CN111621517A

CN111621517A - 一种温郁金毛状根的诱导方法

Info

Publication number: CN111621517A
Application number: CN202010506343.0A
Authority: CN
Inventors: 徐正贤; 向太和; 江洁; 罗灶霞; 李江山
Original assignee: Hangzhou Normal University
Current assignee: Hangzhou Normal University
Priority date: 2020-06-05
Filing date: 2020-06-05
Publication date: 2020-09-04
Anticipated expiration: 2040-06-05
Also published as: CN111621517B

Abstract

本发明公开了一种温郁金毛状根的诱导方法，包括以下步骤：1）侵染液的制备；2）活体组培苗的培养；3）毛状根的诱导；4）毛状根的脱菌培养及繁殖。本发明首先利用温郁金的内生菌侵染组培苗，作为发根农杆菌的受体，再利用发根农杆菌活体侵染温郁金活体组培苗的茎段，实现高效诱导出毛状根，为利用温郁金毛状根诱导体系生长药用成分提供技术支撑。

Description

一种温郁金毛状根的诱导方法

技术领域

本发明属于组培快繁技术领域，具体涉及一种温郁金毛状根的诱导方法。

背景技术

温郁金（Curcuma wenyujin Y.H. Chen et C. Ling）是姜科姜黄属植物，主要分布于浙江省的温州地区，全株均可供药用。其块根加工成的药材“温郁金”为浙江省著名道地药材“浙八味”之一。根据药用部位与加工方法的不同，温郁金植物体的地下根茎可分别加工成3种不同药材：块根煮熟晒干称“温郁金”，侧根茎纵切厚片晒干称“片姜黄”，主根茎煮熟晒干称“温莪术”。3种药材均为2010年版《中国药典》收载品种，具有极高的经济价值。

在温郁金的化学成分研究方面，迄今为止，已从其中分离得到82种化学成分，主要类型有单萜类、倍半萜类、二萜类、生物碱及其他成分。在温郁金药理活性研究方面，现代药理学研究表明，温郁金中含有抗肿瘤的活性物质，包括蓬莪术环二烯、β-榄香烯、δ-榄香烯等。蓬莪术二烯，作为温郁金根茎挥发油的主要成分之一，对肿瘤细胞具有抑制作用。特别是近年来研究发现，从温郁金中分离的β-榄香烯表现出高效低毒的抗肿瘤活性，药理研究证实β-榄香烯对肺癌、肝癌、脑癌、食道癌、胃癌和骨转移癌等多种癌症安全有效，具有增加诱导细胞凋亡的作用。据此已研制出疗效好、副作用小的新型抗肿瘤药物，开发出具有我国自主知识产权的抗肿瘤植物药物。并且，温郁金在抗炎、镇痛方面具有显著疗效，还具有保肝、抗忧郁作用、抗血栓和改善血液循环等功效。

另一方面，毛状根（hairy roots）是发根农杆菌所含Ri质粒的T-DNA片段在植物细胞基因组中插入、整合并表达，诱导植物细胞形成的不定根。毛状根在形态上保持了植物原根系统的特征，在生理上具有原根系统完整的代谢通路；毛状根起源于单细胞而不存在嵌合体，在遗传上具有高度的稳定性和一致性。在应用上，由于毛状根具有天然根的结构、能够在不含有植物激素的培养基上快速生长、且遗传稳定性高并能合成和积累次生代谢物质，因此，毛状根可作为生物反应器生产药用植物的药用活性成分。

因此，诱导出温郁金的毛状根，具有重要的实践价值。本发明目的是提供一种诱导温郁金毛状根的高效诱导的方法，克服目前根系药用植物产量少、培养难的问题，以便利用毛状根生产温郁金的药用成分。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明设计的目的在于提供一种诱导温郁金毛状根的技术方案。

本发明通过以下技术方案加以实现：

所述的一种温郁金毛状根的诱导方法，其特征在于包括以下步骤：

1）侵染液的制备

分别取-80℃保存的野生型的发根农杆菌K599及-80℃保存的温郁金内生菌WYJ-E13，经活化与培养后分别制得发根农杆菌侵染液和内生菌侵染液，待用；

2）活体组培苗的培养

于200mL的培养瓶中，加入MS(0)固体培养基50mL，在培养基中接入高1-2cm的组培苗，在培养瓶中接入组培苗后，随即用加样枪吸取5-10μL的内生菌侵染液，加到组培苗基部的培养基表面；

3）毛状根的诱导

经步骤2）处理的组培苗与内生菌侵染液共培养15天，然后用无菌剪刀在距离组培苗根部0.5-1cm的茎处，剪除组培苗上部，仅留组培苗0.5-1cm的茎和根，用微量加样枪吸收发根农杆菌侵染液2-5μL直接滴加到组培苗茎的剪切口处，随后将侵染后的组培苗于28℃的温度条件下遮光培养15-30天，在组培苗的剪切口上部得到毛状根；

4）毛状根的脱菌培养及繁殖

待诱导出的毛状根长至3cm以上时，剪下毛状根并接种到含500 mg/LCef（头孢霉素）的MS培养基上，每20 d继代1次，经过3次继代完全灭杀农杆菌后，转入MS培养基培育繁殖毛状根。

所述的一种温郁金毛状根的诱导方法，其特征在于步骤1）中发根农杆菌侵染液的制备，具体为将-80℃保存的野生型的发根农杆菌K599在含有50 mg/L Str（链霉素）的LB培养基上划线培养；取培养后的单菌落于含有50 mg/L Str的LB液体培养基中过夜培养，当农杆菌生长到菌液OD值约为1.0时，取1 mL菌液于1.5 mL离心管中，离心、除上清；用MS液体培养基悬浮菌体，离心、除上清；再用MS液体培养基稀释至OD值约为0.1，用作农杆菌侵染液。

所述的一种温郁金毛状根的诱导方法，其特征在于步骤1）中内生菌侵染液的制备，具体为将-80℃保存的温郁金内生菌WYJ-E13在含有 50 mg/L Str的PDA培养基上划线培养，取培养后的单菌落于含有50 mg/L Str的PDA液体培养基中过夜培养，当内生菌的菌液OD值约为1.0时，取1 mL菌液于1.5 mL离心管中，离心、除上清；用MS液体培养基悬浮菌体，离心、除上清；再用MS液体培养基稀释至OD值约为0.01，用作内生菌侵染液。

所述的一种温郁金毛状根的诱导方法，其特征在于各培养均于28℃的温度条件下进行，且200 r/min的条件下摇床培养。

本发明首先利用温郁金的内生菌侵染组培苗，作为发根农杆菌的受体，再利用发根农杆菌活体侵染温郁金活体组培苗的茎段，实现高效诱导出毛状根，为温郁金毛状根诱导体系提供技术支撑。

附图说明

图1为不同组培苗茎上诱导毛状根；

图2为对比叶片侵染未能诱导出毛状根；

图3为对比离体茎段诱导毛状根；

图4为毛状根的PCR鉴定，图中，M：DNA标准分子量；1：普通组培苗的根；2和3：从离体茎诱导出的毛状根；4和5：从活体组培苗茎上诱导的毛状根；箭头所指：为扩增的条带。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细描述。

实施例

1、诱导毛状根侵染液的制备

1）农杆菌侵染液的制备：将-80℃保存的野生型的发根农杆菌K599在含有50 mg/L Str的LB培养基上划线培养，28℃；取培养后的单菌落于含有50 mg/L Str的LB液体培养基中过夜培养，当农杆菌生长到菌液OD值约为1.0时，取1 mL菌液于1.5 mL离心管中，离心、除上清；用MS液体培养基悬浮菌体，离心、除上清；再用MS液体培养基稀释至OD值为约0.1，用作农杆菌侵染液。

2）内生菌侵染液的制备

将-80℃保存的温郁金内生菌WYJ-E13在含有 50 mg/L Str的PDA培养基上划线培养，28℃；取培养后的单菌落于含有50 mg/L Str的PDA液体培养基中过夜培养，28℃、200 r/min，当内生菌的菌液OD值约为1.0时，取1 mL菌液于1.5 mL离心管中，离心、除上清；用MS液体培养基悬浮菌体，离心、除上清；再用MS液体培养基稀释至OD值约为0.01，用作内生菌侵染液。

2、活体组培苗的培养

于200mL的培养瓶中，加入MS(0)固体培养基50mL，在培养基中接入高1-2cm的组培苗，在培养瓶中接入组培苗后，随即用加样枪吸取5-10μL的内生菌侵染液，加到组培苗基部的培养基表面；MS(0)固体培养基为不添加任何激素的MS培养基。

3、毛状根的诱导

将经过内生菌侵染的组培苗与内生菌侵染液共培养15天，然后用无菌剪刀在距离组培苗根部0.5-1cm的茎处，剪除组培苗上部，仅留组培苗0.5-1cm的茎和根，用微量加样枪吸收发根农杆菌侵染液2-5μL直接滴加到组培苗茎的剪切口处，随后将侵染后的组培苗于28℃的温度条件下遮光培养15-30天，在组培苗的剪切口上部得到毛状根。不同组培苗茎上诱导的毛状根见图1。毛状根具有典型的非向地性特征，其诱导率达100%（50/50）。同时，对照未接种内生菌WYJ-E13的组培苗，在其他条件均相同的情况下，在茎的伤口处，虽然也能诱导出毛状根，但诱导率仅为25%（5/20）。

4、毛状根的脱菌培养及繁殖

待诱导出的毛状根长至3cm以上时，剪下毛状根并接种到含500 mg/LCef的MS培养基上，每20 d继代1次，经过3次继代完全灭杀农杆菌后，转入MS培养基培育繁殖毛状根。

对比例

1、温郁金组培苗的来源：温郁金组培苗来自接入MS+6-BA2 mg/L+IAA1mg/L固体培养基上培养15天的组培苗，组培苗高3-4cm。

2、利用温郁金组培苗的叶片和茎段作为受体材料

在超级工作台上，剪取1-1.5 cm的叶片、将茎剪切为长0.5-1 cm，作为农杆菌侵染的受体。

3、毛状根的诱导

对于离体叶片和茎段作为受体材料：将剪切的温郁金叶片和茎段放在培养皿中，加入发根农杆菌侵染液中，菌液没过叶片和茎段，室温、60 r/min、侵染5 min。用无菌的滤纸吸干外植体表面菌液，接种在添加25 mg/L AS的有MS培养基上，放置在28℃培养室中遮光培养。3 d后将叶片和茎段转接在含500 mg/L Cef 的MS液体培养基中100 r/min振荡洗菌15min，然后用无菌水冲洗3次。用无菌的滤纸吸干外植体表面液体，然后将其接种到添加500mg/L Cef的MS培养基上，放置在28℃培养室中遮光培养。此后，每隔一周更换一次培养基以杀灭农杆菌。

4、诱导结果

对于农杆菌侵染叶片，诱导结果，未出现毛状根（图2）。农杆菌侵染茎段，在茎段的伤口处有毛状根的出现，毛状根的诱导率可以达到35.6%（16/45）（图3）。

毛状根的分子鉴定

利用生工公司植物基因组DNA快速提取试剂盒提取毛状根和普通根的DNA。根据发根农杆菌K599 Ri质粒pRi2659 T-DNA上rolB序列（GenBank：EF433766）设计引物5’-GCCAGCATTTTTGGTGAACT-3’和5’-CTGGCCCATCGTTCTAAAAA-3’。再利用PCR扩增仪对DNA进行扩增，PCR反应程序为：94℃预变性5 min，按94℃变性45 sec、55℃退火45 sec、72℃延伸90sec的程序进行30个循环，循环结束后在72℃下延伸10 min结束反应。扩增产物在1.2%的琼脂糖凝胶上电泳1 h （5 V/cm），溴化乙锭染色，凝胶成像系统观察和拍照记录，对获得的毛状根进行分子鉴定。

PCR扩增结果显示，不论从离体的茎上，还是活体的组培苗上诱导的毛状根，均扩增出大小约700 bp的特征条带，而普通组培苗温郁金的根，则无条带（图4）。进一步说明，诱导出的根为毛状根。

本发明首先利用温郁金的内生菌侵染组培苗，作为发根农杆菌的受体；再利用发根农杆菌活体侵染温郁金活体组培苗的茎段，可实现高效诱导出毛状根。该发明有助于利用温郁金的毛状根进一步工厂化生长温郁金的药用成分。

Claims

1.一种温郁金毛状根的诱导方法，其特征在于包括以下步骤：

1）侵染液的制备

2）活体组培苗的培养

3）毛状根的诱导

4）毛状根的脱菌培养及繁殖

2.如权利要求1所述的一种温郁金毛状根的诱导方法，其特征在于步骤1）中发根农杆菌侵染液的制备，具体为将-80℃保存的野生型的发根农杆菌K599在含有50 mg/L Str的LB培养基上划线培养；取培养后的单菌落于含有50 mg/L Str的LB液体培养基中过夜培养，当农杆菌生长到菌液OD值约为1.0时，取1 mL菌液于1.5 mL离心管中，离心、除上清；用MS液体培养基悬浮菌体，离心、除上清；再用MS液体培养基稀释至OD值约为0.1，用作农杆菌侵染液。

3.如权利要求1所述的一种温郁金毛状根的诱导方法，其特征在于步骤1）中内生菌侵染液的制备，具体为将-80℃保存的温郁金内生菌WYJ-E13在含有 50 mg/L Str的PDA培养基上划线培养，取培养后的单菌落于含有50 mg/L Str的PDA液体培养基中过夜培养，当内生菌的菌液OD值约为1.0时，取1 mL菌液于1.5 mL离心管中，离心、除上清；用MS液体培养基悬浮菌体，离心、除上清；再用MS液体培养基稀释至OD值约为0.01，用作内生菌侵染液。

4.如权利要求2或3所述的一种温郁金毛状根的诱导方法，其特征在于各培养均于28℃的温度条件下进行，且200 r/min的条件下摇床培养。