CN110592100A - 一种木薯camta基因及其抑制表达载体的构建和抗病应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种木薯CAMTA基因及其抑制表达载体的构建和抗病应用，其从木薯中分离获得一种基因，其CDS的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。木薯CAMTA基因抑制表达载体的构建：提取华南124号木薯叶片中RNA并反转录为cDNA，以CAMTA基因5’端1‑600bp片段作为病毒诱导基因沉默体系特异性核酸沉默片段，以获得的cDNA为模板扩增得到CAMTA基因5’端1‑600bp片段，胶回收后连接到TRV病毒诱导基因沉默载体pTRV2中，得到pTRV‑MeCAMTA基因沉默表达载体。通过构建该基因的沉默表达载体，注射木薯叶片，获得有效的瞬时MeCAMTA基因沉默木薯，为研究基因功能提供了一个有效的方法。

Description

一种木薯CAMTA基因及其抑制表达载体的构建和抗病应用
技术领域
本发明属于植物基因工程和技术领域，具体而言，涉及一种增强木薯对病原菌Xam(Xanthomonas axonopodis pv.manihotis)抗性的MeCAMTA基因，同时还涉及一种木薯CAMTA基因沉默体系及表达载体的构建方法，还涉及一种木薯CAMTA基因沉默表达载体在增强植物对病原菌Xam抗性中的用途。
背景技术
病毒诱导的基因沉默体系(Virus-induced gene silencing，VIGS)是被用于表征植物中某种基因功能的一种基因转录抑制技术。近年来，多种VIGS载体相继在植物中得到广应用。其中，烟草脆裂病毒(TRV)是目前应用最广泛的载体，它是由TRV1与TRV2两条病毒链组成，TRV1用于辅助载有靶基因片段的TRV2在植物体内移动。反向遗传学是鉴定基因功能的重要手段，其最关键步骤是通过遗传转化以实现基因的表达或沉默。然而，非模式植物因自身复杂的遗传背景使其研究困难加大，转化体系操作复杂，耗时费力。而VIGS技术具有周期短、效率高、成本低等优点，同时VIGS技术具有快速鉴定基因功能、避免遗传转化的特点。
木薯亦称树薯，大戟科(Euphorbiaceae)植物，学名为Manihot esculenta，原产于美洲热带地区的亚马逊河流域，是世界七大作物之一。目前，危害国内木薯的病害有7种，其中真菌病害6种，细菌病害1种。木薯细菌性萎蔫病是由地毯草黄单胞木薯萎蔫致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.manihotis)所引起的，是国际上木薯生产国的重要检疫对象，也是中国的外检对象，带病植株和产品能够传播该病。目前尚无该病菌侵染其他作物的报告。普查结果表明，该病可造成木薯产量损失估计在20％以上，淀粉出粉率减少40％。
植物中CAMTA(calmodulin-binding transcription activator)/SR(signalresponsive)转录因子是一个多基因家族，在拟南芥中已经报道发现的共发现有6个AtCAMTA/SR基因，在木薯中尚未见有关该基因的报道。植物CAMTA/SR基因响应一系列环境胁迫(如干旱、盐害、冷害和伤害等)和激素信号[如乙烯、脱落酸(abscisic acid，ABA)、生长素、水杨酸(salicylic acid，SA)、茉莉酸(jasmonicacid，JA)。CAMTA基因是Ca2+信号通路以及下游抗病相关信号通路中的关键基因。近年来，研究表明CAMTA/SR在生物胁迫反免疫应以及植物生长发育方面发挥了重要的调控作用。拟南芥中SR1基因功能缺失突变体具有组成性抗病的表型，如生长受到抑制、叶片黄化并带自发坏死斑点、抗病相关基因PR1等的组成性表达和抗病性显著增强等。水稻中CAMTA/SR的同源基因OsCBT在植物对病原菌的防卫反应中也发挥相似的功能。OsCBT功能缺失突变体生长受到明显抑制，但对水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)和稻瘟菌(Magnaporthe grisea)的抗性增强，表明OsCBT也是植物防卫反应的一个负调控因子。然而，关于CAMTA基因在木薯中的功能研究尚未见报道。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的是在于提供了一种木薯CAMTA基因，以及增强植物对Xam等病原菌抗性的木薯MeCAMTA基因表达沉默体系，该基因的沉默可以增强植物对病害的抗性，应用于抗性育种。
为了完成上述目的，本发明采用如下技术方案：一种木薯CAMTA基因，其CDS的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No.1所示。
一种木薯CAMTA基因沉默体系，其包含在VIGS沉默载体上插入SEQ ID No.1所示的核苷酸序列5’端1-600bp片段得到的重组载体。
进一步优选地，如上所述的木薯CAMTA基因沉默体系，其中的VIGS沉默载体为烟草脆裂病毒TRV2载体。
另外，本发明还提供了一种用于TRV介导的基因沉默体系中的基因载体的构建方法，该方法的步骤如下：
(1)以CAMTA基因5’端1-600bp的基因片段作为病毒诱导基因沉默体系特异性核酸沉默片段，选用BamHI和SmaI酶切位点设计引物CAMTA-F和CAMTA-R；
(2)以华南124号木薯cDNA为模板进行PCR扩增，得到约600bp的PCR产物，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收目的片段，将目的片段连接到pEASY-Blunt3载体，转化到到大肠杆菌DH5α，涂布于含有氨苄抗性的LB固体培养基，培养后挑选单菌落进行PCR检测，将PCR检测的得到的阳性克隆菌液测序；
(3)测序比对正确后，提取pEASY-Blunt3-MeCAMTA质粒，用BamHI和SmaI酶切得到600bp目的片段，得到的片段胶回收后，4℃过夜连接到经同样双酶切线性化的空载体pTRV2上，转化到大肠杆菌DH5α中，涂布于含有卡纳抗性的LB固体培养基，培养后挑选单菌落进行PCR检测，将PCR检测的得到的阳性克隆提取质粒，用BamHI和SmaI酶切验证，得到pTRV2-MeCAMTA基因沉默载体。
进一步优选地，如上所述用于TRV介导的基因沉默体系中的基因载体的构建方法，其中步骤(1)中所述的CAMTA-F和CAMTA-R引物序列如下：
CAMTA-F：5’-CGCGGATCCATGGCTGGTCGCGGATCGTATGGA-3’
CAMTA-R：5’-TCCCCCGGGATTACTCTGCATTTGTGGTGACTC-3’。
由于木薯MeCAMTA基因的沉默显著增强了植物对病原菌Xam的抗性，因此本发明的另一个目的在于上述方法构建的pTRV2-MeCAMTA基因沉默载体在木薯抗病害中的应用。具体地，将转有pTRV2-MeCAMTA基因沉默载体的农杆菌菌液注射在木薯叶片背面。所述的病害为木薯细菌性萎蔫病。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：
(1)通过克隆该基因，运用分子生物学及基因工程技术证实了抑制该基因表达可以有效增强木薯植株对病原菌Xam抗性的功能。通过沉默该基因，可以获得瞬时抗病性增强的木薯材料，为实现抗性分子育种提供新的参考。
(2)通过构建该基因的沉默表达载体(pTRV-MeCAMTA)，能快速高效地对MeCAMTA基因进行沉默，即pTRV-MeCAMTA注射木薯叶片后，可获得有效的瞬时MeCAMTA基因沉默木薯，为研究基因功能提供了一个有效的方法。
(3)在VIGS体系建立完成的木薯叶片上侵染病原菌Xam，通过比较MeCAMTA基因沉默表达木薯与对照组木薯的抗病性，发现pTRV-MeCAMTA基因沉默的木薯在病原菌Xam侵染后叶片的细菌数目比华南124号木薯的少20％左右。
附图说明
图1：VIGS植株中MeCAMTA基因的表达。
图2：MeCAMTA基因沉默的木薯中细菌性枯萎病的细菌数目统计。
图3：MeCAMTA基因沉默的木薯接种细菌性枯萎病后的表型。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做出更详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征。并且，在不偏离本发明精神和范围的前提下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例1：木薯MeCAMTA基因表达沉默载体的构建
(1)木薯MeCAMTA基因5’端1-600bp的特异性核酸沉默片段的克隆：
取适量华南124号木薯叶片置于经液氮冷却后的研钵中，加适量液氮，将木薯叶片研磨成细粉状，参照RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书(购自天根生化有限公司，以下相同)，提取木薯总RNA。用蛋白检测仪(DM 650BECKMAN，MSA)分别测定RNA在260纳米和280纳米光吸收值以及RNA浓度，并用1.5％(质量体积比)琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度。根据反转录试剂盒(购自Thermo Fermentas，以下相同)说明书，将RNA反转录为cDNA置于-40℃冰箱保存备用。
通过设计引物，我们首次克隆获得了木薯MeCAMTA基因的全长序列，MeCAMTA编码区CDS(coding sequence)碱基序列如SEQ ID NO：1所示，以CAMTA基因5’端1-600bp的基因片段作为病毒诱导基因沉默体系特异性核酸沉默片段，选用BamHI和SmaI酶切位点设计引物CAMTA-F(CGCGGATCCATGGCTGGTCGCGGATCGTATGGA)和CAMTA-R(TCCCCCGGGATTACTCTGCATTTGTGGTGACTC)，以木薯叶片的cDNA为模版，进行PCR扩增，用DNA纯化回收试剂盒(购自天根生化有限公司，以下相同)回收并纯化扩增的PCR产物。PCR反应体系为：5×TransStratFastPfu Buffer、2.5mM dNTPs 4μL、TransStrat FastPfu DNA Polymerase(购自全式金生物技术有限公司)1μL、CAMTA-F 1μL、CAMTA-R 1μL，加无菌水至50μL。反应程序为：95℃变性3min，95℃30s、55℃30s、72℃1min 32循环，72℃延伸10min(以下相同)。
(2)pTRV2-MeCAMTA基因沉默载体的构建：
将回收得到的目的片段按以下体系连接到克隆载体pEASY-Blunt3：目的基因DNA片段3μL和0.6μL的-Blunt3 Cloning Vector，短暂离心混匀，置于37℃水浴锅中反应30min，转化到大肠杆菌DH5a，涂布于含有氨苄抗性的LB固体培养基(配方如下：称取10g胰蛋白胨，5g酵母提取物和10g氯化钠，定容于1000毫升，分装于200mL三角瓶中，固体培养基中加入2％的琼脂，121℃，6.859×104Pa下高压灭菌20分钟。4℃冷藏备用，以下相同)，37℃过夜培养，挑选单菌落进行PCR检测，挑选能够扩增出目的大小的条带的对应的阳性单克隆菌落稀释液，加入含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，200rpm，37℃摇床培养过夜。取300μL过夜培养的菌液送往华大基因公司测序，将剩余菌液保存备用。测序比对正确得到克隆载体pEASY-Blunt3-MeCAMTA，根据质粒提取试剂盒(购自天根生化有限公司，以下相同)提取pEASY-Blunt3-MeCAMTA质粒和空载体pTRV2质粒，用BamHI和SmaI酶切pEASY-Blunt3-MeCAMTA质粒和空载体pTRV2，37℃条件下反应30min，PCR检测后，回收目的片段和线性化的pTRV2载体。在1.5ml离心管中加入目的片段7μL，载体片段1μL，Buffer 1μL，T4DNA Ligase(购自Thermo Fisher Scientific)1μL在4℃条件下过夜连接，用冻融法转化到大肠杆菌DH5α中，涂布于含有卡纳抗性的LB固体培养基上，37℃过夜培养，挑取单菌落进行PCR检测。PCR检测的得到的阳性克隆提取质粒，用BamHI和SmaI酶切验证，验证正确的质粒命名为pTRV2-MeCAMTA，即为MeCAMTA基因的沉默表达载体。
(3)pTRV2-MeCAMTA质粒和空载体转化根癌农杆菌菌株GV3101
取构建好的pTRV2-MeCAMTA基因沉默表达载体质粒和空载体pTRV2质粒各10μL分别加到干净的离心管中，每管加入30μL农杆菌感受态GV3101(Yang LX，Wang RY，Ren F，LiuJ，Cheng J，Lu YT(2005)AtGLB1 enhances the tolerance of Arabidopsis to hydrogenperoxide stress.Plant Cell Physiol 46：1309-1316.)，轻轻混匀，用冻融法转化到含有三种抗性(利福平、庆大霉素、卡那霉素)的固体LB培养基上，置于28℃培养箱培养2天左右，挑取单菌落PCR鉴定(前面已述)。
实施例2：pTRV2-MeCAMTA基因沉默表达载体在木薯抗病中的应用
(1)木薯材料准备：
A.选种：应选择适应性良好、丰产性好的品种，选择华南124进行种植。一般选择木薯茎干充分成熟、木栓化、茎粗节密、表皮及腋芽完整、芽眼粗大明显、无病虫害、无破损、新鲜、坚实的主茎中下段为好。应避免选用老茎和嫩茎。
B.催芽：下种前，将茎用利刀砍断，切口应保持平整，不使表皮脱离并且不损伤腋芽，每段长13～20cm，留有3～5个强壮腋芽。将选用的茎干腋芽朝上，底端浸入水中1～2cm，保证底端湿润，放置3～4天至冒出新芽。
C.育苗：选口径20cm、高10cm，底部漏3个小孔的白色育苗钵进行育苗。营养土与蛭石按1∶1比例混匀，每盆直插放入一段茎干，且腋芽朝上，淋透水，保持湿润，育苗房温度保持在27℃左右，阴凉。种植在2～4月进行，以春分-清明前后为宜。
D.苗期管理：育苗初期保持土壤湿润，合理增施肥料。在幼苗时期，及时查苗补缺，对补种后出的幼苗，要及时进行追肥，确保苗齐健壮，保证有效的株数，以免影响产量。苗高20～30cm时，及时除草，确保苗的质量。
(2)木薯中VIGS体系的建立
利用VIGS技术在木薯中对特定基因进行诱导沉默研究其抗病性，选择长势一致的华南124号木薯进行处理。将转有pTRV2-MeCAMTA表达载体、对照pTRV2空载和含有pTRV1质粒的农杆菌菌液加入到含有三种抗性(利福平、庆大霉素、卡那霉素)的5ml LB液体培养基中，于200rpm、28℃过夜培养。向过夜培养的菌液中加入20ml新的含有三种抗性(利福平、庆大霉素、卡那霉素)的LB培养基中继续培养至OD600为0.6左右。将菌液4000rpm离心10min，去上清，用渗透液(终浓度为10mmol/L MgCl2，10mmol/L的pH为5.6的MES缓冲液和200μmol/L乙酰丁香酮)重新悬浮菌体，将悬浮菌体调至OD600值为0.6左右。将含有pTRV1质粒的农杆菌菌液分别与pTRV2-MeCAMTA-GV3101、pTRV2空载的GV3101农杆菌菌液等量混合。用注射器针头轻柔地摩擦木薯叶的背部，用注射器吸取菌液注射，当天注意保湿，置于室温下继续培养。分别设置实验组和对照组各三个重复。
(3)VIGS体系的检测
为了鉴定转入目的基因的农杆菌侵染木薯后是否成功沉默了该目的基因，建立了VIGS体系。设计MeCAMTA基因定量引物QMeCAMTA-F和QMeCAMTA-R，在注射木薯叶片第14天取样提取植物的总RNA，然后反转录成cDNA(前面已述)。根据TransStart Tip Green qPCRSuperMix(购自全氏金公司)试剂使用说明操作，以未注射菌液的木薯叶片cDNA为模板进行实时荧光定量PCR反应，反应体系为如下：SuperMix 7.5μL，qPCR Forward Primer 0.4μL，qPCR Reverse Primer 0.4μL，cDNA 1μL，ddH2O5.7μL。使用罗氏定量PCR仪进行qRT-PCR。所有样品设置3次重复，以MeEFla内参基因为对照，将实验所得数据以2-ΔΔCT计算分析MeCAMTA基因的相对表达量。根据定量的数据以2-ΔΔCT计算分析MeCAMTA基因的相对表达量。确认MeCAMTA基因是否沉默。在VIGS体系中的MeCAMTA基因被沉默，相对表达量为0.2(请见图1)。
(4)Xam的侵染
将的Xam菌液的母液加到10mL LB液体培养基中，28℃摇床中培养12h。吸取3mL菌液加到新的LB液体培养基中继续培养，培养至OD600为0.6左右。用终浓度10mM的MgCl2溶液稀释至OD600为0.8左右。使用一次性的注射器吸取稀释的Xam菌液注射分别建立了VIGS体系木薯的叶片，当天注意保湿，然后将注射的木薯置于温室中继续培养。
(5)Xam细菌数目统计
在0d、6d时，使用打孔器取注射过Xam的木薯叶片，每个处理每次取样取4个叶圆盘，70％酒精消毒3min采用无菌水漂洗2min，连续漂洗2次，将叶圆盘加水磨碎。在无菌操作台中用无菌水将研磨叶中的菌稀释至103至108倍，吸取不同梯度浓度的菌液点在LB平板上，每个梯度重复3次，每次吸取10μL。将平板密封好，放置28℃恒温培养箱倒置培养16h左右，统计每个样品的细菌数目。Xam细菌数目随时间变化不断增加，MeCAMTA基因沉默木薯细菌数目显著低于对照组(请见图2)。
(6)叶片表型变化
接种Xam后，在第6天观察木薯植株叶片表型变化，并拍照记录。MeCAMTA基因沉默木薯病斑面积明显小于对照组(请见图3)。

Claims (8)

1.一种木薯CAMTA基因，其CDS的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种木薯CAMTA基因沉默体系，其特征在于，包含在VIGS沉默载体上插入SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列5’端1-600bp片段得到的重组载体。
3.根据权利要求2所述的木薯CAMTA基因沉默体系，其特征在于，所述的VIGS沉默载体为烟草脆裂病毒TRV2载体。
4.一种用于TRV介导的基因沉默体系中的基因载体的构建方法，其特征在于，该方法的步骤如下：
(1)以CAMTA基因5’端1-600bp的基因片段作为病毒诱导基因沉默体系特异性核酸沉默片段，选用BamHI和SmaI酶切位点设计引物CAMTA-F和CAMTA-R；
(2)以华南124号木薯cDNA为模板进行PCR扩增，得到约600bp的PCR产物，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收目的片段，将目的片段连接到pEASY-Blunt3载体，转化到到大肠杆菌DH5a，涂布于含有氨苄抗性的LB固体培养基，培养后挑选单菌落进行PCR检测，将PCR检测的得到的阳性克隆菌液测序；
(3)测序比对正确后，提取pEASY-Blunt3-MeCAMTA质粒，用BamHI和SmaI酶切得到600bp目的片段，得到的片段胶回收后，4℃过夜连接到经同样双酶切线性化的空载体pTRV2上，转化到大肠杆菌DH5α中，涂布于含有卡纳抗性的LB固体培养基，培养后挑选单菌落进行PCR检测，将PCR检测的得到的阳性克隆提取质粒，用BamHI和SmaI酶切验证，得到pTRV2-MeCAMTA基因沉默载体。
5.根据权利要求4所述用于TRV介导的基因沉默体系中的基因载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述的CAMTA-F和CAMTA-R引物序列如下：
CAMTA-F：5’-CGCGGATCCATGGCTGGTCGCGGATCGTATGGA-3’
CAMTA-R：5’-TCCCCCGGGATTACTCTGCATTTGTGGTGACTC-3’。
6.权利要求2所述方法构建的pTRV2-MeCAMTA基因沉默载体在木薯抗病害中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将转有pTRV2-MeCAMTA基因沉默载体的农杆菌菌液注射在木薯叶片背面。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的病害为木薯细菌性萎蔫病。
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