CN102154298A - 水稻根特异启动子Os02g37190及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻调控外源基因在根中特异表达的Os02g37190启动子，为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明的Os02g37190启动子的用途，用于构建根特异表达的转基因植物载体。本发明还提供了一种转基因植物细胞，其为包含本发明所示的启动子序列的转基因植物细胞。

Description

水稻根特异启动子Os02g37190及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，本发明涉及水稻Os02g37190基因的启动子序列，即从该基因ATG开始上游-1——-3500bp之间的核苷酸序列，该启动子序列能够在水稻转基因调控体系中驱动目标基因在根中特异表达。发明还涉及该序列在基因工程及遗传改良中的应用。

背景技术

植物基因工程技术的成功应用不仅需要大量调控不同水平的启动子，而且需要适合于不同植物背景、不同的器官、组织、转基因类型的启动子以避免在转基因过程中的不利影响。一直以来，非植物内源的组成型启动子，来自于花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)CaMV 35S(Odell et al.，1985)有着重要的利用价值，能驱动目的基因在单、双子叶转基因植物的所有组织中高效表达(Battraw and Hall，1990；Benfey et al.，1990a)。植物内源的组成型的启动子ZmUbi1是另一个在植物转基因中被广泛使用的启动子，它来自于玉米泛素，是植物内源启动子。研究还发现，ZmUbi1启动子在单子叶植物许多的细胞中都有很高的活性，能够调控目的基因在根、叶中强烈表达，但表达水平随着器官的成熟显著下降(Cornejo et al.，1993)。

但是，由于组成型启动子驱动的基因在植物的不同组织、不同生长阶段均有高水平的表达，在应用中逐渐暴露出一些问题(Napoli et al.，1990)。外源基因在植物体内大量表达产生许多的异源蛋白或者产生有害物质在植物体内积累，打破了植物体内原有的代谢平衡，影响了植物正常的生长发育，例如生长延缓、开花延迟、甚至造成植物不育或死亡(Pino et al.，2007)。另外，在同一个载体中同时驱动几个不同的基因表达而重复使用同一个组成型启动子容易造成同源基因的沉默与失活或者共抑制现象(Lessard et al.，2002；Potenza et al.，2004)。因此，寻找一些能在细胞、组织、器官以及发育各阶段上更为专一地调控基因表达的启动子进行遗传载体的构建，在可控的条件下为基础研究和作物改良创造所需性状显得尤为必要。组织特异性启动子调控基因只在特定的器官、组织、细胞及不同的发育阶段表达，因而可以用于以茎叶为主要收获产物的作物，使蛋白质产物富集于茎叶中，减少宿主植物无谓的物质能量消耗，改善光合作用特性；也可以用于以种子、果实为主要收获产物的作物，让抗虫、抗除草剂等外源基因只在茎叶部分而不在种子果实等器官中表达，以提高转基因作物的生物安全性(Dale et al.，2002)，在植物基因工程研究中具有广泛的应用前景。

目前，大多数组织特异启动子的研究主要集中在植物的地上部分，根特异启动子的研究及应用还很少(Potenza et al.，2004)。然而，根与土壤的广泛接触，是植物进行营养、运输、储存等生理功能的重要器官，因此根特异启动子的研究具有广泛的应用价值。利用根特异启动子可以进行土壤污染的生物修复，提高植物的抗旱能力和对盐、碱的耐受力，大量和微量元素的高效吸收以及增强对病原微生物的抵抗力等；同时，利用根特异启动子研究植物根的发育，根系的形态建成和根构型的重建并进行作物的遗传改良具有重要意义。

植物内源的根特异启动子被开发应用之前，非植物内源的的根特异启动子rolD在根特异表达的转基因研究中发挥着重要作用。发根农杆菌含有Ri质粒，侵染植物后能诱发植物细胞产生毛发状根，即发根瘤。农杆碱型Ri质粒的T-DNA是由左、右两个片段组成，rolD位于TL-DNA上。rolD5′端-426bp～-373bp显示出根特异和高水平的表达。序列分析显示启动子区存在一个根特异的基序(RSEs)(Keller and Baumgartner，1991；Elmayan and Tepfer，1995)。rolD启动子现已用于氮的同化研究，包括根特异的胞质型谷氨酰胺合成酶基因和高亲和硝酸盐转运体基因的超表达(Fei et al.，2003；Fraisier et al.，2000)。另一个非植物来源的根特异启动子是CaMV 35S上游-90bp Domain A(Benfey and Chua，1989)但表达水平比rolD低5-10倍，主要在根尖表达(Elmayan and Tepfer，1995)。

长期以来，烟草根特异表达基因TobRB7在根特异表达的植物转基因研究中起着重要作用，实验显示在主根的顶端分生组织、不成熟的维管组织和侧根中表达很高，而在成熟的叶、茎、茎尖分生组织中没有表达(Conkling et al.，1990)。TobRB7转录起始位点上游636bp序列分析显示其足够调控目的基因在根中特异表达，而299bp长的区域不能调控目的基因在根里特异表达，在-813bp～-636bp存在一个负调控元件(Yamamoto et al.，1991)。随着研究的深入，相继报道了一些植物根特异的启动子(Xu et al.，1995；Schünmann et al，2004；delCampillo，2004；Koyama et al.，2005；Nitz et al.，2001；Vijaybhaskar et al.，2008；Liu et al.，2003；Winicov et al.，2004)，然而，能够在基因工程遗传改良和农业生产中应用的仍然很少。直到最近，编码拟南芥根特异表达的黑芥子酶(myrosinase)的PYK10启动子(Nitz et al.，2001)调控CKX3在拟南芥根中特异表达，与野生型材料相比，转基因植株形成了庞大的根系，主根伸长，根生物量增加，植株地下部与地下部比率加大，而地上部未受任何影响，提高了作物抗旱及吸引矿物质的能力(Werner et al.，2010)。另外，用根特异启动子RCc3(Xu et al.，1995)与组成型启动子GOS2调控OsNAC10在水稻中过表达研究发现，与GOS2：OsNAC10相比，RCc3：OsNAC10使根变大，增强了对干旱的耐受性，在干旱条件下显著提高了作物的产量(Jeong et al.，2010)。综上所述，在植物中，特别是水稻等禾谷类作物基因工程遗传载体构建中能够选用的植物内源的根特异启动子仍然很少，因此，发展更多的水稻等禾谷类作物的根特异启动子对基础研究和生产应用具有重要的意义。

关于水稻Os02g37190启动子调控外源基因根特异表达及应用目前还未见相关报道。

文中所用的参考文献具体如下：

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11、Jeong JS，Kim YS，Baek KH，Jung H，Ha SH，Do Choi Y，Kim M，Reuzeau C，Kim JK(2010)Root-specific expression of OsNAC10 improves drought tolerance and grain yield in rice under field drought conditions.Plant Physiol 153：185-197(Jeong JS，Kim YS，Baek KH，Jung H，Ha SH，Do Choi Y，Kim M，Reuzeau C，Kim JK(2010).OsNAC10根特异的超表达改善了水稻在干旱条件下的耐受力和谷粒产量.植物生理学，153：185-197)。

12、Keller B，Baumgartner C(1991)Vascular-specific expression of the bean Grp-1.8 gene is negatively regulated.Plant Cell 3：1639-1646(Keller B，Baumgartner C(1991)豌豆Grp-1.8的维管束特异表达是由负调控元件调控的.植物细胞，3：1639-1646)。

13、Koyama T，Ono T，Shimizu M，Jinbo T，Mizuno R，Tomita K，Mitsukawa N，Kawazu T，Kimura T，Ohmiya K，Sakka K(2005)Promoter of Arabidopsis thaliana phosphate transporter gene drives root-specific expression of transgene in rice.J Biosci Bioeng 99：38-42(Koyama T，Ono T，Shimizu M，Jinbo T，Mizuno R，Tomita K，Mitsukawa N，Kawazu T，Kimura T，Ohmiya K，Sakka K(2005)拟南芥磷酸盐转运子的启动子在转基因水稻中驱动根特异的表达.生物科学与生物工程杂志，99：38-42)。

14、Lessard PA，Kulaveerasingam H，York GM，Strong A，Sinskey AJ(2002)Manipulating gene expression for the metabolic engineering of plants.Metab Eng 4：67-79(Lessard PA，Kulaveerasingam H，York GM，Strong A，Sinskey AJ(2002).植物代谢工程的基因表达调控.代谢工程，4：67-79)。

15、Liu JJ，Ekramoddoullah AK(2003)Root-specific expression of a western white pine PR10gene is mediated by different promoter regions in transgenic tobacco.Plant Mol Biol 52：103-120(Liu JJ，Ekramoddoullah AK(2003)西部白松PR10不同的启动子区域在转基因烟草中介导的根特异表达.植物分子生物学，52：103-120)。

16、Napoli C，Lemieux C，Jorgensen R(1990)lntroduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes

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19、Pino M-T，Skinner JS，Park E-J，Jekni Z，Hayes PM，Thomashow MF，Chen THH(2007)Use of a stress inducible promoter to drive ectopic AtCBF expression improves potato freezing tolerance while minimizing negative effects on tuber yield.Plant Biotech J 5：591-604(Pino M-T，Skinner JS，Park E-J，Jekni Z，Hayes PM，Thomashow MF，Chen THH(2007).压力诱导启动子驱动AtCBF异位表达在减少对马铃薯产量不利影响的同时改善了其对冻害的耐受力，植物生物技术杂志，5：591-604)。

20、Potenza C，Aleman L，Sengupta-Gopalan C(2004)Targeting transgene expression in research，agricultural，and environmental applications：promoters used in plant transformation.In Vitro Cell Dev Biol 40：1-22(Potenza C，Aleman L，Sengupta-Gopalan C(2004).在基础研究、农业及环境应用方面目标基因的表达调控：遗传转化中应用的启动子.体外细胞发育生物学，40：1-22)。

21、Schünmann PHD，Richardson AE，Smith FW，Delhaize E(2004)Characterization of promoter expression patterns derived from the Pht1 phosphae transporter genes of barley (Hordeum vulgare L.).J Exp Bot 55：855-865(Schünmann PHD，Richardson AE，Smith FW，Delhaize E(2004).大麦磷转运子Pht1启动子的表达分析.实验生物学杂志，55：855-865)。

22、Vijaybhaskar V，Subbiah V，Kaur J，Vijayakumari P，Siddiqi I(2008)Identification of a root-specific glycosyltransferase from Arabidopsis and characterization of its promoter.J.Biosci 33：185-193(Vijaybhaskar V，Subbiah V，Kaur J，Vijayakumari P，Siddiqi I(2008).拟南芥根特异的糖基转移酶基因的鉴定及启动子分析.生物科学杂志，33：185-193)

23、Werner T，Nehnevajova E，

I，Novák O，Strnad M，

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I，Novák O，Strnad M，

U，Schmülling T(2010).在拟南芥和烟草中根特异地减少细胞分裂素增强了根的发育、对干旱的耐受性及叶中矿物质的积累.植物细胞(online))。

24、Winicov I，Valliyodan B，Xue L，Hoober JK(2004)The MsPRP2 promoter enables strong heterologous gene expression in a root-specific manner and is enhanced by overexpression of Alfin 1.Planta 219：925-935(Winicov I，Valliyodan B，Xue L，Hoober JK(2004)MsPRP2启动子介导的根特异表达及过表达Alfin 1促进了MsPRP2对转录的调控.植物学，219：925-935)

25、Xu Y，Buchholz WG，DeRose RT，Hall TC(1995)Characterization of a rice gene family encoding root-specific proteins.Plant Mol Biol 27：237-248(Xu Y，Buchholz WG，DeRose RT，Hall TC(1995).一个编码水稻根特异蛋白的基因家族的分析.植物分子生物学，27：237-248)

26、Yamamoto YT，Taylor CG，Acedo GN，Cheng CL，Conkling MA(1991)Characterization of cis-acting sequences regulating root-specific gene expression in tobacco.Plant Cell 3：371-382(Yamamoto YT，Taylor CG，Acedo GN，Cheng CL，Conkling MA(1991).马铃薯根特异表达启动子的顺式作用元件分析.植物细胞，3：371-382)

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种水稻根特异启动子Os02g37190及其应用。

本发明的目的是提供一种从水稻根中克隆的Os02g27190启动子序列(ATG上游-1--3500bp)，如SEQ ID NO：1(即序列表中第1项序列)所示的启动子序列，也包括与SEQ IDNO：1所示的启动子序列至少有80％同源性的基因序列。另外，也包括在SEQ ID NO：1中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能达到本发明的目的。

本发明的另一个目的是提供一种用Os02g37190进行高效的植物转化的方法，具体地说，本发明提供了具有SEQ ID NO：1所示的序列的基因片段的载体。

本发明还提供了一种利用Os02g37190构建遗传载体达到植物根特异表达外源基因的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻调控外源基因在根中特异表达的Os2g37190启动子，为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

作为本发明的水稻调控外源基因在根中特异表达的Os02g37190启动子的改进：还包括在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。

本发明还同时提供了上述Os02g37190启动子的用途：用于构建根特异表达的转基因植物载体。

本发明还同时提供了一种转基因植物细胞，包含SEQ ID NO：1所示的启动子序列的转基因植物细胞。

本发明的具体内容如下：

从水稻基因芯片中发现了7个在水稻根中特异表达的基因，它们是Os09g24370，OsO4g44060，Os03g01700，Os02g44080，Os02g44310，Os03g01300，Os02g37190。根据TIGRE(http://rice.plantbiology.msu.edu/)注释，Os02g37190未知基因，位于2号染色体上，519nt，无内含子。

RT-PCR及qRT-PCR等实验显示，Os02g37190在水稻的叶和小穗中没有表达，在根中表达量很高，是水稻根特异表达基因。另外，在水稻根中mRNA表达丰度很高，与OsActin比较，他们的表达水平基本一致。因此，Os02g37190是水稻根特异表达基因，基因的表达水平很高。

通过将Os02g37190启动子(ATG上游-3500bp～-1bp)与报告基因GUSPlus融合进行遗传受体材料的转化研究，我们发现Os03g01700启动子调控下游报告基因在水稻的主根、侧根的表皮、皮层、内皮层、木质部、韧皮部及侧根原基发生的细胞中都有表达，但在根冠、根毛、根茎结合部、地上部分的茎、叶、颖壳、种子、雄蕊和雌蕊中没有表达。进一步说明了Os02g37190启动子能够调控目的基因在根中特异表达。

以上结果表明，我们克隆的水稻根特异启动子Os02g37190具有一定的应用价值。我们可以通过利用该启动子对作物品种进行转基因改造，如通过该启动子调控外源基因在根中的特异表达进行土壤污染的生物修复，提高植物的抗旱能力和对盐、碱的耐受力，大量和微量元素的高效吸收以及增强对病原微生物的抵抗力等；同时，利用根特异启动子研究植物根的发育，根系的形态建成和根构型的重建并进行作物的遗传改良。

附图说明

下面结合附图对理解本发明作进一步的详细描述，但并非对发明作限定。

图1是水稻根特异表达侯选基因在根、叶、花中的表达谱分析(RT-PCR分析)；

如图所示，Os09g24370(未知基因)，OsO4g44060(水通道PIP2.3基因)，Os03g01700(柠檬酸盐转运体)，Os02g44080(水通道TIP2.1)，Os02g44310(皮层细胞表达蛋白)，Os03g01300(皮层细胞表达蛋白)，Os02g37190(未知基因，表达蛋白)。图上显示Os02g37190在水稻的根中表达强烈，但在叶及花中没有表达。

图2是水稻根特异表达侯选基因在根、叶、花中的qRT-PCR分析；

结果显示Os02g37190为根特异表达基因。

图3是水稻根特异表达侯选基因与OsActin在根、叶、花中表达水平的比较；

显示Os02g37190在根与OsActin的表达水平很接近，为高水平表达，同时Os02g37190在叶和花中没有表达，说明这是一个根特异的高水平表达的基因。

图4是水稻根特异表达侯选基因与OsActin水稻根特异表达标准曲线；

结果显示OsActin的标准曲线的R²＝1；Os02g37190的标准曲线的R²＝0.9974；说明标准曲线线性较好。

图5是水稻根特异表达侯选基因在根、叶、花中的表达的绝对定量分析；

结果显示与植物中表达水平比较高的看家基因OsActin作为对照，根中Os03g37190的表达水平约为OsActin的21.5％；叶和花中均没有检测到Os02g37190的表达水平，这个结果充分说明Os02g37190为水稻根特异表达的基因。

图6是GUS plus载体示意图。

图7是水稻根特异表达基因Os02g37190驱动报告基因GUS载体Os02g37190promoter：GUS构建示意图。

图8是水稻根特异表达基因Os02g37190驱动报告基因GUS在水稻各组织中的表达分析；

显示Os02g37190 promoter：GUS在水稻的主根、侧根(图a)、根尖(图b)有强烈的GUS表达。将GUS染色的根尖进行树脂包埋，横切观察，在根的表皮(epidermis，Ep)、皮层(cortex，Co)、内皮层(endodermis，En)、木质部(xylem，X)、韧皮部(phloem，Ph)(图c)及侧根原基部位(lateral root primordium，LRP)(图d)均有GUS强烈表达。根毛(图a)、根冠(图b)、根茎结合部(图e)、地上部的颖壳(图f)、雄蕊和雌蕊(图g)、茎(图h)、叶(图i)、种子(图j、k)均没有GUS表达。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。

实施例1、根特异表达基因的筛选：

一、样品制备

挑选饱满的日本晴野生型水稻种子，剥壳用清水冲洗，后换成清水浸泡，于37℃浸种至露白(1-2天)，期间早晚换水。将发芽的种子直播于3L水稻全营养液中(pH值5.5)，水稻全营养液母液配方见(表1)，水稻全营养液的具体配制如下，即每4L培养液中加I-VI号贮备液各5ml，调节pH值至5.5。于水稻光温可控生长室(白天30℃，夜晚22℃，光强3000lux，光照时间12小时)中生长10天。对地上部和根部分别取样。另取于正常营养液生长至抽穗开花期水稻的小穗，用液氮冻存。所有样品均在-70℃保存以备RNA提取。

表1、水稻完全营养液的配方和母液配方(EDTA-Fe)

每4L培养液中加I-VI号贮备液各5ml，调节pH值至5.5。

二、RNA提取

RNA提取采用Gibico公司Trizol试剂抽提方法，操作步骤如下：

1)研钵和研棒用液氮预冷，取50～100mg组织用液氮充分研磨，加1ml Trizol(样品体积不能超过Trizol的10％)，继续研磨直至完全成为粉末，待融化成匀浆后转入离心管，室温下放置5分钟；

2)加入200l氯仿，剧烈摇荡15秒，室温放置2-3分钟，于4℃，15000g离心10分钟；

3)取上清，再加入等体积的氯仿，重复上述步骤；

4)取上清，加0.5ml(或等体积)异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟，于4℃，12000g离心10分钟；

5)弃上清液，用200ml枪头将沉淀块轻轻打碎，加1ml 75％乙醇(0.1％DEPC水配制)洗涤，于4℃，12000g离心5分钟；

6)弃上清液，重复步骤5，弃上清，室温或冷冻干燥；

7)用20-40lDEPC水或TE溶解RNA，于-70℃冻存。

8)用NanoDrop核酸蛋白测定仪ND-1000测其浓度及质量(260/280蛋白去除指标1.8～2.0；260/230盐分去除指标1.8～2.0)。

0.1％DEPC H₂O：取1ml DEPC水加入1L去离子水中混均，放置过夜后高压灭菌。75％乙醇：50ml DEPC水中加入118.5g无水乙醇。

三、逆转录

第一链cDNA合成采用Promega公司的M-MLV逆转录酶在进口的0.5mL离心管内混合下列试剂：

样品混匀后，短暂离心，70℃变性5min，迅速置于冰上冷却10min，短暂离心后，再向管内加入下列试剂：

用移液枪轻轻混匀样品，置于42℃空气浴中反应1小时后，将样品置于70℃处理15分钟终止反应，冰上冷却后，-20℃保存。

四、芯片杂交

芯片杂交实验所用到的材料为Nipponbre野生型材料。将材料浸种露白之后播种于正常营养液中，pH5.5，生长10天以后开始取材，地上部和地下部分开取材，设两个生物学重复。芯片杂交采用的是水稻基因芯片基因组阵列(Rice GeneChip Genome Array，http://www.affymatrix.com/products/arravs/specific/rice.affx)。该阵列包含57381个探针组合。RNA的纯化；cDNA的合成与纯化；芯片杂交与扫描以及芯片数据分析按照GeneTech Biotechnology有限公司(中国上海)的Affymetrix标准步骤进行(Affymetrix，2003)。

芯片扫描后的数据采用Affymetrix公司提供的基因芯片分析软件(GCOS 1.2)以及dChipsoftware进行标准化和统计分析。根据标准化后的均值来计算每个探针的表达变化。用t检验(one-way ANOVA t test)筛选差异显著基因。结果如表2显示，这些基因在水稻根中的信号值很高，在叶中很低，为根特异表达基因。为此，我们根特异表达基因的筛选范围集中在Os09g24370(未知基因)，OsO4g44060(水通道PIP2.3基因)，Os03g01700(柠檬酸盐转运体)，Os02g44080(水通道TIP2.1)，Os02g44310(皮层细胞表达蛋白)，Os03g01300(皮层细胞表达蛋白)，Os02g37190(未知基因，表达蛋白)。

表2、基因芯片筛选得到的水稻根特异表达基因

表2显示，筛选到的水稻根特异表达基因为Os09g24370(未知基因)，OsO4g44060(水通道PIP2.3基因)，Os03g01700(柠檬酸盐转运体)，Os02g44080(水通道TIP2.1)，Os02g44310(皮层细胞表达蛋白)，Os03g01300(皮层细胞表达蛋白)，Os02g37190(未知基因，表达蛋白)。

五、半定量RT-PCR

做半定量RT-PCR反应时，将模板稀释10倍后再用。各个样品的cDNA模板量先用OsActin基因的表达量调成一致，再扩增目的基因。侯选基因的RT-PCR引物(表3)。

RT-PCR的反应体系具体如下：

表3、侯选基因和OsACTIN的RT-PCR引物

结果如图1所示，Os09g24370，Os03g01700，Os03g01300，Os02g37190这四个基因在水稻植株的叶和小穗中均未有表达，但在根中表达比较强烈。

六、实时定量RT-PCR分析(水解探针UPL)

为了提高扩增的物异性，采用水解探针法进行定量检测，即除了特异引物外，还有能与目的基因完全匹配的探针参与扩增。当PCR扩增进行时，与目的基因结合的探针即被水解而发出能被检测的荧光，荧光强度与PCR产物的量成正比，并能排除用SYBR扩增时引物二聚体的干扰。做基因表达的相对定量时，用水稻看家基因OsActin在各个cDNA样品中的表达量作为衡量cDNA浓度的内参，样品间同一基因的相对表达量用以下公式计算：表达倍数＝2-Δ(ΔCp)，其中ΔCp＝同一样品目的基因的Cp值-OsActin的Cp值，Δ(ΔCp值)＝不同样品间ΔCp值的差值。假设PCR扩增效率均为2，扩增重复数为3。

本实验采用Roche公司的UPL(Universal Probe Library，定量PCR通用探针库)定量试剂盒进行检测。

PCR反应体系如下(5μl体系，384孔板)：

PCR反应条件为：95℃5min，95℃10sec，60℃20sec，72℃1sec，45个循环。反应结束冷却：40℃10sec。

根据RT-PCR结果，选取Os09g24370、Os03g1700、Os02g44310、Os02g37190将序列递交至UPL的在线分析设计中心http://www.universalprobelibrary.com，分析得到的特异引物序列和对应的UPL探针编号(表4)。

表4、侯选基因和OsACTINqRT-PCR引物序列及相应的UPL探针编号

为进一步确定根特异表达基因，我们用实时定量RT-PCR(水解探针UPL)分析了Os09g24370，Os03g01700，Os03g01300，Os02g37190这四个RT-PCR筛选的侯选基因，qRT-PCR结果(图2)说明这四个侯选基因均为水稻根特异表达基因。我们发现，侯选基因不但在根中特异表达，而且表达丰度很高，选取了侯选基因中的Os03g01700，Os02g37190与OsActin进行了表达丰度比较(图3)，发现这两个基因在根的表达与OsActin基本一致，表达强度很高，但在叶和小穗中与OsActin相反，没有检测到任何表达。

七、OsActin和Os02g37190质粒标准品的制备

用OsActin 385bp的RT-PCR引物(表3)，以水稻日本晴野生型根的cDNA为模板，扩增出OsActin的标准品片段，长度为385bp(序列信息参见TIGRE注释LOC_Os02g37190)。根据Os02g37190的cDNA序列，在其保守区分别设计引物如下：

Os02g37190  F：5’CGG CGA CTG CAA GCA CTA C 3’

R：5’CAC ACT CAT GGC CTA GCA AGC 3’

以水稻日本晴野生型根的cDNA为模板，扩增出Os02g37190的标准品片段，长度为294bp，分别连入pUCm-T载体(2773bp)，经测序鉴定正确后存于-20℃备用。

八、标准曲线的制备

测定OsActin和Os02g37190标准品质粒浓度，并分别进行8次10倍逐级稀释即(10¹、10²、10²、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸)，以稀释样品为模板，用OsActin和Os02g37190 UPL引物(见表4)进行实时定量RT-PCR(SYBR-Green1)，RT-PCR体系和反应条件同上文(六、实时定量RT-PCR)。根据结果用excel绘制标准曲线，结果见图4。

九、DNA拷贝数计算

分别以水稻日本晴根、叶、花的cDNA为模板，用OsActin和Os02g37190 UPL引物(表4)进行实时定量RT-PCR(SYBR-Green1)，RT-PCR体系和反应条件同上文(五、半定量RT-PCR)。根据结果对照标准曲线计算出cDNA(g/ul)。最后根据下列公式与反转录体系计算出DNA拷贝数(copies/ng)(Lee et al.，2008)。

$\mathrm{DNA}\left(\mathrm{copy}\right)=\frac{6.02\×{10}^{23}\left(\mathrm{copies}{\mathrm{mol}}^{-1}\right)\×\mathrm{DNAamount}\left(g\right)}{\mathrm{DNAlength}\left(\mathrm{bp}\right)\×660\left(g{\mathrm{mol}}^{-1}{\mathrm{bp}}^{-1}\right)}$

结果见图5和表5，显示以植物表达水平比较高的看家基因OsActin作为对照，在根中每微克RNA中OsActin为11135.97个分子，Os02g37190为2398.39个分子，Os03g01700的表达水平约为OsActin的21.5％；在叶中每微克RNA中OsActin为1168.73个分子，没有检测出Os02g37190的表达水平；在花中每微克RNA中OsActin为3913.2个分子，没有检测出Os02g37190的表达水平。以上结果充分说明Os02g37190为水稻根特异表达的基因。

表5、水稻根特异表达基因Os02g37190拷贝数计算结果

表5显示以植物表达水平比较高的看家基因OsActin作为对照，在根中每微克RNA中OsActin为11135.97个分子，Os02g37190为2398.39个分子；在叶中每微克RNA中OsActin为1168.73个分子，没有检测出Os02g37190的表达水平；在花中每微克RNA中OsActin为3913.2个分子，没有检测出Os02g37190的表达水平。以上结果充分说明Os02g37190为水稻根特异表达的基因。

实施例2，水稻根特异启动子Os02g37190调控GUS报告基因的表达分析

一、水稻根特异启动子融合GUS载体构建

按照水稻基因组序列(TIGRE)设计Os02g37190启动子引物，加酶切位点HindIII(小写字体所示)、BamHI(小写斜体字体所示)和保护碱基(下划线所示)。

Os02g37190-3.5Kb启动子引物

F：5’

aagcttTGACAATCCGCCGGAGTCGC-3’

R：5’-

ggatccCTGCATGCATATAGACGACA-3’，

以基因组DNA为模板用phusion超保真DNA聚合酶扩增出OsO2g37190启动子，全长3500bp，如SEQ ID NO：1所示。电泳回收后，用HindIII、BamHI双酶切回收的PCR产物连入HindIII、BamHI双酶切的GUS plus载体(图6)，得到表达载体Os02g37190 promoter：GUS。转化DH5α感受态细胞，涂含Kan(50μg/mL)的LB固体培养基，12h后挑取阳性克隆，用Os02g37190-3.5Kb启动子引物PCR(58℃，30秒；30个循环)和HindIII、BamHI酶切检测无误后测序验证序列的正确性，电击转入农杆菌EHA105感受态细胞内，涂含有Kan(50μg/mL)和链霉素的YEP(50μg/mL)固体培养基。48h后挑取阳性克隆经用Os02g37190-3.5Kb启动子引物PCR验证无误后，加入16％的甘油-70℃保存备用。

二、农杆菌(EHA105)介导的水稻遗传转化体系：主要应用Hiei等人(1994)报道的方法。载体为Os02g37190 promoter：GUS plus，遗传转化的受体材料为粳稻(Oryza.sative L.ssp japonica)品种Nipponbare)。导入的目的基因为Os02g37190 3.5Kb promoter：GUS plus。

三、GUS组织化学染色及显微观察

(1)、分别取生长10天的T2代转基因材料的根、茎、叶、花等各组织，将准备好的材料浸泡在GUS染液中(配方见表6)，于37℃保温1h。

表6、GUS染液配方

(2)、茎、叶、花绿色材料转入75％乙醇中脱色2-3次，到阴性对照材料呈白色。

(3)在LEICA MZ95体视镜下观察，用LEICA DC100摄像头拍照。

(4)分别取生长10天的T3代水稻转基因材料根部距根尖0.5cm处的根样本，长度为0.3-0.4cm，GUS染色后进行树脂包埋和超薄切片。包埋和切片步骤如下：

取材→GUS组织化学染色1h，37℃→30％丙酮洗1次(1h)→50％丙酮洗1次(1h)→70％丙酮洗1次(1h)→80％丙酮(1h)→90％丙酮(1h)→95％丙酮(1h)→100％丙酮洗4次(30min)→2/3丙酮+1/3Spurr′s树脂(2h)→1/2丙酮+1/2Spurr′s树脂(2h)→1/3丙酮+2/3Spurr′s树脂(2h)→纯树脂渗透过夜→包埋→聚合过夜(70℃恒温箱)→用Leica EMUC6超薄切片机切片(2-5μm)→展片→镜检→拍照。

结果见图8所示，显示Os03g01700 promoter：GUS在水稻的主根、侧根(图a)、根尖(图b)有强烈的GUS表达。将GUS染色的根尖进行树脂包埋，横切观察，在根的表皮(epidermis，Ep)、皮层(cortex，Co)、内皮层(endodermis，En)、木质部(xylem，X)、韧皮部(phloem，Ph)(图c)及侧根原基部位(lateral root primordium，LRP)(图d)均有GUS强烈表达。根毛(图a)、根冠(图b)、根茎结合部(图e)、地上部的颖壳(图f)、雄蕊和雌蕊(图g)、茎(图h)、叶(图i)、种子(图j、k)均没有GUS表达。

以上结果说明Os02g37190(-3500bp～0)启动子是一个能够调控目的基因在水稻根中特异表达的强启动子。其启动子融合GUS转基因水稻能够调控GUS在水稻根的各部位中特异表达，转基因水稻的地上部分没有表达，说明本发明的启动子能够在水稻转基因调控体系中驱动目标基因在根中特异表达。

综上所述，本发明将根、叶、花中作了对比说明，其在根中特异表达。其启动子融合GUS转基因水稻能够调控GUS在水稻根的各部位中特异表达，地上各部分没有GUS活性，说明本发明的启动子能够在水稻转基因调控体系中驱动目标基因在根中特异表达。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110> 浙江大学

<120>水稻根特异启动子Os02g37190及其应用

<160> 1

<210> 1

<211> 3500

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 1

tgacaatccg ccggagtcgc cggaccacga agacccaccg ccctcccctg aatactacga    60

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tgtcgtctat atgcatgcag                                            3500

Claims (4)

1. 水稻调控外源基因在根中特异表达的Os2g37190启动子，其特征是：为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2. 根据权利要求1所述的水稻调控外源基因在根中特异表达的Os02g37190启动子，其特征是：还包括在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。

3. 如权利要求1、2所述的Os02g37190启动子的用途，其特征是：用于构建根特异表达的转基因植物载体。

4. 一种转基因植物细胞，其特征是：包含SEQ ID NO：1所示的启动子序列的转基因植物细胞。

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