CN102242119B - 水稻根特异启动子Os03g01700及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻根特异启动子Os03g01700，其为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。该水稻根特异启动子Os03g01700能用于构建根特异表达的转基因植物载体。本发明还提供了一种转基因植物细胞，其包含SEQ ID NO：1所示的启动子的转基因植物细胞。通过该启动子调控外源基因在根中的特异表达能提高植物的抗旱能力和对盐、碱的耐受力等。

Description

水稻根特异启动子Os03g01700及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，本发明涉及水稻Os03g01700基因的启动子序列，即从该基因ATG开始上游-1--3500bp之间的核苷酸序列，该启动子序列能够在水稻转基因调控体系中驱动目标基因在根中特异表达。发明还涉及该序列在基因工程及遗传改良中的应用。

背景技术

植物基因工程技术的成功应用不仅需要大量调控不同水平的启动子，而且需要适合于不同植物背景、不同的器官、组织、转基因类型的启动子以避免在转基因过程中的不利影响。一直以来，非植物内源的组成型启动子，来自于花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)CaMV 35S(Odell et al.，1985)有着重要的利用价值，能驱动目的基因在单、双子叶转基因植物的所有组织中高效表达(Battraw and Hall，1990；Benfey et al.，1990a)。植物内源的组成型的启动子ZmUbil是另一个在植物转基因中被广泛使用的启动子，它来自于玉米泛素，是植物内源启动子。研究还发现，ZmUbil启动子在单子叶植物许多的细胞中都有很高的活性，能够调控目的基因在根、叶中强烈表达，但表达水平随着器官的成熟显著下降(Cornejo et al.，1993)。

但是，由于组成型启动子驱动的基因在植物的不同组织、不同生长阶段均有高水平的表达，在应用中逐渐暴露出一些问题(Napoli et al.，1990)。外源基因在植物体内大量表达产生许多的异源蛋白或者产生有害物质在植物体内积累，打破了植物体内原有的代谢平衡，影响了植物正常的生长发育，例如生长延缓、开花延迟、甚至造成植物不育或死亡(Pino et al.，2007)。另外，在同一个载体中同时驱动几个不同的基因表达而重复使用同一个组成型启动子容易造成同源基因的沉默与失活或者共抑制现象(Lessard et al.，2002；Potenza et al.，2004)。因此，寻找一些能在细胞、组织、器官以及发育各阶段上更为专一地调控基因表达的启动子进行遗传载体的构建，在可控的条件下为基础研究和作物改良创造所需性状显得尤为必要。特异性启动子调控基因只在特定的器官、组织、细胞及不同的发育阶段表达，因而可以用于以茎叶为主要收获产物的作物，使蛋白质产物富集于茎叶中，减少宿主植物无谓的物质能量消耗，改善光合作用特性；也可以用于以种子、果实为主要收获产物的作物，让抗虫、抗除草剂等外源基因只在茎叶部分而不在种子果实等器官中表达，以提高转基因作物的生物安全性(Dale et al.，2002)，在植物基因工程研究中具有广泛的应用前景。

目前，大多数组织特异启动子的研究主要集中在植物的地上部分，根特异启动子的研究及应用还很少(Potenza et al.，2004)。然而，根是植物体的地下部分，它是植物进行营养、运输、储存等生理功能的重要器官。由于植物根与土壤的广泛接触，根特异启动子的研究具有广泛的应用价值。利用根特异启动子可以进行土壤污染的生物修复，提高植物的抗旱能力和对盐、碱的耐受力，大量和微量元素的高效吸收以及增强对病原微生物的抵抗力等；同时，利用根特异启动子研究植物根的发育，根系的形态建成和根构型的重建并进行作物的遗传改良具有重要意义。

植物内源的根特异启动子被开发应用之前，非植物内源的的根特异启动子rolD在根特异表达的转基因研究中发挥着重要作用。发根农杆菌含有Ri质粒，侵染植物后能诱发植物细胞产生毛发状根，即发根瘤。农杆碱型Ri质粒的T-DNA是由左、右两个片段组成，rolD位于TL-DNA上。rolD5′端-426bp～-373bp显示出根特异和高水平的表达。序列分析显示启动子区存在一个根特异的基序(RSEs)(Keller and Baumgartner，1991；Elmayan and Tepfer，1995)。rolD启动子现已用于氮的同化研究，包括根特异的胞质型谷氨酰胺合成酶基因和高亲和硝酸盐转运体基因的超表达(Fei et al.，2003；Fraisier et al.，2000)。另一个非植物来源的根特异启动子是CaMV 35S上游-90bp Domain A(Benfey and Chua，1989)但表达水平比rolD低5-10倍，主要在根尖表达(Elmayan and Tepfer，1995)。

长期以来，烟草根特异表达基因TobRB7在根特异表达的植物转基因研究中起着重要作用，实验显示在主根的顶端分生组织、不成熟的维管组织和侧根中表达很高，而在在熟的叶、茎、茎尖分生组织中没有表达(Conkling et al.，1990)。TobRB7转录起始位点上游636bp序列分析显示其足够调控目的基因在根中特异表达，而299bp长的区域不能调控目的基因在根里特异表达，在-813bp～-636bp存在一个负调控元件(Yamamoto et al.，1991)。随着研究的深入，相继报道了一些植物根特异的启动子(Xu et al.，1995；Schünmann et al.，2004；delCampillo，2004；Koyama et al.，2005；Nitz et al.，2001；Vijaybhaskar et al.，2008；Liu et al.，2003；Winicov et al.，2004)，然而，能够在基因工程遗传改良和农业生产中应用的仍然很少。直到最近，编码拟南芥根特异表达的黑芥子酶(myrosinase)的PYK10启动子(Nitz et al.，2001)调控CKX3在拟南芥根中特异表达，与野生型材料相比，转基因植株形成了庞大的根系，主根伸长，根生物量增加，植株地下部与地下部比率加大，而地上部未受任何影响，提高了作物抗旱及吸引矿物质的能力(Werner et al.，2010)。另外，用根特异启动子RCc3(Xu et al.，1995)与组成型启动子GOS2调控OsNAC10在水稻中过表达研究发现，与GOS2:OsNAC10相比，RCc3:OsNAC10使根变大，增强了对干旱的耐受性，在干旱条件下显著提高了作物的产量(Jeong et al.，2010)。综上所述，在植物中，特别是水稻等禾谷类作物基因工程遗传载体构建中能够选用的植物内源的根特异启动子仍然很少，因此，发展更多的水稻等禾谷类作物的根特异启动子对基础研究和生产应用具有重要的意义。

关于水稻Os03g01700启动子调控外源基因根特异表达及应用目前还未见相关报道。

文中所用的参考文献具体如下：

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11、Jeong JS，Kim YS，Baek KH，Jung H，Ha SH，Do Choi Y，Kim M，Reuzeau C，Kim JK(2010)Root-specific expression of OsNAC10 improves drought tolerance and grain yield in riceunder field drought conditions.Plant Physiol 153：185-197(Jeong JS，Kim YS，Baek KH，Jung H，Ha SH，Do Choi Y，Kim M，Reuzeau C，Kim JK(2010).OsNAC10根特异的超表达改善了水稻在干旱条件下的耐受力和谷粒产量.植物生理学，153：185-197)。

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13、Koyama T，Ono T，Shimizu M，Jinbo T，Mizuno R，Tomita K，Mitsukawa N，Kawazu T，Kimura T，Ohmiya K，Sakka K(2005)Promoter of Arabidopsis thaliana phosphate transportergene drives root-specific expression of transgene in rice.J Biosci Bioeng 99：38-42(Koyama T，Ono T，Shimizu M，Jinbo T，Mizuno R，Tomita K，Mitsukawa N，Kawazu T，Kimura T，Ohmiya K，Sakka K(2005)拟南芥磷酸盐转运子的启动子在转基因水稻中驱动根特异的表达.生物科学与生物工程杂志，99：38-42)。

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16、Napoli C，Lemieux C，Jorgensen R(1990)lntroduction of a Chimeric Chalcone SynthaseGene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes 

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21、Schünmann PHD，Richardson AE，Smith FW，Delhaize E(2004)Characterization ofpromoter expression patterns derived from the Pht1 phosphate transporter genes of barley(Hordeum vulgare L.).J Exp Bot 55：855-865(Schünmann PHD，Richardson AE，Smith FW，Delhaize E(2004).大麦磷转运子Pht1启动子的表达分析.实验生物学杂志，55：855-865)。

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23、Werner T，Nehnevajova E，

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 I，Novák O，Strnad M， U，Schmülling T(2010).在拟南芥和烟草中根特异地减少细胞分裂素增强了根的发育、对干旱的耐受性及叶中矿物质的积累.植物细胞(online))。

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26、Yamamoto YT，Taylor CG，Acedo GN，Cheng CL，Conkling MA(1991)Characterizationof cis-acting sequences regulating root-specific gene expression in tobacco.Plant Cell 3：371-382(Yamamoto YT，Taylor CG，Acedo GN，Cheng CL，Conkling MA(1991).马铃薯根特异表达启动子的顺式作用元件分析.植物细胞，3：371-382)。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种水稻根特异启动子Os03g01700及其应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种从水稻根中克隆的Os03g01700启动子序列(ATG上游-1--3500bp)，如SEQ ID NO：1所示的启动子序列，也包括与SEQ ID NO：1所示的启动子序列至少有80％同源性的基因序列。另外，也包括在SEQ IDNO：1中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能达到本发明的目的。

本发明还提供一种用Os03g01700进行高效的植物转化的方法，具体地说，本发明提供了具有SEQ ID NO：1所示的序列的基因片段的载体。

本发明还提供了一种利用Os03g01700构建遗传载体达到植物根特异表达外源基因的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻根特异启动子Os03g01700，其为SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列。

作为本发明的水稻根特异启动子Os03g01700的改进：还包括在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。

本发明还同时提供了上述水稻根特异启动子Os03g01700的用途，用于构建根特异表达的转基因植物载体。

本发明还同时提供了一种转基因植物细胞，其包含SEQ ID NO：1所示的启动子的转基因植物细胞。

本发明的具体内容如下：

我们从水稻基因芯片中发现了7个在水稻根中特异表达的基因，它们是Os09g24370，Os04g44060，Os03g01700，Os02g44080，Os02g44310，Os03g01300，Os02g37190。根据TIGRE(http://rice.plantbiology.msu.edu/)注释，Os03g01700属于柠檬酸盐转运体基因，位于3号染色体上，1419nt，具两个外显子和一个内含子。

RT-PCR及qRT-PCR等实验显示，Os03g01700在水稻的叶和小穗中没有表达，在根中表达量很高，是水稻根特异表达基因。另外，在水稻根中mRNA表达丰度很高，与OsACTIN比较，他们的表达水平基本一致。因此，Os03g01700是水稻根特异表达基因，并且基因的表达水平很高。

通过将Os03g01700启动子(ATG上游-3500bp～-1bp)与报告基因GUSPlus融合进行遗传受体材料的转化研究，我们发现Os03g01700启动子调控下游报告基因在水稻的主根、侧根的表皮、皮层、内皮层、木质部、韧皮部及侧根原基发生的细胞中都有表达，但在根冠、根毛、根茎结合部、地上部分的茎、叶、颖壳、种子、雄蕊和雌蕊中没有表达。进一步说明了Os03g01700启动子能够调控目的基因在根中特异表达。

为了利用根特异启动子进行作物改良，我们构建了-3500bp Os03g01700 promoter:OsPT2载体(简称3P:OsPT2)，进行了水稻转基因。实验结果显示Os03g01700启动子能够调控水稻磷转运子OsPT2在根中特异表达。有效磷测定显示，在正常营养液中，转基因材料与野生型比叶的有效磷含量增加了2-3倍，而根里的有效磷含量与野生型一致，证明根中OsPT2的超量表达引起水稻植株地上部有效磷的积累。因此，水稻根特异启动子Os03g01700能够成功调控OsPT2在根中特异表达。

以上结果表明，我们克隆的水稻根特异启动子Os03g01700具有一定的应用价值。我们可以通过利用该启动子对作物品种进行转基因改造，如通过该启动子调控外源基因在根中的特异表达进行土壤污染的生物修复，提高植物的抗旱能力和对盐、碱的耐受力，大量和微量元素的高效吸收以及增强对病原微生物的抵抗力等；同时，利用根特异启动子研究植物根的发育，根系的形态建成和根构型的重建并进行作物的遗传改良。

附图说明

下面结合附图对理解本发明作进一步的详细描述，但并非对发明作限定。

图1是水稻根特异表达侯选基因在根、叶、花中的表达谱分析(RT-PCR分析)；如图所示，Os09g24370(未知基因)，Os04g44060(水通道PIP2.3基因)，Os03g01700(柠檬酸盐转运体)，Os02g44080(水通道TIP2.1)，Os02g44310(皮层细胞表达蛋白)，Os03g01300(皮层细胞表达蛋白)，Os02g37190(未知基因，表达蛋白)。图上显示Os03g01700在水稻的根中表达强烈，但在叶及花中没有表达。

图2是水稻根特异表达侯选基因在根、叶、花中的表达的qRT-PCR分析；结果显示Os03g01700为根特异表达基因。

图3是水稻根特异表达侯选基因Os03g01700与OsACTIN在根、叶、花中表达水平的比较；显示Os03g01700在根与OsACTIN的表达水平很接近，为高水平表达，同时Os03g01700在叶和花中没有表达，说明其是一个根特异的高水平表达的基因。

图4是Os03g01700与OsACTIN在水稻根特异表达的标准曲线；显示OsACTIN的标准曲线R²＝1；Os03g01700的标准曲线R²＝0.9984；说明标准曲线线性较好。

图5是水稻根特异表达侯选基因Os03g01700绝对定量分析；显示与植物中表达水平比较高的看家基因OsACTIN作为对照，根中Os03g01700的表达水平约为OsACTIN的82.1％；叶中Os03g01700的表达水平约为OsACTIN的0.02％；花中Os03g01700的表达水平约为OsACTIN的0.045％；以上结果进一步充分说明Os03g01700为水稻根特异表达的基因。

图6是GUS plus载体示意图。

图7是水稻根特异表达基因Os03g01700驱动报告基因GUS载体构建示意图。

图8是水稻根特异表达基因Os03g01700驱动报告基因GUS的表达分析；

显示Os03g01700 promoter:GUS在水稻的主根、侧根(图a)、根尖(图b)有强烈的GUS表达。将GUS染色的根尖进行树脂包埋，横切观察，在根的表皮(epidermis，Ep)、皮层(cortex，Co)、内皮层(endodermis，En)、木质部(xylem，X)、韧皮部(phloem，Ph)(图c)及侧根原基部位(lateral root primordium，LRP)(图d)均有GUS强烈表达。根毛(图a)、根冠(图b)、根茎结合部(图e)、地上部的颖壳(图f)、雄蕊和雌蕊(图g)、茎(图h)、叶(图i)、种子(图j、k)均没有GUS表达。

图9是构建水稻根特异表达超OsPT2选用的载体pGOFS1。

图10是水稻根特异表达超OsPT2载体基本载体pGOFS1-R。

图11是过渡载体pGOFS1-R-P。

图12是过渡载体pGOFS1-R-P-G。

图13是Os03g01700启动子驱动水稻磷转运子OsPT2根特异的超表达转化载体pGOFS-R-3P的构建示意图。

图14是Os03g01700启动子驱动水稻磷转运子OsPT2在转基因水稻T0代植株阳性材料鉴定；图中DL2000为DNA marker，WT(wild type，野生型)作为对照，数字1-10分别表示10个转基因株系，即株系1、株系2、……、株系10，结果显示在随机选取的3P:OsPT2 10个T0转基因株系中，有9个潮霉素筛选为阳性，阳性率为90％。

图15是Os03g01700启动子驱动水稻磷转运子OsPT2在转基因水稻T0植株中根和叶中的超表达检测(qRT-PCR分析)，图中WT为水稻日本晴野生型，数字表示独立的转基因株系编号；显示在随机选取的9个转基因材料中，株系2、4、5、6、7共5个株系成功实现根特异超表达。另外，有2个株系3和10根和叶都超表达，但根中表达水平比叶中更高。尽管各株系之间表达水平不一，根特异超表达率达56％，说明Os03g01700启动子介导的根特异超表达是成功的，Os03g01700启动子是一个根特异启动子。

图16是Os03g01700启动子驱动水稻磷转运子OsPT2在转基因水稻T0植株拷贝数鉴定；图上显示了水稻日本晴野生型(wild type，WT)和4个T0代转基因株系3P:OsPT2-2、3P:OsPT2-4、3P:OsPT2-6、3P:OsPT2-7 Southern blot杂交结果，结果表明四个株系分别为独立株系，其中3P:OsPT2-4为单拷贝的株系3P:OsPT2-2、3P:OsPT2-6、3P:OsPT2-7为多拷贝株系。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。

实施例1、根特异表达基因的筛选：

一、样品制备

挑选饱满的日本晴野生型水稻种子剥壳用清水冲洗，后换成清水浸泡，于37℃浸种至露白(1-2天)，期间早晚换水。将发芽的种子直播于3L水稻全营养液中(pH值5.5)，水稻全营养液母液配方见(表1)，水稻全营养液的具体配制如下，即每4L培养液中加I-VI号贮备液各5ml，调节pH值至5.5。于水稻光温可控生长室(白天30℃，夜晚22℃，光强3000lux，光照时间12小时)中生长10天。对地上部和根部分别取样。另取于正常营养液生长至抽穗开花期水稻的小穗，用液氮冻存。所有样品均在-70℃保存以备RNA提取。

表1、水稻完全营养液配方和母液配方(EDTA-Fe)；

每4L培养液中加I-VI号贮备液各5ml，调节pH值至5.5。

二、RNA提取

RNA提取采用Gibico公司Trizol试剂抽提方法，操作步骤如下：

1)研钵和研棒用液氮预冷，取50～100mg组织用液氮充分研磨，加1ml Trizol(样品体积不能超过Trizol的10％)，继续研磨直至完全成为粉末，待融化成匀浆后转入离心管，室温下放置5分钟；

2)加入200l氯仿，剧烈摇荡15秒，室温放置2-3分钟，于4℃，15000g离心10分钟；

3)取上清，再加入等体积的氯仿，重复上述步骤；

4)取上清，加0.5ml(或等体积)异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟，于4℃，12000g离心10分钟；

5)弃上清液，用200ml枪头将沉淀块轻轻打碎，加1ml 75％乙醇(0.1％DEPC水配制)洗涤，于4℃，12000g离心5分钟；

6)弃上清液，重复步骤5，弃上清，室温或冷冻干燥；

7)用20-40 lDEPC水或TE溶解RNA，于-70℃冻存。

8)用NanoDrop核酸蛋白测定仪ND-1000测其浓度及质量(260/280蛋白去除指标1.8～2.0；260/230盐分去除指标1.8～2.0)。

注：0.1％DEPC H₂O：取1ml DEPC水加入1L去离子水中混均，放置过夜后高压灭菌。75％乙醇：50ml DEPC水中加入118.5g无水乙醇。

三、逆转录

第一链cDNA合成采用Promega公司的M-MLV逆转录酶在进口的0.5mL离心管内混合下列试剂：

样品混匀后，短暂离心，70℃变性5min，迅速置于冰上冷却10min，短暂离心后，再向管内加入下列试剂：

用移液枪轻轻混匀样品，置于42℃空气浴中反应1小时后，将样品置于70℃处理15分钟终止反应，冰上冷却后，-20℃保存。

四、芯片杂交

芯片杂交实验所用到的材料为Nipponbre野生型材料。将材料浸种露白之后播种于正常营养液中，pH5.5，生长10天以后开始取材，地上部和地下部分开取材，设两个生物学重复。芯片杂交采用的是水稻基因芯片基因组阵列(Rice GeneChip Genome Array，http://www.affymatrix.com/products/arrays/specific/rice.affx)。该阵列包含57381个探针组合。RNA的纯化；cDNA的合成与纯化；芯片杂交与扫描以及芯片数据分析按照GeneTechBiotechnology有限公司(中国上海)的Affymetrix标准步骤进行(Affymetrix，2003)。

芯片扫描后的数据采用Affymetrix公司提供的基因芯片分析软件(GCOS 1.2)以及dChipsoftware进行标准化和统计分析。根据标准化后的均值来计算每个探针的表达变化。用t检验(one-way ANOVA t test)筛选差异显著基因。结果如表2显示，这些基因在水稻根中的信号值很高，在叶中很低，为根特异表达基因。为此，我们根特异表达基因的筛选范围集中在Os09g24370(未知基因)，OsO4g44060(水通道PIP2.3基因)，Os03g01700(柠檬酸盐转运体，是TIGRE(http://rice.plantbiology.msu.edu/)注释预测而得的基因名称。)，Os02g44080(水通道TIP2.1)，Os02g44310(皮层细胞表达蛋白)，Os03g01300(皮层细胞表达蛋白)，Os02g37190(未知基因，表达蛋白)。

表2、通过基因芯片筛选得到的水稻根特异表达基因

表2显示，筛选到的水稻根特异表达基因为Os09g24370(未知基因)，Os04g44060(水通道PIP2.3基因)，Os03g01700(柠檬酸盐转运体)，Os02g44080(水通道TIP2.1)，Os02g44310(皮层细胞表达蛋白)，Os03g01300(皮层细胞表达蛋白)，Os02g37190(未知基因，表达蛋白)。

五、半定量RT-PCR

做半定量RT-PCR反应时，将模板稀释10倍后再用。各个样品的cDNA模板量先用OsActin的表达量调成一致，再扩增目的基因。侯选基因的RT-PCR引物(表3)。

RT-PCR的反应体系具体如下：

结果如图1所示，Os09g24370，Os03g01700，Os03g01300，Os02g37190这四个基因在水稻植株的叶和小穗中均未有表达，但在根中表达比较强烈。

表3、侯选基因和OsACTIN的RT-PCR引物

六、实时定量RT-PCR分析(水解探针UPL)

为了提高扩增的特异性，采用水解探针法进行定量检测，即除了特异引物外，还有能与目的基因完全匹配的探针参与扩增。当PCR扩增进行时，与目的基因结合的探针即被水解而发出能被检测的荧光，荧光强度与PCR产物的量成正比，并能排除用SYBR扩增时引物二聚体的干扰。做基因表达的相对定量时，用水稻看家基因OsACTIN在各个cDNA样品中的表达量作为衡量cDNA浓度的内参，样品间同一基因的相对表达量用以下公式计算：表达倍数＝2^-Δ(ΔCp)，其中ΔCp＝同一样品目的基因的Cp值-OsACTIN的Cp值，Δ(ΔCp值)＝不同样品间ΔCp值的差值。假设PCR扩增效率均为2，扩增重复数为3。

本实验采用Roche公司的UPL(Universal Probe Library，定量PCR通用探针库)定量试剂盒进行检测。

PCR反应体系如下(5μl体系，384孔板)：

PCR反应条件为：95℃5min，95℃10sec，60℃20sec，72℃1sec，45个循环。反应结束冷却：40℃10sec。

根据RT-PCR结果，选取Os09g24370、Os03g1700、Os02g44310、Os02g37190将序列递交至UPL的在线分析设计中心http://www.universalprobelibrary.com，分析得到的特异引物序列和对应的UPL探针编号(表4)。

表4、侯选基因和OsACTINqRT-PCR引物序列及相应的UPL探针编号

为进一步确定根特异表达基因，我们用实时定量RT-PCR(水解探针UPL)分析了Os09g24370，Os03g01700，Os03g01300，Os02g37190这四个RT-PCR筛选的侯选基因，qRT-PCR结果(图2)说明这四个侯选基因均为水稻根特异表达基因。我们发现，侯选基因不但在根中特异表达，而且表达丰度很高，选取了侯选基因中的Os03g01700，Os02g37190与OsActin进行了表达丰度比较(图3)，发现这两个基因在根的表达与OsACTIN基本一致，表达强度很高，但在叶和小穗中与OsACTIN相反，没有检测到任何表达。

七、OsACTIN、Os03g01700质粒标准品的制备

用OsACTIN385bp的RT-PCR引物(表3)，以水稻日本晴野生型根的cDNA为模板，扩增出OsACTIN的标准品片段，长度为385bp(序列信息参见TIGRE注释LOC_Os03g50890)。

根据Os03g01700 cDNA序列，在其保守区设计引物如下：

Os03g01700  F：5’GCG GCT TCA ACA AGA CGG3’

R：5’CTC GCC TGC TCG CAC ACT 3’

以水稻日本晴野生型根的cDNA为模板，扩增出Os03g01700的标准品片段，长度为298bp，分别连入pUCm-T载体(2773bp)，经测序鉴定正确后存于-20℃备用。

八、标准曲线的制备

测定OsACTIN、Os03g01700标准品质粒浓度，并分别进行8次10倍逐级稀释即(10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸)，以稀释样品为模板，用OsACTIN、Os03g01700 UPL引物(见表4)进行实时定量RT-PCR(SYBR-Green1)，RT-PCR体系和反应条件同上文(六、实时定量RT-PCR)。根据结果用excel绘制标准曲线，结果见图4。

九、DNA拷贝数计算

分别以水稻日本晴根、叶、花的cDNA为模板，用OsOsACTIN、Os03g01700 UPL引物(表4)进行实时定量RT-PCR(SYBR-Green1)，RT-PCR体系和反应条件同上文(五、半定量RT-PCR)。根据结果对照标准曲线计算出cDNA(g/ul)。最后根据下列公式与反转录体系计算出DNA拷贝数(copies/ng)(Lee et al.，2008)。

$\mathrm{DNA}\left(\mathrm{copy}\right)=\frac{6.02\×{10}^{23}\left(\mathrm{copies}{\mathrm{mol}}^{-1}\right)\×\mathrm{DNA\; amount}\left(g\right)}{\mathrm{DNA\; length}\left(\mathrm{bp}\right)\×660\left(g{\mathrm{mol}}^{-1}{\mathrm{bp}}^{-1}\right)}$

结果见图5和表5，显示以植物表达水平比较高的看家基因OsOsACTIN作为对照，在根中每微克RNA中OsACTIN为11135.97个分子，Os03g01700为9141.47个分子，Os03g01700的表达水平约为OsACTIN的82.1％；在叶中每微克RNA中OsACTIN为1168.73个分子，Os03g01700为0.38个分子，Os03g01700的表达水平约为OsACTIN的0.02％；在花中每微克RNA中OsACTIN为3913.2个分子，Os03g01700为1.78个分子，Os03g01700的表达水平约为OsACTIN的0.045％，充分说明Os03g01700为水稻根特异表达的基因。

表5

表5是水稻根特异表达基因拷贝数计算结果；

显示以植物表达水平比较高的看家基因OsACTIN作为对照，在根中每微克RNA中OsACTIN为11135.97个分子，Os03g01700为9141.47个分子；在叶中每微克RNA中OsACTIN为1168.73个分子，Os03g01700为0.38个分子；在花中每微克RNA中OsACTIN为3913.2个分子，Os03g01700为1.78个分子，充分说明Os03g01700为水稻根特异表达的基因。

实施例2，水稻根特异启动子Os03g01700调控GUS报告基因的表达分析

一、水稻根特异启动子融合GUS载体构建

按照水稻基因组序列(TIGRE)设计Os03g01700启动子引物，加酶切位点HindIII(小写字体所示)、BamHI(小写斜体字体所示)和保护碱基(下划线“_”所示)。

Os03g01700-3.5Kb启动子引物

F：5’-

aagcttTGAAAAGAGCTTGAGAGAAT-3’

R：5’-ggatccCTTCTTCTTCTTCGATCGAC-3’

以基因组DNA为模板用phusion超保真DNA聚合酶扩增出OsO3g01700启动子，全长3500bp，如SEQ ID NO：1所示。电泳回收后，用HindIII、BamHI双酶切回收的PCR产物连入HindIII、BamHI双酶切的GUS plus载体(图6、图7)，得到Os03g01700 promoter:GUSplus。转化DH5α感受态细胞，涂含Kan(50μg/mL)的LB固体培养基，12h后挑取阳性克隆，用Os03g01700-3.5Kb启动子引物PCR(58℃，30秒；30个循环)和HindIII、BamHI酶切检测无误后测序验证序列的正确性，电击转入农杆菌EHA105感受态细胞内，涂含有Kan(50μg/mL)和链霉素的YEP(50μg/mL)固体培养基。48h后挑取阳性克隆经PCR验证无误后，加入16％的甘油-70℃保存备用。

二、农杆菌(EHA105)介导的水稻遗传转化体系主要应用Hiei等人(1994)报道的方法。

载体为Os03g01700promoter:GUS plus，遗传转化的受体材料为粳稻(Oryza.sative L.sspjaponica)品种Nipponbare)，导入的目的基因为Os03g017003.5Kb promoter:GUS plus。

三、GUS组织化学染色及显微观察

(1)分别取生长10天的T2转基因材料的根、茎、叶、花等各组织，将准备好的材料浸泡在GUS染液中(配方见表6)，于37℃保温1h。

表6、GUS染液配方

(2)茎、叶、花绿色材料转入75％乙醇中脱色2-3次，到阴性对照材料呈白色。

(3)在LEICA MZ95体视镜下观察，用LEICA DC100摄像头拍照。

(4)分别取生长10天的T3代水稻转基因材料根部距根尖0.5cm处的根样本，长度为0.3-0.4cm，GUS染色后进行树脂包埋和超薄切片。包埋和切片步骤如下：

取材→GUS组织化学染色1h，37℃→30％丙酮洗1次(1h)→50％丙酮洗1次(1h)→70％丙酮洗1次(1h)→80％丙酮(1h)→90％丙酮(1h)→95％丙酮(1h)→100％丙酮洗4次(30min)→2/3丙酮+1/3Spurr′s树脂(2h)→1/2丙酮+1/2Spurr′s树脂(2h)→1/3丙酮+2/3Spurr′s树脂(2h)→纯树脂渗透过夜→包埋→聚合过夜(70℃恒温箱)→用Leica EMUC6超薄切片机切片(2-5μm)→展片→镜检→拍照。

结果见图8所示，显示Os03g01700promoter:GUS在水稻的主根、侧根(图a)、根尖(图b)有强烈的GUS表达。将GUS染色的根尖进行树脂包埋，横切观察，在根的表皮(epidermis，Ep)、皮层(cortex，Co)、内皮层(endodermis，En)、木质部(xylem，X)、韧皮部(phloem，Ph)(图c)及侧根原基部位(lateral root primordium，LRP)(图d)均有GUS强烈表达。根毛(图a)、根冠(图b)、根茎结合部(图e)、地上部的颖壳(图f)、雄蕊和雌蕊(图g)、茎(图h)、叶(图i)、种子(图j、k)均没有GUS表达。

以上结果说明Os03g01700(-3500bp～0)启动子是一个能够调控目的基因在水稻根中特异表达的强启动子。

实施例3，Os03g01700启动子调控OsPT2在水稻根中特异表达

一、Os03g01700启动子调控OsPT2载体构建

用构建Os03g01700-3.5Kb promoter::GUS载体引物，引入EcoR I(小写字体所示)、SmaI(小写斜体字体所示)酶切位点，加保护碱基(下划线“_”字体所示)设计Os03g01700-3.5Kb promoter双酶切引物；根据pFX-E24.2R质粒上GAL4/VP16+UAS序列，引入Sma I酶切位点设计GAL4/VP16+UAS In-Fusion引物(http://bioinfo.clontech.com/infusion/)；根据NCBI上公布的OsPT2(AF536962)信息，确定OsPT2基因组序列(其无内含子)，设计In-Fusion引物，引入BamHI。引物序列如下：

Os03g01700-3.5Kb promot(EcoR I，SmaI)

F：5’

gaattcTGAAAAGAGCTTGAGAGAAT-3’

R：5’-TCCcccgggCTTCTTCTTCTTCGATCGAC-3’，

GAL4/VP16+UAS

F：5’-AAGAAGAAGAAGCCCGGGATGAAGCTCCTGTCCTCCATC-3’

R：5’-GGTCGACGGATCCCCGGGGGGATCTTCGACGTCTGTCCTCTC-3’

OsPT2

F：5’-ATCCCCCCGGGGATCCGCTTATAACTTTGCAGCTTGAGG-3’

R：5’-GCAGGTCGACGGATCCGGGAAAGTTCACAAAATCTCACA-3’

分别以Os03g01700-3.5Kb promoter::GUS、pFX-E24.2R质粒和日本晴水稻基因组DNA为模板PCR(58℃，30秒，30个循环)扩增Os03g01700 promoter片段长度3.5Kb，GAL4/VP16-6×UAS片段长度1198bp，OsPT2片段长度1825bp。然后电泳回收扩增片段。

用Xba I酶切pGOFS1载体(图9)去掉2322bp～3971bp之间的序列，形成构建水稻根特异表达超OsPT2载体的基本载体pGOFS1-R(图10)。

用EcoR I、SmaI双酶切Os03g01700promoter和pGOFS1-R质粒，电泳回收后将Os03g01700promoter连到pGOFS1-R载体，形成中间过渡载体pGOFS1-R-P(图11)。

分别用Sma I酶切GAL4/VP16+UAS片段和pGOFS1-R-P载体，回收之后，用In-FusionPCR Cloning Kit(Clontech)将GAL4/VP16+UAS片段连到pGOFS1-R-P载体上，形成另一个中间过渡载体pGOFS1-R-P-G(图12)。

最后，分别用BamH I酶切OsPT2片段和中间过渡载体pGOFS1-R-P-G，回收之后，用In-Fusion PCR Cloning Kit(Clontech)将OsPT2克隆到过渡载体pGOFS1-R-P-G，形成水稻根特异超表达OsPT2载体Os03g01700prom::GAL4/VP16-6×UAS::OsPT2(图13)(简称3P:OsPT2。

二、农杆菌(EHA105)介导的水稻遗传转化体系主要应用Hiei等人(1994)报道的方法。载体为Os03g01700 prom::GAL4/VP16-6×UAS::OsPT2，遗传转化的受体材料为粳稻(Oryza.sative L.ssp japonica)品种Nipponbare)。

三、转基因植物PCR阳性检测

转基因材料是潮霉素Hpt(hygromycin phosphotransferase)基因为筛选标记，通过引物对Hpt-F(5’-AGAAGAAGATGTTGGCGACCT-3’)、Hpt-R(5’-GTCCTGCGGGTAAATAGCTG-3’)进行PCR阳性检测。PCR反应体系为20μl，包括DNA模板100ng，10mM引物对各0.2μl，10×PCR buffer 2.0μl，2mM dNTP混合液2.0μl，25mM MgCl₂1.5μl，加ddH₂O至总体积20μl。PCR扩增反应程序为：1cycle(94℃，10min)，30cycles(94℃，1min；58℃，1min；72℃，1.5min)，1cycle(72℃，5min)。扩增产物在1.0％的琼脂糖凝胶上检测。

结果见图14，在随机选取的3P:OsPT210个T0转基因株系中，有9个潮霉素筛选为阳性，阳性率为90％。

四、T0代转基因植物根特异超表达OsPT2检测

为了选取根特异超表达材料进行实验，我们对3P:OsPT2转基因阳性植株进行了根特异超表达测定。qRT-PCR结果显示(图15)，在随机选取的9个转基因材料中，株系2、4、5、6、7共5个株系OsPT2在根中超表达，而在叶中没有检测到OsPT2的表达水平，各株系之间OsPT2在根中超表达的表达水平有高有低。另外，有2个株系3和10根和叶都超表达，但根中表达水平比叶中更高。尽管各株系之间表达水平不一，根特异超表达率达56％，说明Os03g01700启动子介导的根特异超表达是成功的，Os03g01700启动子是一个根特异启动子。

五、转基因拷贝数检测

DNA的抽提：

1)在50ml带盖离心管中加入20ml抽提液(DNA抽提液配方见表7)，在60℃水中预热。

2)水稻叶片5g左右，剪小后放在研钵内，倒入液氮磨成粉末后，迅速转入预热的抽提液中，在60℃保温30分钟，期间温和振荡数次，使样品均匀散于溶液中。

3)在摇床上缓慢振荡20分钟(60rpm)。

4)加入20-25ml氯仿，内含4％(V/V)异戊醇，16％(V/V)乙醇，混匀，继续在摇床上缓慢振荡20分钟。

5)3000rpm，室温下离心20分钟。

6)仔细将上层清液转入干净的离心管中，加入0.8至1倍体积的异丙醇，混匀，在室温下放置片刻，直至出现纤维状沉淀。

7)用玻璃勾捞出纤维状沉淀，用75％乙醇中漂洗后，离心，弃去乙醇，晾干沉淀，加入1mlddH₂O溶解。

8)加入5μl RNase(2.5μg/μl)，在37℃中放置30分钟。

9)所得的DNA水溶液在12000rpm离心5分钟，去除不溶物质，将上清液转入干净的离心管中。

10)加入1/10体积3M的NaOAC及2倍体积预冷的无水乙醇，在-20℃放置0.5小时左右，DNA形成纤维状沉淀。

11)用玻璃勾捞出DNA沉淀，在75％乙醇中漂洗后，离心，弃去乙醇，晾干沉淀。

12)加入500ml TE，溶解后储藏于-20℃。

表7、水稻基因组DNA抽提液配方：

选择Roche公司的DIG_High_Prime_DNA_Labeling_kit II，方法参照其说明，具体如下：

DNA酶切、电泳与转膜：

1)将抽提的基因组DNA，取5μg用限制性内切酶HindIII酶切24-48h。

2)酶切好的样品点样于0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，以15-20V/cm电泳12-15h，电泳缓冲液为1×TAE。

3)电泳结束后，取出凝胶，切去边缘多于部分，将凝胶依次用如下试剂处理进行碱变性，室温下轻轻摇动确保溶液覆盖凝胶：

0.25M(0.2M)HCl 15min(溴酚蓝变黄色)；

蒸馏水摇洗5min；

变性液(0.5MNaOH，1MNaCl)30min(溴酚蓝再变蓝)；

蒸馏水摇洗5min；

中和液(0.5M Tris-HCl，3M NaCl PH7.4)15min，2次；

蒸馏水摇洗5min。

4)在凝胶碱变性的同时，制备转印迹装置。毛细管转移法(向上转移)，在转印迹槽中，倒入20×SSC溶液，槽中置一固相支持物，在固相支持物上从下向上依次置入：两张比凝胶稍宽的滤纸，将滤纸纵向自固相支持物垂于转印迹槽中(简称“桥”)，底面在上的凝胶，滤膜(与凝胶等大)，滤纸(与凝胶等大)，吸水纸(略小于滤纸，5-8cm高)，400-800g重物。凝胶四周用Parafilm膜包围防止短路。转膜8-24小时，每隔数小时换掉已经湿透的纸巾。

5)转膜结束后，取出滤膜，边角剪一小角做标记。滤膜于2×SSC摇洗5min，用滤纸吸干，80℃烤箱烘烤0.5-2小时，膜可立即进行杂交。

探针制备：

1)用潮霉素基因的引物HPT-U：CGGTCGCGGAGGCTATGGATG和HPT-L：GCTTCTGCGGGCGATTTGTGTA，以pCAMBIA1300载体为模板，扩增出650bp左右的片段作为杂交探针，扩增条件为95℃5min；95℃30s，64℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min结束。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳并割胶回收目的条带。

2)将1μg需要标记的纯化潮霉素DNA模板(PCR回收产物)稀释到16μl ddH2O中。在沸水浴中充分变性10分钟，放于冰水浴中迅速冷却。

3)加入4μl地高辛高效标记混合物DIG-High Prime充分混匀，37℃温浴过夜。适当延长反应时间能够提高标记效率。

4)加入2μl 0.2M EDTA(pH 8)终止反应，并于65℃下10min加热降低其活性。

杂交：

1)预热适量的DIG Easy Hyb工作液(10ml/100cm²膜)到杂交温度(42℃)。在杂交管中将膜预杂交30min，缓慢摇动。

2)沸水浴变性DIG标记探针(大约25ng/ml DIG Easy Hyb)5min，迅速放入冰水浴冷却。

3)将变性的DIG标记探针加入预热的DIG Easy Hyb工作液(3.5ml/100cm²膜)，混合均匀并注意避免产生气泡(气泡会导致背景产生)。

4)倒出杂交袋中的预杂交液，加入混有探针的杂交液，42℃摇床中杂交过夜。

5)回收杂交液存放于-20℃。再使用时68℃变性10分钟即可。

洗膜：

1)用足量含有0.1％SDS的2×SSC在室温摇床洗膜2次(各5分钟)。

2)用足量含有0.1％SDS的预热的0.5×SSC 65℃摇床洗膜2次(各15分钟)。

信号检测：

以下步骤在15-25℃水浴摇床上进行。

1)用足量Washing buffer漂洗尼龙膜1-5min.

2)在100ml Blocking solution中温育30分钟。

3)在20ml Antibody solution中温育20分钟。

4)100ml Washing buffer漂洗尼龙膜两次，每次15min。

5)20ml Detection buffer平衡2-5min。

6)将膜含DNA面朝上放在一个打开的活页夹(或者杂交袋)，将1ml CSPD raady-to-use点在膜上，马上用活页夹的另一页盖住膜以使溶液均匀散布在膜上并确保膜上没有气泡。

15-25℃温育5min，去除多余的液体，密封活页夹的边缘。

7)将湿润的膜在37℃温育10min以增强荧光反应

8)15-25℃用X-ray film曝光15-25min，显影、定影后扫描记录结果。

结果见图16，经过qRT-PCR鉴定为根特异超表达的T0植株，提取4个T0转基因植株，分别为3P:OsPT2-2、3P:OsPT2-4、3P:OsPT2-6、3P:OsPT2-7，用HindIII进行酶切，用潮霉素基因的PCR产物作为探针，杂交结果表明四个株系分别为独立株系，其中3P:OsPT2-4为单拷贝的株系3P:OsPT2-2、3P:OsPT2-6、3P:OsPT2-7为多拷贝株系。

六、T0转基因植株有效磷测定

为验证OsPT2在根中超量表达确实对表型造成影响，选取经qRT-PCR鉴定OsPT2在根中超量表达的5个转基因株系(图10)，即株系2、株系3、株系4、株系7、株系10溶液培养40天之后，将阳性株系与野生型进行有效磷测定。具体过程如下：

1.将新鲜植株先用自来水洗涤，在用蒸馏水冲洗，然后用吸水纸擦干。

2.取0.5克鲜样用液氮研磨成粉末，放置于4℃使样品冻融，加入1ml 10％(w/v)的高氯酸研磨均匀。

3.加入9ml 5％(w/v)的高氯酸至匀浆液中，使之稀释10倍，放置冰上30分钟。

4.在4℃条件下10000g离心10分钟，取上清液，用于有效磷浓度的测定(钼锑抗法，详见总磷测定方法)。

5.取2ml工作溶液与1ml样品上清液混合，于4℃温育20分钟。

6.于820nm可见光波长下测定吸收值。如样品浓度过高，应适当稀释，使其OD值落在标线的线性范围内。大量样品可用酶标仪测定，以空白溶液为参比调节仪器零点。

磷标准曲线绘制：准确吸取5ppmP标准工作溶液0、0.5、1、2、3、4、5、6、8ml，分别放入50ml容量瓶中，加水至30ml，同上步骤显色并定容，即得0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8ppm P标准系列溶液，与待测液同时测定，读取吸光度(2.5ml石英比色皿，光程1cm，BACKMAN DU460分光光度计)。绘制标准曲线和直线回归方程。

植物有效磷(Pi)含量(mg Pi/g FW)＝OD值*(V/m)*(V2/V1)*C

OD值-换算后待测液中磷的质量浓度(PPM：ppm)

V-样品制备溶液的ml数，即样品所加提取剂的体积(此为0.01L)

m-样品鲜重(g)(实际称得的质量)

V1-吸取的反应的体积(1ml)

V2-反应液的总体积(3ml)

C-样品稀释倍数(若样品浓度过高，需稀释后再反应)

有效磷测定结果见表8，显示在正常营养液中，转基因材料与野生型比：叶的有效磷含量增加了2-3倍，而根里的有效磷含量与野生型基本一致，证明根中OsPT2的超量表达引起水稻植株地上部有效磷的积累。因此，水稻根特异启动子Os03g01700能够成功调控OsPT2在根中特异表达。

表8、Os03g01700启动子驱动水稻磷转运子OsPT2在转基因水稻T0代植株中的有效磷测定

图8显示在正常营养液中，T0转基因材料各株系与野生型比较，叶中的有效磷含量增加了2-3倍，而根里的有效磷含量与野生型基本一致，证明根中OsPT2的超量表达引起水稻植株地上部有效磷的积累。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110> 浙江大学

 <120> 水稻根特异启动子Os03g01700及其应用

 <160> 1

<210> 1

<211> 3500

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

 <400> 1

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Claims (2)

1.水稻根特异启动子Os03g01700，其特征是：为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的水稻根特异启动子Os03g01700的用途，其特征是：用于构建根特异表达的转基因植物载体。

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