CN106916853A - 利用植物基原料和内生菌共培养制备生物活性物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用植物基原料和内生菌共培养制备生物活性物质的方法，包括以下步骤：（1）植物基原料的预处理：取无菌培养的活体植物细胞与组织等繁殖体，或将植物基原料经过烘干和/或造粉和灭菌预处理；（2）内生菌活化：将内生菌接种于微生物培养基上进行预培养，预培养时间为1‑25天，从而制得活化的内生菌；（3）生物材料与内生菌共培养：在共培养设备中，接种步骤（2）中制得的活化的内生菌中，并加入步骤（1）中所制得的含植物基材料的固体或液体培养基进行混合培养，培养时间为4‑90天，获得共培养产物；（4）生物活性物质的提取制备。通过植物基和内生菌共培养，制得活性物质，工艺简单可控，产物稳定表达，且生产周期短。

Description

利用植物基原料和内生菌共培养制备生物活性物质的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用植物基原料和内生菌共培养制备生物活性物质的方法。

背景技术

生物活性物质（Bioactive substance），是指来自生物体内的对生命过程有调控作用的一类微量或少量物质，具备以下特点：一是含量少，二是生物活性高。具备医药用途的生物活性物质是指从生物组织或生物质中提取获得的一类对人体或动物具有显著调控作用的天然组分。这些天然组分尤其是对改善人类健康有积极功效。这类生物活性物质通过提取、改性、修饰、转化成为相关产业追求的目标。

自然界的生物类群千差万别，每一种生物中都含有大量的生物活性物质，这些生物活性物质主要为生物体内的一次代谢产物与二次代谢产物。第一，这些一次代谢指植物细胞通过光合作用或微生物的代谢，生成生物体生存繁殖所必需的化合物，如糖类、氨基酸、脂肪酸、核酸及其聚合衍生物、乙酰辅酶A等的代谢过程。第二，有些是以二次代谢产物方式产生，其过程往往是以生物体本身的某些一次代谢产物作为起始原料，通过一系列生物化学反应生成的化合物是典型的生物活性物质，如萜类、甾体、生物碱、多酚类等；第三，这类二次代谢产物也可以是微生物利用植物或动物或微生物的代谢产物，转化合成而来，也可能是在植物或动物的前体或信号物质诱导下自身加快合成而来；后一种情况在药用植物及其内生菌相互作用关系中比较普遍。

从自然界中的生物体内分离提取的生物活性物质，其种类包括活性多糖、低聚糖类、功能性糖醇类、膳食纤维、功能性油脂、功能性蛋白质、功能性氨基酸与多肽、生物碱、酚类化合物、黄酮类化合物、植物甾醇类、甙类、挥发油、单宁类、皂苷类、含硫活性物等。部分生物活性物质已经可以人工合成，但是化学合成的生物活性物质往往具有旋光性差异并导致生物活性差异，往往达不到天然产物的效果，且纯化成本高。

目前制备生物活性物质的主要方法中也包括利用培养植物细胞和组织，以及其他繁殖体如原球茎和毛状根等。但是，人工培养的植物组织中天然产物的含量往往不高，达不到工业化利用的需求，且植物培养成本高，周期长。值得注意的是，药用植物内生菌也能够表达与药用植物类似或完全相同的生物活性物质，其培养周期短，成本低，甚至表达量高。但是，内生菌表达生物活性物质的水平很不稳定，往往随着继代培养代数的增加而显著降低，甚至完全丧失。

其他产生物活性物质的菌株表达生物活性物质水平随着继代培养代数的增加而显著降低的情况也比较普遍。如文章《蛹虫草菌种退化的探讨》中介绍，蛹虫草具有与冬虫夏草极相似的药理药效，可以作为冬虫夏草的代用品，但其菌株在继代培养过程中极易退化。再如文章《继代培养对球孢白僵菌毒素产生水平的影响》中报道，继代培养对球孢白僵菌生物学特性、毒力及毒力相关因素等均会产生影响，发现随着世代的增加，白僵菌某些毒素的代谢水平也逐渐降低。文章《继代培养对球孢白僵菌毒力及毒力相关酶表达的影响》也证实：随着继代次数的增多,供试菌株的表达量均呈下降趋势。

因此，在内生菌培养过程中加入药用植物因子，以保障内生菌产生生物活性物质的能力，或刺激内生菌产生相应生物活性物质是一种有效的新选择。

中国专利文献（申请号：201610647628.X）公开了一种利用人参内生真菌制备人参白茯苓发酵液的方法，其包括如下步骤：S1：用人参在内生菌诱导培养基中制备真菌；S2：分别用人参和步骤S1获得的真菌制备人参提取浸膏和真菌代谢产物浸膏，并利用所述人参提取浸膏和真菌代谢产物浸膏筛选出目标菌株；S3：利用所述目标菌株制备目标菌株种子液；S4：将所述目标菌株种子液接入由人参和白茯苓制备的发酵培养基中，在28～32℃下培养，得到所述人参白茯苓发酵液。现有公开专利一方面证明了本发明通过添加植物基材料的观点；但其所采用的方法仅限对于人参，不适用其它的植物基材料；同时，与现有技术相比，本发明先活化内生菌，提高其生物合成能力，且在共培养过程中形成优势菌群，不易污染；同时，本发明只需要一种生物基材料就可以高水平持续表达含有人参的活性成分，且发酵液更好；其次，本发明采用获得植物细胞和活的繁殖体，或部分灭活的植物组织，而不仅仅是提取物作为植物基材料，选择面更广，原材料更容易获得，实践证明在人参皂甙等活性物质的培养过程中，用本发明之方法活性更高，更稳定。

根据上述特点，本发明设计开发了利用药用植物原料和内生菌，以共培养方式持续表达和制备生物活性物质的方法，发挥药用植物内生菌快速高水平表达生物活性物质的特点，并通过药用植物活体细胞和组织及其生物质诱导和维持其表达水平，从而实现天然生物活性物质的持续高水平表达，由此建立具备产业化水平的天然生物活性物质的表达体系。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种一种天然活性物质高效表达和制备的方法。

为了解决上述问题，本发明采用的技术方案是，该利用植物基原料和内生菌共培养制备生物活性物质的方法，具体包括以下步骤：

（1）植物基原料的预处理：取无菌培养的活体植物细胞、植物组织或器官繁殖体，或将植物基原料经过烘干和/或造粉和灭菌预处理；

（2）内生菌活化：将内生菌接种于含不同生物材料浓度梯度微生物培养基上进行预培养，预培养时间为1-25天，从而制得活化的内生菌；

（3）生物材料与内生菌共培养：在共培养设备中接种步骤（2）中制得的活化的内生菌中，并加入步骤（1）中所制得的含植物基材料的固体或液体培养基进行混合培养，培养时间为4-90天，获得共培养产物；

（4）生物活性物质的提取：将步骤（3）中获得的共培养产物根据所需的生物活性物质的特点，采用醇提、水提、超临界提取、层析收集和喷雾干燥方法，获得生物活性物质的浓缩，再分离和纯化，得到生物活性物质。通过植物基和内生菌共培养，制得活性物质，工艺简单可控，且生产周期短。

进一步改进在于，所述植物基原料包括活的植物细胞和组织、组织培养所获得无性繁殖体和植物生物质；所述活的植物细胞和组织包括种子、细胞、新鲜茎、叶和根；组织培养所获得无性繁殖体包括愈伤组织、原球茎、幼苗、毛状根和胚状体；植物生物质包括药用植物茎秆、叶片、汁液、粉末和植物的愈伤组织、种苗、毛状根和提取物。

进一步改进在于，共培养内生菌为具有生物活性物质的植物内生真菌或内生细菌或放线菌，是从具有生物活性物质物质的药用植物中分离获得的。

进一步改进在于，所述步骤（3）中的所述共培养设备包括固体发酵设备、间歇浸没植物生物反应器、发酵罐、培养瓶中的一种或两种以上。

进一步改进在于，所述共培养产物是指培养液和/或混合培养物和/或培养后植物材料和/或培养后内生菌菌体；也可以是固体发酵产物。

进一步改进在于，所述步骤（3）中所获得的共培养产物，可以作为下一代培养的种子菌，循环扩大培养3-5代，且扩大培养的培养基中含有/或不含有植物基原料。

进一步改进在于，所述步骤（2）中内生菌活化的预培养时间为3-10天；所述步骤（3）中生物材料与内生菌共培养中进行混合培养，培养时间为7-50天。

进一步改进在于，所述步骤（3）中加入步骤（1）中所制得的含植物基材料的固体或液体培养基与内生菌一同加入，培养时间为7~50天。

进一步改进在于，所述步骤（3）中加入步骤（1）中所制得的含植物基材料的固体或液体培养基在内生菌接种培养2-20天后加入，加入后继续培养4-60天。

作为本发明的优选方案，所述步骤（3）中加入步骤（1）中所制得的含植物基材料的固体或液体培养基在内生菌接种培养4-10天后加入，加入后继续培养15-45天。

采用本发明的技术方案，与现有技术相比，其产生的有益效果是：本发明的有益效果包括：（1）天然活性物质的生产周期短、效率高；（2）天然活性物质制备过程可控，适宜工厂化和规模化生产；（3）内生菌产生天然活性物质的水平稳定，不随着培养代数的增加而减少。

附图说明

下面结合附图进一步描述本发明的技术方案：

图1是本发明利用植物基原料和内生菌共培养制备生物活性物质的方法的流程框图。

具体实施方式

实施例1：

该利用植物基原料和内生菌共培养制备生物活性物质的方法，具体包括以下步骤：

（1）植物基原料的预处理：植物基原料选取栀子嫩芽作为外植体，通过氯化汞、酒精和无菌水处理得到无菌的栀子外植体，培养栀子愈伤组织；栀子愈伤组织的培养基的配方为：采用MS液体为基本培养液，添加激素2,4-D 4.0mg/L，6-BA 2.0mg/L，蔗糖浓度10g/L，琼脂浓度1.5g/L，调整pH值5.8；设定的培养条件为：黑暗培养20d，然后转入光照条件下培养，培养时间为15d，光照强度1800lx，光照时间18h/d，温度为24±1℃。在愈伤组织长成后，转入愈伤组织固体增殖步骤中，所述固体培养基配方为：采用MS液体为基本培养液，添加激素NAA 3.0mg/L，6-BA 2.0mg/L，蔗糖浓度30g/L，琼脂浓度7.0g/L，调整pH值7.0；设定的培养条件为：培养时间为90d，光照强度1800lx，光照时间18h/d，温度为24±1℃；

（2）内生菌活化：将藏红花的内生菌接种于含不同生物材料浓度梯度微生物培养基上进行预培养，预培养时间为3天，从而制得活化的内生菌；

（3）生物材料与内生菌共培养：将步骤（1）获得的愈伤组织与分离自藏红花的内生菌Fusarium spp-1共培养，共培养条件为：1）Fusarium spp-1在普通PDA固体培养基上，活化培养4d，培养温度25℃；2）配置马铃薯葡萄糖液体（PD）培养基并灭菌；3）在灭菌分装好的PD培养基中加入栀子愈伤组织，达到总量的3%，同时接种活化的Fusarium spp-1培养物，达到总量的0.5%以上；4）摇瓶培养 35d，获得共培养产物；

（4）生物活性物质的提取：将步骤（3）中获得的共培养产物分离纯化。根据藏红花素难溶于无水乙醚、正丁醇，石油醚等，易溶于水、无水乙醇、碱液等特点，选取50%的无水乙醇，待共培养产物固液分离后，量取液体体积2倍的50%的无水乙醇，在 60℃下提取3次，合并3次提取液，55℃下旋转蒸发至干，甲醇溶解至5mL，HPLC检测其含量。

结果显示：培养产物液体部分粗藏红花素的含量为0.43mg/L。

实施例2：

该利用植物基原料和内生菌共培养制备生物活性物质的方法，具体包括以下步骤：

（1）植物基原料的预处理：植物基原料选取红豆杉外植体，通过氯化汞和无菌水处理得到无菌的红豆杉外植体，培养红豆杉愈伤组织；红豆杉愈伤组织的培养基的配方为：采用MS液体为基本培养液，添加激素2,4-D 2.0mg/L，6-BA 1.0mg/L，蔗糖浓度30g/L，琼脂浓度6.0g/L，调整pH值6.0；设定的培养条件为：黑暗培养25d，然后转入光照条件下培养，培养时间为13d，光照强度1800lx，光照时间18h/d，温度为24±1℃。在愈伤组织长成后，转入愈伤组织固体增殖步骤中，所述固体培养基配方为：采用MS液体为基本培养液，添加激素NAA2.0mg/L，6-BA 1.0mg/L，蔗糖浓度30g/L，琼脂浓度6.0g/L，调整pH值7.0；设定的培养条件为：培养时间为90d，光照强度1800lx，光照时间16h/d，温度为25±1℃；

（2）内生菌活化：将红豆杉的内生菌接种于含不同生物材料浓度梯度微生物培养基上进行预培养，预培养时间为6天，从而制得活化的内生菌；

（3）生物材料与内生菌共培养：将步骤（1）获得的愈伤组织与分离自红豆杉的内生菌Phomopsis TCN-01共培养，共培养条件为：1）Phomopsis TCN-01在普通PDA固体培养基上，活化培养5d，培养温度25℃；2）配置马铃薯葡萄糖液体（PD）培养基并灭菌；3）在灭菌分装好的PD培养基中加入红豆杉愈伤组织，达到总量的4%，同时接种活化的Phomopsis TCN-01培养物，达到总量的0.8%以上；4）摇瓶培养 20d，获得共培养产物；

（4）生物活性物质的提取：提取紫杉醇；将步骤（3）中获得的共培养产物根据所需的生物活性物质的特点，先进行固液分离，鉴于紫杉醇易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等特点，采用乙酸乙酯进行提取。液体部分：取100mL的液体，量取液体体积2倍的乙酸乙酯，与液体混合萃取浸提8h后，取上层液，45℃旋转蒸发浓缩至干，甲醇溶解至5mL，HPLC检测其含量；固体部分：称取3g的菌丝，液氮研磨后，加入30mL乙酸乙酯，浸提8h，离心分离取上清液体，45℃旋转蒸发浓缩至干，甲醇溶解至5mL，HPLC检测其含量。醇提、水提、超临界提取、层析收集和喷雾干燥方法，获得生物活性物质的浓缩，再分离和纯化，得到生物活性物质。

结果显示：培养产物液体部分粗紫杉醇的含量为123.78μg/L 。培养产物固体部分紫杉醇含量为3.82μg/g。

实施例3：

该利用植物基原料和内生菌共培养制备生物活性物质的方法，具体包括以下步骤：

（1）植物基原料的预处理：植物基原料选取红豆杉叶提取物，通过高压湿热灭菌处理得到无菌的红豆杉叶提取物；

（2）内生菌活化：将红豆杉的内生菌接种于含不同生物材料浓度梯度微生物培养基上进行预培养，预培养时间为5天，从而制得活化的内生菌；

（3）生物材料与内生菌共培养：将步骤（1）获得的红豆杉叶提取物与分离自红豆杉的内生菌Phomopsis TCN-01共培养，共培养条件为：1）Phomopsis TCN-01在普通PDA固体培养基上，活化培养5d，培养温度25℃；2）配置马铃薯葡萄糖液体（PD）培养基并灭菌；3）在灭菌分装好的PD培养基中加入红豆杉叶提取物，达到总量的4%，同时接种活化的Phomopsis TCN-01培养物，达到总量的0.6%以上；4）摇瓶培养30d，获得共培养产物；

（4）生物活性物质的提取：提取紫杉醇；将步骤（3）中获得的共培养产物，先进行固液分离，鉴于紫杉醇易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等特点，采用乙酸乙酯进行提取。液体部分：取100mL的液体，量取液体体积2倍的乙酸乙酯，与液体混合萃取浸提8h后，取上层液，45℃旋转蒸发浓缩至干，甲醇溶解至5mL，HPLC检测其含量；固体部分：称取3g的菌丝，液氮研磨后，加入30mL乙酸乙酯，浸提8h，离心分离取上清液体，45℃旋转蒸发浓缩至干，甲醇溶解至5mL，HPLC检测其含量。

结果显示：培养产物液体部分粗紫杉醇的含量为592.25μg/L 。培养产物固体部分紫杉醇含量为3.82μg/g。

实施例4：

该利用植物基原料和内生菌共培养制备生物活性物质的方法，具体包括以下步骤：

（1）植物基原料的预处理：植物基原料选取银杏叶提取物，通过过滤灭菌处理得到无菌的银杏叶提取物；

（2）内生菌活化：从银杏枝条中获得一株高产黄酮的内生菌，经鉴定为刺盘孢属真菌YXX03（Colletotrichum sp.）；将菌株YXX03在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上活化培养6天；

（3）生物材料与内生菌共培养：将步骤（2）中活化后的菌株YXX03接种到银杏叶提取物残渣中，进行固体发酵；固体发酵温度27℃；

（4）生物活性物质的提取：通过在索氏提取器内，用95%乙醇溶液提取后，将浸提液用旋转蒸发仪55°C减压浓缩得棕色粘稠物，结果显示：用70%乙醇溶解，分光光度计，检测培养15d的固体培养物和菌丝中，粗黄酮含量为0.69mg/g；培养35d的固体培养物和菌丝中，粗黄酮含量为1.73mg/g。

实施例5：

该利用植物基原料和内生菌共培养制备生物活性物质的方法，具体包括以下步骤：

（1）植物基原料的预处理：植物基原料取在MS固体培养基上培养30天的银杏愈伤组织若干，在超净台中捣碎，平铺在PDA培养基上，待用；

（2）内生菌活化：从银杏枝条中获得一株高产黄酮的内生菌，经鉴定为刺盘孢属真菌YXX03（Colletotrichum sp.）；将菌株YXX03在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上活化培养6天；

（3）生物材料与内生菌共培养：将步骤（1）制得的银杏愈伤组织接种活化后的菌株YXX03，培养10天后，在无菌条件下切取1cm见方的菌丝块，接种到马铃薯葡萄糖培养液（PD）中，摇瓶培养45天，分别收集培养液和菌丝体；

（4）生物活性物质的提取：通过在索氏提取器内，用乙醇溶液提取后，测得菌丝体中粗黄酮含量为2.33mg/g；培养液中粗黄酮含量为120.01mg/L；且表达稳定；相对于栽培银杏，需要数年时间，按照本实施例，产生系统级别黄酮含量的菌培养时间在40天以内。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种利用植物基原料和内生菌共培养制备生物活性物质的方法，具体包括以下步骤：

（1）植物基原料的预处理：取无菌培养的活体植物细胞、植物组织或器官繁殖体，或将植物基原料经过烘干和/或造粉和灭菌预处理；

（2）内生菌活化：将内生菌接种于微生物培养基上进行预培养，预培养时间为1-25天，从而制得活化的内生菌；

（3）生物材料与内生菌共培养：在共培养设备中接种步骤（2）中制得的活化的内生菌中，并加入步骤（1）中所制得的含植物基材料的固体或液体培养基进行混合培养，培养时间为4-90天，获得共培养产物；

（4）生物活性物质的提取：将步骤（3）中获得的共培养产物根据所需的生物活性物质的特点，采用醇提、水提、超临界提取、层析收集和喷雾干燥方法，获得生物活性物质的浓缩，再分离和纯化，得到生物活性物质。

2.如权利要求1所述的利用植物基原料和内生菌共培养制备生物活性物质的方法，其特征在于，所述植物基原料包括活的植物细胞和组织、组织培养所获得无性繁殖体和植物生物质；所述活的植物细胞和组织包括种子、细胞、新鲜茎、叶和根；组织培养所获得无性繁殖体包括愈伤组织、原球茎、幼苗、毛状根和胚状体；植物生物质包括药用植物茎秆、叶片、汁液、粉末和植物的愈伤组织、种苗、毛状根和提取物。

3.如权利要求2所述的利用植物基原料和内生菌共培养制备生物活性物质的方法，其特征在于，共培养内生菌为具有产生生物活性物质能力的植物内生真菌或内生细菌或放线菌，是从产生生物活性物质的药用植物中分离获得的。

4.如权利要求2所述的利用植物基原料和内生菌共培养制备生物活性物质的方法，其特征在于，所述步骤（3）中的所述共培养设备包括固体发酵设备、植物生物反应器、发酵罐、培养瓶中的一种或两种以上。

5.如权利要求3所述的利用植物基原料和内生菌共培养制备生物活性物质的方法，其特征在于，所述共培养产物是指培养液和/或混合培养物和/或培养后植物材料和/或培养后内生菌菌体；也可以是固体发酵产物。

6.如权利要求5所述的利用植物基原料和内生菌共培养制备生物活性物质的方法，其特征在于，所述步骤（3）中所获得的共培养产物，可以作为下一代培养的种子菌，循环扩大培养3-5代，且扩大培养的培养基中含有/或不含有植物基原料。

7.如权利要求6所述的利用植物基原料和内生菌共培养制备生物活性物质的方法，其特征在于，所述步骤（2）中内生菌活化的预培养时间为3-10天；所述步骤（3）中生物材料与内生菌共培养中进行混合培养，培养时间为7-50天。

8.如权利要求6所述的利用植物基原料和内生菌共培养制备生物活性物质的方法，其特征在于，所述步骤（3）中加入步骤（1）中所制得的含植物基材料的固体或液体培养基与内生菌一同加入，培养时间为7~50天。

9.如权利要求6所述的利用植物基原料和内生菌共培养制备生物活性物质的方法，其特征在于，所述步骤（3）中加入步骤（1）中所制得的含植物基材料的固体或液体培养基在内生菌接种培养3-20天后加入，加入后继续培养4-60天。

10.如权利要求9所述的利用植物基原料和内生菌共培养制备生物活性物质的方法，其特征在于，所述步骤（3）中加入步骤（1）中所制得的含植物基材料的固体或液体培养基在内生菌接种培养4-10天后加入，加入后继续培养15-45天。