而计算得到式I、式II所示化合物的产量。

槐耳及云芝发酵共培养时，化合物I和II的产量分别为32.8mg/L和27.2mg/L，相同条件下单培养槐耳20天也可产生化合物I和II，产量分别为0.71mg/L和12.9mg/L。两个化合物的产量在共同培养时相比槐耳单培养时的产量分别提高了46.2和2.1倍。

实施例3：式I、式II所示化合物的抗氧化活性测试，具体实验方法如下：

实验样品：测试样品为上述实施例2中分离精制的化合物I和II。精密称取适量样品，用甲醇配制成浓度为40mM的溶液，供测活性。

实验方法：抗氧化活性利用96孔板，采用梯度稀释方法测定，以维生素C为阳性对照药，比较观察化合物对DPPH的清除作用。首先，分别用甲醇将DPPH配制成浓度为150μM的溶液，将维生素C配制成浓度为100μM的溶液。然后，向96孔板前4列第一行加入160μL DPPH，剩余7行分别加入100μL DPPH溶液，再向第一行分别加入40μL待测化合物的甲醇溶液、维生素C溶液及甲醇对照溶液，混合均匀后取出100μL放入第二行，再混合均匀后取出100μL放入第三行，依次向下，直到最后一行，混合均匀后吸出100μL液体丢弃。最后，再向各个孔中加入100μL DPPH溶液并混匀，此时，每孔共200μL溶液。此外，在另外3列的第一行加入160μL甲醇，剩余7行分别加入100μL甲醇溶液，再向第一行分别加入40μL待测化合物的甲醇溶液、维生素C溶液，混合均匀后取出100μL放入第二行，再混合均匀后取出100μL放入第三行，依次向下，直到最后一行，混合均匀后吸出100μL液体丢弃。最后，再向各个孔中加入100μL甲醇溶液并混匀，此时，每孔共200μL溶液，作为空白对照组。将96孔板置于酶标仪中，25℃保温40分钟后，测定517nm处的光密度OD值。

清除率按照以下公式计算：

清除率(％)＝[1-(样品组OD值-空白对照组OD值)/甲醇对照组OD值]*100％

实验结果如下：

利用DPPH，采用梯度稀释方法对所示化合物I和II的抗氧化活性进行了研究，以维生素C为阳性对照药，结果发现所述化合物I和II均具有良好的抗氧化活性。其中，化合物I和II在250μM终浓度下对DPPH的清除率分别为95.7％和67.6％(阳性对照药维生素C在625nM浓度下抑制率为97.8％)。此外，化合物I的EC₅₀(半数有效浓度，即50％的清除率)为70.7μM，化合物II的EC₅₀为160.1μM(阳性对照药维生素C的EC₅₀74.4nM)。

结论

式I、式II所示化合物具有较好的抗氧化活性，可作为抗氧化制剂使用，也可应用于新型抗氧化剂的制备。

此外，需要说明的是，本说明书中所描述的具体实施例，其零、部件的形状、所取名称等可以不同。凡依本发明专利构思所述的构造、特征及原理所做的等效或简单变化，均包括于本发明专利的保护范围内。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种利用槐耳、云芝发酵共培养制备甲酰苯胺类化合物的方法，其特征在于，所述甲酰苯胺类化合物的结构式如式I、式II所示；

其中，式I、式II所示化合物的具体制备步骤如下：

S1，将槐耳、云芝分别接种至固体平面培养基上，培养6-8天；

S2，取部分步骤S1中培养得到的槐耳及云芝，将其分别接种至装有培养基的培养容器中，分别发酵培养6-8天；

S3，将步骤S2中发酵培养得到的槐耳培养液及云芝培养液进行混合，去除部分上清液，再进行发酵共培养12-14天；

S4，采用有机溶剂提取步骤S3发酵培养得到的发酵混合液；

S5，对步骤S4中得到的粗提取物，进行分离纯化得到式I、式II所示化合物。

2.根据权利要求1所述的利用槐耳、云芝发酵共培养制备甲酰苯胺类化合物的方法，其特征在于，步骤S2中，所述槐耳和云芝的接种比例为1∶0.5～1∶1.5。

3.根据权利要求2所述的利用槐耳、云芝发酵共培养制备甲酰苯胺类化合物的方法，其特征在于，步骤S2中所述的培养基由以下质量含量的组份组成：甘露醇18.0～22.0g/L，味精8.0～12.0g/L，麦芽糖18.0～22.0g/L，酵母膏2.0～4.0g/L，葡萄糖8.0～12.0g/L，蛋白胨4.0～6.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2～0.4g/L，KH₂PO₄ 0.4～0.6g/L，余量为水。

4.根据权利要求3所述的利用槐耳、云芝发酵共培养制备甲酰苯胺类化合物的方法，其特征在于，步骤S2中所述的培养基由以下质量含量的组份组成：甘露醇20.0g/L，味精10.0g/L，麦芽糖20.0g/L，酵母膏3.0g/L，葡萄糖10.0g/L，蛋白胨5.0g/L，MgSO₄·7H₂O0.3g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，余量为水。

5.根据权利要求2所述的利用槐耳、云芝发酵共培养制备甲酰苯胺类化合物的方法，其特征在于，步骤S2中，所述槐耳和云芝的接种比例为1∶1。

6.根据权利要求1所述的利用槐耳、云芝发酵共培养制备甲酰苯胺类化合物的方法，其特征在于，步骤S2中，槐耳、云芝单独发酵培养的温度为26～28℃，所述槐耳、云芝单独发酵培养可在摇床上进行，摇床的转速为180～200rpm；步骤S3中，槐耳、云芝发酵共培养的温度为26～28℃。

7.根据权利要求1所述的利用槐耳、云芝发酵共培养制备甲酰苯胺类化合物的方法，其特征在于，步骤S5中，式I、式II所示化合物通过HPLC分离纯化得到，HPLC所用流动相为乙腈和2/1000的三氟乙酸水溶液。

8.根据权利要求7所述的利用槐耳、云芝发酵共培养制备甲酰苯胺类化合物的方法，其特征在于，采用HPLC进行分离纯化时，流动相梯度淋洗方法如下：0-2min，5％乙腈，95％三氟乙酸水溶液；2-30min，由5％乙腈，95％三氟乙酸水溶液逐渐调整至50％乙腈，50％三氟乙酸水溶液。

9.由权利要求1-8任一制备方法制备得到的式I、式II所示化合物在制备抗氧化制剂中的应用。

10.一种利用槐耳单独发酵培养制备甲酰苯胺类化合物的方法，其特征在于，所述甲酰苯胺类化合物的结构式如式I、式II所示；

其中，式I、式II所示化合物的具体制备步骤如下：

步骤(1)，将槐耳接种至固体平面培养基上，培养6-8天；

步骤(2)，取部分步骤(1)中培养得到的槐耳，将其接种至装有培养基的培养容器中，在26～28℃，发酵培养18-22天；其中，所述的培养基由以下质量含量的组份组成：甘露醇18.0～22.0g/L，味精8.0～12.0g/L，麦芽糖18.0～22.0g/L，酵母膏2.0～4.0g/L，葡萄糖8.0～12.0g/L，蛋白胨4.0～6.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2～0.4g/L，KH₂PO₄ 0.4～0.6g/L，余量为水；

步骤(3)，采用有机溶剂提取步骤(2)发酵培养得到的发酵液；

步骤(4)，对步骤(3)中得到的粗提取物，通过HPLC分离纯化得到式I、式II所示化合物。