CN106609281B - 花粉发育相关的abc转运蛋白或其编码基因的用途、培育植物不育系的方法及植物育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种培育植物不育系的方法，包括降低所述植物植株中花粉发育相关的ABC转运蛋白的表达或活性的步骤。以及一种将植物从不育转为可育的方法，包括降低花药绒毡层细胞转运蛋白的合成、和/或延缓花粉发育速度的步骤。另外本发明提供了花粉发育相关的ABC转运蛋白或其编码基因在培育植物不育系、或制备培育植物不育系的试剂或试剂盒中的用途。本发明的优点为：(a)提供了一种通过降低植物中花粉发育相关的ABC转运蛋白的表达或活性来创制植物不育系的方法；(b)提供了一种通过降低花粉细胞外壁合成速度、和/或延缓花粉发育速度来使不育植株的性状转化为可育的方法。

Description

花粉发育相关的ABC转运蛋白或其编码基因的用途、培育植物 不育系的方法及植物育种方法

技术领域

本发明涉及农业和生物技术领域，尤其涉及一种创制温敏不育系的方法及其 在植物育种中的应用。

背景技术

在农业生产中，由于传统去雄手段耗时费力，雄性不育系在杂交制种，提高 农业产量中有巨大的优势。雄性不育往往被分为细胞质雄性不育(CMS)以及细胞核 雄性不育(GMS)。三系杂交体系的建立依赖于细胞质雄性不育。然而，有几个缺 点阻碍了三系配套杂交在实践中的广泛应用。首先，细胞质雄性不育植株普遍存 在着品质较差的问题；其次，三系杂交水稻的组合增产潜力越来越小。再次，由 于野败类型的雄性不育细胞质单一，一旦胞质不育丧失或某种毁灭性病虫害发生， 会造成巨大损失。随着细胞核雄性不育中光温敏条件性雄性不育的发现，两系法 杂交水稻应运而生。相对于三系杂交法，光温敏不育系兼有不育系和保持系两种 状态。与三系法相比，两系法具有不受恢保关系的限制，即核不育可以与大量常 规品种杂交，配组自由，因而更容易获得优良性状的杂交优势，从根本上解决三 系中雄性不育细胞质单一化的问题。近年来，两系杂交水稻在中国农业生产中的 应用越来越广泛。

早在1973年,石明松在中国湖北省从晚粳品种(Oryza sativa ssp.japonica)农垦 58中选育出光敏感不育系并提出了一系两用的水稻杂种优势利用新途径。随后， 以农垦58S(NK58S)为父本，与籼稻杂交获得的培矮64S(PA64S)也在两系杂交中得 到广泛应用。但培矮64S的育性对于温度的变化更加敏感。在水稻中，光温敏不 育系受到单基因隐性位点控制。最近的研究表明，农垦58S与培矮64S的不育性 状受到同一个遗传位点的控制，而温度和光照都会对该位点产生影响，这些发现 使人们对光温敏育性转换的分子机制更加难以理解。

目前为止，水稻中共有十三个光温敏不育系被发现：pms1,pms2,pms3,rpms1,rpms2,tms1,tms2,tms3,tms4,tms5,tms6,rtms1以及Ms-h，分别定位在第7,3,12,8, 9,8,7,6,2,2,5,10和9条染色体上。光温敏不育在番茄，玉米以及小麦中也有报 道。最近的研究发现，一个突变的小RNA(small RNA),osa-smR5864m,导致pms2 以及p/tms2-1(农垦58S和培矮64S)突变体的不育表型。然而，光温敏不育的 分子机理仍然不清楚，使得人们缺乏有效的理论支持和技术手段来解决两系育种 中实际问题。

鉴于拟南芥较小的基因组，快速的生长周期以及大量的突变体库等无可比拟 的优势，使其在植物生物学研究领域成为模式植物。此外，拟南芥能够在严格控

然而，目前本领域中尚缺少调控方式简便的植物不育系用于植物育种过程中， 因此迫切需要调控方式简单方便的植物不育系培育技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种培育植物温敏不育系的方法，包括降低花粉发育相 关的ABC转运蛋白表达或活性来创制温敏植物材料，从而解决目前核不育温敏遗 传位点少，制种纯度不高的问题。

在本发明的第一方面，提供了一种培育植物不育系的方法，包括步骤：降低 所述植物植株中花粉发育相关的ABC转运蛋白的表达或活性。

在另一优选例中，所述的ABC转运蛋白参与所述植物的花粉发育过程的花粉 外壁形成。

在另一优选例中，所述的ABC转运蛋白将花粉外壁前提物质从绒毡层中转运 到花粉上。

在另一优选例中，所述的“降低”是指将所述植株中在花粉发育过程中ABC 转运蛋白的表达活性降低满足以下条件：

A1/A0的比值≤80％，较佳地≤60％，更佳地≤40％，最佳地为0-30％；

其中，A1为所述植株中花粉发育相关的ABC转运蛋白活性；A0为野生型同 种类型植物植株中相同ABC转运蛋白活性。

在另一优选例中，所述ABC转运蛋白为ABCG26或其同源蛋白。

在另一优选例中，所述ABCG26的野生型氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO.:1、SEQID NO.:2、SEQ ID NO.:3、SEQ ID NO.:4、SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO.:6。

在另一优选例中，所述ABC转运蛋白是选自下组的细胞、组织或器官中特异 性表达的：植物花序以及花药中。

在另一优选例中，所述细胞或组织包括：绒毡层。

在另一优选例中，所述ABC转运蛋白在花药发育期特异性表达。

在另一优选例中，所述的花药发育期包括前花药形成阶段(-3天～0天)、花药 形成阶段、后花药形成阶段(花药形成后1-5天)。

在另一优选例中，所述ABC转运蛋白在花药发育第7-8期特异表达。

在另一优选例中，所述ABC转运蛋白在小孢子从四分体释放期及后达到表达 最高峰。

在另一优选例中，所述降低植物植株中花粉发育相关的ABC转运蛋白活性的 方法包括：使ABC转运蛋白编码基因的表达水平下降、和/或使ABC转运蛋白活 性下降。

在另一优选例中，所述的下降指与野生型ABC转运蛋白的表达水平E0相比， 所述植株中花粉发育相关的ABC转运蛋白的表达水平E1为野生型的0-80％，较 佳地0-60％，更佳地0-40％；和/或与野生型的花粉发育相关的ABC转运蛋白活 性A0相比，所述植株中花粉发育相关的ABC转运蛋白活性A1为野生型的0-80％， 较佳地0-60％，更佳地0-40％。

在另一优选例中，所述的降低植株中ABC转运蛋白活性通过选自下组的方式 实现：基因突变、基因敲除、基因中断、RNA干扰技术、或其组合。

在另一优选例中，所述ABC转运蛋白编码基因为ABCG26基因。

在另一优选例中，所述ABCG26基因能够编码SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:2、 SEQID NO.:3、SEQ ID NO.:4SEQ ID NO.:5或SEQ ID NO.:6所示氨基酸序列。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：降低所述植株中ABCG26基因的表达 水平、缺失ABCG26基因和/或致ABCG26基因突变来实现降低植株中ABC转运 蛋白的表达或活性。

在另一优选例中，所述的植物包括农作物、林业植物、花卉；优选地包括禾 本科，豆科以及十字花科植物，更优选地包括水稻、玉米、蒺藜状苜蓿、小米、 小麦或拟南芥。

在另一优选例中，所述的植物选自：十字花科(Brassicaceae)植物、鼠耳芥属(Arabidopsis)植物、拟南芥(A.thaliana)。

本发明的第二方面，提供了一种花粉发育相关的ABC转运蛋白或其编码基因 的用途，用于培育植物不育系、或用于制备培育植物不育系的试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述的编码基因为ABCG26基因。

在另一优选例中，所述ABCG26基因能够编码SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:2、 SEQID NO.:3、SEQ ID NO.:4、SEQ ID NO.:5或SEQ ID NO.:6所示氨基酸序列。

本发明的第三方面，提供了一种将植物从不育转为可育的方法，包括步骤： 降低花粉ABC转运蛋白合成速度、和/或延缓花粉发育速度。

在另一优选例中，所述的植物是花粉发育相关的ABC转运蛋白的表达或活性 水平下降的植物。

在另一优选例中，所述植物为根据权利要求1-6中任一项所述的方法培育的植 物不育系。

在另一优选例中，所述方法包括：降低花粉ABC转运蛋白合成速度，从而延 缓花粉发育。

在另一优选例中，所述方法包括：降低植株代谢水平，从而降低花粉ABC转 运蛋白合成速度。

在另一优选例中，所述降低或延缓是通过以下方式实现：降低植株生长的环 境温度。

在另一优选例中，降低植株生长的环境温度包括将环境温度(平均温度)控制在17-22℃，更优选地为17-20℃，如18℃、18℃、19℃或20℃。

在另一优选例中，降低植株生长的环境温度的时间包括花药形成阶段，花粉 成熟阶段以及开花授粉阶段，或其前后2周。

在另一优选例中，在植株抽苔或抽穗时开始降低植株的生长温度，低温培育 3-10天后，恢复正常温度培育。

本发明的第四方面，提供了一种植物育种方法，包括维持植株不育的步骤； 将植株由不育转为可育的步骤；和，维持植株可育并育种的步骤；

在所述维持植株不育的步骤中，包括，对根据本发明第一方面的方法培育的 植物不育系进行维持；

在将植株由不育转为可育的步骤中，包括，利用根据本发明第三方面的方法 将植株由不育转为可育。

本发明的第五方面，提供了一种植物细胞，所述植物细胞发育成的植株中花 粉发育相关的ABC转运蛋白的表达或活性降低。

在另一优选例中，所述ABC转运蛋白为ABCG26。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。 限于篇幅，在此不再一一累述。

本发明的优点为：

(a)提供了一种通过降低植物中花粉发育相关的ABC转运蛋白的表达或活性 来创制植物不育系的方法。

(b)提供了一种通过降低花粉细胞外壁合成速度、和/或延缓花粉发育速度来使不育植株的性状转化为可育的方法。

附图说明

图1显示低温能够恢复雄性不育abcg26突变体的育性。

a.abcg26-1突变体的突变位点，abcg26-1突变体中ABCG26基因的第5 个外显子上有T-DNA插入。

b.Col植株的正常可育表型。

c-d.在正常条件下，abcg26突变体不育，短小果荚不含种子。

e-f.在正常条件下，abcg26突变体不育，短小果荚不含种子；移到低温条 件下植株恢复育性，果荚变得粗长含有种子；再放回正常条件下，突变体又变 得不育，短小果荚不含种子。

g-k.野生型和abcg26突变体花药的亚历山大染色。野生型(g)，abcg26-1 (18℃)(j)和abcg26-2(18℃)(k)花药中充满了紫色有活力的花粉，而在abcg26-1 (24℃)(h)和abcg26-2(24℃)(i)花药只染成绿色说明花粉败育。

图2为野生型，突变体以及恢复育性突变体花药发育的半薄切片分析图。

到发育的第6，7期花药，野生型(a)和abcg26(24℃或18℃)(h,o)突变体花 药没有可见的区别，其中(b)为第7期的野生型花药发育的半薄切片分析图,其 中(I、P)为第7期的abcg26(24℃或18℃)突变体花药发育的半薄切片分析图。 在第8期，野生型(c)和abcg26(24℃或18℃)(j,q)突变体药室中，小孢子成功 的从四分体中释放。在第9期，其中(D)为第9期的野生型花药发育的半薄切 片分析图,在abcg26(24℃)(k)中有些小孢子开始降解，然而在abcg26(18℃)(r) 中的小孢子与野生型的基本一致。在第10期，其中(E)为第10期的野生型花药 发育的半薄切片分析图，大多数abcg26(24℃)(l)的小孢子空泡化降解。然而，abcg26(18℃)(s)中大部分恢复的小孢子较为正常。在第11期，其中(F)为第11 期的野生型花药发育的半薄切片分析图,大多数abcg26(24℃)(m)的小孢子在药 室中降解空泡化，而除了个别败育的小孢子abcg26(18℃)(t)中有花粉粒出现。 在第12期，其中(G)为第12期的野生型花药发育的半薄切片分析图abcg26(18 ℃)(u)中出现成熟花粉粒，但是在abcg26(24℃)(n)仅有降解的细胞残余紧贴于 药室内壁。E,表皮层；En,药室内壁；ML,中间层；T,绒毡层；Ms,小孢子母细胞； Tds,四分体；Msp,小孢子；PG,花粉粒；Dmsp,退化的小孢子；Dpg,退化的花 粉粒；RM,残余。Bar＝20um。

图3为恢复育性突变体花粉发育阶段的扫描电镜分析图；

野生型和abcg26(24℃或18℃)(b,c)突变体花粉发育的扫描电镜观察。恢 复植株abcg26(18℃)(c)与野生型(a)的成熟花药中都含有许多正常的花粉，但 其花粉没有正常的外壁结构(f,i)。而abcg26(24℃)(e,h)突变体中则仅有残余的 表面结构异常的小孢子。其中h-i图为经过戊二醛固定的花粉,其中(a、d、g) 为野生型花粉发育阶段的扫描电镜分析图。

图4为恢复突变体花粉发育阶段的透射电镜分析图；

野生型和abcg26(24℃)以及abcg26(18℃)花粉发育的超显微结构。在第7 期野生型(a)和abcg26(24℃或18℃)突变体(d和g)的四分体发育正常。在第9 期，abcg26(24℃)(e)小孢子外壁异常缺少野生型的外壁结构。在第11期， abcg26(18℃或24℃)(f和i)的小孢子外壁结构依然异常，没有野生型(c)的柱状 和顶盖外壁结构。Msp,小孢子；Ba,柱状结构；Tc,顶盖结构。Bars＝5um，其 中(b)为野生型第9期的透射电镜分析图，(h)为abcg26(18℃)第9期的透 射电镜分析图。

图5为与ABCG26共表达的基因不受低温诱导表达图；

野生型和abcg26突变体(24℃/18℃)花序RNA中的ABCG26基因的半定量 RT-PCR。

图6为ABCG26同家族基因不涉及育性恢复的过程图；

野生型和abcg26突变体(24℃/18℃)中11个ABCG26同家族基因的定量 RT-PCR。

图7为低温延缓了花粉的生长速度图；

a.不同温度条件下花粉发育的四个时期(四分体时期，单核细胞期，双核 细胞期和三核细胞期)之间小孢子生长的速度。

b.DAPI染色显示选定时间点上不同温度条件下小孢子发育的进程。

图8为不同物种中abcg26基因的进化分析图，进化分析表明不同物种中 的直系同源基因在双子叶植物和单子叶植物有清晰的分岔，有共同的起源。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，对于某些特定的植物不 育系，通过调控花粉发育相关的ABC转运蛋白的表达或活性，可以调控所述植株 的育性，实现不育性与育性之间进行可控的转换。本发明人还开发了相应的培育 植物不育系等多种在农业育种等方面有广泛应用价值的技术。在此基础上完成了 本发明。

在实验中，申请人发现拟南芥ABCG26基因(ATP Binding Cassette G26)编码 了一个ABC转运蛋白并参与到花粉发育中孢粉素前体物质的转运过程中，该基因 的缺失使得突变体在正常生长条件下(24℃，16小时光照/8小时黑暗)显示完全 不育的表型。而低温减缓了花粉的生长速度，使突变体克服了该基因的缺失造成 的缺陷，使花粉安全度过快速膨胀期。

ABC转运蛋白及其编码序列

ABC转运蛋白是一类在不同物种中都存在的膜定位的超家族蛋白 (Sanchez-Fernandez et al.,2001)，在转运脂肪酸，ABA以及孢粉素前体物质等过程 中起重要作用(Choi et al.,2011)。在植物中，目前有一些ABC转运蛋白的功能被 报道与植物生长发育，抗逆等有关(Choi et al.,2011)。

适用于本发明的花粉发育相关的ABC转运蛋白没有特别限制，可以是来自任 何植物品种，代表性的植物包括，但并不限于：

水稻(基因号：Os06g060770与拟南芥直系同源ABCG26蛋白同源性为60％)、 玉米(Sequence ID：NP_001151511.1与拟南芥直系同源ABCG26蛋白同源性为 61％)、蒺藜状苜蓿(基因号：MTR_5g096390与拟南芥直系同源ABCG26蛋白同 源性为72％)、小米(SequenceID：Si008002m与拟南芥直系同源ABCG26蛋白同 源性为61％)、小麦(Sequence ID：Traes_7DL_439CC6EA0.1与拟南芥直系同源 ABCG26蛋白同源性为65％)。

在图8中，At为拟南芥、Os为水稻、Zm为玉米、Mt为蒺藜状苜蓿、Si为小 米、Ta为小麦；从图8不同物种中ABCG26基因的蛋白序列相似性以及进化分析 中可以看出该基因在不同物种中的的保守性较强，拟南芥中该基因的突变会造 成不育性状，因此，对该基因进行分子遗传操作将可以用于培育其它物种的不 育系。

拟南芥ABCG26蛋白序列如SEQ ID NO.:1所示，编码拟南芥ABCG26蛋 白的核苷酸序列如SEQ ID NO.:7所示。水稻ABCG26蛋白序列如SEQ ID NO.:2 所示，编码水稻ABCG26蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.:8所示。玉米 ABCG26蛋白序列如SEQ ID NO.:3所示，编码玉米ABCG26蛋白的核苷酸序 列如SEQ ID NO.:9所示。蒺藜状苜蓿ABCG26蛋白序列如SEQ IDNO.:4所示， 编码蒺藜状苜蓿ABCG26蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.:10所示。小米ABCG26蛋白的序列如SEQ ID NO.:5所示，编码小米ABCG26蛋白的核苷酸 序列如SEQ IDNO.:11所示。小麦ABCG26蛋白序列如SEQ ID NO.:6所示， 编码小麦ABCG26蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.:12所示。

在一方面，本发明提供一种培育植物不育系的方法，包括步骤：降低所述植 物植株中花粉发育相关的ABC转运蛋白的表达或活性。

术语“ABC转运蛋白”、“ABC多肽”、“ABC蛋白”等可互换使用，指 具有ABC转运蛋白氨基酸序列(如SEQ ID NO:1-6)的蛋白或多肽。在未特别指 出时，术语“ABC转运蛋白”包括野生型和突变型ABC蛋白。

本发明的ABC转运蛋白可包含SEQ ID NO:1-6所示氨基酸的序列。然而， 不限于此，因为根据植物种类或品种，该蛋白的氨基酸序列可能有所不同。换 言之，其可以是突变型蛋白或人工变体，所述突变型蛋白或人工变体的氨基酸 序列在SEQ ID NO:1-6所示氨基酸序列的一个或多个位置包含一个或几个氨基 酸的取代、缺失、插入或添加，只要有助于通过弱化该蛋白的活性而培育植物 不育系。本文的“几个”可根据蛋白中氨基酸残基的三维结构的位置或类型而 有所不同，优选是2-20，较优选是2-10，更优选是2-5。此外，根据植物的个 体或种类，氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒置包括人工变体或天然突变 所致的那些。

可通过以下方式降低(弱化)本发明ABC转运蛋白的活性：1)编码该蛋白 的多核苷酸的部分或完全缺失，2)修饰表达调控序列以降低该多核苷酸的表 达，3)修饰染色体上的序列或4)它们的组合。

在上文中，可利用染色体基因插入的载体，通过将编码内源性靶蛋白的多 核苷酸替换为标记基因或部分核苷酸序列缺失的多核苷酸来实施编码蛋白的 多核苷酸的部分或完全缺失。“部分”缺失的长度可根据多核苷酸的种类而有 所不同，优选是2bp-300bp，较优选是2bp-100bp，更优选是1bp-5bp。

还可通过以下方式修饰表达调控序列来降低多核苷酸表达：通过核苷酸序 列的缺失、插入、保守或非保守性取代或它们的组合在表达调控序列中诱导突 变以进一步弱化表达调控序列的活性，或将表达调控序列替换成活性更低的序 列。表达调控序列包括编码启动子的序列、操纵子序列、核糖体结合位点和控 制转录和翻译终止的序列。

此外，可通过以下方式修饰染色体上的多核苷酸序列以弱化蛋白的活性： 通过核苷酸序列的缺失、插入、保守或非保守性取代或它们的组合在序列中诱 导突变以进一步弱化该序列的活性，或将多核苷酸序列替换成经修饰的序列以 便获得更弱的蛋白活性。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物 质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽 是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他 物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的ABC转运蛋白或多肽”是指ABC转运蛋白基本上不 含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用 标准的蛋白质纯化技术纯化水稻等植物中ABC转运蛋白。基本上纯的多肽在 非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本 发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从 原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。 根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖 基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括ABC转运蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语 “片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然ABC转运蛋白相同 的生物学功能或活性的多肽。

本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是：

(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取 代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；

(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；

(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；

(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌 序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。

根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公 知的范围。

在本发明的优选地实施方式中，“ABC转运蛋白”或“ABC多肽”序列如SEQ ID NO:1-6所示。该术语还包括具有与ABC转运蛋白相同功能的、SEQ ID NO:1-6序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为 1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插 入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内， 较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能 相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C 末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术 语还包括ABC转运蛋白或多肽的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突 变体、诱导突变体、在高或低的严谨度的条件下能与ABC转运蛋白DNA杂 交的DNA所编码的蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含ABC转运蛋白或 其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了ABC转运蛋白 的可溶性片段。通常，该片段具有ABC转运蛋白序列的至少约10个连续氨基 酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至 少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如 乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基 (如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了 其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“ABC保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:1-6所示的氨基酸序 列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨 基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好 根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、 基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以 是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:7-12所 示的编码区序列相同或者是简并的变异体。

如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:1-6的蛋 白质，但与SEQ ID NO:7-12所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO:1-6的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码 序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选 的附加编码序列)以及非编码序列。

在一个优选地实施方式中，所述的ABC多肽的编码序列选自下组：(1)编 码如SEQID NO:1-6所述多肽的多核苷酸序列；(2)如SEQ ID NO:7-12所示的 多核苷酸序列；(3)与(1)或(2)所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码该多肽的多核苷酸，也可以是还 包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序 列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发 生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、 缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替 换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改 变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至 少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与 本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较 低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂 交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3) 仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。 并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ IDNO:1-6所示的成熟多肽有相同 的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长 度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸， 最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确 定和/或分离编码ABC转运蛋白的多聚核苷酸。

本发明的ABC转运蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、 重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关 核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本 领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。 当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片 段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通 常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中 分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片 段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很 长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段， 或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现 有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发 明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或ABC 转运蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所 述多肽的方法。通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利 用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的水稻ABC转运蛋白。一 般来说有以下步骤：(1).用本发明的编码ABC转运蛋白的多核苷酸(或变异体)， 或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适 的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，ABC转运蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重 组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、 哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质 粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、 标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含ABC转运蛋白编码DNA序列 和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、 DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中 的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结 合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择 转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗 性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。包 含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化 适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌 细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代 表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序 列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到 300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主 细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当 宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收 获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。 如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的 DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体 包装等。

转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转 化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得耐受性改变 的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根 据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主 细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的 方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用 ABC转运蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测 ABC转运蛋白的转录产物。

花粉发育

植物中不同器官特异表达的ABC转运蛋白基因也提示了其在植物发育中 ABC转运蛋白对调控脂肪，孢粉素前体物质运输起到重要的作用(Choi et al., 2011)。作为转运蛋白的ABC转运蛋白可转运脂肪，孢粉素等物质(Choi et al.,2011)。 在花粉发育中，小孢子壁的快速生长需要许多原料包括孢粉素前体物质等以供花 粉壁合成使用，认为其参与到小孢子外壁的形成中，为小孢子外壁的合成提供原 料。

本发明的主要优点包括：

(a)提供了一种通过降低植物中花粉发育相关的ABC转运蛋白的表达或活性 来创制植物不育系的方法。

(b)提供了一种通过降低花粉细胞外壁合成速度、和/或延缓花粉发育速度来使不育植株的性状转化为可育的方法。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆-实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)或植物分子生物学-实验手册(Plant Molecular Biology-ALaboratory Mannual,Melody S.Clark编,Springer-verlag Berlin Heidelberg,1997)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另 外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

材料与方法

植物材料与种植

本发明中拟南芥材料为Col背景。T-DNA插入突变株来自美国拟南芥生物资 源中心ABRC。4℃条件下，种子预萌发于0.1％琼脂糖培养基上72小时。植物材 料培养于蛭石中，培养条件则为：室温24℃，光培养16小时/暗培养8小时(正 常条件)直至抽苔。之后，抽苔植株转移至光照培养箱中低温培养(18℃-22℃)。

细胞学分析

用尼康数码相机(D-7000)拍摄植物材料。亚历山大染色与DAPI染色可参考方 法(Alexander,1969；Ross et al.,1996)。对于半薄切片，选取花苞不同发育阶段进 行固定并包埋于Spurr环氧树脂中(具体方法可参考Zhang et al.,2007)。使用 Powertome XL(RMC Products,Tucson,Arizona,USA)切片机进行每1μm切片并用 甲苯胺蓝进行染色。使用Olympus DX51数码相机(Olympus,Japan)进行花药切片 的拍摄。将8nm金颗粒包裹新鲜雄蕊和花粉粒材料进行扫描电镜实验，并利用 JSM-840显微镜(JEOL,Japan)观察。对于透射电镜实验，将拟南芥花絮冰上固定 于固定液中(配方是：含有2.5％戊二醛的0.1M磷酸缓冲液，pH 7.2)。花苞材料则 进一步依次包埋至树脂(‘Hard Plus’Embedding Resin,UniteKingdom)中(具体 方法可参考Zhang et al.,2007)。超薄切片(50-70nm)则利用JEM-1230透射电子 显微镜(JEOL,Japan)进行观察。

RNA抽提、半定量RT-PCR以及定量RT-PCR

总RNA可利用Trizol试剂(Invitrogen,USA)由成熟的土培拟南芥植物花组织进行提取。利用poly-dT(12–18)引物；MMLV反转录酶和相应试剂将5μg的RNA反 转第一条cDNA链(60分钟，42℃)。合成好的cDNA链作为PCR的模板。半定 量RT-PCR操作参照方法(Zhanget al.,2007)；定量RT-PCR则是利用SYBR Green I master mix(Toyobo,Japan)通过ABIPRISM 7300系统(Applied Biosystems,USA) 进行检测。定量RT-PCR的程序参数是：95℃5分钟，94℃10秒变性40个循环, 60℃退货延伸1分钟。定量RT-PCR中所使用的引物列表于电子版的附件中。β -Tubulin则作为对照。

实施例1拟南芥abcg26突变体的不育表型在低温条件下得以恢复

发明人利用从ABRC中心购买的拟南芥Col生态型的T-DNA插入突变体 库中分离到了abcg26-1和abcg26-2突变体，如图1中a所示。在正常的环境 温度下(24℃)，纯合的abcg26突变体的营养生长正常，但育性丧失，只有短 小无种子的果荚，如图1中c和d所示。遗传分析表明abcg26突变体属于孢 子体雄性不育，受到单基因隐性位点控制。申请人将abcg26-1和abcg26-2突 变体在24℃培养至抽苔，将其移入18℃连续培养，其后续的果荚皆恢复育 性，然后把该突变体放回到正常的环境温度下，突变体又恢复不育的表型，果 荚短小，如图1中e和f所示。在同样低温条件下，野生型植株没有受到影响 (结果未显示)。亚历山大染色显示低温条件下突变体的花粉被染成紫红色， 与野生型的基本相同如图1中g、j、k所示，而正常条件下的突变体花药内没 有被染成紫红色的可育花粉，如图1中h,i所示。这个结果说明低温能够弥补 abcg26突变体中的雄配子体发育缺陷。

实施例2低温能够弥补abcg26突变体中从四分体释放后的小孢子发育 缺陷

为了确定abcg26突变体在花粉发育中的缺陷，发明人进行了花药半薄切 片。在野生型第6和7期，小孢子母细胞经历减数分裂形成四分体(Sanders et al., 1999)。随后，小孢子从四分体释放，并逐渐形成正常可育的花粉，如图3中 a-g所示。在常温条件下(24℃)的abcg26(24℃)突变体中，直到花药发育第7期 突变体和野生型没有观察到可见差异，这表明突变体雄配子体减数分裂不受影 响如图3中h-i所示；至花药发育第8期，abcg26(24℃)小孢子从四分体释放， 与野生型相比，呈现不规则的肿胀表型；第9期，大部分abcg26(24℃)小孢子 开始降解，最终，药室内只有一些败育花粉的碎片，基本没有正常的花粉形成 如图3所示。另一方面，在低温状态下(18℃)，abcg26(18℃)小孢子在第8期 的肿胀表型仍然存在。但在后续的发育阶段，大部分小孢子并没有破裂降解， 而是继续发育，最后除去一小部分的败育花粉外，低温下的药室中产生了正常 的成熟花粉粒，如图3所示。

扫描电镜显示，abcg26突变体在常温条件下(24℃)的药室中基本没有花粉 粒，在低温条件下有花粉粒但没有正常的外壁结构，如图3所示。TEM观察表 明abcg26小孢子的细胞完整性在低温条件下得以恢复，如图4所示。在四分 体时期，在不同条件下，abcg26小孢子与野生型相比都比较正常，如图4中 a,d,g所示。第九期在正常温度(24℃)下，abcg26小孢子没有形成野生型那样 的外壁结构，如图4中e所示。在低温条件(18℃)下，abcg26小孢子发育虽然 没有破裂，但也没有完整外壁形成，如图4中h所示。

实施例3ABCG26基因等表达不受低温诱导

为了阐明abcg26突变体温敏的机制，申请人对不同温度条件下的野生型 和突变体花苞中的ABCG26转录水平进行了检测。定量PCR检测表明，常温 (24℃)与低温(18℃)条件下突变体和野生型的ABCG26在转录水平上没有显著 差异,如图5。为了检测共表达基因是否存在补偿机制，申请人提取了野生型和 突变体的花序总RNA，进行了共表达基因转录水平检测，半定量RT-PCR结果 显示在低温时也没有表达的变化，如图5。同时，为了鉴定是否存在ABCG26 同家族基因的补偿机制，申请人选取了11个在花药表达的ABCG26同家族基因进行了不同条件下的定量RT-PCR检测。结果显示都没有明显的变化，如图 6所示。这些结果表明，在低温条件下，拟南芥花粉发育过程对于ABCG26共 表达基因或者其同家族基因并不依赖。因此，低温条件下突变体育性的恢复与 这些基因没有关系。

实施例5较低的环境温度导致拟南芥花粉的发育速度减缓

上述的细胞学观察表明在常温(24℃)下大多数abcg26突变体小孢子在第 九期开始降解。早期的文献报道在拟南芥花粉发育过程中小孢子体积不断增大 扩展。申请人推测在abcg26突变体中，小孢子由于不能渡过快速膨胀过程而 导致花粉破裂和败育。因此，申请人测定了野生型小孢子在雄配子体发生过程 中的生长速率，根据花苞的大小初步确定花粉发育过程的4个时期：四分体时 期，单核花粉期，双核花粉期以及三核花粉期，如图7中a所示。数据统计结 果表明，小孢子从四分体释放后发育到单核期需要时间为Col(24℃)24小时， 而Col(18℃)为30小时；从单核期发育到双核期需要时间为Col(24℃)75小时， 而Col(18℃)为96小时；从双核期发育的三核期需要时间为Col(24℃)84小时， 而Col(18℃)为150小时，如图7中a所示。这些数据说明在低温下小孢子发 育进程变慢了。同时，申请人也研究了不同温度下不同时间节点野生型小孢子 的发育进程。以四分体时期为起始点(记为0时)，在24小时后，常温下的Col 从四核聚集在一处变成一个染色较亮的核位于小孢子的正中央；而低温下的Col则正 处于第七期第八期的中间时段，能同时观察到四分体和单核小孢子；约在70个小时 后常温下的Col小孢子到达双核期，DAPI染色显示一个不位于中央的荧光较亮的小 核，以及一个位于小核边上荧光较暗的大核；但是低温下的DAPI染色观察到Col小 孢子正处于有丝分裂期，核位于小孢子的边缘而且呈弥散状，还未形成双核；90小 时后，常温下的Col到达三核期，显示特有的两个荧光较亮的生殖核和一个荧光较暗 的营养核；而低温下的野生型小孢子则刚刚进入二核时期，如图7中b所示。这些 结果也显示在低温下小孢子发育进程变慢了。总之，以上这些结果说明低温延 缓了花粉发育进程，而且这种花粉发育缓慢的过程是弥补abcg26小孢子发育 缺陷的重要原因。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被 单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本 领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所 附权利要求书所限定的范围。

参考文献：

Alexander,M.P.Differential staining of aborted and nonabortedpollen.Stain Technol.44:117–122(1969).

Alonso J.M.,Stepanova,A.N.,Leisse,T.J.,Kim,C.J.,Chen,H.,Shinn,P.,Stevenson,D.K.,Zimmerman,J.,Barajas,P. &Cheuk,R.Genome-wide insertionalmutagenesis of Arabidopsis thaliana.Science 301:653–657(2003).

Choi,H.,Jin,J.Y.,Choi,S.,Hwang,J.U.,Kim,Y.Y.,Suh,M.C.&Lee,Y.An ABCG/WBC-type ABC transporter is essential for transport of sporopolleninprecursors for exine formation in developing pollen.Plant J.65:181–193.(2011).

Ebling,F.J.Photoperiodic differences during development in the dwarfhamsters Phodopus sungorus and Phodopus campbelli.Gen Comp Endocrinol.95(3):475-482(1994).

Hu,W.,Wang,Y.,Bowers,C.&Ma,H.Isolation,sequence analysis,andexpression studies of Xorally expressed cDNAs in Arabidopsis.Plant MolBiol.53:545–563(2003).

Quilichini,T.D.,Friedmann,M.C.,Samuels,A.L.&Douglas,C.J.ATP-BindingCassette Transporter G26 Is Required for Male Fertility and Pollen ExineFormation in Arabidopsis.Plant Physiol.154:678–690(2010).

Sanchez-Fernandez,R.,Davies,T.G.E.,Coleman,J.O.D.&Rea,P.A.TheArabidopsis thaliana ABC Protein Superfamily,a Complete Inventory.J BiolChem.276(32):30231–30244(2001).

Yoo,S.D.,Cho,Y.H.&Sheen,J.Arabidopsis mesophyll protoplasts:aversatile cell system for transient gene expression analysis.Nat Protoc 2:1565–1572(2007).

Zhang,Z.B.,Zhu,J.,Gao,J.F.,Wang,C.,Li,H.,Zhang,H.Q.,Zhang,S.,Wang,D.M.,Wang,Q.X.,Huang,H.,Xia, H.J.&Yang,Z.N.Transcription factor AtMYB103 isrequired for anther development by regulating tapetum development, callosedissolution and exine formation in Arabidopsis.Plant J.52:528-538(2007).

Zhu,Y.X.&Davies,P.J.The Control of Apical Bud Growth and Senescenceby Auxin and Gibberellin in Genetic Lines of Peas.Plant Physiol.113:631-637(1997).

Claims (3)

1.一种将植物从不育转为可育的方法，其特征在于，包括步骤：培育植物不育系，致使所述植物不育系中的花粉发育相关的ABCG26基因突变，降低植株中ABC转运蛋白活性，通过在培养至抽苔之后，降低植株生长的环境温度，将植株生长的环境温度降低至17-22℃，进而恢复所述植物植株中花粉的正常发育，其中，所述植物为拟南芥。

2.一种植物育种方法，其特征在于，包括：

(1)维持植株不育的步骤；

(2)将植株由不育转为可育的步骤；和，

(3)维持植株可育并育种的步骤；

其中，所述植物为拟南芥，在所述维持植株不育的步骤中，包括，致使所述植物不育系中的花粉发育相关的ABCG26基因突变，降低植株中ABC转运蛋白活性，培育植物不育系进行维持；在将植株由不育转为可育的步骤中，包括，通过在花药形成阶段，花粉成熟阶段以及开花授粉阶段，或其前后2周，降低植株生长的环境温度，将植株生长的环境温度降低至17-22℃，进而恢复所述植物植株中花粉的正常发育，将植株由不育转为可育。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述ABCG26基因编码的氨基酸序列为SEQID NO.:1。