CN117660451A - 一种紫花苜蓿根尖特异启动子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种紫花苜蓿根尖特异启动子及其应用，属于基因工程技术领域。该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供了在紫花苜蓿根部特异性的表达的启动子，能够驱动外源基因在植物根尖进行特异性的表达，可有效的改善根尖生长特性，对于苜蓿属植物基因改良具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种紫花苜蓿根尖特异启动子及其应用。
背景技术
植物基因的正常表达依赖于基因上游的启动子序列。植物基因工程技术的成功应用需要适合于不同植物背景、不同器官、组织、转基因类型的启动子以避免转基因过程中的不利影响。特异性启动子调控基因只在特定的器官、组织、细胞及不同的发育阶段表达，对于转基因作物的生物安全性以及遗传改造具有重要意义。因此，寻找--些能在细胞、组织、器官以及发育各阶段上更为专一地调控基因表达的启动子，在可控的条件下进行基础研究和作物改良具有重要的意义。
目前，大多数组织特异性启动子的研究主要集中在植物的地上部分，根特异性启动子的研究及应用还很少。然而，根系对植物生长发育的重要性不言而喻，它主要具有吸收水分和营养物质、合成能力、贮藏功能、传导功能、固着和支持作用，此外根系还能够感应来自环境的胁迫因素如干旱、高/低温、盐碱和重金属离子等，并迅速做出反应。根尖是根系生长最活跃的部位，是细胞分裂素、脱落酸、乙烯等植物生长调节物质的主要合成部位，同时是根系感应外部环境因子的主要部位，所以说根尖对根系功能的发挥具有非常重要的作用。根尖部位特异基因的研究，为根尖功能的发挥，进而加强根系功能提供了理论依据，对培育抗干旱、盐碱等逆境因素的作物，提高和改良作物产量和品质具有重要意义。因此，根尖特异性启动子就成为研究根尖基因表达非常必要的基因工程元件，具有广泛的应用价值。
当前，根尖特异性启动子主要源自拟南芥、水稻等模式植物，紫花苜蓿源的根尖特异性启动子鲜有报道。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种紫花苜蓿根尖特异启动子及其应用，其能在紫花苜蓿根尖特异性表达，对于苜蓿属作物基因改良具有重要意义。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种紫花苜蓿根尖特异启动子，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，基因表达盒由上述启动子、该启动子转录的目的基因以及终止子组成。
进一步地，目的基因为抗旱基因、抗盐基因、抗虫基因或耐铝基因。
一种重组载体，包括上述启动子或基因表达盒。
一种转基因细胞系，包括上述启动子、基因表达盒，或重组载体。
一种转基因重组菌，包括上述启动子、基因表达盒，或重组载体。
进一步地，转基因重组菌为农杆菌。
上述启动子、基因表达盒、重组载体、转基因细胞系，或转基因重组菌在改良苜蓿属作物性状中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供了在紫花苜蓿根部特异性的表达的启动子，能够驱动外源基因在植物根尖进行特异性的表达，可有效的改善根尖生长特性，对于苜蓿属植物基因改良具有重要意义。
附图说明
图1为半定量检测紫花苜蓿不同部位基因的表达水平；
图2为RT-qPCR验证紫花苜蓿RNA-seq筛选出的根尖特异启动子下游基因；
图3为根尖特异启动子载体pBI101-M811-GUS构建；
图4为启动子驱动GUS基因在紫花苜蓿中表达情况；
图5为启动子驱动GUS基因在拟南芥中表达情况。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
“渝苜1号”紫花苜蓿、Columbia野生型拟南芥种子由本实验室保存。农杆菌LBA4404及发根农杆菌感受态C58C1购于上海唯地生物技术有限公司。
实施例1启动子的获得
1、紫花苜蓿RNA-seq分析
于2019年3月，使用1％ NaClO对紫花苜蓿种子消毒，蒸馏水清洗3次后于湿润滤纸上孵育至发芽，将幼苗移栽到1/2霍格兰营养液(pH 6.0)于25℃/20℃(昼/夜)200μmol·m-2·s-1恒光条件下培养。选择长势一致的紫花苜蓿幼苗，分别用0、25μmol/L AlCl3(pH 4.5)处理，取根尖(0-1cm)和根基(4-5cm)组织样品，并将不同处理(0、25μmol/L AlCl3)、同一区段的根混合成一个样，分别命名为MX01(根尖0-1cm)、MX45(根基4-5cm)，提取RNA(2个生物学重复)。样品送北京诺禾致源科技股份有限公司测序，建库方法参照Parkhomchuk et al.(2009)，DESeq2软件分析方法参照Anders et al.(2010)，P-value计算模型参照Patro etal.(2014)，FDR计算方法参照Love et al.(2014)，差异基因筛选标准参照Robinson etal.(2010)。
2、紫花苜蓿根尖特异启动子对应基因的筛选
以根基(4-5cm)为参照，选择RNA-seq测序结果中根尖(0-1cm)上调表达变化倍数(log2FC)前14个基因MsG0180003600.01、MsG0180003604.01、MsG0280011128.01、MsG0280011369.01、MsG0380017079.01、MsG0480020811.01、MsG0480021224.01、MsG0480021786.01、MsG0480022571.01、MsG0880042640.01、MsG0880044028.01、MsG0880045882.01、MsG0880046434.01、MsG0880047450.01作为候选基因，基因相关信息见表1。
表1紫花苜蓿根尖特异启动子对应相关基因的筛选
通过比对紫花苜蓿基因组数据库，找出上调表达变化倍数(log2FC)前14个基因的全长编码序列，琼脂糖凝胶电泳半定量初步筛选。结果显示，在根尖强表达的基因包括MsG0280011369.01、MsG0480020811.01、MsG0880042640.01、MsG0880045882.01、MsG0880046434.01，且同时满足在根基(4-5cm)和叶组织中弱表达的基因为MsG0280011369.01、MsG0480020811.01、MsG0880042640.01(图1)，用于后续RT-qPCR检测。
RT-qPCR检测MsG0280011369.01、MsG0480020811.01、MsG0880042640.01在茎、叶、根尖(0-1cm)、根基(4-5cm)中的相对表达水平(图2)。结果发现，MsG0280011369.01在根尖和茎中均强表达(P<0.05)；MsG0480020811.01在根尖中强表达(P<0.05)，而茎、叶中弱表达(P>0.05)；MsG0880042640.01在根尖、叶、茎中均显著表达(P<0.05)，且在根尖的相对表达水平与叶、茎中差异不显著(P>0.05)。由此确定MsG0480020811.01作为根尖特异启动子对应的基因。
3、根尖特异启动子的克隆及序列分析
利用启动子分析软件，对MsG0480020811.01基因起始密码子上游的0-2024bp进行启动子预测，预测MsG0480020811.01可能存在3个启动子序列(表2)。将MsG0480020811.01基因上游的0-2024bp分为3段，分别为0-1256bp(命名为M813)，1257-1777bp(命名为M812)，1778-2024bp(命名为M811)。
表2MsG0480020811.01基因的启动子序列预测
M811序列如下：
CAAACTCATGACAATAGGAAGAACAATCTACAATATAGGAACAATATG
ACCTTATATAAATATTTTGTTTTGGTGTAACATTTTTCTTCCAATATGACCATT
CACTTAACTACTTACTACAGTTTTATCGTTTCTTGCCAAAAAGTGAAAAGAT
GGCCATGTTAATGTCTATCTTGACTCTAGTATTCGAATAAAATTTATCTAAAA
GTGAGTTGAACATAAAATTTGAGATTATATAGAATCAAAA。(SEQ ID NO.1)
M812序列如下：
GCTTCATTTCTAGCTTCAAGTATAAATAAATCTTGTGGAGGCAAAATCAAATTTACTCGAGAGCAACCAAATATGTTAGAATAAATTTTACACCGTAGAATAATTTTGGTCTCTCTAGAAATGAAACCAAACACACTATAGATAAAAACAAC TTTCACTTCTAGTCACTCTAAAAAATTACTTCGAACTTTGGTTCCTCTAAATTTGTGTTACTAATTTTAGTCTTTGTTTTATTACAAAAATTAACGTTGCATGTTCTAAATGACTTTATTGATGACATATCATTGATGAGACCTTAAAATGTAATTAATTTAATAACTTGAATATTTATTTAAGATTAAATAATTAAATTATAAGTTAATGATATTTTAAGATATTAAAAATGATGTGTCATAAAAGGCCATTTGAAACATGTGACGTGAACTTTTGGCAAAAGATCGGGGTTAAAATTGGTAACAGAAAATTTAGAAGGACTAAAGTTTAAAATAAAATTTTAAAATGGTTAAAAAATGAAATTTGA。
M813序列如下：
TATATTTTGAGTGACAAAAAATCATATTTGACTTTTTATCTTTTATAGATAAAAATTTAAGCGAGTTGGGAATTATATGCTCACTAGGGTCGGAGAAAATGTCAAGACTCATTAAGTGATAGCATAATGTACTTCTAAATTATTCACATTTGAAGTTATCTCATCGACAACGGATTCACATAACCGCATGTCTTGATCTACATTTTAAGTAAATCACACTCCATATTTTTAGAGATGCTTAAACTGCTTCTAATCTCTCCATTTTATTAAAATATGTTCTCCTCCTCTCTTAAATACAATATATTAGATAAATACACTATCCTTTTGAGATAGACAAAAATTTAATTACATCATCTCTCTCTTATGTTCAAATCTTATTTCCCCCCTAAATGAACACTTTTTCTTTTTTTTTTTATTCACGTCATTAAAATGTAGTTTTAAATTATTTAACAAGATAAAATTAAAACTTGGACAAAATACTAAAACCGATTAAAAAAACCTATTTAAAATTACACTTCACATTCTAAAACTATTAGATAGAGTAACACACAAGCTCTTAGAGCATCTAAAATGAGGGCTTCTTCACCTTTTTAACAAGTTTGCTTAATAGCTATCCCCATCATAGGATAATTAGAAAGATTTTTTTTAAAACACTTTTTAGAAGTGAGAGAAAATTCTTATACAAGCATACTCTCTATCCTTTTGACCCCACAAACAAAAAATTTTATTGAAAAAAGATTTACCTTATATTCAATTCAAAGTTATTAATAAATTTTAGAAGTGTGGCCCGGAGGGGTTAAATAAATACTAATTAGGTATTAATATTTAAAAGTTCTCCATTATAGATTCTCTTAACAAGAACCTGAATAAACAGAAAGTAGTGAGTTGATAAATTAATTTGGTCAATATTCTATAGTTGGCATTTTAACATTATTAAGCTTTGAATAGCCCTCATACATATCATTACCAAGCAATAACAAACTTTAGAACTTAGAAGCGTACTTAGAAAAAAGATACAAACAAATCTTAAGCCGAACTTCAAGCTCTAGGCCAACATGCATATACCAAATTCTCTCTATATATTTTCTTCAATACATGTACCTATCCATCAATCTATAAATCTTCTGCATCATTGAAGTAATTGAAAATCACTAAATAATTGCATAGGAAAGTAATAAAGATATCATCAAGAGAGTTCACCAAGATGGCTGGAAGAAAGTGGAGCATCTTGGTGGCCTTTTTATCTTACTCATCTCT。
实施例2GUS染色鉴定
1、克隆启动子序列
基于实施例1获得的M811、M812、M813启动子序列，设计扩增引物，以紫花苜蓿DNA为模板，分别扩增M811、M812、M813启动子序列，回收。其中，M811扩增引物如下：
M811-F：5’-TACGAATTCCAAACTCATGACAATAGGAAGAAC-3’；
M811-R：5’-GATCGTCGACTGGCTTGAGCTCAGAGATGAGTAAGATAAAAAGGCC-3’；
M812、M813目标序列按本领域常规技术进行扩增。
2、构建35S、M811、M812、M813启动子表达载体pBI101
将35S以及M811、M812、M813这3段启动子序列两端添加SalI和BamHI后，与pBI101载体酶切连接，转化DH5α大肠杆菌，质粒提取，测序验证。构建好的载体分别命名为pBI101-35S-GUS、pBI101-M811-GUS、pBI101-M812-GUS、pBI101-M813-GUS，M811载体改造示意图见图3，其他启动子同法。
3、农杆菌LBA4404介导35S、M811、M812、M813，瞬时转化紫花苜蓿幼芽方法如下：
紫花苜蓿种子，在1/2MS(含500mg/L Cef和50mg/L Kan)培养基上发芽，取幼嫩的植株，根、茎、叶组织剪碎为0.4cm×0.4cm左右，农杆菌LBA4404侵染30min，侵染过程中反复2次抽真空。用滤纸吸干菌液，并在湿润条件下培养3d。分别放入离心管中，加入GUS染色液，对LBA4404侵染的幼苗根、胚轴、茎、叶GUS染色。于37℃培养箱中温育12h，蒸馏水洗去表面染色液，结果见图图3。
构建启动子35S、M811、M812、M813表达载体，转化紫花苜蓿后，对转基因幼苗不同组织(根、胚轴、茎、叶)进行GUS染色。结果显示，35S组成型启动子转基因苗的根、胚轴、幼茎、叶均染成蓝色(图4A)；M813转基因苗根、胚轴、幼茎染成浅蓝，且根尖着色不显著(图4D)；M811、M812转基因苗根着色明显深于其他部位，且M811根尖着色最深(图4B、C)。以上说明35S组成型启动子在紫花苜蓿各部位均表达，M811表现为根尖特异性强表达，用于后续拟南芥GUS染色进一步验证。
4、农杆菌GV3101介导pBI101-M811-GUS，柱头侵染法转化拟南芥(韩蓉蓉，2020)：Columbia野生型拟南芥种子表面消毒10min、无菌水清洗3遍后，在1/2MS(500mg/L Cef)培养基上发芽，待子叶展开后，剪去拟南芥的果荚及已开花蕾，将刚露头的花簇浸到菌液中侵染30s，避光保湿培养16h后正常条件培养，7d后再转化1次。待植株自然衰老后，收取转基因植株T0代种子。对种子表面消毒10min，无菌水清洗3遍，铺于1/2MS(含500mg/L Cef)培养基上，4℃冰箱冷藏，2d后正常条件培养，发芽后利用LUYOR-3415RG荧光蛋白激发光源，观察到荧光即为转基因阳性，提取组织进行PCR检测。T0代转基因阳性拟南芥收种后，播种土培长出T1代转基因拟南芥幼苗，以野生型WT为对照，整株GUS染色，结果见图5。
如图5所示，M811根尖着色明显加深，且茎、叶等其他部位几乎没有着色，最终确定M811为根尖特异的强启动子。
最后应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (8)
1.一种紫花苜蓿根尖特异启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.一种紫花苜蓿根尖特异基因表达盒，其特征在于，所述基因表达盒由权利要求1中所述的启动子、该启动子转录的目的基因以及终止子组成。
3.根据权利要求2所述的紫花苜蓿根尖特异基因表达盒，其特征在于，所述目的基因为抗旱基因、抗盐基因、抗虫基因或耐铝基因。
4.一种重组载体，其特征在于，包括权利要求1中所述的启动子或权利要求2或3中所述的基因表达盒。
5.一种转基因细胞系，其特征在于，包括权利要求1中所述的启动子、权利要求2或3中所述的基因表达盒，或权利要求4所述的重组载体。
6.一种转基因重组菌，其特征在于，包括权利要求1中所述的启动子、权利要求2或3中所述的基因表达盒，或权利要求4所述的重组载体。
7.根据权利要求6所述的转基因重组菌，其特征在于，所述转基因重组菌为农杆菌。
8.权利要求1中所述的启动子、权利要求2或3中所述的基因表达盒、权利要求4所述的重组载体、权利要求5所述的转基因细胞系，或权利要求6所述的转基因重组菌在改良苜蓿属作物性状中的应用。
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