CN112522283B

CN112522283B - 一种花粉发育相关基因及其应用

Info

Publication number: CN112522283B
Application number: CN202011527108.8A
Authority: CN
Inventors: 余小林; 缪黎明; 赵坤; 曾繁欢; 宋建伟
Original assignee: Wuxi Dimode Biological Seed Industry Technology Co ltd; Zhejiang University ZJU
Current assignee: Wuxi Dimode Biological Seed Industry Technology Co ltd; Zhejiang University ZJU
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2020-12-22
Publication date: 2023-01-03
Anticipated expiration: 2040-12-22
Also published as: CN112522283A

Abstract

本发明提供了花粉发育相关基因，为芜菁花粉发育相关基因BrbHLH046或BrbHLH046的拟南芥直系同源基因AT3G61950。通过转录组数据分析发现BrbHLH046可能与芜菁生殖发育相关。亚细胞定位发现BrbHLH046是定位在细胞核中的转录因子。对BrbHLH046在根、茎、叶、花、大蕾、中蕾和小蕾中的表达模式进行分析发现，该基因在生殖器官中有较高的表达量。启动子活性分析结果也表明，BrbHLH046在植物的生殖器官中有高表达。该基因在拟南芥中的直系同源基因是AT3G61950。通过双引物法筛选到AT3G61950的T‑DNA插入纯合突变体。对突变体表型进行鉴定发现，拟南芥纯合突变体的花序经ABA处理后花粉败育率升高。表明AT3G61950在激素响应下调控植物生殖发育，也说明BrbHLH046确实是参与芜菁生殖发育的候选基因，可将该基因应用于白菜类蔬菜等园艺植物育种。

Description

一种花粉发育相关基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，主要涉及芜菁BrbHLH046与拟南芥AT3G61950及其在植物生殖发育调控过程中的应用。

背景技术

芜菁(Brassica rapa L.syn.B.campestris L.)属于十字花科芸薹属芸薹种作物。拟南芥是与芜菁有较近的亲缘关系的十字花科模式植物，在植物基础科学中有重要研究意义。植物的生殖发育是其完成世代交替重要的发育阶段，花粉的发育是其中重要的环节。

bHLH基因在植物生殖发育过程中起着重要的调控作用，且激素参与相关的调控通路。SPATULA(SPT)是第一个鉴定出与植物雌性器官发育相关的bHLH基因(Heisler et al.,2001)。随后陆续有研究发现其他bHLH基因也参与植物生殖发育，如INDEHISCENT(IND)(Girin et al.,2011)和HECATE1(HEC1)、HECATE2(HEC2)、HECATE3(HEC3)(Schuster etal.,2015)。进一步研究结果显示，很多bHLH转录因子通过激素调控途径参与到雌蕊的发育中。有研究发现，HEC可能是作用于YUC和PINs来调控生长素的合成和运输，进而影响雌蕊的发育。此外，ETT作为生长素响应因子参与了该调控路径。花粉发育也是植物生殖发育中的重要部分，且雄性不育的研究要远远多于雌性不育，2010年有研究提出在花粉发育中有14,000个基因参与其中，有5000～7000个基因参与成熟花粉的发育。有研究发现小麦中的TaMs1是一个花粉特异表达的基因且能够被IAA和ABA诱导高表达。另外，在水稻中ABA能够通过糖代谢缓解由高温引起的花粉败育。所以，研究植物在生殖发育过程中的调控基因以及激素的调控作用，对我们在生产上利用分子育种获得更好性状的品种有重要的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种花粉发育相关基因及其应用。

本发明提供了一种bHLH蛋白编码基因BrbHLH046，该基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

本发明提供了BrbHLH046的拟南芥直系同源基因AT3G61950，该基因具有SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列。

本发明提供了含有上述芜菁BrbHLH046或拟南芥AT3G61950的生物材料，所述生物材料为表达载体，表达盒，宿主细胞或工程菌。

本发明提供了上述芜菁BrbHLH046和拟南芥AT3G61950或其相应的生物材料在调控植物生殖发育功能中的应用。该基因拟南芥的直系同源基因是AT3G61950，其纯合突变体的花序经ABA处理后花粉败育率升高，例如通过敲除或沉默BrbHLH046(或AT3G61950)可以预防植物花粉败育。

本发明提供了上述芜菁BrbHLH046和拟南芥AT3G61950或其相应的生物材料在制备转基因拟南芥中的应用。

本发明提供的芜菁BrbHLH046序列如SEQ ID No.1所示。亚细胞定位发现BrbHLH046是定位在细胞核中的转录因子。表达模式分析发现，该基因在植物生殖器官中有较高的表达量。启动子活性分析结果也表明，该基因在生殖器官中有高表达。通过共线性比对发现其在拟南芥中的直系同源基因是AT3G61950，通过双引物法筛选到AT3G61950的T-DNA纯合突变体植株，标记为644-70C。研究结果发现，拟南芥纯合突变体644-70C的花序经ABA处理后花粉败育率升高。这说明了芜菁BrbHLH046与植物生殖发育关系密切，将该基因应用于白菜或其他十字花科蔬菜育种，具有良好的应用前景。

附图说明

图1、BrbHLH046在植株不同组织部位的相对表达量。R：根；St：茎；L：叶；F：花；LB：大蕾；MB：中蕾；SB：小蕾；纵坐标即基因的相对表达量。

图2 BrbHLH046在烟草细胞中的亚细胞定位。第一行为pFGC空载体在烟草细胞中的引起的荧光蛋白分布；第二行为BrbHLH046所编码蛋白的亚细胞定位；第一列为烟草细胞中的绿色荧光蛋白，第二列显示红色荧光蛋白，第三列是绿色荧光和红色荧光融合后结果。

图3 BrbHLH046启动子融合GUS表达载体转化拟南芥的转基因植株的不同组织或器官的组织化学观察。图A～D分别为对照转基因植株的幼苗、叶片、花序和角果染色后的结果；图E～H分别是BrbHLH046的拟南芥转基因植株的幼苗、叶片、花序和角果的染色结果。

图4 AT3G61950的拟南芥纯合突变体的筛选。A～C：利用双引物法筛选拟南芥突变体的纯合植株；M：Mraker；WT：拟南芥野生型；644-05C、644-70C和644-410为拟南芥突变体不同株系的编号；D：AT3G61950的拟南芥的纯合突变体花序中基因的相对表达量。

图5拟南芥野生型(左)和AT3G61950拟南芥纯合突变体(右)的花器官形态观察。A：开放花，标尺：1mm；B：去除1～2片花瓣的开放花，标尺：1mm；C：萼片，标尺：500μm；D：花瓣，标尺：1mm；E：雄蕊，标尺：500μm；F：雌蕊，标尺：1mm。

图6拟南芥野生型和AT3G61950拟南芥纯合突变体花粉活力观察及角果中种子数量统计。A～D：拟南芥野生型(A和B)和突变体(C和D)的花粉亚历山大染色；E：拟南芥野生型和纯合突变体角果中种子数量统计；标尺：50μm。

图7 ABA处理后拟南芥突变体及其对照的花器官形态观察。A：分别用ddH₂O(左)和ABA(右)处理的拟南芥野生型和突变体的开放花，标尺：1mm；B：分别用ddH₂O(左)和ABA(右)处理的拟南芥野生型和突变体去除部分花瓣和萼片的开放花，标尺：1mm；C：分别用ddH₂O(左)和ABA(右)处理的拟南芥野生型和突变体的雌蕊，标尺：500μm；D：分别用ddH₂O(左)和ABA(右)处理的拟南芥野生型和突变体的成熟角果，标尺：2mm。

图8 ABA处理后拟南芥突变体单个雌蕊中配珠数量统计。

图9 ABA处理后拟南芥突变体的花粉亚历山大染色和扫描电镜观察。A～C：ddH₂O处理的拟南芥野生型的花粉活力及扫描电镜观察；D～F：ABA处理的拟南芥野生型的花粉活力及扫描电镜观察；G～I：ddH₂O处理的拟南芥突变体的花粉活力及扫描电镜观察；J～L：ABA处理的拟南芥突变体的花粉活力及扫描电镜观察。

图10 ABA处理后拟南芥突变体的花粉败育率统计。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，实施例中未作详细描述的技术手段属于本领域专业技术人员熟知的常规技术。实施例只用于说明本发明，但不限制本发明的范围，任何本领域的技术人员在不付出创造性劳动的情况下，以本发明的实施例为基础所获得的其他实施例均属于本发明的保护范围。

本发明实施例提供了一种与植物生殖发育相关的基因BrbHLH046，该基因为：从来源于本实验室多代自交的芜菁021-03株系中克隆得到的基因，其基因序列如SEQ ID No.1所示。

本发明实施例还提供了上述芜菁BrbHLH046在参与植物生殖发育过程中的应用，下面对其进行具体描述。

实施例1亚细胞定位及启动子融合GUS表达载体的构建

1、亚细胞定位载体的构建

采用同源重组法构建亚细胞定位载体p35S::BrbHLH046::GFP：

首先用软件CE Design V 1.03设计带有同源臂的扩增引物(表1)，以带有BrbHLH046 CDS序列的P-clone载体为模板，用高保真酶KOD-plus-Neo扩增基因并回收片段；同时用BamH I和Xba I对pFGC载体进行双酶切，酶切体系(20μL)为：Buffer 4μL，pFGC空载载体约2μg，BamH I和Xba I各2μL，最后用ddH₂O补足至40μL，混匀后在37℃金属浴中反应1～2h后用试剂盒回收酶切产物。之后，用同源重组酶对回收后的目的片段及酶切回收后的载体片段进行同源重组，反应体系为：CE Buffer 4μL、目的基因片段(50μg～200μg)、载体片段(50μg～200μg)、同源置换酶CE II 2μL、ddH₂O补足至20μL，混匀后在37℃金属浴中反应30min，迅速冰浴5min后保存在-20℃冰箱中备用。构建好的载体转化大肠杆菌后送测序验证，测序正确后提质粒保存于-20℃冰箱中。将测序正确的质粒用冻融法转入菌株为GV3101的农杆菌感受态，PCR验证后保存于-80℃冰箱中。

表1 亚细胞定位载体构建所用引物(下划线为含有酶切位点的同源臂序列)

2、启动子融合GUS表达载体的构建

本实施例用CTAB法精提白菜叶片中的基因组DNA，具体方法步骤见董衡博士学位论文(董衡，2016)。选取BrbHLH046起始密码子前约1500bp的序列为基因的启动子序列并在白菜数据库中下载了此序列(SEQ ID No.5)，用CE Design V 1.03设计带有同源臂的扩增引物(表2)，以提取的白菜叶片基因组DNA为模板，用高保真酶KOD-plus-Neo扩展了BrbHLH046的启动子序列，经电泳检测后回收，保存于-20℃冰箱中。

用BamH I和Xba I对PBI101载体进行双酶切，酶切体系(20μL)为：Buffer 4μL，PBI101空载载体约2μg，BamH I和Xba I各2μL，最后用ddH₂O补足至40μL，混匀后在37℃金属浴中反应1h～2h后用试剂盒回收酶切产物；再用同源重组酶对回收后的目的片段(BrbHLH046的启动子序列)及酶切回收后的载体片段进行同源重组；构建好的载体转化大肠杆菌后送测序验证，测序正确后提质粒保存于-20℃冰箱中。将测序正确的质粒用冻融法转入菌株为GV3101的农杆菌感受态，PCR验证后保存于-80℃冰箱中。

表2 启动子扩增所用引物(下划线为含有酶切位点的同源臂序列)

实施例2烟草细胞瞬时表达

在10mL含有Rif(50mg/L)和Kan(50mg/L)的LB液体培养基中加入10μL经过活化的转入了p35S::BrbHLH046::GFP质粒的GV3101菌液，在28℃摇床中培养至OD₆₀₀为0.8～1.0；再5,000rpm离心15min，去上清，用等体积的重悬缓冲液悬浮菌体，室温静置3～4h(小时)后注射烟草叶片。

选用生长健壮的烟草叶片，在其背面远离叶脉处用针头扎孔，然后用注射器取适量菌液注射入叶片(菌液迅速在叶片中弥漫开为宜)，做好标记后再生长约36h；然后用剪刀沿注射孔周围剪下边长1cm的正方形叶片进行制片，用激光共聚焦显微镜LSM780(ZEISS，Germany)来观察GFP荧光信号。

结果如图2所示，BrbHLH046是定位在细胞核中的转录因子。

实施例3组织化学染色

1、浸花法转化拟南芥

取5mL经过活化的含有启动子融合GUS表达载体的农杆菌菌液加至400mL含Rif(50mg/L)和Kan(50mg/L)的LB液体培养基中；28℃摇床中培养至OD₆₀₀为0.8～1.2；再8,000rpm离心10min，弃上清；再加入等体积的5％(质量分数)蔗糖溶液悬浮菌块；再加入8μL表面活性剂Silwet L-77；将野生型拟南芥去除开放花后的花序浸入菌液中约20s；再稍稍吸掉花序上的菌液，包上保鲜膜后在黑暗中生长24h；之后，去掉保鲜膜置于光照培养箱中正常培养一周后再重复浸花一次，浸入菌液前不用去除开放花；再正常生长至成熟后收种。

2、阳性植株筛选

PBI101载体上带有Kan基因，本研究采用Kan筛选法来筛选转基因阳性植株。先配制筛选培养基，4.43g MS粉末、20g蔗糖，定容至1L后用2mol·L^-1NaOH调pH至5.8；加入0.8％(质量分数)琼脂粉后121℃高温高压灭菌20min；冷却至60℃左右后在超净工作台中加入500μL浓度为100mg·mL^-1的Kan抗生素至终浓度为50mg·L^-1，再分装至已灭菌培养皿中。取适量浸花转化后收到的种子于1.5mL离心管中；在超净工作台中用75vol％的酒精清洗种子两次，每次1～2min，再用灭菌的ddH₂O清洗种子两次，每次1～2min；重复酒精和ddH₂O清洗1～2次；再用1mL ddH₂O悬浮种子，用枪头吸取含有种子的ddH₂O于筛选培养基上，使种子均匀分布后吸掉多余的ddH₂O；再用封口膜封口后正置于培养室中培养7～10天；待培养基上长出绿叶植株而其他非抗性植株白化后，将绿叶的抗性植株移至育苗块上生长，待长出3～4片真叶后就可移栽至基质中生长。对于筛选到的抗性植株可以提取叶片DNA后进行PCR来验证其是否为阳性植株。

3、组织化学染色

GUS染液基础液配方是0.78g NaH₂PO₄·2H₂O、0.71g Na₂HPO₄、0.0165g K₃[Fe(CN)₆]和0.0219g K₄[Fe(CN)₆]·3H₂O溶解于50mL ddH₂O中；再依次加入100μL Triton-100，2mL EDTA溶液(0.5mol·L^-1，pH8.0)后混匀，最后加水补足88mL，4℃保存备用。GUS染液工作液配方是3.52mL基础液、400μL甲醇，80μL X-gluc母液混均即可，-20℃备用。100mg X-gluc粉末溶于2mL DMF中即为X-gluc母液，储存于-20℃冰箱。

GUS染色的步骤如下：取适量染色液到2mL离心管中(完全浸泡组织样品即可)；将转基因拟南芥阳性植株的相应组织部位放入染液中；放入真空器中真空处理直至所取组织完全浸入GUS工作液中；37℃保温箱中过夜处理；用95vol％乙醇脱色后用50vol％甘油制片后即可在荧光显微镜ECLIPSE 90i(Nikon，Japan)下观察GUS染色情况。

根据GUS染色的结果(图3)可知，BrbHLH046的拟南芥转基因植株的幼苗、叶片、花序和角果显出蓝色，表明BrbHLH046的启动子在植株的生殖器官中有较好的启动活性。

实施例4表达模式分析

1、总RNA的提取

芜菁的根、茎、叶、花、大蕾、中蕾和小蕾标记好后迅速置入液氮固定，后放入-80℃冰箱中保存，设置3次生物学重复。本实验采用Trizol法提取植物总RNA，提取过程中所使用到的实验耗材及试剂要去RNA酶。整个提取过程中的加样需在冰上进行，离心机提前降温至4℃，且所有的离心步骤均在4℃的环境中进行。

在通风厨中用移液枪吸取1mL Trizol至1.5mL离心管中；把液氮加进研钵中，预冷研钵，研棒，药匙；在液氮中快速将样品研磨至粉末，转入离心管中后做好标记，涡旋1min；静置5min后，在通风厨中加入200μL预冷的氯仿，再涡旋1min；静置5min后12000g离心5min；取上清至新的1.5mL离心管中，若蛋白层较厚可再用氯仿抽提一次；加入与上清等体积预冷的异丙醇，轻轻地上下颠倒混匀，再在-20℃冰箱中静置30min以上；静置后用12000×g离心15min，弃上清。用1mL预冷的75vol％乙醇洗涤沉淀，再12000×g离心5min(重复两次)；弃乙醇，将离心管倒扣在超净工作台上已灭菌的滤纸上，干燥沉淀(不用完全干燥)；用50μLDEPC-ddH₂O溶解沉淀；用NanoDrop2000测量提取的RNA的浓度及质量，样品保存在-80℃冰箱中。

2、实时荧光定量PCR

反转录的具体步骤可见试剂盒中的说明书。得到的cDNA在保存于-20℃冰箱中。内参基因为白菜中的UBC10，用Primer Premier 5.0软件设计引物(表3)。使用SYBR PrimixEx Taq试剂盒进行荧光定量PCR实验，每个反应设置3次技术重复。实时荧光定量PCR反应体系15μL：7.5μL SYBR Green Master Mix，正反向引物各0.3μL，模板1μL，5.9μL双蒸水。qRT-PCR反应流程：95℃:30s,40个循环(95℃:5s，55℃–58℃:45s)利用CT值和2^﹣△△Ct法来计算基因的相对表达量。

结果如图1显示，BrbHLH046在芜菁的茎以及开放花及花蕾中有较高的表达量，即BrbHLH046在芜菁的生殖器官中有较高表达量。

表3 qRT-PCR的引物序列

实施例5纯合突变体的筛选及表型鉴定

1、拟南芥T-DNA插入突变体纯合植株的筛选

BrbHLH046在拟南芥中的同源基因是AT3G61950，该基因的SALK系列和SAIL系列突变体的编号及标记见表4。

表4 拟南芥T-DNA插入突变体及其标记

拟南芥突变体生长于光照培养箱中，待其长出4片真叶后取新叶，用微量提取法提取基因组DNA。采用双引物法来筛选拟南芥突变体的纯合植株，所用到的引物见表5。双引物法是用基因左臂引物(LP)和右臂引物(RP)作为一对引物，再用T-DNA上的一条引物(BP)和右臂引物(RP)作为一对引物来进行PCR。T-DNA上的引物(BP)是同一个系列突变体通用的，SALK系列突变体的BP引物序列我们选用的是：ATTTTGCCGATTTCGGAAC(SEQ ID No.12)；SAIL系列突变体引物序列我们选用的是：TAGCATCTGAATTTCATAACCAATCTCGATACAC(SEQ IDNo.13)。

得到的PCR产物进行电泳检测，若LP+RP和BP+RP的两对引物对扩增的产物都有条带，则模板植株单株为杂合突变体；若LP+RP的引物对扩增的产物有条带，而BP+RP的引物对扩增的产物无条带，则模板植株单株为野生型植株；若LP+RP的引物对扩增的产物无条带，而BP+RP的引物对扩增的产物有条带，则模板植株单株为纯合突变体。同时，利用荧光定量PCR对突变体植株中AT3G61950的表达量进行验证。

如图4所示，PCR筛选后发现标记为644-70C的拟南芥T-DNA插入突变体为纯合株系，且AT3G61950在644-70C拟南芥植株中几乎不表达。

表5 拟南芥T-DNA插入突变体纯合植株筛选所用引物

2、纯合突变体的表型鉴定

(1)纯合突变体的表型观察

用Leica MZ16 FA体式显微镜观察拟南芥突变体和野生型花器官的形态；配制亚历山大染色剂：10mL 95vol％乙醇、5mL 1％的酸性品红溶液、0.5mL 1％(质量分数)的橙黄G、2mL冰醋酸、25mL甘油、5g苯酚和50mL ddH₂O混合后配制成亚历山大染色剂母液，需要时再按照1:50的比例进行稀释后再使用。用亚历山大染色观察拟南芥突变体和野生型植株花粉的活力；在解剖显微镜下统计拟南芥突变体和野生型成熟角果中的种子数量，结果如图6所示，拟南芥突变体的种子数量多于野生型。

(2)激素处理拟南芥纯合突变体

用ABA对突变体的花序进行处理。选取长势一致的突变体和野生型植株各24棵，待其抽薹开花后分别用30mL 100μM的ABA和ddH₂O处理突变体和野生型植株的花序，每周处理一次，连续处理三周；处理结束后正常生长3～5天，期间观察拟南芥植株花器官形态及花粉的活力。将花粉均匀地涂抹在导电胶上后再真空镀膜，利用扫描电镜观察花粉表面的结构。

结果显示，AT3G61950的突变体的花器官形态及花粉活力与野生型相比没有差异(图5)，但ABA处理后的拟南芥纯合突变体的花粉出现败育，胚珠的发育没有受到影响(图7-10)。表明AT3G61950在激素响应下调控植物生殖发育，也说明BrbHLH046确实是参与芜菁生殖发育的候选基因，可将该基因应用于白菜类蔬菜等园艺植物育种。

以上所述为本发明较佳的具体实施方式，但在其基础上可以进行一些改进或修改，这对任何熟悉本领域的技术人员而言是显而易见的。因此，在本发明基础上所作的这些修改和改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 浙江大学

无锡迪茉得生物种业科技有限公司

<120> 一种花粉发育相关基因及其应用

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 981

<212> DNA

<213> 芜菁(Brassica rapa L.syn. B. campestris L.)

<400> 1

atgcaagaca cagttccatt tctacagatg ctccaaagtg aagaagaccc tttaccgttc 60

acatcattca aagaactatt gtctcttcag aacctccata accattggga actccaaagc 120

tatctttcac acaatgaaac caacccagtt tcaacctcat ccatggaagt aaccagacaa 180

gctttgtcaa gccaagaact accctttagc cgacaacaag acatgacagt tccttcttcc 240

tcatcaacac caaactcaag acgcaagcgc aaaatcatca cgaaccctcc tgaagtgact 300

agagggaaga ggaagaggag gaaaactaaa ccaagtaaag acattgaaga gatagagaat 360

caaagaatca accacattgc cgttgaacgt aatcgacggc ggcagatgaa cgaacatatc 420

agctccttac gttctcttct cccaccttct tacatccaac gagtaatctc cacaaccaaa 480

agtctcaatc tttaaccctc aaaaacctct tttaaacttg tttagtgttt tgtcttgcag 540

ggagaccaag catctatagt aggaggagct ataaactacg cgaaggtcct cgagcaagtc 600

atacaatcac ttgagttgca aaggagaacg aaacagagtt gtgaagtaga aaacagagtt 660

acttgcgtcc caagaatcga agctacgttg atacagaacc acgttaacct taaagtagag 720

tgccggaaga aacaagggca gcttctgaaa ggaatcgttt cacttgaaaa gcttagactc 780

actgttcttc atctcaatat ctcgtcattg tcttgttcgt cagtctctta ttgcttcaac 840

ctcaaggtaa cttacttttt catttttttt ttataaaatg caatatttaa cgatatatca 900

ctggagcaga tggaggatga ttgtaaacta gaatcggccg aggagataac gaaggtggcg 960

catcagattt tcgatacata a 981

<210> 2

<211> 1077

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 2

atggaaaggt ttcaaggaca catcaacccc tgtttcttcg atcgaaaacc ggatgtgaga 60

agcctcgagg ttcaaggatt tgcagaggct caaagctttg ctttcaaaga aaaagaggaa 120

gaaagcttac aagatacagt tccatttcta cagatgctgc aaagtgaaga cccctcatcg 180

tttttttcaa tcaaagagcc aaactttctg acgctactgt ctcttcaaac cctcaaggag 240

ccttgggaac tcgaaagata tctttcactt gaggattcac aatttcattc accggtccaa 300

tctgagacca accgcttcat ggaaggagcc aatcaagctg tgtcaagcca agaaattccc 360

tttagccaag caaacatgac actcccttct tctacctcat caccactcag tgcacattca 420

agacgaaagc gcaaaatcaa ccacttgctg cctcaagaaa tgactagaga aaagagaaag 480

aggaggaaaa caaaaccaag taaaaacaat gaagagattg agaatcaaag aataaaccac 540

attgctgttg aacgaaacag aagacgtcaa atgaacgaac atatcaactc tctccgggcc 600

cttctcccac cttcctacat ccaacgagga gaccaagctt ccatagtagg aggagcaata 660

aactacgtga aggtcctcga gcaaatcata caatctctcg aatcgcaaaa gagaacgcaa 720

caacaaagta acagtgaggt agtagaaaac gcacttaatc atctctcagg catttcgtcg 780

aacgacctgt ggacaactct tgaagatcaa acttgtatcc ccaaaatcga agctacagtg 840

atacaaaacc atgtcagcct taaagttcaa tgtgagaaga aacaaggaca acttctcaaa 900

ggaatcatat cacttgaaaa gcttaaactc actgttcttc atctcaatat cactacttcg 960

tctcattcct ctgtttctta ttccttcaac ctcaagatgg aagatgagtg cgacttagag 1020

tcagccgacg agattacggc ggctgttcat cggattttcg atattccgac aatttga 1077

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacgagctgt acaagggatc catgcaagac acagttccat ttctaca 47

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtcttaatt aactctctag attatgtatc gaaaatctga tgcgc 45

<210> 5

<211> 1449

<212> DNA

<213> 芜菁(Brassica rapa L.syn. B. campestris L.)

<400> 5

aaaagggtat ctgaaaggac atagctttat ttgagattag gtctttgtgt tatgttactg 60

tagaagaatc tgaatcttta gggtttatct cttataacat gcctaccaat aagagtgggg 120

catgtttgtc cttagagcaa gtaaccatag ctcgtgtgtg acagtagcaa accagatcac 180

agtacacaca cacatgataa aaaaacaatt caaactttct ttggagtttt tagttttata 240

gttgataagg tttctaaggt cttcattgtt gatttgttaa ggatgttgat tgtcgagaga 300

ctggctatga attttaccca ttgactgaga ttatagacaa aactgggaca ttttatagta 360

caacactatt caatgccgtt gaagccaagg catcaataat acataagatt ctttggtgtt 420

atattatcta tagattcaag atattagaca aaacccacac ataagaacat tataaaatga 480

tgggggcagc gtagttctgt ataaaggttt agatttttga gctttgaaga aaaggaatgg 540

tgtggtgtgt aatgtaatga tgtatagtga agaaaggatg attgagacat catgagaaag 600

atgacacaaa cccaatacaa gctctcttac ccatgacttg tctctattta ccttcttctt 660

atgtgtaaat tagaatgtcc ccacaaagtc tctgtctcca cttcaagaca aaactgcctc 720

caccaataat caatctttct ctccctctct ctctctctcc tatgctctgc tcagcctcac 780

cagctcttct tacagtacct aaatagattt attttcttac ctctctggtt tttttacagc 840

tcctctgttt ccttctctac tcaatagcta ctaaagagtc actgctctct atataaagct 900

agcagttaca agtccagaaa gactcagaat cagaagagag tacatgagtt tcctattctg 960

cttctaagca tttattgtta cacacatcat tgcgttataa taattcataa caaacaaaag 1020

ctttcaaatg gagaggtttc aaggacacat caacccctct gtatgtatat tttgcttaat 1080

ttaggaagct ctcactttct ttctctcttc tccttgaatc attttttttt tctcaaatgc 1140

tcagagaaac agacttgtat ttactcattt ttccctaatg agtccagatg atttgcattc 1200

aatgcttttc ttgtttgctt tacagaaaac aataacagat tctgcaatca atttgtttcc 1260

catctacctt gaaaacattc catttcccct tctacttttg tttattatct ctacactaac 1320

aaacacacag cagaatcaga ttacactttt caatcattct tcttaccaag taatctaaat 1380

cctctctctt tcttgtagtt tgcagaagct caaagctttg cctttaaaga agaagaggag 1440

gaagaaagc 1449

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gattacgcca agctttctag aaaaagggta tctgaaagga catagc 46

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ataagggact gaccacccgg ggctttcttc ctcctcttct tctttaa 47

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cctttaccgt tcacatcatt 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agcttgtctg gttacttcca 20

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gggtcctaca gacagtcctt ac 22

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atggaacacc ttcgtcctaa a 21

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

attttgccga tttcggaac 19

<210> 13

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tagcatctga atttcataac caatctcgat acac 34

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gtttcaagga cacatcaacc c 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgtatgattt gctcgaggac c 21

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

accaataacc atgcaaagca c 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggaatgagat tagccggtga g 21

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tgaagaaaag gaatggtgtg g 21

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tagcgtcaga aagtttggct c 21

Claims

1.一种花粉发育相关基因在调控植物生殖发育功能中的应用，所述花粉发育相关基因为芜菁花粉发育相关基因BrbHLH046或BrbHLH046的拟南芥直系同源基因AT3G61950，其中，BrbHLH046的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；AT3G61950的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述应用为：敲除或沉默花粉发育相关基因能预防植物花粉败育。

2.一种花粉发育相关基因在调控植物生殖发育功能中的应用，所述花粉发育相关基因为芜菁花粉发育相关基因BrbHLH046或BrbHLH046的拟南芥直系同源基因AT3G61950，其中，BrbHLH046的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；AT3G61950的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述应用为：花粉发育相关基因的纯合突变体的花序经ABA处理后花粉败育率升高。

3.一种花粉发育相关基因在制备转基因植物中的应用，所述花粉发育相关基因为芜菁花粉发育相关基因BrbHLH046，其中，BrbHLH046的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.如权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为芜菁、拟南芥或芸薹种其他变种。