CN103695422A

CN103695422A - 水稻根尖特异表达启动子Pro-Os04g24469及其应用

Info

Publication number: CN103695422A
Application number: CN201310654853.2A
Authority: CN
Inventors: 王芳; 邓敏娟; 徐磊; 赵红玉; 易可可
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-12-05
Filing date: 2013-12-05
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2033-12-05
Also published as: CN103695422B

Abstract

本发明涉及一种水稻根尖特异表达启动子Pro-Os04g24469及其应用，该启动子具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或由该序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸衍生的且有同等功能核苷酸序列。本发明还提供含有上述启动子的载体、转基因细胞系以及工程菌。提供含有上述启动子的转基因株系。提供水稻根特异表达启动子Pro-Os04g24469在调控下游基因表达中的应用。本发明有益的效果是：本发明首次提出一个新的能够在水稻根尖特异表达启动子，为后续进一步分析根特异表达的顺式作用元件奠定了基础，还可以为植物根系发育与根构型的改造重建，以及植物抗逆基因工程与遗传改良研究提供新的启动子元件。

Description

水稻根尖特异表达启动子Pro-Os04g24469及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，主要是一种水稻根尖特异表达启动子Pro-Os04g24469及其应用。

背景技术

启动子是参与特定基因转录及其调控的DNA序列。它决定了一个基因是否表达、何时表达以及何处表达。按作用方式和功能，启动子可分成组成型启动子、特异型启动子和诱导型启动子三类。在植物基因工程中，人们利用具有不同表达调控水平的启动子来启动目标基因的表达。例如来源于玉米的Ubiqutin和水稻的Actin启动子，能够调控目的基因在根、叶中强烈表达，是植物转基因中被广泛使用的启动子。虽然组成型启动子能驱动目标基因在植物中非特异性地高效表达，但往往造成植株大量积累异源蛋白，打破原有代谢平衡，过分消耗植株能量，因而得不到所预期的表型。因此，选择一些能在组织、器官以及发育各阶段特异的启动子，使目标基因只在特定组织或特定时期表达，对于基因功能研究、作物性状改良有重要的意义。

根系是植物吸收水分和养分的主要器官，并可运输和储存营养物质。根系能够分泌抗病虫的物质来增强植物对各种病原微生物的抵抗力，优良的根系构型也能够在各种非生物胁迫条件下提高植物的耐受力来维持地上部分的正常生长。因此研究根特异型启动子具有广泛而实际的应用价值。利用根特异型启动子来改善植物根的生长和增加根际分泌物，从而实现对污染土壤的生物修复和提高植物的耐盐抗旱能力；同时，利用根特异型启动子研究植物根的发育和根系的形态建成并进行作物遗传改良和新品种培育具有重要意义。

目前在植物中，特别是在水稻等禾谷科作物中使用的根特异型启动子并不多。用根特异启动子RCc3驱动OsNAC10在水稻中的表达后，能增强水稻在干旱胁迫下的耐受力和作物产量（Jin Seo Jeong,Youn ShicKim,Kwang Hun Baek,Harin Jung,Sun-Hwa Ha,Yang Do Choi,Minkyun Kim,Christophe Reuzeau andJu-Kon Kim.Root-specific expression of OsNAC10improves drought tolerance and grain yield in rice under fielddrought conditions.Plant Physiol.2010153:185-197）。由此可见，发展更多的水稻等禾谷科作物的根特异型启动子对基础性研究和遗传改良应用都具有重要意义。关于水稻Os04g24469启动子调控外源基因根特异表达及应用目前还未见相关报道。

发明内容

本发明要解决上述现有技术的缺点，提供一种水稻根尖特异表达启动子Pro-Os04g24469及其应用，具体地说，涉及一个水稻根尖特异表达启动子Pro-Os04g24469及其驱动目标基因在转基因水稻的根中特异表达，以及该启动子在基因工程及遗传改良中的应用。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：为了实现本发明目的，本发明的水稻特异表达启动子Pro-Os04g24469，其具有：i）SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或ii）SEQ ID NO：1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由i）衍生的核苷酸序列。

本发明还提供含有上述启动子的载体、含有上述启动子的转基因细胞系以及含有上述启动子的工程菌。

本发明还提供含有上述启动子的转基因株系。

本发明还提供水稻根特异表达启动子Pro-Os04g24469在调控下游基因表达中的应用，优选下游基因为GUS基因、GFP基因、LUC基因等报告基因，或CKX基因、OsNAC10基因等目标基因。所述启动子与目标基因融合，转化到植物细胞或组织中，并将所述植物细胞或组织培育成植株，实现目标基因在植物根尖中特异性表达。

将水稻基因Os04g24469的起始密码子ATG上游1.221kb序列扩增后，连接到GUS表达载体上，进行水稻的转化研究，并用GUS显示底物x-gluc对转基因植株染色，观察根部位的着色情况。

本发明有益的效果是：本发明首次提出一个新的能够在水稻根尖特异表达启动子，该启动子适用于启动目标基因在水稻根部的特异性表达。由于该启动子的特异性很强，因此为后续进一步分析根特异表达的顺式作用元件奠定了基础，同时还可以为植物根系发育与根构型的改造重建，以及植物抗逆基因工程与遗传改良研究提供新的启动子元件。

附图说明

图1为real-time PCR方法检测基因在水稻叶片、根部和幼穗中的表达水平；叶片（Leaf），根（Root），幼穗（Spiklet）。

图2为本发明实施例2中构建的Pro-Os04g24469载体图谱；

图3为本发明实施例2中转基因水稻不同组织器官的染色结果；其中，A为主根尖染色结果，B为侧根尖染色结果，C为叶片染色结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：

以下实施例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行或按照制造生产厂商的使用说明。

实施例1：Os04g24469基因在水稻不同组织中的表达分析

1.1水稻总RNA样品制备

分别取生长15天水稻幼苗的根部和叶片，于液氮速冻保存；取水稻开始抽穗时约2厘米长度的幼穗，快速保存于液氮。将水稻各组织样品用液氮充分研磨后，使用植物RNA抽提试剂盒（QIAGEN公司）分别提取样品的总RNA。用NanoDrop ND-1000核酸检测仪测量RNA样品的浓度及质量。

1.2第一链cDNA的合成

取上述RNA样品各2.5μg，按Invitrogen公司提供的

第一链合成系统先加入1μl10mMdNTP和1μl Oligo(dT)20，加水补足体积到10μl，于65℃温育5分钟后，立即放置冰上冷却。然后依次添加2μl10X RT buffer，4μl25mM MgCl₂，2μl0.1M DTT，1μl RNaseOUT和1μl在50℃温育50分钟，85℃加热5分钟终止反应。

1.3real-time PCR分析

根据基因Os04g24469的序列设计特异性引物4qF：5’-ACAAGTCCGGCGACTCCT-3’；4qR：5’-TTCCGGTAGAAAGAGCTCCA-3’用于定量PCR。设计水稻Actin基因的特异性引物AqF：5’-TCAGCAACTGGGATGATATGGAG-3’；AqR：5’-GCCGTTGTGGTGAATGAGTAAC-3’，作为内参基因。使用

480定量PCR仪（Roche公司），每一个PCR设置三次重复。反应体系包含5μl SYBRGreen I Master，正反向引物各0.1μl，各种cDNA模板1μl，加水补足体积至10μl。反应程序为：95℃5分钟，95℃10秒，60℃10秒，72℃15秒，40个循环后添加PCR产物熔解曲线分析。

通过Roche LightCycler480SW1.5.0软件分析采集到Ct值后，输入EXCEL表格，采用2^-⊿⊿Ct方法作数据分析。通过Actin基因均一化后，以叶片的表达量设为1，绘制表达差异柱状图。从图1中可以看出，根中的表达量极高，而在幼穗中几乎没有表达。

实施例2：水稻根尖特异表达启动子Pro-Os04g24469的克隆

2.1生物材料

2.1.1植物材料

水稻转基因受体材料为粳稻日本晴

2.1.2菌株和载体

使用的农杆菌菌株为EHA105，载体为pCAMBIA1300。

2.2方法

2.2.1水稻根尖特异表达启动子Pro-Os04g24469的克隆

以水稻日本晴叶片为材料，用植物基因组提取试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）提取水稻总DNA。按照水稻数据库网站（http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml）公布的水稻Os04g24469基因组序列，设计其上游启动子序列的PCR扩增引物，并分别在两条引物的5’端添加酶切位点序列和保护碱基。引物序列分别为：pro-F：5’-TGCTCTAGATTCAATTCTCTTTTAAGATTTA-3’；pro-R：5’-CGCGGATCCCTCTCGATCGATCGATCTATTA-3’。PCR扩增体系为：PCR反应缓冲液25μl，dNTP4μl，ddH2O17.5μl，KOD聚合酶（TOYOBO公司）0.5μl。反应程序为热启动95℃20秒，60℃20秒，72℃1.5分钟，30个循环后72℃延伸10分钟。PCR结束后，用凝胶回收试剂盒（QIAGEN公司）回收PCR产物，然后用XbaI、BamHI（NEB公司）双酶切回收的PCR产物。

2.2.2水稻根尖特异表达启动子Pro-Os04g24469-GUS载体的构建

通过XbaI和BamHI（NEB公司）双酶切将载体pCAMBIA1300线性化。酶切反应结束后，用凝胶回收试剂盒（QIAGEN公司）回收酶切产物。

用T4DNA连接酶（NEB公司）连接载体与目的片段。将连接反应体系直接转化大肠杆菌DH5感受态细胞，并对重组质粒进行测序，所构建的Pro-Os04g24469-GUS载体图谱如图2所示。

2.2.3转基因水稻的获得

选取成熟饱满的日本晴种子脱壳后，经消毒滤干后接种到愈伤诱导培养基上进行诱导培养。选择外观颜色嫩黄、生长良好的颗粒状愈伤组织用于遗传转化。采用农杆菌介导法将Pro-Os04g24469-GUS转入水稻愈伤组织中，用含有乙酰丁香酮和OD600为0.5的农杆菌的AAM转化液进行浸泡，将浸泡过的愈伤组织转至共培养基上暗培养3天。然后转移至选择培养基上培养，每10天继代一次。30天后将筛选出的抗性愈伤转至分化培养基上分化培养40天。将分化出的绿色小苗移至生根培养基上生根并进行炼苗。当幼苗长至10cm高时，取出幼苗并用无菌水洗净根部附着的固体培养基。

培养基配制如下：

诱导培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+2.0mg/L2,4-D+0.5g/L L-谷氨酰胺+2.8g/L L-脯氨酸+0.3g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，pH调至5.8后加入植物凝胶4g/L。

共培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+2.0mg/L2,4-D+0.5g/L L-谷氨酰胺+2.8g/L L-脯氨酸+0.6g/L水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L蔗糖，pH调至5.2后加入植物凝胶4g/L。灭菌后，加入乙酰丁香酮200μmol/L。

选择培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+2.0mg/L2,4-D+0.5g/L L-谷氨酰胺+2.8g/L L-脯氨酸+0.6g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，pH调至5.8后加入植物凝胶4g/L。灭菌后加入30mg/L潮霉素和400mg/L头孢。

分化培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+0.5g/L L-谷氨酰胺+0.5g/L L-脯氨酸+1g/L水解酪蛋白+3.0mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+20g/L山梨醇，pH调至5.8后加入植物凝胶4g/L。

实施例3：水稻根尖特异表达启动子Pro-Os04g24469调控报告基因GUS的表达

GUS组织化学染色及显微观察

取生长7天的转基因水稻的根部和叶片材料，浸泡在含GUS显示底物x-gluc的染色液中，于黑暗下37℃保温2-4小时后拍照。结果如图3所示，只在水稻主根根尖和侧根根尖部位出现特异染色，而根的其他部位和叶片都未染色，表明Pro-Os04g24469启动子能调控目的基因只在水稻根尖表达，且特异性很强。GUS染色液配方为：100mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0），5mmol/L EDTA，0.5mmol/L铁氰化钾，0.5mmol/L亚铁氰化钾，0.5%Triton X-100，0.2mg/L X-gluc，以水配制。

Claims

1.一种水稻根尖特异表达启动子Pro-Os04g24469，其特征在于：该DNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种表达载体，其特征在于：含有权利要求1的DNA核苷酸序列。

3.一种转基因细胞系，其特征在于：含有权利要求1的DNA核苷酸序列。

4.一种工程菌，其特征在于：含有权利要求1的DNA核苷酸序列。

5.根据权利要求1所述的水稻根尖特异表达启动子Pro-Os04g24469在调控下游基因表达中的应用。

6.根据权利要求5所述的水稻根尖特异表达启动子Pro-Os04g24469在调控下游基因表达中的应用，其特征在于：所述启动子与目标基因融合，转化到植物细胞或组织中，并将所述植物细胞或组织培育成植株，实现目标基因在植物根尖中特异性表达。