BR112020006386A2 - uso de um gene de milho, método para preparar um milho transgênico, uso de material biológico, gene mutante, proteína codificada pelo gene mutante, uso do gene mutante, promotor específico de espigas jovens, uso do promotor específico, marcador molecular de dna, iniciador, reagente ou kit de detecção, e, uso do marcador molecular de dna, do iniciador ou do reagente ou kit de detecção - Google Patents
uso de um gene de milho, método para preparar um milho transgênico, uso de material biológico, gene mutante, proteína codificada pelo gene mutante, uso do gene mutante, promotor específico de espigas jovens, uso do promotor específico, marcador molecular de dna, iniciador, reagente ou kit de detecção, e, uso do marcador molecular de dna, do iniciador ou do reagente ou kit de detecção Download PDFInfo
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Abstract
É fornecido o uso de um gene ZmABCG20 de milho na regulação da fertilidade masculina de culturas. A sequência de DNA genômico de ZmABCG20 na variedade de milho B73 é apresentada na SEQ ID NO: 1 e a sequência de proteína codificada é apresentada na SEQ ID NO: 3. Também é fornecido um mutante zmabcg20-1 do gene ZmABCG20 e usos do mesmo e a sequência do gene mutado é apresentada na SEQ ID NO: 7. Também é fornecido um método de identificação de marcador molecular do gene mutado. Também é fornecido um marcador molecular de DNA associado à fertilidade masculina em milho, o marcador molecular de DNA sendo localizado nas bases na sequência de TGCA nas posições 326 a 329 após o códon de início da sequência de ácido nucleico do gene ZmABCG20 de milho e a linhagem de milho com 4 pb deletadas exibe esterilidade genética masculina recessiva. O marcador molecular de DNA da presente invenção pode ser usado para identificar ou melhorar recursos de germoplasma de milho masculinos estéril e similares.
Description
“USO DE UM GENE DE MILHO, MÉTODO PARA PREPARAR UM MILHO TRANSGÊNICO, USO DE MATERIAL BIOLÓGICO, GENE MUTANTE, PROTEÍNA CODIFICADA PELO GENE MUTANTE, USO DO GENE MUTANTE, PROMOTOR ESPECÍFICO DE ESPIGAS JOVENS, USO DO PROMOTOR ESPECÍFICO, MARCADOR MOLECULAR DE DNA, INICIADOR, REAGENTE OU KIT DE DETECÇÃO, E, USO DO MARCADOR MOLECULAR DE DNA, DO INICIADOR OU DO REAGENTE OU KIT DE DETECÇÃO” Referência Cruzada
[001] O presente pedido reivindica a prioridade do pedido de patente chinês nº 201710919714.6 intitulado “Use of maize gene ZMnABCG20 in regulating crop male fertility" depositado em 30 de setembro, 2017 e o pedido de patente chinês nº 201710919712.7 intitulado “DNA molecular marker associated with maize male fertility and use thereof” depositado em de setembro de 2017, sendo que toda a descrição é incorporada aqui por referência em sua totalidade. Campo Técnico
[002] A presente invenção pertence aos campos da engenharia genética e do melhoramento vegetal molecular, e se refere especificamente ao uso do gene ZMnABCG?20 de milho na regulação da fertilidade masculina da cultura e de marcadores moleculares de DNA associados à fertilidade masculina do milho e o uso do mesmo. Fundamentos da Técnica
[003] A mutação estéril masculina da planta é um fenômeno muito comum na natureza. Os mutantes estéreis masculinos foram encontrados em pelo menos 617 espécies de 162 gêneros de 43 famílias. Geneticamente, a esterilidade masculina da planta é dividida em três tipos, isto é, esterilidade masculina genética, esterilidade masculina citoplasmática e esterilidade masculina citoplasmática genética, em que 1) a esterilidade masculina genética é causada por mutações em genes nucleares, incluindo mutação dominante e mutação recessiva, mutação de gene esporófito e mutação de gene gametófito.
A mutação dominante e a mutação de gene gametófito só podem ser herdadas por gametas femininos, e a mutação recessiva pode ser herdada por gametas femininos e masculinos, e segue a lei de Mendel.
Atualmente, alguns genes estéreis masculinos geneticamente recessivos esporófitos foram clonados, tal como ms2 de Arabidopsis, ms45 de milho e mill de arroz (Aarts et al., 1997, The Arabidopsis MALE STERILITY 2 protein shares similarity with reductases in elongation/condensation complexes, Plant Journal, 12: 615-623; Albertsen, 2006, Male tissue-preferred regulatory sequences of MS45 gene and method of using same, documento de patente de número: US7154024B2; e Hong et al., 2012, Somatic and reproductive cell development in rice anther is regulated by a putative glutaredoxin, Plant Cell, 24: 577-588); alguns genes estéreis masculinos geneticamente recessivos gametófitos também foram clonados, tais como pólen sidecar e pólen gemini, dois mutantes mitóticos de micrósporos de Arabidopsis (Oh et al., 2010, The SIDECAR POLLEN gene encodes a microspore-specific LOB/AS2 domain protein required for the correct timing and orientation of asymmetric cell division, Plant Journal, 64: 839-50; e Park et al., 1998, The Arabidopsis thaliana gametophytic mutation gemini pollen1 disrupts microspore polarity, division asymmetry and pollen cell fate, Development, 125: 3789-99); e um gene MS44 esporófito masculino estéril geneticamente dominante também foi clonado em milho (Cigan e Albertsen, 1998, Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants, USST50868); 2) A esterilidade masculina citoplasmática é controlada por genes citoplasmáticos, e não há gene restaurador nuclear correspondente, que pertença à herança materna; 3) a esterilidade masculina citoplasmática genética é controlada tanto pelo gene citoplasmático quanto pelo gene nuclear, e sua essência é o resultado da discordância entre material genético citoplasmático e material genético nuclear. O citoplasma estéril é causado por alguns genes mitocondriais que sofreram mutação, mas existem genes restauradores — nucleares — correspondentes que podem inibir genes citoplasmáticos estéreis. Os genes citoplasmáticos estéreis podem produzir uma nova proteína que afeta a função normal das mitocôndrias (Chen and Liu, 2014, Male sterility and fertility restoration in crops, Annu Rev Plant Biol, 65: 5.1-5.28). Em termos de genes restauradores de fertilidade, os genes Rf-1, Rf-2, Rf-4, Rf-5 e semelhantes foram clonados em arroz (Komori et al., 2004, Map-based cloning of a fertility restorer gene, RF-1, in rice (Oryza sativa L.), Plant Journal, 37: 315-325; Itabashi er al., 2011, The fertility restorer gene, RP, for Lead Rice-type cytoplasmic male sterility of rice encodes a mitochondrial glycine-rich protein, Plant Journal, 65: 359-367; Tang et al., 2014, The rice restorer Rf4 for wild-abortive cytoplasmic male sterility encodes a PPR protein that functions in reduction of WA352 transcripts, Molecular Plant, 7: 1497-500; e Hu et al., 2012, The rice pentatricopeptide repeat protein RF5 restorers fertility in Hong-Lian Cytoplasmic male-sterile lines via a complex with the glycine-rich protein GRP162, Plant Cell, 24: 109-22).
[004] O milho se tornou a primeira cultura alimentar do mundo e da China, é uma importante matéria-prima para alimentação, processamento alimentar e bioenergia, e também é um dos vegetais com maior consumo no exterior. Atualmente, quase todo o milho cultivado internamente é milho híbrido. A polinização híbrida do milho é realizada principalmente por emasculação artificial, que demanda muito trabalho e é cara; e como a emasculação danifica as folhas superiores do milho, o rendimento da produção de sementes será reduzido. O uso de linhagens estéreis masculinas para a produção de sementes pode resolver os problemas causados pela emasculação artificial. No entanto, as linhagens estéreis masculinas citoplasmáticas que já foram utilizadas no milho têm algumas deficiências como a seguir: em primeiro lugar, uma vez que as linhagens estéreis masculinas citoplasmáticas requerem genes restauradores específicos para restaurar a fertilidade, a utilização de recursos de germoplasma é muito baixa, o que limita a eficiência de melhoramento vegetal de excelentes variedades; em segundo lugar, a fertilidade de algumas linhagens estéreis é instável, e a fertilidade pode ser restaurada sob certas condições, afetando assim a pureza dos híbridos; finalmente, devido ao único genótipo citoplasmático, ocorre um grande surto de doença da mancha da folha de milho, o que resulta diretamente na retirada da tecnologia de esterilidade masculina citoplasmática do mercado. A esterilidade genética masculina comum pode evitar esses problemas, e se for aplicada ao milho, pode não apenas economizar custos de mão-de-obra necessários para emasculação artificial, mas também aumentar o rendimento da produção de sementes.
[005] A planta da família de proteinas ABC é um tipo de transportador de membrana que está localizado na membrana celular e é responsável pelo transporte de transmembrana de metabólitos, e o transportador de ABCG é a maior subfamília no mesmo. As proteínas ABCG podem ser divididas principalmente em dois tipos de acordo com suas características estruturais, um tipo é uma proteína de tamanho real contendo dois domínios de união de nucleotídeos e duas regiões de transmembranas, que podem formar uma estrutura completa de transporte de transmembrana sozinha para completar o transporte de substrato; e o outro tipo é uma proteína de tamanho médio que possui apenas um domínio de união de nucleotídeo e uma região de transmembrana, que precisa ser combinada com outra molécula de proteína de tamanho médio para formar uma unidade de transporte completa (Verrier et al., 2008, Plant ABC proteins — a unified nomenclature and updated inventory. Cell, Trends in Plant Science, 13 (4): 151-159.). O gene AtABCG26 de Arabidopsis e o gene OSABCG15 ortólogos no arroz submetem à formação de código um transportador de transmembrana de um precursor de esporopolenina do componente da parede de pólen, que é expresso no tapetum das anteras e transporta o precursor de esporopolenina da célula de tapetum para a câmara da antera para sintetizar a esporopolenina na parede de células de pólen O mutante atabcg26 exibe uma quantidade extremamente baixa de pólen e fertilidade masculina. O mutante osabcg15 do arroz é completamente estéril e não tem pólen. Além disso, o arroz com OsABCG26 que sofreu mutação também exibe esterilidade masculina completa, com um fenótipo similar a osabcg15 (Zhao et al., 2016, ATP binding cassette G transporters and plant male reproduction. Plant Signal and Behavior, 11 (3): el 136764. doi: 10.1080/15592324.2015.1136764)). Através da análise de bioinformática genômica, Pang et al. identificaram 54 genes ABCG de espécies de milho (Pang et al., 2013, Inventory and general analysis of the ATP-binding cassette (ABC) gene superfamily in maize (Zea May L.). Gene, 2013, 526 (2): 411- 428), mas nenhum gene associado à fertilidade masculina foi encontrado até agora. Sumário da Invenção
[006] O objetivo da presente invenção é o de fornecer o uso de um gene ZmMABCG20 de milho na regulação da fertilidade masculina das culturas.
[007] Outro propósito da presente invenção é o de fornecer um zmabcg20-1 mutante do gene ZnABCG?20 de milho e o uso do mesmo.
[008] A fim de alcançar os propósitos da presente invenção, em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece o uso do gene ZnABCG20 de milho na regulação da fertilidade masculina das culturas, em que a sequência de cDNA do gene ZNnABCG20 é: 1) a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 2; 11) uma sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 2 com um ou mais nucleotídeos substituídos, deletados e/ou adicionados na mesma, que expressam a mesma proteína funcional;
ii) uma sequência de nucleotídeos que se hibridiza com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 2 sob condições de estringência e expressa a mesma proteína funcional, as condições de estringência são dadas da seguinte forma: hibridização em um 0,1 x SSPE contendo 0,1% de SDS ou um 0,1 x SSC contendo 0,1% de SDS a 65º C, e lavagem de uma membrana com a solução; ou iv) uma sequência de nucleotídeos que tenha 85% ou mais homologia à sequência de nucleotídeo de 1), ii) ou ii) e que expresse a mesma proteína funcional.
[009] No uso supracitado, a regulação se refere à fabricação de culturas com fertilidade masculina. O uso compreende: 1) permitir que as culturas contenham o gene ZmMABCG20; ou 2) permitir que as culturas expressem a proteína submetida à formação de código pelo gene ZnABCG20.
[0010] Na presente invenção, em primeiro lugar, as sementes da variedade de milho JING KE NUO 2000 (geração MO) são tratadas por mutagênese de radiação de cobalto 60, e as sementes tratadas são plantadas para obter plantas da geração Ml. As plantas da geração M1 produzem sementes (geração M2) por autofecundação, as plantas da geração M2 são plantadas, e a identificação morfológica, histológica e genética das plantas da geração M2 são realizadas para triagem de plantas estéreis. Em seguida, as plantas estéreis são submetidas ao sequenciamento genético e análise de sequência de DNA para fazer a verificação em nível molecular. Finalmente, plantas individuais homozigotas estéreis são obtidas e usadas para melhoramento vegetal híbrida e pesquisa de biotecnologia.
[0011] O gene ZmMABCG20 de milho (gene para controlar o desenvolvimento de pólen) fornecido na presente invenção exibe esterilidade masculina completa após a mutação. Sua sequência de nucleotídeos é definida na SEQ ID NO: | ou SEQ ID NC: 4; sua sequência de DNA da região de codificação é definida na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 5; e a sequência de proteína submetida à formação de código está definida na SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 6.
[0012] Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece o uso do gene ZmABCG20 de milho na preparação de uma planta transgênica. Por exemplo, um vetor de expressão recombinante carreando o gene ZnABCG20 de cDNA ou a sequência genômica é transferida para o calo de um milho tipo selvagem, o material transformado é submetido a cocultivo, triagem, diferenciação, enraizamento, aclimatação e transplante de plântulas transgênicas, e triagem para obter uma planta transgênica, e então o milho transgênico é hibridizado com milho estéril masculino para restaurar a fertilidade do milho estéril masculino.
[0013] Em um terceiro aspecto, a presente invenção fornece o uso do gene ZmABCG?20 de milho na restauração da fertilidade de uma planta estéril masculina, em que o traço estéril masculino é causado por um mutante do gene.
[0014] Em um quarto aspecto, a presente invenção fornece um método para preparar um milho geneticamente transgênico estéril masculino por meio da inibição da atividade do gene ZMnABCG20 de milho, no qual o silenciamento genético, a supressão genética, o nocaute genético ou a tecnologia de mutação genética direcionada é usada para reduzir a atividade do gene ZmnABCG20 de milho na transcrição e tradução ou na atividade da proteína obtida após a transcrição, para obter um núcleo de milho transgênico estéril masculino.
[0015] Por exemplo, a sequência de RNAi carreando o gene ZmMABCG?20 específico da sequência de cDNA é associada de modo operável a um promotor constitutivo ou um promotor de expressão específico de órgão de flor e transferida para um calo da planta, e o material transformado é submetido a cocultivo, triagem, diferenciação, enraizamento, aclimatação e transplante de plântulas transgênicas, e triagem para obter um milho geneticamente transgênico estéril masculino.
[0016] Em uma modalidade específica da presente invenção, a sequência de DNA alvo à qual o RNAi atua é apresentada na SEQ ID NO: 23.
[0017] Em um quinto aspecto, a presente invenção fornece o uso do material biológico obtido pelo método acima mencionado no melhoramento vegetal melhorado da cultura e produção de sementes.
[0018] Em um sexto aspecto, a presente invenção fornece o uso do gene ZmMABCG20 de milho no melhoramento vegetal melhorado da cultura e produção de sementes.
[0019] No uso acima mencionado, uma planta que contém ou que expressa o gene ZmMABCG20, ou uma planta, que tem o gene ZnNnABCG20 inativado e é obtida de acordo com o método descrito acima, é hibridizada com a cultura da mesma espécie com excelentes traços agronômicos.
[0020] Na presente invenção, a cultura é uma cultura autopolinizada ou de polinização cruzada, incluindo, mas não se limitando ao milho, trigo ou arroz, e preferivelmente milho.
[0021] Na presente invenção, os excelentes traços agronômicos incluem, mas não se limitam a, aumento de rendimento, melhora na qualidade, resistência a pragas e doenças, resistência ao estresse, resistência à estocagem e semelhantes.
[0022] Em um sétimo aspecto, a presente invenção fornece um inibidor para inibir a atividade do gene ZnABCG20. O inibidor é pelo menos um selecionado a partir de shRNA, siRNA, dsRNA, miRNA, cDNA, RNA/DNA antissentido, baixos compostos moleculares, peptídeos, anticorpos e semelhantes.
[0023] Em um oitavo aspecto, a presente invenção fornece um cassete de expressão, um vetor de expressão, ou um vetor de clonagem que submete à formação de código o inibidor de molécula de ácido nucleico acima mencionado.
[0024] Em um nono aspecto, a presente invenção fornece um gene zmabcg20-1 mutante do gene ZMABCG20 de milho, a sequência de ácido nucleico do mesmo é: i) um gene mutante formado pela deleção de 4 bb TGCA localizado nas posições 326 a 329 após o códon de início na sequência de ácido nucleico do gene ZnABCG?2 de milho; ii) a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 7; iii) uma sequência de nucleotídeos apresentada em i) ou ii) com um ou mais nucleotídeos substituídos, deletados e/ou adicionados, que expressam a mesma proteína funcional, e que contém a deleção de 4 bp TGCA na mesma posição que o gene ZnABCG20 ; iv) uma sequência de nucleotídeos que se hibridiza com a sequência apresentada em 1) ou ii) em condições de estringência, expressa a mesma proteína funcional, e contém a deleção de 4 bb TGCA na mesma posição do gene ZmABCG20, as condições de estringência são dadas da seguinte forma: hibridização em um 0,1 x SSPE contendo 0,1% de sDS ou um 0,1 x SSC contendo 0,1% de SDS a 65º C, e lavagem de uma membrana com a solução; ou v) uma sequência de nucleotídeos que tenha 85% ou mais de homologia com a sequência de nucleotídeo de 1) ou il), expresse a mesma proteína funcional e contenha a deleção de 4 bb TGCA na mesma posição do gene ZNnABCG20.
[0025] A sequência de DNA da região de codificação do gene zmabcg20-1 de milho é apresentada na SEQ ID NO: 8. A proteína submetida à formação de código pelo gene de milho zmabcg20-1 tem uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9, ou uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9 com um ou vários aminoácidos substituídos, deletados e/ou adicionados, que tem a mesma função.
[0026] Em um décimo aspecto, a presente invenção fornece o uso do gene zmabcg20-1 na regulação da fertilidade do milho, e o uso compreende: 1) permitir que as culturas contenham o gene zmabcg20-1; ou 2) permitir que as culturas expressem a proteína submetida à formação de código pelo gene zmabcg20-1.
[0027] No uso como mencionado acima, o milho que contém ou que expressa o gene zmabcg20-1 mutante permite exibir esterilidade masculina genética recessiva.
[0028] Em um décimo primeiro aspecto, a presente invenção fornece o uso do gene zmabcg20-1 na melhora do melhoramento vegetal e produção de sementes de milho.
[0029] No uso como mencionado acima, o milho que contém ou que expressa o gene zmabcg20-1 mutante é hibridizado com um milho com excelentes traços agronômicos.
[0030] Em um décimo segundo aspecto, a presente invenção fornece um cassete de expressão, um vetor de expressão ou um vetor de clonagem que compreende uma sequência de ácido nucleico contendo o gene zmabcg20-1 como descrito.
[0031] Em um décimo terceiro aspecto, a presente invenção fornece uma bactéria engenheirada, uma célula hospedeira ou uma linhagem de célula transgênica contendo o gene zmabcg20-1, ou o cassete de expressão, o vetor de expressão ou o vetor de clonagem.
[0032] Em um décimo quarto aspecto, a presente invenção fornece o uso de um material biológico que contém ou que expressa o gene zmabcg20-1 na preparação de um milho transgênico.
[0033] Em um décimo quinto aspecto, a presente invenção fornece um promotor específico de espigas jovens de flores masculinas ou espigas jovens de plantas andróginas, e o promotor é: 1) a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 12;
11) uma sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 12 com um ou mais nucleotídeos substituídos, deletados e/ou adicionados na mesma, e tendo a mesma função; ij) uma sequência de nucleotídeos que se hibridiza com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 12 em condições de estringência e tem a mesma função, as condições de estringência são dadas da seguinte forma: hibridização em um 0,1 x SSPE contendo 0,1% de SDS contendo 0,1% de SDS a 65º C, e lavagem de uma membrana com a solução; ou iv) uma sequência de nucleotídeos que tenha 85% ou mais homologia com sequência de nucleotídeo de i), il) ou iii) e tenha a mesma função.
[0034] Em um décimo sexto aspecto, a presente invenção fornece um cassete de expressão, um vetor de expressão ou um vetor de clonagem, que compreende um ácido nucleico contendo uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 12.
[0035] Em um décimo sétimo aspecto, a presente invenção fornece uma bactéria engenheirada ou uma linhagem celular transgênica, que contém o promotor específico, ou o cassete de expressão ou vetor.
[0036] Em um décimo oitavo aspecto, a presente invenção fornece o uso do promotor específico na regulação da expressão dos genes a jusante.
[0037] Em um décimo nono aspecto, a presente invenção fornece o uso do promotor específico na preparação de uma planta transgênica.
[0038] Por exemplo, a sequência do promotor é associada de modo operável a um gene alvo, a planta alvo é transformada com uma construção obtida, e o promotor direciona o gene alvo a ser expresso especificamente em espigas jovens de flores masculinas ou espigas jovens de plantas andróginas.
[0039] Em um vigésimo aspecto, a presente invenção fornece um marcador molecular de DNA associado à fertilidade masculina de milho. O marcador molecular de DNA está localizado nas bases na sequência de TGCA nas posições 326 a 329 após o códon de início na sequência de ácido nucleico do gene ZMABCG20 de milho, e a linhagem de milho com o 4 bp deletado exibe a esterilidade masculina genética recessiva.
[0040] Em um aspecto vinte e um, a presente invenção fornece um iniciador que amplifica especificamente o marcador de molécula de DNA, que compreende: um iniciador a montante 3326 Fl: 5*- CCAGACGAGGGCAGACCAG-3' (SEQ ID NO: 10) e um iniciador a jusante 3326 RI: 5- GATCTCGCCAGGGTCCACA-3' (SEQ ID NO: 11).
[0041] Em um vigésimo segundo aspecto, a presente invenção fornece um reagente de detecção ou kit contendo os iniciadores 3326 F1 e 3326 RI.
[0042] Em um vigésimo terceiro aspecto, a presente invenção fornece o uso do marcador molecular de DNA, do iniciador, ou do reagente de detecção ou kit no melhoramento vegetal assistido do marcador molecular de milho.
[0043] Em um vigésimo quarto aspecto, a presente invenção fornece o uso do marcador molecular de DNA, do iniciador, ou do reagente de detecção ou kit na identificação ou melhoramento vegetal de recursos de germoplasma de milho estéril masculino. O método específico é o seguinte:
[0044] O DNA genômico do milho a ser testado é extraído, e os iniciadores 3326 F1 e 3326 RI são usados para realizar a reação de amplificação do PCR. O produto de amplificação é detectado por eletroforese. Se uma banda característica com tamanho de 79 bp apareceu no produto de amplificação, a fertilidade do milho a ser testado é normal, e o genótipo ZmMABCG20 correspondente é um tipo selvagem. Se uma banda característica com tamanho de 75 bp apareceu no produto de amplificação, o milho a ser testado é uma variedade estéril masculina, e o genótipo ZmMABCG20 correspondente é um mutante zmabcg20-1. Se o produto de amplificação tinha duas bandas de 79 bp e 75 bp, o milho a ser testado é um genótipo heterozigoto.
[0045] Em um vigésimo quinto aspecto, a presente invenção fornece o uso do marcador molecular de DNA, do iniciador, ou do reagente de detecção ou do kit na tipificação do gene ZmABCG20 de milho.
[0046] As vantagens do gene ZMABCG20 fornecidas pela presente invenção são as seguintes: 1) A mutação ZMABCG20 foi encontrada pela primeira vez para induzir um fenótipo estéril masculino no milho, o que é de grande importância para a pesquisa sobre o uso e função deste gene, bem como a pesquisa sobre o mecanismo de regulação da fertilidade masculina do milho.
2) A mutação de ZmMABCG20 afeta apenas a fertilidade masculina e pode causar esterilidade masculina completa, mas não tem efeito sobre a fertilidade feminina e masculina e outros traços agronômicos. É adequado para aplicações industriais, como o melhoramento vegetal híbrido, e preparação e produção de sementes.
3) O ZmABCG20 é expresso apenas em espigas jovens de flores masculinas de plantas, com grande especificidade temporal e tecidual. Seu promotor pode ser usado para direcionar qualquer gene a ser especificamente expresso em espigas jovens de flores masculinas.
[0047] As vantagens do mutante zmabcg20-1 fornecido pela presente invenção são as seguintes: 1) O zmabcg20-1 é o primeiro mutante de ZMABCG20 relatado, o que é de grande importância para a pesquisa sobre o uso e função deste gene.
2) Este mutante afeta apenas a fertilidade masculina e causa esterilidade masculina completa, mas não tem efeito sobre a fertilidade feminina e masculina e outros traços agronômicos.
3) Este mutante é um mutante de gene deletado causado pela deleção de 4 bp, e não há risco potencial de restauração da fertilidade e nenhum risco de instabilidade genética.
4) O mutante é formado pela deleção de 4 bp de um gene, sem afetar a função de genes adjacentes em ambos os lados de ZMnABCG20.
5) O mutante envolve mutação por meio de deleção de 4 bp, e assim um marcador Indel pode ser projetado para completar a detecção em larga escala por PCR comum e eletroforese; enquanto isso, o marcador também pode ser projetado como um marcador de detecção de chip genético.
6) O antecedente genético do mutante é uma variedade principal atualmente plantada na China, que pode ser usada diretamente no melhoramento vegetal de variedades chinesas de milho sem um longo processo de melhoria.
Breve Descrição dos Desenhos
[0048] A Figura 1 mostra as flores masculinas de um tipo selvagem e o mutante zmabcg20-1 e a espiga de zmabcg20-1 de acordo com o Exemplo 2 da presente invenção.
[0049] A Figura 2 mostra os resultados de manchamento de 12-KI das anteras e pólens de um tipo selvagem e do mutante zmabcg20-1 de acordo com o Exemplo 3 da presente invenção.
[0050] A Figura 3 mostra os resultados de PCR quantitativo fluorescente em tempo real do gene ZmMABCG20 em espigas jovens em diferentes estágios e em diferentes tecidos de JING KE NUO 2000 de acordo com o Exemplo 7 da presente invenção.
[0051] A Figura 4 é um diagrama esquemático da estrutura do gene ZmMABCG?20 e dos locais de mutação de zmabcg20-1, que são identificados nos Exemplos 6 e 8 da presente invenção.
[0052] A Figura 5 mostra os resultados da eletroforese da identificação do marcador molecular dos mutantes na descendência F2, que é obtida a partir do mutante zmabcg20-1 por autofecundação após polinização aberta, e o gene ZnABCG20 de planta do tipo selvagem no Exemplo 9 da presente invenção.
[0053] A Figura 6 é um fluxograma esquemático da construção de um vetor de RNAi para o gene ZNABCG20 de acordo com o Exemplo 10 da presente invenção.
[0054] A Figura 7 mostra os resultados da manchamento por iodo em pólens de plantas de controle e estéreis masculinas de RNAi de acordo com o Exemplo 11 da presente invenção.
[0055] A Figura 8 mostra a rota técnica de hibridização e transferência do gene zmabcg20-1 estéril conforme descrito no Exemplo 13 da presente invenção. Modos específicos para realizar as modalidades
[0056] Os exemplos a seguir são usados para ilustrar a presente invenção, mas não para limitar o escopo da presente invenção. À menos que especificado ao contrário, os Exemplos são baseados em condições experimentais convencionais, tais como as condições descritas em um manual de laboratório de clonagem molecular por Sambrook et al. (Sambrook J & Russell DW, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2001), ou as condições recomendadas nas instruções do fabricante. Exemplo 1: Banco mutante obtida por mutagênese por radiação de cobalto 60
[0057] Em setembro de 2015, 3 kg de sementes de JING KE NUO 2000 (geração MO) foram irradiadas com cobalto 60 (60Co) em uma dose de radiação de 250 Gy em Changsha. As sementes irradiadas foram plantadas no campo do distrito de YaCheng, cidade de Sanya, província de Hainan, em outubro de 2015. As plantas individuais foram submetidas a uma autofecundação rigorosa para obter sementes de geração M1.
[0058] Foram selecionadas 5.400 linhagens de sementes de geração MI, e 50 plantas individuais para cada linhagem foram plantadas no campo do condado de Lingao, Hainan, em fevereiro de 2016. No estágio de plântulas, estágio de espigamento, estágio de florescimento, estágio de enchimento e semelhante, os caracteres do campo foram cuidadosamente observados, vários tipos de mutantes em termos de tipo de planta, tipo de espiga, fertilidade, rendimento e semelhante foram examinados, e as sementes de plantas mutantes individuais de cada tipo foram triadas e armazenadas. Exemplo 2: Plantação e observação de caractere da geração M2
[0059] Durante o período de espigamento e florescimento da geração M2, observou-se a morfologia das anteras no campo. As anteras que mostraram anormalidades tais como cor branca clara, tamanho pequeno e pequena quantidade de pólen foram selecionados para microscopia adicional sob um microscópio. Nove plantas com fertilidade anormal foram encontradas na família nº 3326, que não conseguia espalhar pólen normalmente, mas tiveram produção normal de sementes (Figura 1). A antera do mutante era menor que a do tipo selvagem, tinha cor amarela clara e nenhum pólen visível. No entanto, não há diferença significativa entre o mutante e o tipo selvagem em termos de crescimento vegetativo, estágio de espigamento e tipo de espiga. Portanto, o mutante foi selecionado como um material mutante candidato para estudo adicional. De acordo com o gene mutante finalmente identificado (consultar Exemplos 6, 7 e 8), o mutante foi nomeado como zmabcg20-1. Exemplo 3: Microscopia de pólen e análise genética de mutantes estéreis
[0060] A fertilidade do pólen foi investigada de acordo com a proporção de pólens manchados por iodo e pólens não manchados. A morfologia das flores masculinas zmabcg20-1 foi observada sob um microscópio estéril. As anteras eram menores que as do tipo selvagem e a cor era mais clara (Figura 2). Os floretes foram coletados no estágio de florescimento no campo, as anteras foram retiradas com pinças, as anteras foram introduzidas suavemente em uma solução de iodeto de iodo-potássio
(0,6% KI, 0,3% 12, p/p), pingadas em uma lâmina de vidro, e cobertas com uma lamínula, o estado de manchamento por iodo dos pólens foi observado sob um microscópio e fotos foram feitas. Os pólens do tipo selvagem de pólen eram abundantes e pigmentados de preto azulado, enquanto nenhum grão de pólen do mutante pode ser visto (Figura 2).
[0061] O mutante pode produzir sementes normalmente sob polinização aberta (Figura 1), indicando que o mutante era um mutante estéril masculino e a fertilidade da espiga feminina não foi afetada. As sementes (F1) de plantas mutantes zmabcg20-1 que foram polinizadas abertas foram colhidas e semeadas. Após o espigamento, os pólens foram espalhados normalmente. Por autofecundação, o ajuste de sementes das plantas de F1 era normal. As sementes F2 foram colhidas de espiga única a espiga única. As sementes F2 de espiga única autofecundadas foram levadas para realizar a semeadura de espiga por fileira, e a fertilidade foi identificada após o espigamento, em que os pólens de 125 plantas eram normalmente manchados por iodo, e 38 plantas não tinham pólen, o que está em conformidade com a segregação 3:1 (72 = 0,30), indicando que a esterilidade era controlada por um único gene recessivo. Exemplo 4: Amostragem de folhas e extração de DNA
[0062] Neste estudo, o método CTAB foi utilizado para extrair DNA de folha de milho. O método específico foi o seguinte: cerca de 0,1 g de folhas foram pesadas e postas em um tubo de centrífuga, 600 uL de um tampão de extração por CTAB e 5 ul de RNase A foram adicionados, seguidos de dispersão por agitação, e tratamento em banho de água a 65º C por 0,5 h, durante o qual foi realizada uma agitação suave por 2 a 3 vezes; clorofórmio/fenol tris-saturado de volume igual (1:1, v/v) foram adicionados, seguido de mistura e agitação suave por 10 min; a centrifugação foi realizada a 10.000 rpm a 4º C por 20 min; o sobrenadante foi transferido para um novo tubo, e 1/10 volume de acetato de sódio 3 M (pH 5,2) e 0,6 a 1 vez de volume de isopropanol frio foram adicionados; a agitação suave foi realizada para misturar bem até que o precipitado floculante aparecesse; a centrifugação foi realizada a 10.000 rpm a 4º C por 10 min; o sobrenadante foi descartado, e o precipitado foi lavado duas vezes com 70% de etanol por volume; foi realizada a secagem ao ar, e 50 uL 1 x TE foram adicionados para dissolver o precipitado, e a solução resultante foi armazenada a -20º C. A concentração de DNA foi medida com Nanodrop 2000, e a solução está diluindo para 10 ng/L para uso como modelo de PCR. Exemplo 5: Localização preliminar de genes candidatos estéreis masculinos no cromossomo
[0063] De acordo com o mapa genético IBM2 2008 (www.maizegdb.org), foram triados marcadores SSR e Indel distribuídos uniformemente em cada cromossomo de milho, foram triados marcadores polimórficos entre os precursores de JING KE NUO 2000, e foi realizada a identificação do genótipo em JING KE NUO 2000 e nas nove plantas zmabcg20-1 de geração M2. O sistema de reação de PCR para o procedimento PCR foi o seguinte: 1 uL de 10 x tampão de reação, 0,25 uL de dNTP, 0,25 uL de iniciador direto e 0,25 uL de iniciador reverso, 0,5 enzima U Tag, 1 uL de 10 ng/uL de modelo de DNA, e água ultrapura adicionada para atingir um volume total de 10 uL. O procedimento de reação do PCR foi o seguinte: desnaturação de 94º C a 98º C por 1 a 3 minutos, depois os seguintes ciclos foram realizados de 30 a 40 vezes: desnaturação a 95º C por segundos, renaturação de 53º C a 58º C por 20 segundos, e estendendo-se a 72º C por 30 segundos.
[0064] Os produtos de reação foram separados por eletroforese em um gel de poliacrilamida a 6%. O método de eletroforese do gel de poliacrilamida foi o seguinte: (1) Preparação do gel de poliacrilamida: 80 mL de 6% de gel PA, 250 uL (inverno)/125 uL (verão) de 10% de persulfato de amônio, 80 uL de tetrametiletilenodiamina (TEMED). A fusão do gel foi realizada após agitação.
Uma placa de vidro foi limpa por meio de esfregaço repetidamente com um detergente, removido com etanol e seca.
Uma placa côncava foi revestida com 2% de silano repelente em um exaustor de laboratório, seguida de remoção com etanol e secagem, e outra placa foi revestida com 1,5 mL de 0,5% de silano de união (7,5 uL de silano de união e 7,5 uL de ácido acético glacial foram adicionados em um tubo de centrífuga de 1,5 ml, e 95% de etanol foi adicionado até que o volume total fosse de 1,5 mL). Durante a operação, as duas placas de vidro foram impedidas de contaminar uma a outra.
Depois que as placas de vidro foram completamente secas, as placas de vidro foram montadas, e a fusão de gel foi realizada. (2) Pré-eletroforese: depois que o gel foi solidificado, o pente foi retirado e o gel no mesmo foi lavado e, particularmente, a porção de costura deve ser limpa.
Em primeiro lugar, um 1 x tampão de eletrodo TBE foi enchido no tanque inferior (cátodo) do tanque de eletroforese, a placa de gel polimerizada foi instalada no tanque de eletroforese, e um 0,5 x tampão de eletrodo TBE foi injetado no tanque superior.
A pré-eletroforese foi realizada a uma potência constante de 40 W a 65 W por cerca de 30 minutos.
A ureia e as bolhas de ar depositadas na superfície do gel foram removidas por um tubo de sucção, e um pente foi inserido. (3) Eletroforese: o produto de amplificação foi adicionado com 5 ul de 5 x tampão de carga, misturado, desnaturado a 95º C por 5 minutos, e imediatamente transferido para o gelo para resfriamento, em seguida, 1,5 a 3 ul foi sugado e adicionado no poço da amostra.
A eletroforese foi realizada em potência constante de 40 W a 65 W até que o azul de bromofenol tenha atingido o fundo do tanque de eletroforese.
O tempo de eletroforese foi ajustado de acordo com o peso molecular do produto de amplificação SSR e a distinção de diferentes bandas. (4) Manchamento de prata e desenvolvimento de cor: uma placa de vidro com gel foi posta em uma solução de fixação de ácido acético glacial a 10% e a agitação foi realizada a 65 r/min por cerca de minutos até que o xileno nitrila fosse completamente descolorido.
O enxágue foi realizado duas vezes com água destilada por 5 minutos cada vez. A placa de gel lavada foi colocada em uma solução de manchamento recém- preparada (2 g de nitrato de prata e 3 mL de 37% de formaldeído foram adicionados em 2 L de água,) e a agitação foi realizada a 65 r/min por 30 minutos. A placa de gel manchada foi colocada em água destilada para lavar por 5 segundos, e imediatamente retirada para desenvolvimento. A placa de gel foi rapidamente transferida para uma solução de desenvolvimento pré- resfriada (30 g de hidróxido de sódio e 10 ml de 37% de formaldeído foram adicionados em 2 L de água,) a 4º C, e agitação suave foi realizada até que as bandas aparecessem. A placa de gel foi colocada em uma solução de fixação de ácido acético glacial a 10% até que não fossem geradas bolhas. O enxágue foi realizado duas vezes com água destilada por 2 minutos cada vez. Após a secagem natural à temperatura ambiente, fotos foram feitas para salvar a imagem.
[0065] Entre os marcadores de identificação, o marcador Indel IDP8150 (iniciador direto: S* -TGCTCGCAGGAATAGAAAGOC-3'; iniciador reverso: 5”-GACGCAATCGACAGAGTACG-3") localizado no cromossomo 9 era heterogêneo em JING KE NUO 2000, mas eram homozigotos em todas as nove plantas zmabcg20-1, indicando que o gene mutante que controla a fertilidade está associado ao IDP8150 e está localizado no cromossomo 9. À análise dos genes de controle de fertilidade masculina de plantas clonadas revelou que o Ms45 (GRMZM2G307906) de milho, gene ZmMABCG20 ortólogo — (GRMZM2G076526/Zm00001d046537) de AtABCG26 de Arabidopsis e OsABCG15 de arroz estavam todos localizados no cromossomo 9. Esses dois genes foram selecionados como genes alvo para análise de sequenciamento adicional. Exemplo 6: Sequenciamento de genes candidatos
[0066] Os iniciadores foram projetados de acordo com as sequências genéticas Ms45 e ZMABCG20 da linhagem congênita de milho B73, e o
DNA genômico do tipo selvagem JING KE NUO 2000 e zmabcg20-1 foi amplificado.
Os produtos de amplificação foram sequenciados e montados em uma sequência completa.
Os pares de iniciadores usados para amplificar o milho ZNMABCG20 são ZNABCG20 1a3,e os pares de iniciadores usados para amplificar Ms45 são Ms45 | para Ms45 4. As sequências foram mostradas na Tabela 1: Tabela 1 - Sequências de pares de iniciadores usados para amplificar o milho ZmABCG20 e Ms45 Nome do par ZmABCG20 | CCATCTTCTTGCTCTAGCCOTT | CAGGCGAAAACTCAAATTCC [7 o “OSSOS SS NES SSSts SOS ZmABCG20 | GACAGGGTAGACGCCATCAT | CGCATCTGTCCAGGTAGTCG [7 AA NOSSA SS SS CSS SST ZmABCG20 GGGCGCATAAAAGGACCG TGCGCCCCAATTTAATTAGG
Ms45 1 GCAATTTGGATTGTCACG GCACAGCTTGCACTCGTAGC BN ia MA Ms45 2 CTATTCATGCAACCACCTC | ACACCTCTCAAAATTCGAGC sc vv Ms45 3 CTAATGACATTATACCTCAT | GGTCTTTGAAGTACAGTTGC Ms45 4 TCTCTTACTGGGATCCTGAC | AGICTAGAGACCATGTAAGC ve ZmABCG20 | CAACAACATTACAAAAAAA | CACCGTCAGCTGTGGGAAG [mo Ago o SS ZmABCG20 | AAAMAGGAGGATCGGATTTGT | CCGCATCTTGTCCAGGTAGT A se ZmABCG20 | CGCATCCGACTACCTGGACA | CIGGCACAGTTGTACGTGAG T4 TT
[0067] O sistema de reação de PCR foi o seguinte: 1 uL de 10 x tampão de reação, 0,25 uL de dNTP, 0,25 uL de iniciador direto e 0,25 uL de iniciador reverso, 0,5 de enzima U Taq, 1 uL de 10 ng/uL de DNA modelo, e água ultrapura adicionada para atingir um volume total de 10 uL. O procedimento de reação de PCR foi o seguinte: desnaturação de 94º C a 98º C por | a 3 minutos, depois os seguintes ciclos foram realizados de 30 a 40: desnaturação a 95º C por 20 segundos, renaturação de 53º C a 58º C por 20 segundos, e estendendo-se a 72º C por 30 segundos. Após o término do ciclo, a extensão foi realizada adicionalmente por 3 a 10 minutos a 72º C, e a reação foi encerrada. Um gel de agarose a 1,5% foi configurado, e a eletroforese foi realizada sob um campo elétrico de 5 V/cm por 30 minutos. Os produtos de PCR foram recuperados utilizando um kit de recuperação de gel de DNA comercialmente disponível.
[0068] O DNA do produto de PCR recuperado do tipo selvagem e o mutante foram sequenciados usando um sequenciador ABI3730. Os iniciadores de sequenciamento eram iniciador direto e iniciador reverso, respectivamente. O software de análise de sequência de DNA comum DNAman6.0 foi usado para montar os resultados de sequenciamento bidirecional. A análise mostrou que a sequência do gene Ms45 do mutante zmabcg20-1 era idêntica à do tipo selvagem JING KE NUO 2000, e nenhuma mutação ocorreu. A sequência de nucleotídeos de comprimento completo do gene ZmMABCG20 do mutante zmabcg20-1 foi mostrada na SEQ ID NO: 7, e 4 pares de base foram deletados em comparação com JING KE NUO 2000.
[0069] Os ZmMABCG20 e OSsABCGIS5 em arroz e AtABCG26 em Arabidopsis são genes ortólogos, e o fenótipo mutante dos dois últimos também é estéril masculino, em que o mutante osabcg15 do arroz também não tem pólen maduro. Exemplo 7: Especificidade da expressão de ZnABCG20 para o tecido
[0070] As borlas de JING KE NUO 2000 foram selecionadas a partir de diferentes estágios de desenvolvimento, variando do estágio V7 (a formação inicial de espigas masculinas de milho) ao estágio VI8 (a maturidade das espigas masculinas de milho) (How a Corn Plant Develops. Special Report No. 48. Iowa State University of Science and Technology, Cooperative Extension Servce, Ames, Iowa. Reprinted 2/1996), e foram selecionadas raízes jovens, caules, folhas, gluma externa e gluma interna de flores masculinas e espigas. Em seguida, os materiais selecionados foram transportados em nitrogênio líquido e armazenados a -80º C. Os kits de reagente de extração de RNA TRIzol (Invitrogen, EUA) foram utilizados para extrair o RNA dos tecidos acima mencionados, e o kit de reagente PrimeScript RT (TaKaRa, Dalian) foi imediatamente utilizado para reverter o RNA de transcrição em cDNA de acordo com as instruções de operação.
[0071] O PCR quantitativo fluorescente foi realizado utilizando-se a Green Master Mix da PowerUpTM SYBRTM (Thermo Fisher, EUA), e um instrumento de PCR quantitativo fluorescente PikoReal 96 (Thermo Fisher, EUA) foi utilizado para amplificação e detecção de fluorescência. O gene Actinl do milho foi selecionado como o gene de referência. Os iniciadores de amplificação eram actinI-F e actinl-R (SEQ ID NO: 15-16), e os iniciadores de amplificação para a quantificação fluorescente de ZMABCG20 eram ABCG-2F e ABCG-2R (SEQ ID NOs: 17 a 18).
[0072] O sistema de reação de PCR quantitativo fluorescente foi o seguinte: 5 uL de Green Mix de SYBR, 0,5 uL de iniciador direto, 0,5 uL de iniciador reverso, 1 uL de cDNA e 3 uL de água ultrapura. O procedimento de reação do PCR foi o seguinte: pré-desnaturação a 95º C por 5 minutos; os seguintes ciclos foram realizados 40 vezes: desnaturação a 95º C por 15 segundos, recozimento a 60º C e extensão por 1 minuto; permanecendo a 60º C por 30 segundos; a temperatura inicial de uma curva de dissolução foi de 60º C, o tempo de retenção foi de 1 segundo para cada aumento de 0,2º C na temperatura, e a temperatura final foi de 95º C.
[0073] Os resultados de PCR quantitativo fluorescente em tempo real foram apresentados na Figura 3. O gene ZmnABCG20 foi expresso apenas em espigas jovens de flores masculinas nos estágios VI0 a V15, em que a expressão foi acentuadamente aumentada no estágio V12, e houve apenas traço de expressão em outros estágios. À expressão de ZMABCG20 não foi detectada em outros tecidos como raízes, caules, folhas, espigas femininas, bem como gluma interna e gluma externa de flores masculinas. O estágio V12 corresponde ao período mononuclear do pólen, e a parede externa do mesmo está se formando. Este tecido e estágio de expressão foram consistentes com a função dos genes homólogos de Arabidopsis e de arroz. Exemplo 8: Análise da sequência de transcrição de ZMABCG20
[0074] Na base de dados Gramene, o gene ZmMABCG20 tem dois números de anotação genética, a saber, GRMZM2G076526 e Zm00001d046537, respectivamente, com um total de 8 transcrições previstas. Para determinar a região de codificação do gene, um par de iniciador ZmABCG20 TI a T4 (a sequência mostrada na Tabela 1) cobrindo todo o comprimento da região de codificação de ZmMABCG20 foi usado para amplificar o cCDNA obtido a partir de espigas jovens de flores masculinas de JING KE NUO 2000. O produto foi separado e sequenciado de acordo com o método do Exemplo 6. O resultado do sequenciamento da região de codificação de ZMABCG20 é mostrado na SEQ ID NO: 5, que é consistente com GRMZM2G076526-T001 (SEQ ID NO: 2).
[0075] Comparando-se as sequências genômica e cDNA de zmabcg20-1 e ZnABCG20 de JING KE NUO 2000, verificou-se que, quatro pares de base TGCA, que está localizada após a posição 246 bp na região de codificação, ou seja, após a posição de base 326 a partir do códon de início na sequência genômica, e localizado no segundo éxon, são deletados, resultando em mutação por mudança da matriz de leitura ocorrendo após o 82º resíduo de aminoácido na proteína traduzida, e a tradução foi terminada logo após a tradução para o 100º resíduo de aminoácido. A sequência da região de codificação do gene mutante zmabcg20-1 é mostrada na SEQ ID NO: 8, e a sequência da proteína submetida à formação de código é mostrada na SEQ ID NO: 9. A sequência genômica, sequência de região de codificação e sequência de proteína de B73 ZmMABCG20 são mostradas na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3, respectivamente. À sequência genômica, a sequência de região de codificação e a sequência de proteínas de JING KE NUO 2000 ZmMABCG20 são mostradas na SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, respectivamente. A estrutura do gene ZnABCG20 e o local de mutação zmabcg20-1 são mostrados na Figura 4. Exemplo 9: Identificação do genótipo ZnABCG20 na população F2 por marcadores funcionais
[0076] Um par de iniciadores específicos do gene foram projetados com base nas sequências em ambos os lados do local de mutação obtidos no Exemplo 6: o iniciador direto 3326 F1, cuja sequência de nucleotídeos é apresentada na SEQ ID NO: 10; iniciador reverso 3326 R1, cuja sequência de nucleotídeos é apresentada na SEQ ID NO: 11.
[0077] Se o tamanho do produto obtido por amplificação usando o par de iniciador acima mencionado for de 79 bp, indica que o genótipo da planta a ser testada é do tipo selvagem. Se o tamanho do produto de amplificação for de 75 bp, indica que a planta a ser testada é um mutante zmabcg20-1. Se o tamanho do produto de amplificação for de 79 bp e 75 bp (duas bandas), indica que o gene ZmMABCG20 da planta a ser testada é um genótipo heterozigoto do tipo selvagem e o mutante zmabcg20-1.
[0078] Na linhagem F2 obtida no Exemplo 3, as plantas do tipo selvagem e fenótipo mutante foram selecionadas aleatoriamente, e o DNA da folha foi extraído. O DNA do genoma de JING KE NUO 2000 e o DNA da folha foram respectivamente amplificados usando os pares de iniciador acima mencionados. O sistema de reação de PCR foi o seguinte: 1 uL de 10 x tampão de reação, 0,25 uL de dNTP, 0,25 uL de iniciador direto, 0,25 uL de iniciador reverso, 0,5 enzima U Tag, 1 uL de 10 ng/uL de DNA modelo, e água ultrapura adicionada para atingir um volume total de 10 uL. O procedimento de reação de PCR foi o seguinte: pré-desnaturação de 94º C a 98º C por 1 a 3 minutos, depois os ciclos seguintes foram realizados de 30 a 40 vezes: desnaturação a 95º C por 20 segundos, renaturação de 53º C a 58º C por 20 segundos, e estendendo-se a 72º C por 30 segundos. Os produtos de amplificação foram separados por eletroforese em gel de poliacrilamida a 6%, a eletroforese foi realizada por 1 hora em um campo elétrico com potência constante de 40 W, e o eletroferograma foi registrado por fotografia após manchamento com nitrato de prata.
[0079] Os resultados são mostrados na Figura 5. O tamanho do produto de amplificação do controle do tipo selvagem é de 79 bp. O tamanho do produto de amplificação das plantas estéreis na fileira de espiga F2 é de 75 bp. O tamanho do produto de amplificação de todas as plantas férteis é de 79 bp, ou 79 bp. +75 bp de banda heterozigota, sem banda homozigota de 75 bp. Esses resultados indicam que a mutação no local descrito no Exemplo 6 é cossegregada com o gene estéril masculino geneticamente recessivo. Exemplo 10: Construção do vetor RNAi de ZnABCG20
[0080] De modo a verificar a função do gene ZnABCG20, um vetor RNAi do gene foi construído no presente Exemplo. O processo de construção do vetor é mostrado na Figura 6. O método específico foi o seguinte:
1. O fragmento de cDNA altamente específico na SEQ ID NO: 23 em ZmMABCG20 foi selecionado como a sequência alvo de RNAI. A partir do cDNA de estágio V12 obtido no Exemplo 7, os pares de iniciador 17N19- F1 (SEQ ID NO: 21) e I7NI9-R1 (SEQ ID NO: 22) foram utilizados para amplificar o fragmento direto 17N19-1 da estrutura em grampo de RNAi; e os pares de iniciador 17N19-F2 (SEQ ID NO: 19) e 17N19-R2 (SEQ ID NO: 20) foram usados para amplificar o fragmento reverso 17N19-2 da estrutura em grampo de RNAi.
[0081] 2. O vetor intermediário utilizado pBSK-RTM (fornecido por Chengdu HaoChen Biotechnology Co., Ltd., o vetor pBSK-RTM foi modificado a partir do plasmídeo pBSK. Isso contém o íntron do gene Arabidopsis RTM1 cuja sequência é apresentada na SEQ ID NO: 24. Como mostrado na Figura 6, os locais de digestão enzimática SacI e Notl estão posicionados no lado esquerdo do íntron, e os locais de digestão enzimática Xbal e BamHI estão posicionados no lado direito do íntron). A digestão dupla de enzimas de pBSK-RTM e fragmentos diretos foi realizada usando SaclI e Notl, seguida de conexão e transformação em £. coli. Oito transformantes foram selecionados para verificação de PCR. Foram selecionados dois transformantes positivos, e os plasmídeos foram extraídos para sequenciamento para verificar se o vetor PBSK-17N19-1 foi obtido.
[0082] 3. O fragmento reverso 17N19-2 do gene 17N19 foi clonado usando pBSK-17N19-1 como um modelo.
[0083] A digestão dupla de enzimas de pBSK-17N19-1 e o fragmento reverso 17N19-2 foram realizados usando Xbal e BamHI, seguidos de conexão e transformação em E. coli. Oito transformantes foram selecionados para realizar a verificação de PCR. Um transformante positivo foi selecionado, e os plasmídeos foram extraídos para sequenciamento. Foi confirmado que o plasmídeo era o vetor alvo pPBSK-17NI1I9R.
[0084] A digestão dupla de enzimas do vetor pBSK-17NI9R foi realizada usando BamHI e Sacl, e o fragmento alvo contendo fragmento direto + RTM + fragmento reverso foi recuperado. Enquanto isso, a digestão dupla de enzimas de plasmídeo pCambia3301ky (fornecido por Chengdu HaoChen Biotechnology Co., Ltd., um promotor 35S foi inserido a montante do local policlonal de plasmídeo pCambia3301 para obter pCambia3301ky) foi realizada usando BamHI e Sacl. O fragmento alvo foi ligado com pCambia3301ky e transformado em E. coli. Um transformante de PCR positivo foi selecionado, o plasmídeo foi extraído e a digestão dupla enzimática foi realizada usando BamHI e Sacl. A eletroforese foi realizada para mostrar grandes fragmentos (fragmento direto + RTM + fragmento reverso) e bandas de esqueleto plasmídeo pCambia3301ky. Os resultados mostraram que o fragmento alvo estava corretamente conectado ao vetor policlonal pCambia3301ky, para formar o vetor pCambia3301-17NI9R, e a construção do vetor RNAi foi completada.
Exemplo 11: Transformação genética e identificação fenotípica de Plantas transformadas Os componentes de meios de cultura MS e N6 foram os seguintes: Componentes Conteúdo (mg/L Componentes Conteúdo (mg/L) P Ms N6 p Ms — N6 Elementos massivos Vestígios KNO; 1.900 2.830 FeSO,47H20 27,85 27,85 NHANO; 1.650 - Na;EDTA-2H,0 37,25 37,25 (NH41)SO 4 - 463 KI 0,83 0,8 KH;/PO, 170 400 H;BO; 6,2 1,6 MgSOs 7H70 — 370 185 MnSO,44H,0 22,3 4,4 CaCl;:2H,0 440 166 ZnSO,4 7H,0 8,6 1,5 Componentes orgânicos Na?Mo0O,2H;,0 0,25 - Inositol 100 100 CuSO,:5H,O0 0,025 - Niacina 0,5 0,5 CoCl2:6H,0 0,025 - Vitamina B6 0,5 0,5 Vitamina Bl 0,4 1 Glicina 2 2
[0085] Os meios de cultura usados nas etapas restantes foram os seguintes: Solução de cultura YEB: 5,0 g/L de levedura, 10,0 g/L de peptona, 5,0 g/L de NaCl, 50,0 mg/L de canamicina e 25,0 mg/L de rifampicina, pH 6,8; Solução de infecção: meio de cultura básica N6, suplementado com 1,0 mg/L de 2,4-D, 700 mg/L de L-prolina, 100 mg/L de caseína hidrolisada, 120 mg/L de inositol, 68 g/L de sacarose, 36 g/L de glicose e 100 umol/L de acetoseringona, pH 5,2; Meio de cocultura: meio de cultura básica N6, suplementado com 1,38 g/L de prolina, 500 mg/L de caseína hidrolisada, 120 mg/L de inositol, 2,0 mg/L de 2,4-D, 0,7% de ágar, 3% de sacarose, 100 umol/L de acetoseringona, 200 mg/L de cisteína e 0,85 mg/L de AgNO3, pH 6,0; Meio de cultura de recuperação: meio de cultura básica N6, suplementado com 1,38 g/L de prolina, 500 mg/L de caseína hidrolisada, 120 mg/L de inositol, 2,0 mg/L de 2,4-D, 0,7% de ágar, 3% de sacarose, 0,85 mg/L de AgNO3, e 400 mg/L de cefalosporina, pH 5,8; Meio de cultura para a triagem da primeira rodada: meio de cultura básica N6, suplementado com 1,0 mg/L de 2,4-D, 700 mg/L de L- prolina, 100 mg/L de caseína hidrolisada, 20 g/L de manitol, 120 mg/L de inositol, 0,7% de ágar, 3% de sacarose, 400 mg/L de cefalosporina, 0,85 mg/L de AgNO3, e 0,3 mg/L de Bialaphos, pH 5,8; Meio de cultura para a triagem de segunda rodada: com base no meio de cultura para a triagem da primeira rodada, a concentração de Bialaphos foi aumentada para 0,6 mg/L; Meio de cultura para diferenciação: meio de cultura básica MS, suplementado com 1 mg/L de cinetina, 100 mg/L de caseína hidrolisada, 200 mg/L de cefalosporina, 0,7% de ágar e 3% de sacarose, pH 5,8; Meio de cultura para enraizamento: meio de cultura básica 1/2 MS, suplementado com 100 mg/L de caseína hidrolisada, 700 mg/L de L- prolina, 0,2 mg/L de IBA, 0,7% de ágar e 3% de sacarose, pH 5,8.
[0086] A transformação genética e a regeneração das plantas foram realizadas de acordo com as seguintes etapas: 1) Preparação dos materiais de infecção: espigas de milho da linhagem b104 congênita de milho foram feitas no dia 10 ao dia 13 após a autofecundação, e foram selecionados embriões imaturos, embebidos em 75% de etanol por 15 segundos, embebidos em 2,5% de hipoclorito de sódio para esterilizar por 10 minutos, e enxaguados com água destilada por 3 a 5 vezes.
[0087] 2) Infecção de embriões imaturos: colônias únicas de Agrobacterium geneticamente engenheiradas foram selecionadas a partir da placa e inoculadas na solução de cultura YEB, e a agitação da cultura foi realizada a 28º C e 220 rpm de 20 horas a 36 horas. Quando as bactérias atingiram a fase logarítmica, a centrifugação foi realizada a 4º C e 3.000 rom por 10 minutos para coleta das bactérias, e as bactérias coletadas foram ressuspensas na solução de infecção para OD = 0,5 para serem utilizadas para infecção. Os 150 embriões imaturos selecionados foram imersos na solução de infecção de 5 minutos a 10 minutos, e a solução de infecção foi suavemente seca por sucção com papel filtro.
[0088] 3) Cultura de recuperação e cocultivação: os embriões imaturos infectados foram transferidos para o meio de cocultura, cultivados no escuro a 22º C por 3 dias, depois transferidos para o meio de recuperação e cultivados no escuro a 28º C por 7 dias.
[0089] 4) Triagem: o calo obtido após o tratamento de acordo com a etapa 3) foi transferido para o meio de triagem e cultivado no escuro a 28º C, e triado por duas rodadas, 3 semanas para cada rodada.
[0090] 5) Diferenciação e enraizamento: o calo resistente obtido a partir da etapa de triagem foi transferido para o meio de cultura para diferenciação, cultivado no escuro a 25º C por 7 dias, cultivado a 25º C sob a condição de alternar 16 horas de irradiação de luz (intensidade de luz 2.000 lux) e 8 horas no escuro, transferido para o meio de cultura para enraizamento quando as plântulas atingiram um comprimento de cerca de 5 cm, e cultivado a 28º C sob irradiação leve por 15 dias.
[0091] 6) Aclimatação e transplantação: as plântulas cultivadas enraizadas foram transplantadas em pequenos vasos cheios de solo nutriente,
e cultivadas a 28º C sob irradiação por luz por 10 dias; e as plântulas foram transplantadas para uma estufa (irradiação por luz natural, temperatura do dia 32º C, temperatura noturna 28º C) para a cultivação.
[0092] As plântulas transplantadas após as etapas acima foram identificadas pelo PCR iniciador, e foi confirmado que 5 delas eram plantas de transformação positiva carreando o fragmento de RNAi ZmMABCG20 projetado no Exemplo 9.
[0093] Quando as plantas transformadas estavam florescendo, as anteras foram retiradas do controle e das plantas de transformação positiva, e a fertilidade do pólen foi identificada por meio do uso do método de manchamento por iodo no Exemplo 3. Os resultados foram apresentados na Figura 7. O pólen da linhagem B104 congênita de tipo selvagem era normalmente fértil, enquanto uma planta transformada numerada R02 mostrou esterilidade masculina sem pólen, o que era consistente com o fenótipo do mutante zmabcg20-1. Este resultado indica que o nocaute de ZmMABCG20 causa infertilidade masculina.
[0094] Combinando com os resultados dos Exemplos 1 a 10, o fenótipo mutante zmabceg20-1 e os genes mutantes são consistentes com os mutantes de genes homólogos ZMABCG20 em Arabidopsis e arroz. O gene ZmABCG20 é especificamente expresso em espigas jovens de flores masculinas de milho, mas não expressa durante outros períodos ou em outros tecidos. O fenótipo estéril é cosegregado com o gene mutante zmabcg20-1. O nocaute do gene ZmMABCG20 pode resultar em um fenótipo estéril masculino consistente com zmabcg20-1. Os resultados acima provam que, ZNABCG20 é um gene essencial para o desenvolvimento da fertilidade masculina no milho, e a perda de sua função pode levar ao fenótipo estéril masculino do milho; e o fenótipo estéril masculino do mutante zmabcg20-1 é causado pela mutação do ponto no gene ZnABCG20 descrita no Exemplo 6. Exemplo 12: Clonagem do promotor ZMABCG20
[0095] Os iniciadores pZmABCG20 F (com sequência apresentada na SEQ ID NO: 13) e pZmABCG20 R (com sequência apresentada na SEQ ID NO: 14) foram usados para amplificar o DNA do genoma do milho, e um fragmento de DNA com tamanho de 1.653 bp pode ser obtido, no qual 1.634 bp está localizado a montante do códon de início ATG (SEQ ID NO: 12). PIantCARE, uma ferramenta de análise de elementos de transcrição on-line (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/) foi utilizada para analisar a sequência deste fragmento, e verificou-se que +1237 e +1385 eram CAAT-box e TATA-box, respectivamente. Além disso, houve alguns elementos de resposta hormonal da seguinte forma: elemento de resposta ao ácido abscísico ABRE (GCAACGTGTC, +1236); elementos de resposta ao ácido jasmônico TGACG motif (TGACG, +655) e CGTCA motif (CGTCA, +765); elemento de resposta de giberelina GREA motif (TCTGTTG, +513; AAACAGA, +1397) Havia um elemento regulador circadiano CAANNNNATC em +973. A abundante transcrição e elementos regulatórios indicam que essa região é a região promotora de ZMABCG20. Exemplo 13: Transferência híbrida de genes mutantes
[0096] O mutante obtido pela presente invenção e o marcador funcional do gene mutante descrito no Exemplo 9 pode ser usado em vários métodos de seleção auxiliados por marcadores moleculares. Tomando a transferência por retrocruzamento como exemplo, o gene zmabcg20-1 estéril pode ser transferido para outros antecedentes genéticos de milho por hibridização de acordo com as etapas da Figura 8: (1) Hibridização: As sementes F1 foram obtidas por meio de hibridização do mutante zmabcg20-1l como o precursor feminino com o material de milho receptor como o precursor masculino.
(2) Primeira rodada de retrocruzamento: As plantas F1 foram obtidas após a semeadura das sementes
Fl, e as plantas F1 foram hibridizadas com precursores recorrentes para obter sementes BC1.
(3) Seleção de genes BC!1 estéreis (seleção subsequente): As sementes BC1 foram semeadas para a obtenção de pelo menos 500 plântulas, folhas de plantas individuais foram coletadas no estágio de plântulas, o DNA foi extraído de acordo com o método descrito no Exemplo 4, o par de iniciador (3326 F1, 3326 R1) no Exemplo 9 foi utilizado para realizar amplificação e eletroforese, plantas individuais com genótipo heterozigoto foram selecionadas para continuar o plantio, e plantas individuais de tipo selvagem homozigota foram descartadas.
(4) Seleção de antecedentes de BC1: Um grupo (por exemplo, 100 ou 200) de marcadores moleculares (incluindo, mas não limitado a marcadores como SSR, INDEL, SNP, EST, RFLP, AFLP, RAPD, SCAR) que são polimórficos entre zmabcg20-1 mutantes e precursores recorrentes, e distribuídos uniformemente pelo genoma, foram usados para identificar as plantas individuais selecionadas na etapa (3), e materiais com alta similaridade com os precursores recorrentes (por exemplo, similaridade de 88% ou mais, ou taxa de seleção de 2%) foram selecionados.
(5) Segunda rodada de retrocruzamento: a planta individual selecionada na etapa (4) foi usada como o precursor masculino para polinizar os precursores recorrentes de modo a obter sementes BC2.
(6) Seleção antecedente e subsequente de BC2: o funcionamento da etapa (3) à etapa (4) foi repetido nos materiais selecionados, e as plantas de geração BC2 têm uma semelhança com o precursor recorrente maior do que os critérios de seleção (por exemplo, similaridade de 98% ou mais ou taxa de seleção de 2%) foram selecionados.
(7) Autofecundação para obter sementes BC2F2: as plantas BC2 selecionadas na etapa (6) foram submetidas à autofecundação para obter sementes de BC2F2.
(8) Seleção subsequente de BC2F2: as sementes de BC2F2 obtidas na etapa (7) foram semeadas para obter mais de 500 plântulas, as folhas foram coletadas no estágio de plântulas, o DNA foi extraído de acordo com o método descrito no Exemplo 4, o par de iniciador (3326 F1,3326 R1) no Exemplo 9 foi utilizado para amplificação e eletroforese, plantas individuais com bandas de mutantes homozigotos e tipo heterozigoto foram selecionadas para continuar o cultivo, e plantas individuais de tipo selvagem homozigotas foram descartadas; (9) Seleção de antecedente e uso de BC2F2: as plantas individuais selecionadas na etapa (8) foram submetidas à triagem antecedente de acordo com o método de etapa (4), e foram selecionadas plantas individuais com homozigosidade de antecedente de 100%. Se o genótipo da planta individual selecionada era um mutante homozigoto, esta planta individual era nosso material alvo final, que pode ser adicionalmente hibridizada com o precursor recorrente para preservar o material, ou hibridizada com outros materiais de milho. Se a planta individual selecionada era um tipo de banda heterozigota, pode ser usada diretamente para preservar o germoplasma, ou usada para obter, por autofecundação, plantas estéreis por melhoramento vegetal híbrido ou produção de sementes.
[0097] Embora a presente invenção tenha sido descrita em detalhes com a descrição geral e as modalidades específicas, é óbvio para uma pessoa versada na técnica que algumas modificações ou melhorias podem ser feitas com base na presente invenção. Portanto, essas modificações ou melhorias feitas sem partir do espírito da presente invenção pertencem ao escopo de proteção da presente invenção.
Aplicabilidade industrial
[0098] A presente invenção fornece o uso de um gene ZmnABCG20 de milho na regulação da fertilidade masculina das culturas. A sequência de
DNA genômico de ZMABCG20 na variedade de milho B73 é apresentada na SEQ ID NO: 1, e a sequência de proteína submetida à formação de código é apresentada na SEQ ID NO: 3. A presente invenção também fornece um zmabcg20-1 mutante do gene ZmnABCG20 e o uso do mesmo, e a sequência de gene mutado é apresentada na SEQ ID NO: 7. Também é fornecido um método de identificação de marcadores moleculares do gene mutado.
Os genes de controle de desenvolvimento de pólen, mutantes e marcadores moleculares do mesmo fornecidos pela presente invenção podem ser aplicados ao melhoramento vegetal híbrido de culturas e à produção de sementes híbridas.
A presente invenção também fornece o uso do gene ZmMABCG20 de milho na regulação da fertilidade masculina das culturas.
À sequência de DNA genômico de ZMABCG20 na variedade de milho B73 é apresentada na SEQ ID NO: 1, e a sequência de proteína submetida à formação de código é apresentada na SEQ ID NO: 3. A presente invenção também fornece um zmabcg20-1 mutante do gene ZMABCG20 e o uso do mesmo, e a sequência de gene mutado é representada por SEQ ID NO: 7. É também fornecido um método de identificação de marcadores moleculares do gene mutado.
Os genes de controle de desenvolvimento de pólen, mutantes e marcadores moleculares do mesmo fornecidos pela presente invenção podem ser aplicados ao melhoramento vegetal híbrido de culturas e à produção de sementes híbridas, e têm bons valores econômicos e perspectivas de aplicação.
Claims (30)
1. Uso de um gene de milho ZnABCG20, caracterizado pelo fato de ser na regulação da fertilidade masculina de culturas, em que a sequência de cDNA do gene ZmMABCG20 é: 1) a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 2; ii) uma sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 2 com um ou mais nucleotídeos substituídos, deletados e/ou adicionados à mesma, que expressam a mesma proteína funcional; iii) uma sequência de nucleotídeos que hibrida com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 2 sob condições de estringência e expressa a mesma proteína funcional, as condições de estringência são dadas da seguinte maneira: hibridização em uma solução 0,1x SSPE contendo SDS a 0,1% ou uma solução de SSC 0,1x contendo SDS a 0,1% a 65ºC e lavagem de uma membrana com a solução ou iv) uma sequência de nucleotídeos que possui 85% ou mais de homologia com a sequência de nucleotídeos de 1), 11) ou iii) e expressa a mesma proteína funcional.
2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a regulação se refere a fazer com que as culturas apresentem fertilidade masculina.
3. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o uso compreende: 1) permitir que as culturas contenham o gene ZnABCG20 ou 2) permitir que as culturas expressem a proteína codificada pelo gene ZMABCG20.
4. Uso de um gene de milho ZnMABCG20, caracterizado pelo fato de ser na preparação de plantas transgênicas, em que o gene ZnABCG20 é como definido na reivindicação 1.
5. Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que um vetor de expressão recombinante portador do cDNA ou da sequência genômica do gene ZnABCG20 é transferido para o calo de um milho do tipo selvagem, o material transformado é sujeito a co-cultivo, triagem, diferenciação, enraizamento, aclimatação e transplante de plântulas transgênicas e triagem para obter uma planta transgênica e, em seguida, o milho transgênico é hibridizado com milho masculino estéril para restaurar a fertilidade do milho masculino estéril.
6. Uso de um gene de milho ZnABCG20, caracterizado pelo fato de ser na restauração da fertilidade de uma planta masculina estéril, em que a característica de esterilidade masculina é causada por um mutante do gene.
7. Método para preparar um milho transgênico com esterilidade masculina genética pela inibição da atividade do gene ZmABCG20, caracterizado pelo fato de que uma tecnologia de silenciamento, supressão genética, nocaute genético ou mutação genética direcionada é usada para reduzir a atividade do gene do milho ZnABCG20 na transcrição e tradução ou a atividade da proteína obtida após a transcrição, para obter um milho transgênico com esterilidade masculina genética.
8. Método acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a sequência de RNAi que porta a sequência de CDNA do gene específico ZmMABCG20 está operacionalmente associado a um promotor constitutivo ou a um promotor de expressão específica de órgão floral e transferido a um calo de planta, o material transformado é submetido ao co-cultivo, triagem, diferenciação, enraizamento, aclimatação e transplante de plântulas transgênicas e triagem para obter um milho transgênico com esterilidade masculina genética.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a sequência de DNA alvo na qual o RNAi atua é apresentada na SEQ ID NO: 23.
10. Uso do gene ZnABCG20 de milho, caracterizado pelo fato de ser no melhoramento de culturas e de produção de sementes, em que o gene ZmMABCG20 é como definido na reivindicação 1.
11. Uso do material biológico obtido pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de ser no melhoramento de culturas e de produção de sementes.
12. Uso acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que uma planta que contém ou expressa o gene ou uma planta que contém o gene ZmMABCG20 inativado e é obtida pelo método como definido na reivindicação 7 ou 8 é hibridizada com uma cultura da mesma espécies tendo excelentes traços agronômicos.
13. Uso acordo com o a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a cultura é uma cultura de autopolinização ou de polinização cruzada, incluindo milho, trigo ou arroz, preferencialmente milho e excelentes traços agronômicos incluem rendimento aumentado, qualidade aumentada, resistência a pragas e doenças, resistência ao estresse e resistência à estoque.
14. Gene mutante zmabcg20-1 do gene de milho ZnABCG20, caracterizado pelo fato de que sequência de ácido nucleico do gene mutante zmabcg20-1 é: i) um gene mutante formado pela deleção de 4pb TGCA localizados nas posições 326 a 329 após o códon de início da sequência do ácido nucleico do gene do milho ZMnABCG20; ii) uma sequência de ácido nucleicos apresentada na SEQ ID NO: 7; 11) uma sequência de ácidos nucleicos apresentada em 1) ou ii) com um ou mais nucleotídeos substituídos, deletados e/ou adicionados à mesma, que expressa a mesma proteína funcional e contém a exclusão de 4 pb TGCA na mesma posição do gene ZnABCG20; iv) uma sequência de nucleotídeos que hibridiza com uma sequência apresentada em i) ou ii) sob condições de estringência, expressa a mesma proteína funcional e contém deleção de 4 pp TGCA na mesma posição do gene ZnABCG20, as condições de estringência são dadas da seguinte maneira: hibridização em uma solução SSPE 0,1x contendo SDS a 0,1% ou uma solução SSC 0,1x contendo SDS a 0,1% a 65ºC e lavagem de uma membrana com a solução ou v) uma sequência de nucleotídeos que possui 85% ou mais de homologia com a sequência de nucleotídeos de i) ou 1i), expressa a mesma proteína funcional e contém a exclusão de 4 pb TGCA na mesma posição do gene ZmMABCG20.
15. Proteína codificada pelo gene mutante zmabcg20-1, como definido na reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos da proteína é apresentada na SEQ ID NO: 9 ou uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9 com um ou vários aminoácidos substituídos, excluídos e/ou adicionados à mesma, que têm a mesma função.
16. Uso do gene mutante zmabcg20-1, como definido na reivindicação 14, caracterizado pelo fato de ser na regulação de fertilidade do milho, em que compreende: 1) permitir que as culturas contenham o gene zmabcg20-1; ou 2) permitir que as culturas expressem uma proteína codificada pelo gene zmabcg20-1.
17. Uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o milho contendo ou expressando o gene mutante zmabceg20-1 é capaz de exibir esterilidade genética masculina recessiva.
18. Uso de um material biológico compreendendo ou expressando o gene mutante zmabcg20-1, como definido na reivindicação 14, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um milho transgênico.
19. Uso do gene mutante zmabcg20-1, como definido na reivindicação 14, caracterizado pelo fato de ser no melhoramento de culturas e de produção de sementes.
20. Uso de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o milho contendo ou expressando o gene mutante zmabcg20-1 é hibridizado com um milho com excelentes traços agronômicos.
21. Uso de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que os excelentes traços agronômicos incluem rendimento aumentado, qualidade aumentada, resistência a pragas e doenças, resistência ao estresse e resistência à estoque.
22. Promotor específico de espigas jovens de flores masculinas ou espigas jovens de plantas andróginas, caracterizado pelo fato de que o promotor é: i) a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 12; ii) uma sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 12 com um ou mais nucleotídeos substituídos, deletados e/ou adicionados à mesma, que tem a mesma função; 11) uma sequência de nucleotídeos que hibrida com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 12 sob condições de estringência e tem a mesma função, as condições de estringência são dadas da seguinte maneira: hibridização em uma solução 0,1x SSPE contendo SDS a 0,1% ou em uma solução SSC 0,1x contendo SDS a 0,1% a 65ºC e lavagem de uma membrana com a solução; ou iv) uma sequência de nucleotídeos que possui 85% ou mais de homologia com a sequência de nucleotídeos de i), ii) ou ili) e tem a mesma função.
23. Uso do promotor específico, como definido na reivindicação 22, caracterizado pelo fato de ser na regulação da expressão de genes a jusante, em que a sequência do promotor está operacionalmente ligada a um gene alvo, a planta alvo é transformada com uma construção obtida e o promotor direciona o gene alvo especificamente expressar em espigas jovens de flores masculinas ou espigas jovens de plantas andróginas.
24. Marcador molecular de DNA associado à fertilidade masculina de milho, caracterizado pelo fato de que o marcador molecular de DNA está localizado nas bases na sequência de TGCA nas posições 326 a 329 após o códon de início na sequência de ácido nucleico do gene de milho ZmMABCG20 e a linhagem de milho com os 4 pb eliminados exibe esterilidade masculina genética recessiva; em que, a sequência de cDNA do gene ZmABCG20 é: 1) a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 2; ii) uma sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 2 com um ou mais nucleotídeos substituídos, deletados e/ou adicionados à mesma, que expressa a mesma proteína funcional; iii) uma sequência de nucleotídeos que hibridiza com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 2 sob condições de estringência e expressa a mesma proteína funcional, as condições de estringência são dadas da seguinte maneira: hibridização em uma solução 0,1x SSPE contendo SDS a 0,1% ou em uma solução SSC 0,1*x contendo SDS a 0,1% a 65ºC e lavagem de uma membrana com a solução; ou iv) uma sequência de nucleotídeos que possui 85% ou mais de homologia com a sequência de nucleotídeos de i), 11) ou lil) e expressa a mesma proteína funcional.
25. Iniciador para amplificar o marcador molecular de DNA, como definido na reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que compreende: iniciador a montante 3326 Fl: 5- CCAGACGAGGGCAGACCAG-3' e iniciador a Jusante 3326 R1: 5º- GATCTCGCCAGGGTCCACA-3'.
26. Reagente ou kit de detecção, caracterizado pelo fato de conter o iniciador como definido na reivindicação 25.
27. Uso do marcador molecular de DNA como definido na reivindicação 24, do iniciador como definido na reivindicação 25, ou do reagente ou kit de detecção como definido na reivindicação 26, caracterizado pelo fato de ser no melhoramento molecular de milho assistido por marcador.
28. Uso do marcador molecular de DNA como definido na reivindicação 24, do iniciador como definido na reivindicação 25, ou do reagente ou kit de detecção como definido na reivindicação 26, caracterizado pelo fato de ser na identificação ou melhoramento de características de germoplasma de milho masculino estéril.
29. Uso de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o DNA genômico do milho a ser testado é extraído, os iniciadores 3326 F1 e 3326 R1 são utilizados para realizar a reação de amplificação por PCR e o produto de amplificação é detectado por eletroforese; se uma banda característica com tamanho de 79 pb aparecer no produto de amplificação, a fertilidade do milho a ser testado é normal e o genótipo ZmABCG20 correspondente é do tipo selvagem; se uma banda característica com tamanho de 75 pb aparecer no produto de amplificação, o milho a ser testado é uma variedade masculina estéril e o genótipo ZnABCG20 correspondente é um mutante; e se o produto de amplificação tiver duas bandas de 79 pb e 75 pb, o milho a ser testado é um genótipo heterozigoto.
30. Uso do marcador molecular de DNA como definido na reivindicação 24, do iniciador como definido na reivindicação 25 ou do reagente ou kit de detecção como definido na reivindicação 26, caracterizado pelo fato de ser na tipificação do gene de milho ZnABCG20.
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| B06W | Patent application suspended after preliminary examination (for patents with searches from other patent authorities) chapter 6.23 patent gazette] | ||
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