CN109456979B

CN109456979B - 利用SlPIF3基因创建可调控的番茄核雄性不育系及其创建方法及应用

Info

Publication number: CN109456979B
Application number: CN201811308105.8A
Authority: CN
Inventors: 卢钢; 杨丹丹; 叶蕾; 潘长田; 刘悦
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2018-11-05
Filing date: 2018-11-05
Publication date: 2021-03-26
Anticipated expiration: 2038-11-05
Also published as: CN109456979A

Abstract

本发明公开了一种利用SlPIF3基因创建可调控的番茄核雄性不育系的方法及应用。该发明在分离鉴定一个调控雄蕊发育的番茄光敏色素作用因子SlPIF3基础上，利用基因定点编辑技术或者诱变技术获得栽培番茄SlPIF3基因纯合的突变株系，该突变植株的营养生长与雌蕊发育不受影响，但花粉败育，表现为雄性不育。不育植株外源喷施生长素，可恢复部分花粉育性，并形成可结籽的果实，且收获的种子种植后在没有喷施生长素条件下发育为雄性不育植株。通过以上途径可以繁殖形成可恢复的核雄性不育株系，解决了目前利用测交方法保存核隐性不育系需要拔除一半可育单株的问题。该技术简化了番茄雄性不育系的培育过程，可提高杂交种纯度，方便地用于番茄优良杂交品种的选育。

Description

利用SlPIF3基因创建可调控的番茄核雄性不育系及其创建方法及应用

技术领域

本发明涉及作物分子育种技术领域，尤其涉及一种利用SlPIF3基因创建可调控的番茄核雄性不育系及其创建方法及应用。

技术背景

目前在生产上可利用的作物不育体系主要有三类，一类是细胞质雄性不育，有时也被称为细胞质与细胞核互作不育系。目前广泛应用于水稻、油菜等作物的杂交育种中，但其存在恢复系选育困难、转育繁琐，育种周期相对较长；细胞质单一，且易受温度影响，育性的不稳定性导致可育和不育的转变等诸多问题。第二类为细胞核雄性不育。配制组合自由，容易出现强优势组合，特别是隐性核不育，许多材料都可以作为其恢复系，并且不受细胞质的影响，可解决三系中雄性不育细胞质单一化的问题。但制种时需要去掉50％可育株。第三类为基因工程雄性不育，一般育性败育彻底，制种纯度高，转育相对容易(Ling et al.,2007)。细胞工程雄性不育最具有代表性的为利用TA29-barnase等基因构建的转基因作物。但目前该方法受到专利以及转基因技术的限制。

番茄(Solanum lycopersicum；2n＝2x＝24)属于茄科(Solanaceae)番茄属植物，是世界上普遍栽培的极其重要的蔬菜作物之一，同时也是生殖发育研究的模式植物。目前植物雄性不育是作物杂种优势利用的重要途径,杂种优势利用作为作物育种的主要方向和目标,在生产上取得了很大地成功。杂种优势也广泛应用于番茄中，但目前普遍采用纯合自交系杂交方法，雄性不育系在番茄杂交制种中应用较少。所以发掘番茄雄性不育调控基因并创建新型可利用的雄性不育系一直是番茄品种选育的重要课题。

转录因子可以通过与下游基因启动子序列上的顺式作用元件结合，从而调控下游基因表达。碱性螺旋-环-螺旋转录因子(basic helix-loop-helix,bHLH)基因家族是植物中最大的转录因子家族之一，目前在拟南芥中已经鉴定出147个bHLH基因(Toledoortiz etal.,2003)。PIF基因家族作为bHLH基因家族的亚家族，能够与光敏色素互作被称为光敏色素作用因子(phytochrome interacting factors,PIFs)(Leivar et al.,2011；Ni etal.,1998)。植物雄蕊发育是一个受到严格转录调控的复杂过程，多种转录因子参与调解，包括bHLH、WAKY、MYB等(Ko et al.,2014；Zhang et al.,2006)。番茄中一个编码bHLH转录因子的基因突变后得到雄性不育突变体ms10³⁵(Jeong et al.,2014)，水稻基因bHLH142敲除后植株表现为花粉败育，虽然已有不少研究指出bHLH家族基因可能参与调控花粉发育过程，同时拟南芥中已有研究表明PIF3参与光周期响应、光形态建成、非生物抗性、激素信号转导调控方面，而花粉发育过程也涉及激素信号转导等调控途径,但截止目前关于PIF家族基因参与植物中花粉发育相关的研究还未见报道。

发明内容

发明的目的为克服现有番茄雄性不育利用技术的缺陷，在克隆鉴定一种调控番茄雄蕊发育的新基因基础上，提供一种利用该基因培育新型可调控细胞核雄性不育系的方法。本发明鉴定了一个新的番茄核雄性不育调控基因SlPIF3，其敲除突变体可形成稳定的核不育系，可通过外源喷施生长素来部分恢复该突变体花粉育性，从而通过自交实现保持系的功能，该技术解决了利用测交方法保存核隐性不育系需要拔除一半可育单株的问题。该发明可用于指导番茄雄性不育系的选育和改良，为番茄优良杂种的选育以及杂种优势的利用提供了技术依据。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：SlPIF3基因在创建番茄核雄性不育系中的应用，所述SlPIF3基因的野生型核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

进一步地，敲除番茄基因组中的SlPIF3基因或沉默SlPIF3的表达活性，使得发育过程中花粉败育，经纯化后获得核不育株系。

进一步地，通过以下任意一种方式敲除SlPIF3基因或沉默SlPIF3的表达活性，(1)利用物理或甲基磺酸乙酯(EMS)等化学试剂诱变，使得编码所述SlPIF3的核苷酸部分或完全缺失；(2)利用CRISPR/Cas9基因编辑等技术部分修饰SlPIF3的核苷酸序列；(3)利用上述方法修饰SlPIF3表达启动子或调控序列以抑制编码所述SlPIF3基因的表达；(4)上述(1)-(3)中的任意组合。

进一步地，所述纯化方法如下：以花粉败育的不育株系为母本，以番茄优良自交系材料为父本杂交，获得F₁代植株可育，以优良自交系材料为轮回亲本，进行回交，PCR检测后代出现两种基因型，AA：Aa＝1:1,留下杂合的可育株继续回交，重复回交等杂合的可育株综合性状同轮回亲本相似，再将其自交，自交后代育性3:1分离，获得纯合不育株系。

按照上述方法获得的番茄核雄性不育系。

一种番茄核雄性不育系的育性恢复方法，该方法为：对所述番茄核雄性不育系的花蕾外源喷施生长素，以恢复部分花粉育性。所述生长素包括但不限于IAA、NAA等。

一种构建番茄核雄性不育系的保持方法，该方法为：对所述番茄核雄性不育系的花蕾外源喷施生长素，部分花粉育性恢复，自交保留种子，继续种植获得不育株系。

一种番茄核雄性不育系在构建杂交组合中的应用，利用所述番茄核雄性不育系为母本，以另一个优良亲本材料为父本，配制杂种。

与现有技术比较，本发明具有的实质性特点和显著的进步为：

本发明通过遗传转化或人工诱变手段，获得番茄基因SlPIF3定向敲除纯合突变体，与野生型相比slpif3突变体花粉败育并且不育性可稳定遗传。若在现蕾后外源喷施生长素可部分恢复该突变体的育性。本发明鉴定了一个新的调控番茄雄蕊发育的转录因子，为创建可调控的核不育系提供了新途径。

该方法利用分子生物学方法克隆一个番茄光敏色素作用因子SlPIF3,利用CRISPR/Cas9敲除该基因获得纯合的突变体株系，可创建隐性核不育株系。SlPIF3基因突变的番茄植株花粉败育，不能发育形成正常果实，或只能形成少量单性结实的果实；利用野生型花粉授粉突变体柱头，其子房可正常发育成果实，并含有能够正常萌发的种子，表明雌蕊发育正常；进一步正反交实验证实SlPIF3基因敲除并没有影响番茄雌蕊发育。若对纯合突变体slpif3显花期花蕾外源喷施一定浓度的生长素处理，部分花粉可恢复育性，并形成少量的可结籽的果实，而收获的种子可正常萌发并发育形成核雄性不育系。

附图说明

图1为利用qRT-PCR分析SlPIF3在番茄不同器官及花发育不同时期的时空表达特性。其中，图1(A)为SlPIF3在番茄不同器官中的表达模式，R:根，S：茎，L：叶，FL：花，FR：果实。图1(B)为SlPIF3在番茄花蕾的不同发育时期的表达。Ⅰ到Ⅵ分别代表番茄花粉母细胞时期、四分体时期、单核小孢子早期、单核小孢子中后期、双核小孢子时期、花粉成熟期这6个发育时期的花蕾。方差利用±SDs表示，3次生物学统计。

图2为番茄花发育后期不同花组织中的SlPIF3表达变化。(A)萼片；(B)花瓣；(C)雄蕊；(D)雌蕊。III-VI时期分别代表了单核小孢子早期、单核小孢子中后期、双核期以及成熟期。方差利用±SDs表示，3次生物学统计。

图3为番茄SlPIF3在烟草中的亚细胞定位分析。(A-D)空载pFGC-GFP载体的烟草瞬时转化；(E-H)亚细胞定位载体pFGC::SlPIF3-GFP的烟草瞬时转化。(A)和(E)是白场，(B)和(F)是核定位烟草RFP信号，(C)和(G)是GFP荧光图像，(D)和(H)是合并后的图像。

图4为番茄SlPIF3启动子时空表达模式分析。SlPIF3启动子序列载体PBI101::pSlPIF3-GUS转化到拟南芥中，筛选得到的T₁代阳性植株的不同器官的GUS组织化学分析。A：根；B：茎；C：叶片；D：花序；E：角果。

图5为SlPIF3过表达番茄植株中SlPIF3基因表达水平分析。CK为空载转基因植株，ov-1,ov-2,ov-4,ov-5,ov-12,ov-14为过表达载体p35S::SlPIF3-pCAMBIA1301转化番茄不同芽系。(A)植株叶片；(B)花蕾；(C)绿熟果。CK为空载转基因植株对照。

图6为SlPIF3转基因番茄花及其各个组织的形态观察。(A)开放花；(B)萼片；(C)花瓣；(D)雄蕊；(E)雌蕊；(A-E)每个图中左侧为空载转基因植株(CK)，中间为SlPIF3ov-5过表达植株；右侧为sg1-6纯合突变体植株。

图7为SlPIF3转基因植株中花粉活力的结果统计。(A-F)亚历山大染液对番茄SlPIF3转基因植株的花粉活力染色情况；(G-L)FDA染液对番茄SlPIF3转基因植株的花粉活力染色情况，绿色荧光说明花粉有活力；(A)和(G)空载转基因植株CK；(B)和(H)过表达转基因植株SlPIF3ov-5；(C)和(I)纯合突变体芽系sg1-6；(D)和(J)sg1-23；(E)和(K)为sg1-1；(F)和(L)为sg1-3；(M)不同转基因芽系中花粉活力情况统计。根据亚历山大染色的结果进行统计，每个基因型至少统计15个视野。**：P<0.01。

图8为SlPIF3转基因植株花粉体外萌发统计。(A)空载转基因植株CK的花粉；(B)过表达转基因株系SlPIF3ov-5；(C)纯合突变体芽系sg1-6；(D)CK、SlPIF3ov-5、sg1-6转基因植株体外花粉萌发率统计。SlPIF3ov-5，过表达转基因植株；sg1-6为SlPIF3单碱基A插入纯合突变体；根据花粉体外萌发的结果进行统计，每个基因型至少统计来自不同单株花粉的10个以上视野。**：P<0.01。

图9为slpif3外源生长素喷施前后的花粉活力统计结果。pif3代表突变体原来的花粉活力统计结果，IAA-10^-4,IAA-10^-5代表以0.1mmol/L、0.01mmol/L的IAA喷施突变体后突变体的花粉活力统计结果,由于利用1mmol/L的IAA喷施时花蕾显示褐化、掉落等故不做统计。**：P<0.01。

图10为slpif3外源生长素喷施后得到的后代植株花粉活力的结果统计。(A)空载转基因植株CK自交后代花粉；(B)slpif3外源生长素喷施后得到的后代植株花粉。每棵植株统计15个视野。**：P<0.01。

图11为不育系杂交育种流程图。

具体实施方式

利用分子生物学方法分离鉴定一类番茄雄蕊中特异或优势表达、且调控雄蕊发育的关键基因或转录因子，该基因参与花药的碳水化合物代谢或内源激素的生物合成、分布与响应过程；利用物理或化学诱变、基因定点突变等方法敲除该基因，或者通过转录调控方式沉默该基因的表达，获得纯合的核不育株系；在开花早期喷施植物生长调节剂，可恢复部分花粉育性，自交后能结果并获得不育系种子，用于保存与繁育不育系材料。利用该不育系可以直接与番茄优良自交系材料杂交，配制F₁代杂交组合，用于制种生产；也可以利用该不育系转育其它优良自交系材料，培育用于配制杂种的新型不育系，不育系转育程序简单、省时，转育不育系保存与利用均简便。

番茄中的光敏色素作用因子(phytochrome interacting factors,PIFs)中，SlPIF3编码521个氨基酸，含有保守的HLH结构域，该结构域是bHLH家族所特有的结构域。研究发现SlPIF3为核定位基因并且遍在表达，其中花和果实中表达量较高。本发明通过遗传转化方法获得SlPIF3敲除的纯合突变体、过量表达转基因植株，结果显示基因SlPIF3的纯合突变体花粉高度败育。本发明发现SlPIF3敲除的纯合突变体雄蕊的生长素含量和葡萄糖含量较野生型的显著下降，推测突变体花粉出现败育可能是由于生长素、葡萄糖代谢紊乱造成。同时，对突变体喷施外源生长素，结果可恢复部分花粉育性。

本发明首先研究基因SlPIF3在调控植物生殖发育过程中的作用，选用栽培番茄品种“Micro-Tom”进行相关实验，该品种来自于美国UC-DAVIS番茄种质资源库。

本发明番茄SlPIF3基因的编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，启动子序列如SEQ ID NO.3所示。

实施例1SlPIF3基因在番茄不同组织和器官中的时空表达

以番茄品种“Micro-Tom”的不同器官、花发育的不同时期以及花的不同部位的cDNA为模板，检测SlPIF3在番茄不同部位的时空表达。选取番茄中的SlUbi3作为内参基因，SlUbi3-F：5'-TGGTCGGAATGGGACAGAAG-3'(SEQ ID NO:4)；SlUbi3-R：5'-CTCAGTCAGGAGAACAGGGT-3'(SEQ ID NO:5)目的基因SlPIF3设计的引物序列为：SlPIF3-F1：5'-AGAAGGATAACTTTCCCCACT-3'(SEQ ID NO:6)，SlPIF3-R1：5'-GCACTGCTACCAGAACATACA-3'SEQ ID NO:7)，所有引物按照引物合成的说明进行稀释待用。如图1所示SlPIF3在番茄各个器官均有表达，在花和果实中优势表达。其次，随着花蕾不断发育该基因的表达逐渐上升。图2结果表明在花粉发育后期，该基因都是在花粉成熟期表达量最高，其中单核小孢子时期在雄蕊中的表达量也较高。

实施例2SlPIF3的亚细胞定位及启动子分析

以番茄‘Micro-tom’叶片cDNA为模板，利用KOD高保真酶扩增SlPIF3基因的CDS序列。设计的引物序列上游引物SlPIF3-F2：5'-CGCGGATCCATGGCTATTGGGAAGCCTG-3'(SEQ IDNO:8)，下游引物SlPIF3-R2：5'-GCTCTAGACAAACTGGGACCAGCTTCAT-3'(SEQ ID NO:9)。进一步构建pFGC::SlPIF3-GFP载体。通过烟草的瞬时转染进行SlPIF3的亚细胞定位。在番茄SGN数据库中分离了SlPIF3上游2000bp的启动子序列，在PlantCare网站中对这个启动子的顺式作用元件进行预测，在SlPIF3启动子序列上含有多个CAAT-box和TATA-box，以及多种激素响应及逆境的响应元件。以番茄‘Micro-tom’叶片中提取的DNA为模板，利用KOD高保真酶扩增SlPIF3启动子序列，构建PBI101-proSlPIF3-GUS载体并通过农杆菌介导的浸花法转化拟南芥Columbia野生型，筛选阳性的转基因T1代拟南芥植株。取阳性植株得不同器官进行GUS染色观察及不同发育时期的花药进行冷冻切片观察。图3结果显示在烟草叶片细胞中，只有细胞核上能够检测出绿色荧光信号，这表明SlPIF3-GFP融合蛋白只在烟草的细胞核上定位，SlPIF3为细胞核定位基因。图4结果显示SlPIF3启动子能启动GUS蛋白在拟南芥的花药和根中表达。

实施例3番茄SlPIF3转基因植株的获得

(1)载体构建

SlPIF3敲除载体的构建：根据http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR和http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html在线网站设计2个SlPIF3的靶基因序列sgRNA1和sgRNA2。设计的靶基因序列分别为sgRNA1：5'-AAACCTTGTGCTGCTCGAGG-3'(SEQ ID NO:10)；sgRNA2：5'-AGCTGCAGAGGTGCATAATT-3'(SEQID NO:11)。首先将合成的sgRNA1/2序列及其对应的互补序列通过退火形成双链，将形成的双链sgRNA1/2连接到AtU6-26SK载体上。然后将U6-26-sgRNA1/2-SlPIF3连接到酶切后的35S-Cas9SK载体上。最后是将构建好的基因敲除载体U6-26-sgRNA1/2-SlPIF3-35S-cas9SK连接到最终转化载体pCAMBIA1301载体上。

对照空载及SlPIF3过表达载体的构建：为了便于研究SlPIF3基因的功能，因此设计在pCAMBIA1301载体上插入3*flag标签，以便进行蛋白水平的研究。3*flag-F序列为5'–GGACTATAAGGACCACGACGGAGACTACAAGGATCATGATATTGATTACAAAGACGATGACGATAAGTAAA-3'(SEQ ID NO:12)，3*flag-R序列为5'–AGCTTTTACTTATCGTCATCGTCTTTGTAA TCAATATCATGATCCTTGTAGTCTCCGTCGTGGTCCTTATAGTCCTGCA-3'(SEQ ID NO:13)。将序列退火成双链酶切链接至pCAMBIA1301载体即为空载对照载体。根据SlPIF3的cDNA全长序列设计了2172bp的过表达片段进行扩增，以番茄‘Micro-tom’叶片cDNA为模板，KOD高保真酶扩增SlPIF3片段，上游引物序列SlPIF3-F3为5'-CGCGGATCCATGGCTATTGGGAA GCCTG-3'(SEQ ID NO:14)，下游引物SlPIF3-R3序列：5'-GCTCTAGACAAACTGGGACCAGCTTCAT-3'(SEQ ID NO:15)。将上述PCR扩增产物连接至含有3*flag标签的pCAMBIA1301载体上即为p35S::SlPIF3-pCAMBIA1301-3*flag过表达载体。

(2)转基因植株的获得及阳性检测

本发明利用农杆菌介导法获得番茄SlPIF3的转基因植株，通过PCR和GUS染色筛选转基因阳性植株，进一步通过测序来确定敲除植株的基因编辑类型。在SlPIF3序列上设计特异引物检测过表达片段，SlPIF3-F4：5'-TTTTCCTGAGAATGACTTGG-3'(SEQ ID NO:16)，SlPIF3-R4：5'-GAGGGAGAAACCTTTGATGT-3'(SEQ ID NO:17)，片段长度约为600bp；在pCAMBIA1301载体上设计引物，SlPIF3-F5：5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'(SEQ ID NO:18)，SlPIF3-R5：5'-CGCCAGGGTTTTCCC AGTCACGAC-3'(SEQ ID NO:19)，片段长度在800bp左右；在SlPIF3靶基因序列位置附近设计特异引物检测基因敲除片段序列，SlPIF3-F6：5'-CCAGTGCTAAGGCAACCA-3'(SEQ ID NO:20)，SlPIF3-R6：5'-AATCCTATCCCTTCGCCTC-3'(SEQID NO:21)，片段长度约为500bp。此外，本发明为了确认pCAMBIA1301-U6-26-sgRNA1/2-SlPIF3-35S-cas9基因敲除转基因植株的表型是由SlPIF3靶基因序列的变化而调控的，而并非由于靶基因序列脱靶引起其它可能潜在基因序列的变化而调控的，因此需要对可能的脱靶基因序列进行检测。利用在线网站https://solgenomics.net/tools/blast/查询潜在脱靶序列的对应染色体上的序列，设计检测脱靶序列的特异引物，通过测序，对转基因植株潜在的脱靶序列进行检测。结果表明，敲除植株共检测到9个发生基因编辑的芽系，sg1-3为136bp大片段缺失和单碱基G缺失的双等位突变体，其他8个芽系均为在相同位置出现单碱基插入或缺失的编辑类型。此外，根据测序结果表明，潜在脱靶序列位置并没有发生基因序列的变化，说明在SlPIF3敲除突变体中不存在脱靶的情况。

另外通过“叶盘法”将过表达载体转化番茄，利用Gus染色、PCR筛选获得6个阳性过表达芽系，分别标记为SlPIF3ov-1，SlPIF3ov-2，SlPIF3ov-4，SlPIF3ov-5，SlPIF3ov-12，SlPIF3ov-14等。以pCAMBIA1301-3*flag空载转基因植株为对照(CK)，利用qRT-PCR进行检测筛选出表达量最高的芽系SlPIF3ov-5进行后续研究。不同过表达芽系表达量检测结果如图5所示。

实施例4转基因番茄植株的表型观察

(1)转基因植株形态观察

为了研究SlPIF3在番茄植株形态建成中的功能，因此对空载转基因植株(CK)、SlPIF3单碱基插入的纯合突变体植株(sg1-6)以及SlPIF3过表达番茄植株(SlPIF3ov-5)的营养生长、花器官形态进行观察。发现转基因番茄在苗期生长状况良好，对照、过表达和纯合突变体之间没有明显的矮化、伸长等现象，无太大差异，推断SlPIF3缺失后对番茄营养生长并无重要影响。

对番茄转基因植株的开放花以及花的各个组织部位进行观察和测量，结果如图6所示，SlPIF3过表达转基因植株的花略小于CK和sg1-6纯合突变体的花，SlPIF3过表达转基因植株的萼片、雄蕊和雌蕊长度比对照和sg1-6的萼片、雄雌蕊长度显著变短，但SlPIF3敲除对花的萼片、雄雌蕊长度上并没有产生显著的影响；与对照植株相比，SlPIF3过表达植株的花瓣长度则缩短，而sg1-6基因敲除纯合突变体花瓣变长。

(2)转基因番茄花粉活力统计及花粉萌发分析

通过FDA染色及亚历山大染色对T0代的转基因植株进行检测花粉活力和数据统计，结果如图7所示，对照空载转基因番茄花粉活力良好，而基因敲除纯合突变体的花粉活力情况则是差别极大，在单碱基插入的纯合突变体植株sg1-6和sg1-23中，其花粉基本败育；在双等位突变体植株sg1-1和sg1-3芽系中，花粉活力同插入单碱基的纯合突变体相似，发生极显著的花粉败育。SlPIF3过表达对番茄植株的花粉没有显著影响，而单碱基突变及大片段的缺失使基因序列发生改变，则会导致花粉形态畸形，花粉活力极显著下降导致花粉败育。为了进一步确认花粉能否正常萌发，我们对空载转基因植株、过表达及基因纯合突变体植株的花粉进行花粉体外萌发实验，结果如图8所示，以空载的番茄转基因植株作为对照，花粉体外萌发率在86.9％左右，而过表达植株中花粉体外萌发率约82.2％，同对照没有显著差异；但是SlPIF3基因敲除纯合突变体sg1-6等株系没有花粉能体外萌发，萌发率显著性降低。

(3)突变体与野生型植株杂交实验

番茄slpif3突变体的花粉活力出现高度败育，进一步验证突变体雌蕊的生理功能是否正常。突变体植株去雄后将野生型植株的花粉授粉到突变体植株的柱头上，结果显示可以正常结果实并且收获种子。而野生型植株去雄后将突变体植株花粉授到野生型植株柱头上后植株正常结果但极少有种子。该结果显示slpif3突变体的花粉发育异常而雌蕊发育正常。

实施例5外源生长素喷施突变体植株的花蕾

为探究Slpif3基因突变导致的花粉败育是否同花药生长素亏空有关，我们利用高效液相色谱分析法(HPLC)检测了败育华药的生长素浓度，结果发现，转基因植株花药中生长素含量为0.846±0.03ng/g，显著低于对照花药的含量(5.066±0.10ng/g)，说明不育植株花药中内源生长素含量显著下降。

进一步开展了外源生长素喷施花蕾实验。选用生长素IAA处理浓度分别为10^-3mol/L、10^-4mol/L、10^-5mol/L。待Slpif3突变体植株生长至开花期，每株取至少6朵花统计花粉活力，以该数据作为原始对照，然后对处于花粉母细胞时期的花蕾进行喷施，每两天喷施一次，两周后每株取至少6朵花进行花粉活力检测统计。结果显示，利用10^-3mol/L的IAA喷施因浓度过高花蕾出现褐化、掉落，故花粉活力不做统计。结果表明在蕾期利用10^-4mol/L、10^- ⁵mol/L IAA喷施均可部分恢复突变体花粉育性，有活力花粉与喷施前相比均达到显著差异，且可形成少量种子发育正常的果实，其中以10^-4mol/L IAA喷施花蕾花粉育性恢复效果较好。

另外，经试验证明，喷施NAA也具有相同的效果。

实施例6：用生长素喷洒后的不育系进行自交获得的后代保持不育性；

将外源生长素喷施不育系花蕾进行人工自交后得到的种子播种，在正常条件下生长至开花期，检测该植株的花粉活力，结果如图10所示，表明slpif3通过外源生长素喷施后自交获得的后代植株花粉依然败育，雌性器官发育正常，即不育性稳定遗传。利用上述方法可以简便地繁殖不育系。

实施例7：杂交种配置。

番茄slpif3不育株蕾期喷施外源生长素后收获种子可作为不育系繁种。利用不育植株为母本，将优良自交系作为父本。父、母本同期播种,母本与父本的株数比例为1:4～5。种植至开花期，利用人工辅助授粉或蜜蜂授粉的方法将父本花粉授至不育系植株柱头上，最后在不育系上收获的种子即为杂交种。如图11所示。

综合以上所述，本发明在番茄中发现了一个新的调控花粉发育的基因SlPIF3，该基因突变后植株花粉败育，但外源喷施一定浓度的生长素后该突变体花粉可恢复部分育性，自交后可繁育该不育系，用于杂交制种。本发明为创建番茄核不育系的创建与利用提供了新途径。

序列表

<120> 利用SlPIF3基因创建可调控的番茄核雄性不育系及其创建方法及应用

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4581

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

ttggttggtg tattatttta aagtatctga atgaagtctc attaaacaat tgggggtttg 60

actggtaact taatatttat atctttacta ctgttatggg ttttatataa atttactgat 120

taggacattt gtttatggaa acagtttttg gtttacagta ttatatgctt gaataaagtc 180

taaaatgttt gtattgttgt tgaaaagaag tgttactgga ccaggtgtgg aaggcttccc 240

aataatgctt gagtgcctaa acatagatca attctgagta gcagttaaca cacttgttca 300

tcatgcctct ctctgagttt ttgaagatgg ctattgggaa gcctgaatct ggccagcaga 360

agatctcatc tacctcaaat ctgtcatctt tgtgagtaaa gctcctattt tgcaattcgt 420

gtttttaaat aaaatgttcc cgtttgcatc ttattaatgc tcttttatgc ttggagctag 480

ttgatcaata gtttgctagt tagttgttgc tatgttttga gaattttgct ttttttttta 540

tgcagtcctg agaatgactt ggttgagctt aaatggcaaa atggtcagat tgtgatgcaa 600

ggacagaaca gtagtgctaa gaaaagcact gttcctaata atcttccgtc gagtgcctca 660

ggggatcgag acaagtacac gggaaattca tcaacctcta agattgggaa gtttggtctg 720

atggactcca tgttgaatga tatgtcatta actgtgccaa ctggtgaatt agatttgatt 780

caagaggatg aaggggtgcc ttggttagga tatccagcag atgacagtct gcaacaagat 840

tattgtgctc aactattacc tgaaatatct ggcgtgacgg caaatgaaca gtctggacag 900

agtgtatttg gtttaataaa taagagaggt agttctgaca agatgattgg ggattcacat 960

agtgttcctg ttcataatgc tgtgaatttt gagcgaagaa atacatcaaa ggtttctccc 1020

tcttccagat ttagcccatt aagttcattg ccatctcaga aaggtcatgc gtcgatacct 1080

accctagaat caggagtttc agatgtcttt agcagtaaaa atagcaatac tccactatct 1140

gttttggggg aatcaaatca aagtaaagct tcagctggtg atgctaaaag caatagaatt 1200

caaaagcaaa acatgcctgg aaataggtcc aatttgttga acttctcaca tttctcaaga 1260

cctgctacat tagttaaagc agctaagctt caaagtagta ctgggggttc aaatatctca 1320

ggttcaccta ttttagaagc taagggaaaa aaaggagaag aaaaagtgac aattggtgac 1380

aatcatgtta gtgcagcagc aactgaaaac ttcttaactt ctaagaagga taactttccc 1440

cactatccaa ctaatggggt atcttcccaa ctcgagtcaa gaccatctgg agccagcttt 1500

catgatagat catgtcaggc tgaacagtct gataatgcat tcagagattg ttcaagtaac 1560

aatgacaaca cccatgatca ttttaccagt gctaaggcaa ccaaggatat tgccgatggt 1620

gagagaaatg ttgaacatgg ggttgcttgc tcatctgtat gttctggtag cagtgcagag 1680

agaggatcaa gtgatcagcc tctcaaccta aagagaaaaa cccgagataa tgaggagttt 1740

gagtgtcgaa gtgaagtaag tgtgttgctt aaaggccatt atattttaac cttgttttgt 1800

agtatgttac ttaattttca ggatgttcaa cagtctgaca aggaaattct ttgttcagga 1860

tgttgaagaa gaatctgttg gtataaaaaa accttgtgct gctcgaggag gtacaggttc 1920

aaagagaagc cgagctgcag aggtgcataa tttatctgag cgggtaagca accattacca 1980

cagcatctga ggtttttggc aatattctgg ttgtagatct tgttgagaca ttctggatct 2040

aaatgctttc ttattcattt tctgcaaaca gaggcgaagg gataggatta atgagaagat 2100

gcgtgcatta caggaactta tacccaactg caacaaggta tgaaaaatct tggataagtt 2160

aaagtcatgc tgacaagttt gatttctatc gttatgtcca ttcttgttaa aaccatgtca 2220

ttaagcaatc aactttacga gttagtccaa aacttgaaaa tgtgattatt tatttaagct 2280

caatgcataa gcttgaataa gatttttctg atattatact atatatttca agttcccttg 2340

gaactgacat tgtttgatga agtgttgctg gtaatcttaa aattagccat cacctgtagt 2400

ttctcatttt catttttttg atgggttccc ttattgattg ctaggcggat aaagcttcga 2460

tgcttgatga agctattgaa tatttgaaga cacttcaact gcaagtacag gttagatgat 2520

agttttctat gcttgtgcat tttgcttctt aagaactgga aattgaagtc ataactacaa 2580

ttgctaactg cctcatccta tttgtttatt ttgcagataa tgtctgtggg agcagggctt 2640

tgcgtcccgc caatgatgtt ccctatgcag cacatgcatg gagcccagat gccacatttc 2700

tccccaatga gtttagggat gggtatgggg atgggatttg ggttgggtat gcttgagatg 2760

aatggtagat cttctggcta ccccatgtat ccaatgccct ctgtgcaagg agggcatttt 2820

ccctcacctc ctattcctgc ttccaccgct tatccaggaa tagctgtatc taatcgtcac 2880

gtatttgcac atcctggtca aggacttcca atgtcaattc ctcgagcatc tctgggtcct 2940

ttggccgggc aaccatcaac aggtgctgct gttcctatga atgttgcaag agaaggggtt 3000

ccggtggaga tacggggtgc acagccgaat ttggattcca aaactccagt acacaagaac 3060

tcacagatag tccaaaatgc tgaagctagc tgcccacaga atcagacatg cagtcaggtg 3120

tgtgttttta tgaaagactc gtgattttct atctattgaa caggagatca ggaaaaagta 3180

gataaagaga aacaaatgat agagatatta caattgcttt tttactgttt gaaatagttt 3240

ctacttttta ttttgtggtt ctgtttataa agatggcaag agttcgatgg gatcctaggc 3300

taattcaaca aagaaaagat cattcaatat gagatgattg ttttgtacaa cagtatgctt 3360

ttacttcata ggctgatact cgtaaatgta atagtcaagg tatagttaag gtatcagcat 3420

ttggaacttt aatttgagaa gaccatgtga tactatacat atgtaaatag ataagaaact 3480

tgattttttt ttcaaaaaaa tggcaaaata ctgtccagac tataatgcac caagggagaa 3540

atcacctagg gtcttttgtc tcctcatttg cttaaggctt ggtggacata gttattcaat 3600

atcctttgct ggtggttaag caggtacaag ttataatatt aaggtgcaaa caaagctggt 3660

tcgaatagaa attctaactt catcaggata ctttttgaga tattggtttc tcgtgaatct 3720

ggtttatttt ctttcatctt ctgttcctta agctaaggac taatactgta aagttctgca 3780

cctgtattat ctggggtcaa gtgtatttgt cttaacataa tcattgcttg cattcgtatc 3840

tgtatatttt gctttccgtt catggtgtag tcctccttgt tgtcagataa aatcagtgat 3900

gtatcataat aatttctatt tcctgctata ccaggtacaa gcaacaaatg aggttctgga 3960

aaaatcagca caaaaaaatg accaactccc tgatgtcatt ggtagtgcag caaataggtt 4020

gaccaaccga acaaatgtgc ccggaaatga agctggtgag tttgtgttag aaaacgaata 4080

acttcattca ttatgcgaag atggttcttc cctattatat tgtgaatctc tgccaaaaca 4140

ccctttgttg taatgtatat atggtccttc cttttgtcta catgacctgg aagataattg 4200

agtatttcac tgaatgcagg tcccagtttg tagacaactg taggttctga tcaaatgact 4260

gtttggttcc atcctagctg ggaagaagtc atttctcatt cagtggaagg tagcctcttt 4320

taactccgac cgttgtgcag ttctgagaat ttattgttac tggagatgaa tggtagagtt 4380

cccgaatgaa gttggtttat gcaactgcca tcagaatgta gacaaatgca tgcacagacc 4440

ttggtaatat aaagacacca taaggttctc cttccaatgt aacatcaaag atatctaaaa 4500

gcagggagca gcatctcaac aatgtagtgt gtatcagaca tcaacgttct tcaaataata 4560

aaatagcgca agcatttctc t 4581

<210> 2

<211> 715

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

Met Ala Ile Gly Lys Pro Glu Ser Gly Gln Gln Lys Ile Ser Ser Thr

1 5 10 15

Ser Asn Leu Ser Ser Phe Pro Glu Asn Asp Leu Val Glu Leu Lys Trp

20 25 30

Gln Asn Gly Gln Ile Val Met Gln Gly Gln Asn Ser Ser Ala Lys Lys

35 40 45

Ser Thr Val Pro Asn Asn Leu Pro Ser Ser Ala Ser Gly Asp Arg Asp

50 55 60

Lys Tyr Thr Gly Asn Ser Ser Thr Ser Lys Ile Gly Lys Phe Gly Leu

65 70 75 80

Met Asp Ser Met Leu Asn Asp Met Ser Leu Thr Val Pro Thr Gly Glu

85 90 95

Leu Asp Leu Ile Gln Glu Asp Glu Gly Val Pro Trp Leu Gly Tyr Pro

100 105 110

Ala Asp Asp Ser Leu Gln Gln Asp Tyr Cys Ala Gln Leu Leu Pro Glu

115 120 125

Ile Ser Gly Val Thr Ala Asn Glu Gln Ser Gly Gln Ser Val Phe Gly

130 135 140

Leu Ile Asn Lys Arg Gly Ser Ser Asp Lys Met Ile Gly Asp Ser His

145 150 155 160

Ser Val Pro Val His Asn Ala Val Asn Phe Glu Arg Arg Asn Thr Ser

165 170 175

Lys Val Ser Pro Ser Ser Arg Phe Ser Pro Leu Ser Ser Leu Pro Ser

180 185 190

Gln Lys Gly His Ala Ser Ile Pro Thr Leu Glu Ser Gly Val Ser Asp

195 200 205

Val Phe Ser Ser Lys Asn Ser Asn Thr Pro Leu Ser Val Leu Gly Glu

210 215 220

Ser Asn Gln Ser Lys Ala Ser Ala Gly Asp Ala Lys Ser Asn Arg Ile

225 230 235 240

Gln Lys Gln Asn Met Pro Gly Asn Arg Ser Asn Leu Leu Asn Phe Ser

245 250 255

His Phe Ser Arg Pro Ala Thr Leu Val Lys Ala Ala Lys Leu Gln Ser

260 265 270

Ser Thr Gly Gly Ser Asn Ile Ser Gly Ser Pro Ile Leu Glu Ala Lys

275 280 285

Gly Lys Lys Gly Glu Glu Lys Val Thr Ile Gly Asp Asn His Val Ser

290 295 300

Ala Ala Ala Thr Glu Asn Phe Leu Thr Ser Lys Lys Asp Asn Phe Pro

305 310 315 320

His Tyr Pro Thr Asn Gly Val Ser Ser Gln Leu Glu Ser Arg Pro Ser

325 330 335

Gly Ala Ser Phe His Asp Arg Ser Cys Gln Ala Glu Gln Ser Asp Asn

340 345 350

Ala Phe Arg Asp Cys Ser Ser Asn Asn Asp Asn Thr His Asp His Phe

355 360 365

Thr Ser Ala Lys Ala Thr Lys Asp Ile Ala Asp Gly Glu Arg Asn Val

370 375 380

Glu His Gly Val Ala Cys Ser Ser Val Cys Ser Gly Ser Ser Ala Glu

385 390 395 400

Arg Gly Ser Ser Asp Gln Pro Leu Asn Leu Lys Arg Lys Thr Arg Asp

405 410 415

Asn Glu Glu Phe Glu Cys Arg Ser Glu Asp Val Glu Glu Glu Ser Val

420 425 430

Gly Ile Lys Lys Pro Cys Ala Ala Arg Gly Gly Thr Gly Ser Lys Arg

435 440 445

Ser Arg Ala Ala Glu Val His Asn Leu Ser Glu Arg Arg Arg Arg Asp

450 455 460

Arg Ile Asn Glu Lys Met Arg Ala Leu Gln Glu Leu Ile Pro Asn Cys

465 470 475 480

Asn Lys Ala Asp Lys Ala Ser Met Leu Asp Glu Ala Ile Glu Tyr Leu

485 490 495

Lys Thr Leu Gln Leu Gln Val Gln Ile Met Ser Val Gly Ala Gly Leu

500 505 510

Cys Val Pro Pro Met Met Phe Pro Met Gln His Met His Gly Ala Gln

515 520 525

Met Pro His Phe Ser Pro Met Ser Leu Gly Met Gly Met Gly Met Gly

530 535 540

Phe Gly Leu Gly Met Leu Glu Met Asn Gly Arg Ser Ser Gly Tyr Pro

545 550 555 560

Met Tyr Pro Met Pro Ser Val Gln Gly Gly His Phe Pro Ser Pro Pro

565 570 575

Ile Pro Ala Ser Thr Ala Tyr Pro Gly Ile Ala Val Ser Asn Arg His

580 585 590

Val Phe Ala His Pro Gly Gln Gly Leu Pro Met Ser Ile Pro Arg Ala

595 600 605

Ser Leu Gly Pro Leu Ala Gly Gln Pro Ser Thr Gly Ala Ala Val Pro

610 615 620

Met Asn Val Ala Arg Glu Gly Val Pro Val Glu Ile Arg Gly Ala Gln

625 630 635 640

Pro Asn Leu Asp Ser Lys Thr Pro Val His Lys Asn Ser Gln Ile Val

645 650 655

Gln Asn Ala Glu Ala Ser Cys Pro Gln Asn Gln Thr Cys Ser Gln Val

660 665 670

Gln Ala Thr Asn Glu Val Leu Glu Lys Ser Ala Gln Lys Asn Asp Gln

675 680 685

Leu Pro Asp Val Ile Gly Ser Ala Ala Asn Arg Leu Thr Asn Arg Thr

690 695 700

Asn Val Pro Gly Asn Glu Ala Gly Pro Ser Leu

705 710 715

<210> 3

<211> 2044

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

agttgtaatg acgaggctta aaacttgtcc ttaagagatg tcacaatatt cgaggcactc 60

aaagaatatt tatagaaaat tttgataact cattttatta ctttctccgt ttcaaaaaga 120

ttcatctagt ttaacttgaa atggagttta ataaaagaaa gaagatttat taatctcgtg 180

gttataattt aaagttatat taaatgtact aaaatacctt ttaatcttgt ggtcttaaaa 240

tgtatcacgt aaaaagttaa aattaaagta tcatcaaaaa taaaaagaga tcattctttt 300

tgaaacagac aaaaaagaaa aaaaaattat tctttttgaa acagagagaa taataatgat 360

ttgcacgtga tcatcccata attttctttc ttattttttc tacaacattt ttctagtaca 420

tcttttgtaa ttataaaaca agaagtgtaa taggcattgc gatcatatcg ataacaagat 480

atgcaaggta aaaggtcttc tactataata atataatttg ttatattgtc ttgccaaaca 540

aaacataatt ggtaattaaa aagtcaaaaa tcaattaaaa gaatcaaatc gaattgaact 600

acttttaaat ttaatttgta tatctatata ttgaaagtca aaagttcttg tgattcattt 660

taatataaaa ttaataaata aagttataaa cttttataaa aaaaatacat tattcatttt 720

gatttatcag atacacctct caatcaacac aagtaaggtg atgattatta tatgttacat 780

tttgaatata ataaatttaa tatattgaga taattataat taataattaa aataaataaa 840

aaattctctc taatatttca aattaagaat tggcctaatt tgtcaataaa atgattaaaa 900

attcgaagtc ttatttaaaa tttaataaaa aaaaattaga taattttttt ttctctgtgt 960

taacttacat gatatcgaag tgtatgaaaa ctgatccaga caccatcact ataaaaaaaa 1020

aaattcgacg gaggtgtata aacaaacaat attacgtaac aattactact cctaaaagga 1080

taaacaaacc gcggttaagt tatttaagtg tacttttgtt aaccatggtt aaagacaaaa 1140

cagagttaga agttctttta tacttttttt ttttctgtgt caagttaaaa ggcaaagtgc 1200

tatacatttt tgtgctttca gtaatatact gagagagttc cttcgttcct cggccacctg 1260

caaattcgca aacctttcgc cgccttctac tactcccaaa atcctcactt tgcaatcttt 1320

ttttacttct ctctctaaat cttctttaca ttttcaagaa gtacagttgt ttttcttgga 1380

gctcaaaaac ccaagtgact tgggtttagc tgtgaagttt tccacttttt cggaatgcta 1440

tgttgagcat gtggactccc aaatattggt gatttcaaga aaaaaaaatt gtatctttga 1500

ggaaaatact agttcaagaa taagaatttc ttgcagaaac ttgggtgttt ttttcttttt 1560

tgggtgagag ctttctactt tagtgaactg atcttgaagc tgagtgttaa tcttggtgtg 1620

tatattgaag aggtgggtgt tgttttatgt taagcaatag ttgtttgtat tattttatat 1680

aaataataat tgtgggttgt taattaatta aggaaatctt gaagggtttt atactctaat 1740

gattgaaatt gaataaaaag aattgaactt tttaactcaa agaaagctca agttggttgg 1800

tgtattattt taaagtatct gaatgaagtc tcattaaaca attgggggtt tgactggtaa 1860

cttaatattt atatctttac tactgttatg ggttttatat aaatttactg attaggacat 1920

ttgtttatgg aaacagtttt tggtttacag tattatatgc ttgaataaag tctaaaatgt 1980

ttgtattgtt gttgaaaaga agtgttactg gaccaggtgt ggaaggcttc ccaataatgc 2040

ttga 2044

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

tggtcggaat gggacagaag 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

ctcagtcagg agaacagggt 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

agaaggataa ctttccccac t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 7

gcactgctac cagaacatac a 21

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 8

cgcggatcca tggctattgg gaagcctg 28

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 9

gctctagaca aactgggacc agcttcat 28

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 10

aaaccttgtg ctgctcgagg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 11

agctgcagag gtgcataatt 20

<210> 12

<211> 71

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 12

ggactataag gaccacgacg gagactacaa ggatcatgat attgattaca aagacgatga 60

cgataagtaa a 71

<210> 13

<211> 79

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 13

agcttttact tatcgtcatc gtctttgtaa tcaatatcat gatccttgta gtctccgtcg 60

tggtccttat agtcctgca 79

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 14

cgcggatcca tggctattgg gaagcctg 28

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 15

gctctagaca aactgggacc agcttcat 28

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 16

ttttcctgag aatgacttgg 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 17

gagggagaaa cctttgatgt 20

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 18

agcggataac aatttcacac agga 24

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 19

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 20

ccagtgctaa ggcaacca 18

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 21

aatcctatcc cttcgcctc 19

Claims

1.SlPIF3基因在创建番茄核雄性不育系中的应用，所述SlPIF3基因的野生型核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要1所述的应用，其特征在于，该应用为：敲除番茄基因组中的SlPIF3基因或沉默SlPIF3的表达活性，使得发育过程中花粉败育，经纯化后获得番茄核雄性不育系。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过以下任意一种方式敲除SlPIF3基因或沉默SlPIF3的表达活性：(1)利用物理或甲基磺酸乙酯(EMS)诱变，使得编码所述SlPIF3的核苷酸部分或完全缺失；(2)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术部分修饰SlPIF3的核苷酸序列；(3)利用物理或甲基磺酸乙酯EMS诱变、CRISPR/Cas9基因编辑技术修饰SlPIF3表达启动子或调控序列以抑制编码所述SlPIF3基因的表达；(4)上述(1)-(3)中的任意组合。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述纯化方法如下：以花粉败育的不育株系为母本，以番茄优良自交系材料为父本杂交，获得F₁代植株可育，以优良自交系材料为轮回亲本，进行回交，PCR检测后代出现两种基因型，AA：Aa＝1:1,留下杂合的可育株继续回交，重复回交使杂合的可育株综合性状同轮回亲本相似，再将其自交，自交后代育性3:1分离，获得纯合不育株系。

5.一种番茄核雄性不育系的育性恢复方法，其特征在于，所述番茄核雄性不育系通过敲除番茄基因组中的SlPIF3基因或沉默SlPIF3的表达活性，使得发育过程中花粉败育，经纯化后获得；其中，所述SlPIF3基因的野生型核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述育性恢复方法为：对所述番茄核雄性不育系的花蕾外源喷施生长素，以恢复部分花粉育性；所述生长素包括IAA、NAA。

6.一种番茄核雄性不育系的保持方法，其特征在于，所述番茄核雄性不育系通过敲除番茄基因组中的SlPIF3基因或沉默SlPIF3的表达活性，使得发育过程中花粉败育，经纯化后获得；其中，所述SlPIF3基因的野生型核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQID NO.2所示；所述保持方法为：对所述番茄核雄性不育系的花蕾外源喷施生长素，部分花粉育性恢复，自交保留种子，继续种植获得不育株系。