DE60124698T2

DE60124698T2 - DIE PFLANZENENTWICKLUNG KONTROLLIERENDE NUKLEINSäUREN

Info

Publication number: DE60124698T2
Application number: DE60124698T
Authority: DE
Inventors: L. Robert El Cerrito FISCHER; Yeonhee Emeryville CHOI; Mike Livermore HANNON; Kishiro Jack Oak Park OKAMURO; Valerievna Tatiana Los Angeles TATARINOVA
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2000-04-21
Filing date: 2001-04-23
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2021-04-24
Also published as: EP1283668B1; US6476296B1; AU5559301A; DE60124698D1; JP2003533985A; EP1283668A4; EP1283668A1; US7414124B2; US7109394B2; CA2406736A1; US20060292687A1; ATE346092T1; AU2001255593B2; WO2001080626A1; ES2276786T3; US20030135890A1

Description

QUERVERWEISE AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
Diese Anmeldung ist eine Continuation-in-Part der am 21. April 2000 eingereichten US-Patentanmeldung Nr. 09/553.690, deren Inhalt hierin durch Verweis aufgenommen wurde.
STELLUNGNAMHE IN BEZUG AUF RECHTE AN ERFINDUNGEN, DIE UNTER VOM BUND FINANZIERTEN FORSCHUNGS- UND ENTWICKLUNGSAKTIVITÄTEN ERZIELT WURDEN
Diese Erfindung wurde mit Unterstützung der Regierung unter Beihilfe Nr. 97-35304-4941, vergeben vom United States Department of Agriculture, erzielt. Die Regierung besitzt in dieser Erfindung gewisse Rechte.
GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Pflanzen-Gentechnik. Sie betrifft z.B. die Modulation der Samenentwicklung (und insbesondere der Endosperm-, Keimling- und Samenschalen-Entwicklung), der Blütezeit, der chromosomalen DNA-Methylierung sowie die Modulation der Transkription bei Pflanzen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Ein essentielles Problem in der Biologie ist es, zu verstehen, wie sich Samen entwickeln. Bei blühenden Pflanzen erzeugt die Samenanlage den weiblichen Gametophyten, der aus Ei-, Zentral-, Synergid- und Antipoden-Zellen besteht (Reiser et al., Plant Cell 1291-1301 (1993)). Alle sind haploid außer der Zentral-Zelle, die zwei Tochterkerne enthält, die vor der Befruchtung fusionieren. Ein Spermien-Nucleus befruchtet die Eizelle, um die Zygote zu bilden, wohingegen ein weiterer Spermien-Nucleus mit dem diploiden Zentral-Zellennucleus fusioniert, um den triploiden Endosperm-Nucleus zu bilden (van Went et al., Embryology of Angiosperms, 273-318 (1984)). Die beiden Produkte der Befruchtung weisen unterschiedliche Entwicklungsmuster auf. Bei Arabidopsis passiert der Keimling eine lungsmuster auf. Bei Arabidopsis passiert der Keimling eine Reihe an Stadien, die morphologisch als präglobuläres, globuläres, Herz-, Keimblatt- und Reife-Stadium definiert wurden (R.B. Goldberg et al., Science 266, 605-614 (1994); S.G. Mansfield et al., Arabidopsis: An Atlas of Morphology and Development, 367-383 (1994)). Der primäre Endosperm-Nucleus erfährt eine Serie mitotischer Teilungen, um Nuclei zu produzieren, die in die expandierende Zentral-Zelle migrieren (S.G. Mansfield et al., Arab Inf Serv 27, 53-64 (1990); M.C. Webb et al., Planta 184, 187-195 (1991)). Die Zytokinese trennt das Endosperm-Zytoplasma und die -Nuclei in getrennte Zellen (S.G. Mansfield et al., Arab Inf Serv 27, 65-72 (1990)), die Speicherproteine, Stärke und Lipide produzieren, die das Wachstum des Keimlings unterstützen (M.A. Lopes et al., Plant Cell 5, 1383-1399 (1993)). Die Befruchtung aktiviert ebenso die Entwicklung der Integument-Zellschichten der Samenanlage, die sich zu der Samenschale entwickeln, und induziert das Wachstum der Samenanlagen und die Ausbildung der Frucht, oder Schote, bei Arabidopsis.
Von besonderem Interesse sind vor kurzem gemachte Entdeckungen an Genen, die die Entwicklung der Samen, und insbesondere die Endospermentwicklung, steuern. MEDEA (MEA) z.B. (auch als FIE1 (siehe z.B. die gleichzeitig anhängige US-Patentanmeldung 09/071.838) und F644 bekannt (siehe z.B. T. Kiyosue et al., Proc Natl Acad Sci USA 96 (7), 4186-91 (1999))) kodiert für ein Arabidopsis-SET-Domänen-Polycomb-Protein, das in der Endospermentwicklung eine Rolle zu spielen scheint. Die Vererbung eines mütterlichen Mea-Allels mit Funktionsverlust führt zu einem Keimling-Abort und verlängerter Endosperm-Produktion, und zwar unabhängig vom Genotyp des väterlichen Allels. Daher ist lediglich das mütterliche MEA-Wildtyp-Allel für die korrekte Keimling-, Endosperm und Samenschalen-Entwicklung erforderlich (T. Kinoshita et al., Plant Cell 10, 1945-52 (1999)). Diese Resultate zeigen Funktionen für Pflanzen-Polycomb-Proteine bei der Unterdrückung der Zentral-Zellen-Proliferation und der Endosperm-Entwicklung auf (T. Kiyosue et al., s.o.).
Ein weiteres Genprodukt, das die Samenentwicklung steuert, ist FIE, auch als FIE3 bekannt (siehe z.B. gleichzeitig anhängige US-Patentanmeldung Nr. 09/071.838). Das FIE-Protein ist ein Homolog der WD-Motiv-enthaltenden Polycomb-Proteine aus Drosophila und Säugetieren (N. Ohad et al., Plant Cell 11 (3), 407-16 (1999)). In Drosophila fungieren diese Proteine als Repressoren homöotischer Gene. Funktionsverlust-Mutationen im FIE-Gen führen zu Endosperm-Phänotypen, die mit Medea-Funktionsverlust-Mutationen identisch sind. Ein weiblicher Gametophyt mit einem Funktionsverlust-Allel von fie erfährt eine Replikation des Nucleus des Zentral-Zellennucleus und beginnt mit der Endosperm-Entwicklung ohne Befruchtung. Diese Resultate deuten darauf hin, dass das FIE-Polycomb-Protein als Suppressor eines kritischen Aspekts der frühen Pflanzenreproduktion, nämlich der Endosperm-Entwicklung, fungiert, bis es zu einer Befruchtung kommt. Weiters führt die Hypomethylierung von fie-Mutanten zu der Entwicklung von differenziertem Endosperm. Vinkenoog et al., Plant Cell 12, 2271-2282 (2000).
Die Steuerung der Expression von Genen, die die Ei- und Zentral-Zellendifferenzierung steuern, oder jenen, die die reproduktive Entwicklung steuern, d.h. Keimling, Endosperm und Samenschale, ist für die Produktion von Pflanzen mit einer Reihe an gewünschten Merkmalen nützlich. Diese und andere Vorteile werden von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung stellt isolierte Nucleinsäuren bereit, die eine Polynucleotidsequenz oder ein Komplement davon umfassen, die für ein DMT-Polypeptid kodiert, das zumindest 70 % Sequenzidentität mit Seq.-ID Nr. 2 aufweist, worin die Nucleinsäure nach Einführung in eine Pflanze zur Hemmung der Expression von endogenem DMT zu einer Pflanze mit verstärkter Endospermentwicklung führt und worin das DMT-Polypeptid einen Leucin-Zipper und eine Kernlokalisierungs-Signalsequenz umfasst. Die Nucleinsäure kann z.B. für das in Seq.-ID Nr. 2 dargestellte DMT-Polypeptid kodieren. In einem Aspekt umfasst die Polynucleotidsequenz Seq.-ID Nr. 5 oder Seq.-ID Nr. 1. In einigen Aspekten der Erfindung umfasst die Nucleinsäure weiters einen Promotor, der operabel an das Polynucleotid gebunden ist. In einigen Ausführungsformen ist der Promotor konstitutiv. In einigen Aspekten ist die Polynucleotidsequenz an den Promotor in einer Antisense-Ausrichtung gebunden. In anderen Ausführungs formen stammt der Promotor aus einem DMT-Gen. Der Promotor kann z.B. ein Polynucleotid umfassen, das zumindest 70 % Identität mit Seq.-ID Nr. 3 aufweist. In einigen Aspekten umfasst der Promotor Seq.-ID Nr. 3. In einigen Aspekten dieser Erfindung umfasst der Promotor weiters ein Polynucleotid mit zumindest 70 % Identität mit Seq.-ID Nr. 4. In einigen Aspekten z.B. umfasst der Promotor Seq.-ID Nr. 4.
Die Erfindung stellt ebenso eine Expressionskassette bereit, die einen Promotor umfasst, der operabel an eine heterologe Polynucleotidsequenz oder ein Komplement davon gebunden ist, die für ein DMT-Polypeptid kodiert, das zumindest 70 % Sequenzidentität mit Seq.-ID Nr. 2 aufweist, worin die Nucleinsäure nach der Einführung in eine Pflanze zur Hemmung der Expression von endogenem DMT zu einer Pflanze mit verstärkter Endospermentwicklung führt und worin das DMT-Polypeptid einen Leucin-Zipper und eine Kernlokalisierungs-Signalsequenz umfasst. Die Nucleinsäure kann z.B. für das in Seq.-ID Nr. 2 dargestellte DMT-Polypeptid kodieren. In einigen Aspekten umfasst die Polynucleotidsequenz die Seq.-ID Nr. 5 oder Seq.-ID Nr. 1. In einigen Aspekten der Erfindung umfasst die Nucleinsäure weiters einen Promotor, der operabel an das Polynucleotid gebunden ist. In einigen Ausführungsformen ist der Promotor konstitutiv. In einigen Aspekten ist die Polynucleotidsequenz an den Promotor in einer Antisense-Ausrichtung gebunden. In anderen Ausführungsformen stammt der Promotor aus einem DMT-Gen. Der Promotor kann z.B. ein Polynucleotid umfassen, das zumindest 70 % Identität mit Seq.-ID Nr. 3 aufweist. In einigen Aspekten umfasst der Promotor Seq.-ID Nr. 3. In einigen Aspekten dieser Erfindung umfasst der Promotor weiters ein Polynucleotid mit zumindest 70 % Identität mit Seq.-ID Nr. 4. In einigen Aspekten umfasst der Promotor z.B. Seq.-ID Nr. 4. In anderen Ausführungsformen stammt der Promotor aus einem DMT-Gen. Der Promotor kann z.B. ein Polynucleotid umfassen, das zumindest 70 % Identität mit Seq.-ID Nr. 3 aufweist. In einigen Aspekten umfasst der Promotor Seq.-ID Nr. 3. In einigen Aspekten umfasst der Promotor Seq.-ID Nr. 3. In einigen Aspekten dieser Erfindung umfasst der Promotor weiters ein Polynucleotid mit zumindest 70 % Identität mit Seq.-ID Nr. 4. In einigen Aspekten z.B. umfasst der Promotor Seq.-ID Nr. 4.
Für die Verwendung in der Erfindung geeignet ist eine Expressionskassette für die Expression eines heterologen Polynucleotids in einer Pflanzezelle. Die Expressionskassette kann ein Promotor-Polynucleotid mit zumindest 70 % Identität mit Seq.-ID Nr. 3 umfassen, das operabel an ein heterologes Polynucleotid gebunden ist. Der Promotor kann ebenso Seq.-ID Nr. 3 umfassen. Der Promotor kann weiters ein Polynucleotid mit zumindest 70 % Identität mit Seq.-ID Nr. 4 umfassen. Der Promotor kann z.B. Seq.-ID Nr. 4 umfassen. Der Promotor kann weiters ein Polynucleotid mit zumindest 70 % Identität mit Seq.-ID Nr. 6 umfassen, oder der Promotor kann Seq.-ID Nr. 6 umfassen.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso eine Wirtszelle bereit, die eine exogene Polynucleotidsequenz umfasst, die eine Polynucleotidsequenz oder ein Komplement davon umfasst, die für ein DMT-Polypeptid kodiert, das zumindest 70 % Sequenzidentität mit Seq-ID Nr. 2 aufweist, worin die Nucleinsäure nach Einführung in eine Pflanze zur Hemmung der Expression von endogenem DMT zu einer Pflanze mit verstärkter Endospermentwicklung führt und worin das DMT-Polypeptid einen Leucin-Zipper und eine Kernlokalisierungs-Signalsequenz umfasst. In einigen Aspekten der Erfindung umfasst die Nucleinsäure weiters einen Promotor, der operabel an die Polynucleotidsequenz gebunden ist. In einigen Ausführungsformen ist der Promotor konstitutiv. In einigen Aspekten ist der Promotor operabel an die exogene Polynucleotidsequenz ein einer Antisense-Ausrichtung gebunden. In anderen Ausführungsformen stammt der Promotor aus einem DMT-Gen. Der Promotor kann z.B. ein Polynucleotid umfassen, das zumindest 70 % Identität mit Seq.-ID Nr. 3 aufweist. In einigen Aspekten umfasst der Promotor Seq.-ID Nr. 3. In einigen Aspekten dieser Erfindung umfasst der Promotor weiters ein Polynucleotid mit zumindest 70 % Identität mit Seq.-ID Nr. 4. In einigen Aspekten z.B. umfasst der Promotor Seq.-ID Nr. 4.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zur Einführung einer isolierten Nucleinsäure in eine Wirtszelle bereit, umfassend (a) das Bereitstellen einer isolierten Nucleinsäure, oder eines Komplements davon, die für ein DMT-Polypeptid kodiert, das zumindest 70 % Sequenzidentität mit Seq.-ID Nr. 2 aufweist, worin die Nucleinsäure nach Einführung in eine Pflanze zur Hemmung der Expression von en dogenem DMT zu einer Pflanze mit verstärkter Endospermentwicklung führt und worin das DMT-Polypeptid einen Leucin-Zipper und eine Kernlokalisierungs-Signalsequenz umfasst, und (b) das Kontaktieren der Nucleinsäure mit der Wirtszelle unter Bedingungen, die die Insertion der Nucleinsäure in die Wirtszelle ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zur Modulation der Transkription bereit, umfassend das Einführen einer Expressionskassette, die einen Promotor umfasst, der operabel an ein heterologes DMT-Polynucleotid gebunden ist, in eine Wirtszelle, wobei das heterologe DMT-Polynucleotid für ein DMT-Polypeptid kodiert, das zumindest 70 % Identität mit Seq.-ID Nr. 2 aufweist, worin die Nucleinsäure nach der Einführung in eine Pflanze zur Hemmung der Expression von endogenem DMT zu einer Pflanze mit verstärkter Endospermentwicklung führt und worin das DMT-Polypeptid einen Leucin-Zipper und eine Kernlokalisierungs-Signalsequenz umfasst. In einigen Aspekten der Erfindung kodiert das heterologe DMT-Polynucleotid für Seq.-ID Nr. 2. In einigen Aspekten umfasst die Polynucleotidsequenz Seq.-ID Nr. 5 oder Seq.-ID Nr. 1. In einigen Aspekten wird die Expressionskassette durch ein Agrobacterium in eine Wirtszelle eingeführt. In einigen Aspekten wird die Expressionskassette durch eine geschlechtliche Kreuzung eingeführt. In einigen Aspekten des Verfahrens der Erfindung führt die Modulation der Transkription zu der Modulation der Endospermentwicklung in einer Pflanze. In einigen Aspekten wird die Endospermentwicklung verstärkt. In anderen Aspekten wird die Endospermentwicklung verringert. In einigen Aspekten der Verfahren der Erfindung ist der Promotor operabel an das DMT-Polynucleotid in einer Antisense-Ausrichtung gebunden. In einigen Aspekten ist die Wirtszelle eine Pflanze.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso eine transgene Pflanzenzelle oder eine transgene Pflanze bereit, die eine Polynucleotidsequenz oder ein Komplement davon umfasst, die für ein DMT-Polypeptid kodiert, das zumindest 70 % Sequenzidentität mit Seq.-ID Nr. 2 aufweist, worin die Nucleinsäure nach der Einführung in eine Pflanze zur Hemmung der Expression von endogenem DMT zu einer Pflanze mit verstärkter Endospermentwicklung führt und worin das DMT-Polypeptid einen Leucin-Zipper und eine Kernlokalisierungs-Signalsequenz umfasst. Die Nucleinsäure kann z.B. für das in Seq.-ID Nr. 2 dargestellte DMT-Polypeptid kodieren. In einem Aspekt umfasst die Polynucleotidsequenz die Seq.-ID Nr. 5 oder Seq.-ID Nr. 1. In einigen Aspekten der Erfindung umfasst die Nucleinsäure weiters einen Promotor, der operabel an das Polynucleotid gebunden ist. In einigen Ausführungsformen ist der Promotor konstitutiv. In einigen Aspekten ist die Polynucleotidsequenz an den Promotor in einer Antisense-Ausrichtung gebunden. Die vorliegende Erfindung stellt ebenso eine Pflanze bereit, die, wie oben beschrieben, aus einer Pflanzenzelle regeneriert wird. In anderen Ausführungsformen stammt der Promotor aus einem DMT-Gen. Der Promotor kann z.B. ein Polynucleotid umfassen, das zumindest 70 % Identität mit Seq.-ID Nr. 3 aufweist. In einigen Aspekten umfasst der Promotor Seq.-ID Nr. 3. In einigen Aspekten dieser Erfindung umfasst der Promotor weiters ein Polynucleotid, das zumindest 70 % Identität mit Seq.-ID Nr. 4 aufweist. In einigen Aspekten kann der Promotor weiters Seq.-ID Nr. 4 umfassen.
Diese Erfindung stellt eine isolierte Nucleinsäure der Erfindung oder eine Expressionskassette der Erfindung zur Verwendung bei der:

(a) Modulation der Organidentität;
(b) Modulation der Organgröße und/oder -anzahl;
(c) Modulation der Größe oder der Aktivität des Meristems; oder
(d) Vergrößerung des Endosperms bereit.

In einigen Ausführungsformen der Erfindung umfasst die Polynucleotidsequenz zumindest 30 zusammenhängende Nucleotide eines Polynucleotids, das für Seq.-ID Nr. 2 kodiert. In anderen Ausführungsformen umfasst die Polynucleotidsequenz zumindest 100 zusammenhängende Nucleotide eines Polynucleotids, das für Seq.-ID Nr. 2 kodiert. In einer anderen Ausführungsform ist der Expressionskassetten-Promotor ein gewebespezifischer Promotor.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso eine isolierte Nucleinsäure der Erfindung oder eine Expressionskassette der Erfindung zur Verwendung in der Modulation der Zeit bis zur Blüte in einer Pflanze bereit.
Zur Verwendung in der Erfindung geeignet ist ein isoliertes Nucleinsäure-Molekül, das eine Polynucleotidsequenz umfasst, die 60 % Sequenzidentität mit Seq.-ID Nr. 1 aufweist.
Die hierin offenbarten isolierten Nucleinsäuren können eine Polynucleotidsequenz oder ein Komplement davon umfassen, die für ein DMT-Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz mit zumindest 70 % Sequenzidentität mit zumindest einer der folgenden Konsensussequenzen aufweist: DMT-Domäne A
DMT-Domäne B
DMT-Domäne C
In einigen Ausführungsformen kodieren die Nucleinsäuren der Erfindung für ein Polypeptid, das zumindest 70 % Identität mit Seq.-ID Nr. 2 oder, alternativ dazu, zumindest 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % oder 100 % mit Seq.-ID Nr. 2, aufweist. In einigen Ausführungsformen umfasst das DMT-Polypeptid eine Aminosäuresequenz, die 100 % identisch mit den oben aufgezählten Konsensussequenzen ist.
Die hierin offenbarten DMT-Polypeptide können eine Aminosäuresequenz mit zumindest 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % oder 100 % Sequenzidentität mit den DMT-Domänen A, B und/oder C umfassen.
Die hierin offenbarten DMT-Polypeptide sind in der Lage, zumindest eine der folgenden biologischen Aktivitäten aufzuweisen:

(a) Glykosylase-Aktivität;
(b) Demethylierung von Polynucleotiden;
(c) DNA-Reparatur;
(d) worin die Expression des Polypeptids in einer Pflanze die Organidentität moduliert;
(e) worin die Expression des Polypeptids in einer Pflanze die Organanzahl moduliert;
(f) worin die Expression des Polypeptids in einer Pflanze Meristem-Stamm und/oder -aktivität moduliert;
(g) worin die verstärkte Expression des Polypeptids in einer Pflanze zu einer verspäteten Blütezeit führt;
(h) worin die Einführung des Polypeptids in eine Zelle zu der Modulation der Methylierung der chromosomalen DNA in der Zelle führt;
(i) worin die Reduktion der Expression des Polypeptids in einer Pflanze zu der Modulation der Endospermentwicklung führt;
(j) worin die Expression des Polypeptids in einem Arabidopsis-Blatt zu der Modulation der Expression des MEDEA-Gens führt.

Das Polypeptid kann entweder ein/eine/einen

(i) basische Region;
(ii) Kernlokalisierungs-Signal;
(iii) Leucin-Zipper;
(iv) Helix-Haarnadel-Helix-Struktur;
(v) Glycin-Prolin-reiche Schleife mit einer terminalen Asparaginsäure oder eine
(vi) Helix, die in der Lage ist, DNA zu binden, umfassen.

Die hierin offenbarten Nucleinsäuren sind zur Verwendung in Verfahren zur Modulation einer oder mehrerer von Folgendem geeignet:

(a) DNA-Reparatur;
(b) worin die Expression des Polypeptids in einer Pflanze die Organidentität moduliert;
(c) worin die Expression des Polypeptids in einer Pflanze die Organanzahl moduliert;
(d) worin die Expression des Polypeptids in einer Pflanze Meristem-Stamm und/oder -aktivität moduliert;
(e) worin die verstärkte Expression des Polypeptids in einer Pflanze zu einer verspäteten Blütezeit führt;
(f) worin die Einführung des Polypeptids in eine Zelle zu der Modulation der Methylierung der chromosomalen DNA in der Zelle führt;
(g) worin die Reduktion der Expression des Polypeptids in einer Pflanze zu der Modulation der Endospermentwicklung führt;
(h) worin die Expression des Polypeptids in einem Arabidopsis-Blatt zu der Expression des MEDEA-Gens führt,

(a) das Einführen einer Nucleinsäure aus Anspruch 1 in eine Pflanzenzelle; und
(b) das Erzeugen von Bedingungen, in denen die Pflanzenzelle die oben beschriebene Nucleinsäure transkribieren kann.

DEFINITIONEN
Der Ausdruck „Nucleinsäuresequenz" bezieht sich auf ein einzel- oder doppelsträngiges Polymer an Desoxyribonucleotid- oder Ribonucleotid-Basen, gelesen vom 5'- zum 3'-Ende. Sie umfasst chromosomale DNA, selbstreplizierende Plasmide, infektiöse Polymere von DNA oder RNA und DNA oder RNA, die eine primär strukturelle Rolle spielt.
Ein „Promotor" wird als eine Anordnung von Nucleinsäure-Kontrollsequenzen definiert, die die Transkription einer operabel gebundenen Nucleinsäure steuern. Wie hierin verwendet, ist ein „Pflanzen-Promotor" ein Promotor, der in Pflanzen agiert. Promotoren umfassen die notwendigen Nucleinsäure-Sequenzen in der Nähe der Startstelle der Transkription, wie z.B. im Fall eines Promotors vom Typ Polymerase II, ein TATA-Element. Gegebenenfalls umfasst ein Promotor ebenfalls distale Enhancer- oder Repressor-Elemente, die sich in bis zu einigen tausend Basenpaaren Entfernung von der Startstelle der Transkription befinden können. Ein „konstitutiver" Promotor ist ein Promotor, der unter den meisten Umwelt- und Entwicklungs-Bedingungen aktiv ist. Ein „induzierbarer" Promotor ist ein Promotor, der unter Umwelt- oder Entwicklungs-Regulation aktiv ist. Der Ausdruck „operabel gebunden" bezieht sich auf eine funktionelle Bindung zwischen einer Nucleinsäure-Expressionskontrollsequenz (z.B. ein Promotor oder eine Anordnung von Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen) und einer zweiten Nucleinsäuresequenz, worin die Expressionskontrollsequenz die Transkription der Nucleinsäure steuert, die mit der zweiten Sequenz korrespondiert.
Der Begriff „Pflanze" umfasst ganze Pflanzen, Pflanzenorgane (z.B. Blätter, Stängel, Blüten, Wurzeln etc.), Samen und Pflanzenzellen sowie die Nachkommen dieser. Die Klasse der Pflanzen, die im Verfahren der Erfindung verwendet werden kann, ist im Allgemeinen so weit gefasst wie die Klasse der blühenden Pflanzen, die für Transformations-Verfahren geeignet sind, unter anderem Angiospermen (einkeimblättrige und zweikeimblättrige Pflanzen) sowie Gymnospermen. Sie umfasst Pflanzen einer Vielzahl an Ploidie-Stufen, unter anderem polyploid, diploid, haploid und hemizygot.
Eine Polynucleotidsequenz ist „heterolog zu" einem Organismus oder einer zweiten Polynucleotidsequenz, falls sie aus einer fremden Spezies stammt, oder, falls sie von derselben Spezies stammt, im Vergleich zu ihrer ursprünglichen Form modifiziert wurde. Ein Promotor, der z.B. operabel an eine heterologe Kodierungssequenz gebunden ist, bezieht sich auf eine Kodierungssequenz einer Spezies, die sich von jener, aus der der Promotor stammt, unterscheidet, oder, falls er von derselben Spezies stammt, auf eine Kodierungssequenz, die sich von allen natürlich vorkommenden Allelvarianten unterscheidet.
Ein Polynucleotid, das zu einer einzelnen Pflanze „exogen ist", ist ein Polynucleotid, das in die Pflanze oder eine Vorgängergeneration der Pflanze mittels jedes beliebigen Verfahrens, das keine geschlechtliche Kreuzung ist, eingeführt wird. Beispiele der Verfahren, mit denen dies erreicht werden kann, werden unten stehend beschrieben und umfassen die agrobacteriumvermittelte Transformation, biolistische Verfahren, Elektroporation, In-planta-Verfahren und dergleichen. Wie hierin bezeichnet bezieht sich „exogen" auf jede Polynucleotid-, Polypeptid- oder Proteinsequenz, egal, ob diese chimär ist oder nicht, die anfänglich oder anschließend in das Genom einer einzelnen Wirtszelle oder des aus der Wirtszelle regenerierten Organismus mittels eines beliebigen Verfahrens, mit Ausnahme der geschlechtlichen Kreuzung, eingeführt wird. Beispiele der Verfahren, mit denen dies erreicht werden kann, werden unten stehend beschrieben und umfassen die agrobacteriumvermittelte Transformation (von Dikotylen – z.B. Salomon et al., EMBO J. 3, 141 (1984); Herrera-Estrella et al., EMBO J. 2, 987 (1983); von Monokotylen, als Beispiel dienende Dokumente sind jene von Escudero et al., Plant J. 10, 355 (1996), Ishida et al., Nature Biotechnology 14, 745 (1996), May et al., Bio/Technology 13, 486 (1995)), biolistische Methoden (Armaleo et al., Current Genetics 17, 97 (1990)), Elektroporation, In-planta-Verfahren und dergleichen. Solch eine Pflanze, die die exogene Nucleinsäure enthält, wird hierin als T0 für die primäre transgene Pflanze und als T1 für die erste Generation bezeichnet. Der Begriff „exogen", wie er hierin verwendet wird, soll ebenso die Insertion eines natürlich vorkommenden Elements in eine nicht natürlich vorkommende Stelle umfassen.
Der Begriff „Wirtszelle" bezieht sich auf eine Zelle aus einem beliebigen Organismus. Bevorzugte Wirtszellen stammen aus Pflanzen, Bakterien, Hefe, Pilzen, Insekten oder anderen Tieren, einschließlich Menschen. Verfahren zur Einführung von Polynucleotidsequenzen in verschiedene Typen an Wirtszellen sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt.
Die „biologische Aktivität eines Polypeptids" bezieht sich auf eine(n) beliebige(n) molekulare(n) Aktivität oder Phänotyp, die/der durch das Polypeptid hervorgerufen wird. Die Fähigkeit, ein Phosphat zu einem Substrat zu transferieren, oder die Fähigkeit, eine spezifische DNA-Sequenz zu binden, stellt eine biologische Aktivität dar. Eine biologische Aktivität von DMT ist die Glykosylase-Aktivität, d.h. die Spaltung der Nucleotidbase vom Nucleotidzucker. Eine weitere biologische Aktivität von DMT ist die Demethylierung von Nucleotiden (z.B. besitzt DMT 5'-Methylcytosin-Glykosylase-Aktivität). Zusätzlich besitzt DMT die Fähigkeit, die Endospermproduktion, wie hierin beschrieben, zu modulieren und die Blütezeit bei Pflanzen zu modulieren. Wird die DMT-Expression oder DMT-Aktivität in einer Pflanze z.B. erhöht, so wird die Blütezeit der Pflanze verspätet. Weiters führt die Expression eines DMT-Polypeptids in einem Pflanzengewebe (z.B. einem Blatt), das das MEDEA-Gen typischerweise nicht exprimiert (U. Grossniklaus et al., Science 280 (5362), 446-50 (1998)), zu der Expression von MEDEA.
Zusätzliche biologische Aktivitäten von DMT-Polypeptiden umfassen: Kernlokalisierung (z.B. wie von den Aminosäuren 43-78 aus Seq.-ID Nr. 2 lokalisiert); die Fähigkeit, die Pflanzenorgangröße und/oder -anzahl zu modulieren; die Fähigkeit, die Meristemgröße und/oder -aktivität zu modulieren; sowie die Durchführung von DNA-Reparaturen, unter anderem Nucleotid-Methylierung oder -Demethylierung und/oder Reparatur und/oder Entfernung fehlgepaarter Nucleotide aus der DNA.
Eine „Expressionskassette" bezieht sich auf ein Nucleinsäurekonstrukt, das, wenn es in eine Wirtszelle eingeführt wird, zu der Transkription und/oder Translation einer RNA bzw. eines Polypeptids führt. Antisense- oder Sense-Konstrukte, die nicht trans latiert werden oder nicht translatiert werden können, sind ausdrücklich in dieser Definition enthalten.
Eine „DMT-Nucleinsäure" oder eine „DMT-Polynucleotidsequenz" der Erfindung ist eine Subsequenz oder eine Polynucleotidsequenz voller Länge eines Gens, das für ein Polypeptid kodiert, das in die Steuerung der Reproduktionsentwicklung involviert ist und das, wenn das mütterliche Allel mutiert ist oder wenn die DMT-Aktivität in einem/einer mütterlichen Gewebe oder Pflanze reduziert oder eliminiert ist, eine erhöhte Produktion des Endosperms und/oder den Abort des Keimlings ermöglicht. Zusätzlich führt eine Überexpression von DMT in Pflanzen zu einer Verzögerung der Zeit bis zur Blüte. Weiters ist DMT für die Expression von MEDEA in einer Pflanzenzelle notwendig und ausreichend. Eine als Beispiel dienende Nucleinsäure der Erfindung ist die Arabidopsis-DMT-Sequenz (Seq.-ID Nr. 1). Zusätzliche DMT-Nucleinsäuresequenzen aus einer Reihe an Pflanzenspezies werden ebenso bereitgestellt (z.B. Seq.-ID Nr. 7–70). DMT-Polynucleotide werden durch ihre Fähigkeit definiert, unter bestimmten Bedingungen an die dargestellten Nucleinsäuren oder PCR-Produkte, die von ihnen abstammen, zu hybridisieren. Ein DMT-Polynucleotid ist typischerweise zumindest etwa 30–40 Nucleotide bis etwa 7000, normalerweise weniger als etwa 10,000 Nucleotide, lang. Noch bevorzugter enthalten DMT-Polynucleotide eine kodierende Sequenz von etwa 100 bis etwa 5500 Nucleotide, oftmals von etwa 500 bis etwa 3600 Nucleotide, in der Länge. Ein DMT-Polypeptid ist typischerweise zumindest 500 Aminosäuren, typischerweise zumindest 1000 Aminosäuren, noch typischer zumindest 1500 Aminosäuren, lang. In einigen Ausführungsformen umfasst ein DMT-Polypeptid weniger als 2000 Aminosäuren, noch typischer weniger als 3000 Aminosäuren und weiters noch typischer weniger als 5000 oder 7500 Aminosäuren, in der Länge.
Wie unten stehend beschrieben kodieren DMT-Nucleinsäuresequenzen für Polypeptide mit einer beträchtlichen Identität mit zumindest einer der folgenden Konsensussequenzen: DMT-Domäne A
DMT-Domäne B
DMT-Domäne C
Zusätzlich wurden die folgenden, alle drei Domänen umspannenden Konsensussequenzen identifiziert:
Die DMT-Domäne A entspricht den Aminosäurepositionen 697 bis 796 aus Seq.-ID Nr. 2. Die DMT-Domäne B entspricht den Aminosäurepositionen 1192 bis 1404 aus Seq.-ID Nr. 2. Die DMT-Domäne C entspricht den Aminosäurepositionen 1452 bis 1722 aus Seq.-ID Nr. 2. Die Konsensussequenz stellt Aminosäuresequenzen je nach Position unter Verwendung von Einbuchstaben-Aminosäureabkürzungen bereit. Die Zahlen in den Kleiner- und Größer-als-Zeichen („<" oder ">") beziehen sich auf Aminosäurepositionen, in denen es keinen Konsensus gibt und die daher eine beliebige Aminosäure sein können. Aminosäureabkürzungen in runden Klammern deuten auf alternative Aminosäuren an derselben Position hin. Groß geschriebene Buchstaben beziehen sich auf vorherrschende Konsensus-Aminosäuren, und klein geschriebene Buchstaben beziehen sich auf Aminosäuren, die häufig in DMT-Sequenzen zu finden sind, jedoch nicht vorherrschend sind. Es ist daher eine einfache Sache, herauszufinden, ob eine beliebige spezielle Nucleinsäuresequenz eine DMT-Nucleinsäure ist und/oder für ein DMT-Polypeptid kodiert.
Die Struktur von DMT-Polypeptiden voller Länge umfasst die folgenden Domänen und Regionen. Diese Regionen werden im Allgemeinen mit Bezug auf Seq.-ID Nr. 2 beschrieben. Zuerst können Domäne-B-DMT-Polypeptide, wie oben beschrieben, ein zweigeteiltes Kernlokalisierungssignal umfassen (z.B. Aminosäurepositionen 43-60 und 61-78 in Seq.-ID Nr. 2), das aus basischen Aminosäuren besteht. Die Aminosäuren 36-91 sind zu menschlicher G/T-fehlpaarungsspezifischer Thymin-DNA-Glykosylase (Genbank-Zugriffsnr. AAC50540.1) homolog, die eine 5-Methylcytosin-Glykosylaseaktivität aufweist (Zhu et al., Nuc. Acids Res. 28, 4157-4165 (2000)). DMT-Polypeptide enthalten ebenso eine Leucin-Zippersequenz (z.B. Positionen 1330-1351 aus Seq.-ID Nr. 2), die in Protein-Protein-Wechselwirkungen sowie in die DNA-Bindung involviert sein kann. Zusätzlich ist der Aminoteil des DMT-Polypeptids (Aminosäuren 43-78) im Allgemeinen basisch, ähnlich zu Niston H1. Ohne daher den Umfang der Erfindung einschränken zu wollen, wird davon ausgegangen, dass dieser basische Teil von DMT die Wechselwirkungen mit der DNA und/oder chromatischen Proteinen erleichtert.
Zusätzlich sind die Aminosäuren 1-800 mit der β-Untereinheit von bakteriellen DNA-abhängigen RNA-Polymerasen verwandt. Ohne den Umfang der Erfindung einschränken zu wollen, wird davon ausgegangen, dass die RNA-polymeraseartige Domäne die Wechselwirkung von DMT mit der DNA erleichtert.
Die Aminosäuren 1167-1368 sind mit Proteinen in der HhH-GPD-Überfamilie verwandt. Die Aminosäuren 1.271 bis 1.304 entsprechen dem konservierten HhH-GPD-Motiv. Die entsprechende DMT-Sequenz ist DKAKDYLLSIRGLGLKSVECVRLLTLHNLAFPVD. Die sekundäre Strukturprognose (Jpred-Programm) deutet darauf hin, dass DMT zwei α-Helices besitzt (1.271 bis 1.279 und 1.286 bis 1.295), die mit den konservierten α-K- und α-L-Helices im HhH-GPD-Motiv des kristallisierten hOGG1-DNA-Reparatur-Proteins korrespondieren (Bruner et al., Nature 403, 859-866 (2000)). Zwischen den beiden Helices (1280 bis 1285) befindet sich eine Haarnadel mit konservierten Glycinen (G1282 und G1284). Die Aminosäuren 1286 bis 1295 sind mit der α-L-Helix von hOGG1, die das DNA-Rückgrat kontaktiert, verwandt (Bruner et al., Nature 403, 859-866 (2000)). Ohne daher den Umfang der Erfindung einschränken zu wollen, wird davon ausgegangen, dass diese Region von DMT die DNA kontaktiert. Die katalytischen Lysin-(K1286) und Asparaginsäure-(D1304)Reste sind im HhH-GPD-Motiv von DMT konserviert. Ohne den Umfang der Erfindung einschränken zu wollen, wird, in Analogie zu hOGG1, prognostiziert, dass K1286 die modifizierte Base ersetzt und die Konjugat-Elimination der 3'-Phosphodiester-Bindung fördert. Ohne den Umfang der Erfindung einschränken zu wollen, wird, in Analogie zu hOGG1, davon ausgegangen, dass D1304 die Reaktion durch den Transfer von Protonen zu und von K1286 unterstützt.
DMT-Nucleinsäuren sind eine neue Klasse an Pflanzenregulationsgenen, die für Polypeptide mit einer Sequenzidentität mit Mitgliedern der Endonuclease-III-Gene kodieren, die in einer diversen Sammlung an Organismen zu finden sind. Endonuclease III ist in verschiedene DNA-Reparatur-Reaktionen verwickelt. Daher weisen Proteine, die mit Endonuclease III verwandt sind, mit größerer Wahrscheinlichkeit eine chromosomale Funktion auf. DMT (Seq.-ID Nr. 1) ist mit Endonuclease III aus Deinococcus radiodurans, Genbank-Zugriffsnr. AE002073, am meisten verwandt (siehe z.B. O. White et al., Science 286, 1571-1577 (1999)). DMT-Polypeptide besitzen eine Glykosylase-Aktivität (d.h. die Fähigkeit, den Basenteil eines Nucleotids vom Zuckerteil abzuspalten). Insbesondere besitzen DMT-Polypeptide Demethylase-Aktivität und, in bevorzugten Ausführungsformen, besitzen sie 5-Methylcytosin-Glykosylase- Aktivität. Die Demethylierungs-Aktivität kann in vivo durch die Expression eines Kandidaten-Polypeptids im Nucleus einer Zelle und anschließendes Testen auf eine Veränderung in der Methylierung der DNA der Zelle getestet werden. Siehe z.B. Vong et al., Science 260, 1926-1928 (1993). Veränderungen in der chromosomalen Methylierung können durch Vergleichen der Fähigkeit von methylierungsempfindlichen und -unempfindlichen Endonucleasen gemessen werden, DNA von einer Zelle zu spalten, die ein Polypeptid exprimiert, von dem angenommen wird, es hätte eine Demethylase- oder Methylase-Aktivität. Alternativ dazu kann die Bisulfat-Sequenzierung verwendet werden, um zu identifizieren, welche Basenpaare in einer DNA-Sequenz methyliert sind. Für eien Diskussion beider Verfahren siehe Soppe et al., Molec. Cell 6, 791-802 (2000). In-vitro-Tests zur Messung der Demethylase-Aktivität unter Verwendung von markierten Substraten sind dem Fachmann ebenso bekannt. Siehe z.B. Vhu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 5135-5139 (2000).
Sowohl im Fall der Expression von Transgenen als auch im Fall der Inhibierung von endogenen Genen (z.B. durch Antisense- oder Sense-Suppression) wird der Fachmann erkennen, dass die insertierte Polynucleotidsequenz nicht identisch sein muss, sondern nur „im Wesentlichen identisch" mit einer Sequenz des Gens sein kann, von dem es abstammt. Wie unten stehend erklärt, werden diese im Wesentlichen identischen Varianten spezifisch vom Begriff DMT-Nucleinsäure abgedeckt.
In dem Fall, in dem die insertierte Polynucleotidsequenz transkribiert und translatiert wird, um ein funktionelles Polypeptid zu produzieren, wird ein Fachmann erkennen, dass aufgrund der Codon-Degeneration eine Reihe an Polynucleotidsequenzen für dasselbe Peptid kodieren. Diese Varianten werden vom Begriff „DMT-Nucleinsäure" spezifisch abgedeckt. Zusätzlich umfasst der Begriff spezifisch jene Sequenzen, die im Wesentlichen identisch (bestimmt wie unten beschrieben) mit einer hierin offenbarten DMT-Polynucleotidsequenz sind und die für Polypeptide kodieren, die entweder Mutanten von Wildtyp-DMT-Polypeptiden sind oder die Funktion des DMT-Polypeptids beibehalten (z.B. als Resultat von konservativen Substitutionen von Aminosäuren im DMT-Polypeptid). Zusätzlich können Varianten jene sein, die für dominante negative Mutanten kodieren, wie unten stehend beschrieben.
Zwei Nucleinsäuresequenzen oder Polypeptide werden als „identisch" bezeichnet, wenn die Sequenz an Nucleotiden bzw. Aminosäureresten in den beiden Sequenzen dieselbe ist, wenn sie, wie unten stehend beschrieben, für eine maximale Übereinstimmung angeordnet wird. Die Begriffe „identisch" oder Prozent-„Identität" beziehen sich im Kontext von zwei oder mehr Nucleinsäuren oder Polypeptidsequenzen auf zwei oder mehr Sequenzen oder Subsequenzen, die dieselben sind oder einen gleichen spezifischen Prozentsatz an Aminosäureresten oder Nucleotiden aufweisen, wenn er für eine maximale Übereinstimmung über ein Vergleichsfenster verglichen und angeordnet wird, wie sie unter Verwendung eines der folgenden Sequenz-Vergleichs-Algorithmen oder mittels manueller Anordnung und Sichtprüfung gemessen wird. Wird der Prozentsatz der Sequenzidentität in Bezug auf Proteine oder Peptide verwendet, so ist allgemein anerkannt, dass Restpositionen, die nicht identisch sind, sich oftmals durch konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheiden, wo Aminosäurereste für andere Aminosäurereste mit ähnlichen chemischen Eigenschaften (z.B. Ladung oder Hydrophobizität) substituiert werden und daher die funktionellen Eigenschaften des Moleküls nicht verändern. Wo sich Sequenzen in konservativen Substitutionen unterscheiden, kann der Prozentsatz der Sequenzidentität nach oben hin angepasst werden, um aufgrund der konservativen Natur der Substitution korrigierend einzugreifen. Mittel zur Durchführung dieser Anpassung sind dem Fachmann nach dem Stand der Technik wohlbekannt. Typischerweise umfasst dies das Bewerten einer konservativen Substitution als eine partielle, anstatt als eine volle, Fehlpaarung, wodurch der Prozentsatz der Sequenzidentität erhöht wird. Daher wird dort, wo z.B. eine identische Aminosäure eine Bewertung von 1 erhält und eine nicht konservative Substitution eine Bewertung von 0 erhält, einer konservativen Substitution eine Bewertung zwischen Null und 1 zugeteilt. Die Bewertung konservativer Substitutionen wird z.B. gemäß dem Algorithmus von Meyers & Miller, Computer Applic. Biol. Sci. 4, 11-17 (1988), berechnet, wie er z.B. im Programm PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Kalifornien, USA) implementiert wurde.
Der Ausdruck „im Wesentlichen identisch" bezieht sich im Kontext von zwei Nucleinsäuren oder Polypeptiden auf eine Sequenz oder Subsequenz, die zumindest 40 % Sequenzidentität mit einer Referenzsequenz aufweist. Alternativ dazu kann die Pro zentidentität jede ganze Zahl von 40 % bis 100 % sein. Noch bevorzugtere Ausführungsformen umfassen zumindest: 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % im Vergleich zu einer Referenzsequenz unter Verwendung der hierin beschriebenen Programme, vorzugsweise BLAST unter Verwendung von Standard-Parametern, wie sie unten stehend beschrieben werden. Diese Definition bezieht sich auf das Komplement einer Testsequenz, wenn die Testsequenz eine wesentliche Identität mit einer Referenzsequenz aufweist.
Für den Sequenzvergleich dient typischerweise eine Sequenz als eine Referenzsequenz, mit der Testsequenzen verglichen werden. Wird ein Sequenzvergleichs-Algorithmus verwendet, so werden Test- und Referenzsequenzen in einen Computer eingegeben, Subsequenz-Koordinaten bezeichnet, falls notwendig, und die Parameter des Sequenz-Algorithmusprogramms bestimmt. Es können Vorgabe-Programmparameter verwendet werden oder alternative Parameter festgelegt werden. Der Sequenzvergleichs-Algorithmus berechnet dann den Prozentsatz der Sequenzidentitäten für die Testsequenzen in Bezug auf die Referenzsequenz basierend auf den Programmparametern.
Ein „Vergleichsfenster" umfasst, wie hierin verwendet, eine Referenz zu einem Segment einer beliebigen der Anzahl zusammenhängender Positionen, die aus der aus von 20 bis 600, normalerweise etwa 50 bis etwa 200, noch typischer etwa 100 bis etwa 150, bestehenden Gruppe ausgewählt sind, in der eine Sequenz mit einer Referenzsequenz mit derselben Anzahl an zusammenhängenden Positionen verglichen werden kann, nachdem die beiden Sequenzen optimal angeordnet sind. Verfahren zur Anordnung der Sequenzen zum Vergleich sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt. Eine optimale Anordnung von Sequenzen zum Vergleich kann z.B. durch den lokalen Homologie-Algorithmus von Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2, 482 (1981), durch den Homologie-Anordnungs-Algorithmus von Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 443 (1970), durch die Suche nach dem Ähnlichkeitsverfahren von Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85, 2444 (1988), durch computerisierte Implementation dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA im Wisconsin-Genetics-Software-Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) oder durch manuelle Anordnung und Sichtprüfung erfolgen.
Ein Beispiel eines nützlichen Algorithmus ist PILEUP.PILEUP kreiert eine multiple Sequenzanordnung aus einer Gruppe verwandter Sequenzen, und zwar unter Verwendung von progressiven, paarweisen Anordnungen, um die Beziehung und den Prozentsatz der Sequenzidentität aufzuzeigen. Weiters zeichnet es ebenso ein Baumdiagramm oder ein Dendogramm, das die gebündelten Beziehungen zeigt, die verwendet wurden, um die Anordnung zu kreieren. PILEUP verwendet eine Vereinfachung des progressiven Anordnungsverfahrens von Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35, 351-360 (1987). Das verwendete Verfahren ähnelt dem von Higgins & Sharp, CABIOS 5, 151-153 (1989), beschriebenen Verfahren. Das Programm kann bis zu 300 Sequenzen anordnen, jede mit einem Längenmaximum von 5.000 Nucleotiden oder Aminosäuren. Das multiple Anordnungsverfahren beginnt mit der paarweisen Anordnung der beiden ähnlichsten Sequenzen, wodurch ein Cluster von zwei angeordneten Sequenzen entsteht. Dieser Cluster wird anschließend zu der nächsten, am engsten verwandten Sequenz oder dem Cluster angeordneter Sequenzen angeordnet. Die zwei Sequenz-Cluster werden mittels einer einfachen Extension der paarweisen Anordnung von zwei einzelnen Sequenzen angeordnet. Die letzte Anordnung wird durch eine Reihe progressiver, paarweiser Anordnungen erreicht. Das Programm läuft durch die Benennung spezifischer Sequenzen und ihrer Aminosäure- oder Nucleotid-Koordinaten für Regionen des Sequenzvergleichs und durch das Festlegen der Programm-Parameter. Eine Referenzsequenz kann z.B. mit anderen Testsequenzen verglichen werden, um die Beziehung des Prozentsatzes der Sequenzidentität unter Verwendung der folgenden Parameter zu bestimmen: Vorgabe-Lückengewicht („default gap weight") (3,00), Vorgabe-Lückenlängengewicht („default gap length weight") (0,10) und Lücken mit gewogenen Enden („weighted end gaps").
Ein weiteres Beispiel eines Algorithmus, der zum Bestimmen der Prozent-Sequenzidentität und der Sequenzähnlichkeit geeignet ist, ist der BLAST-Algorithmus, der in Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990), beschrieben wird. Die Software zur Durchführung von BLAST-Analysen ist öffentlich durch das National Center for Biotechnology Information erhältlich (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Dieser Algorithmus involviert zuerst durch die Identifikation von kurzen Wörtern der Länge W in der Abfragesequenz die Identifikation von Sequenzpaaren mit hohen Bewertungen (HSPs), die entweder mit einer positivevaluierten Schwellen-Bewertung T übereinstimmen oder dieser genügen, wenn sie mit einem Wort derselben Länge in der Datenbanksequenz angeordnet werden. T wird dabei als der Schwellenwert der Wortbewertung in der Nachbarschaft bezeichnet (Altschul et al., s.o.). Diese anfänglichen Wort-Hits aus der Nachbarschaft dienen als Samen zur Initiierung von Suchoperationen, um längere HSPs zu finden, die diese enthalten. Die Wort-Hits erstrecken sich in beide Richtungen entlang jeder Sequenz, und zwar so weit, wie die kumulative Anordnungsbewertung gesteigert werden kann. Die Ausweitung der Wort-Hits in jede Richtung wird gestoppt, wenn: die kumulative Anordnungsbewertung um die Menge X von ihrem maximal erreichten Wert abfällt; die kumulative Bewertung aufgrund der Akkumulation einer oder mehrerer negativ bewerteter Rest-Anordnungen auf oder unter Null absinkt; oder wenn das Ende einer der Sequenzen erreicht wird. Die BLAST-Algorithmus-Parameter W, T und X bestimmen die Empfindlichkeit und die Geschwindigkeit der Anordnung. Das BLAST-Programm verwendet als Vorgaben eine Wortlänge (W) von 11, die BLOSUM62-Scoring-Matrix (siehe Henikoff & Henikoff, Proc. Natl., Acad. Sci. USA 89, 10915 (1989)) Anordnungen (B) von 50, eine Erwartung (E) von 10, M = 5, N = –4 sowie einen Vergleich beider Stränge.
Der BLAST-Algorithmus führt ebenso eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durch (siehe z.B. Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90, 5873-5787 (1993)). Ein Maß der Ähnlichkeit, das durch den BLAST-Algorithmus bereitgestellt wird, ist die kleinste Summenwahrscheinlichkeit (P(N)), die einen Hinweis auf die Wahrscheinlichkeit bereitstellt, mit der durch Zufall eine Übereinstimmung zwischen zwei Nucleotid- oder Aminosäure-Sequenzen auftreten würde. Eine Nucleinsäure wird z.B. als ähnlich im Vergleich zu einer Referenzsequenz angesehen, wenn die kleinste Summenwahrscheinlichkeit in einem Vergleich der Testnucleinsäure mit der Referenznucleinsäure weniger als etwa 0,2, bevorzugter weniger als etwa 0,01 und insbesondere bevorzugt weniger als etwa 0,001, beträgt.
Der Ausdruck „konservativ modifizierte Varianten" bezieht sich sowohl auf Aminosäure- als auch auf Nucleinsäuesequenzen. Im Hinblick auf bestimmte Nucleinsäuresequenzen bezieht sich konservativ modifizierte Varianten auf jene Nucleinsäuren, die für identische oder im Wesentlichen identische Aminosäuresequenzen kodieren, oder, in Fällen, in denen die Nucleinsäure nicht für eine Aminosäuresequenz kodiert, auf im Wesentlichen identische Sequenzen. Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes kodiert eine große Anzahl an funktionell identischen Nucleinsäuren für ein beliebiges gegebenes Protein. Die Codons GCA, GCC, GCG und GCU kodieren z.B. alle für die Aminosäure Alanin. An jeder Position, an der ein Alanin durch ein Codon spezifiziert wird, kann daher das Codon auf jedes beliebige der beschriebenen Codons geändert werden, ohne das kodierte Polypeptid zu verändern. Solche Nucleinsäurevariationen sind „stumme Variationen", die eine Art konservativ modifizierter Variationen darstellen. Jede hierin beschriebene Nucleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid kodiert, beschreibt ebenso jede mögliche stumme Variation der Nucleinsäure. Ein Fachmann wird erkennen, dass jedes Codon in einer Nucleinsäure (außer AUG, das normalerweise das einzige Codon für Methionin ist) modifiziert werden kann, um ein funktionell identisches Molekül zu ergeben. Dementsprechend ist jede stumme Variation einer Nucleinsäure, die für ein Polypeptid kodiert, in jeder beschriebenen Sequenz inbegriffen.
Im Hinblick auf Aminosäuresequenzen wird ein Fachmann erkennen, dass einzelne Substitutionen, Deletionen oder Additionen zu einer Nucleinsäure-, Peptid-, Polypeptid- oder Protein-Sequenz, die eine einzelne Aminosäure oder einen geringen Prozentsatz an Aminosäuren in der kodierten Sequenz verändern, hinzufügen oder deletieren, eine „konservativ modifizierte Variante" darstellen, in der die Veränderung zu der Substitution einer Aminosäure mit einer chemisch ähnlichen Aminosäure führt. Tabellen bezüglich konservativer Substitutionen mit funktionell ähnlichen Aminosäuren sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt.
Die folgenden sechs Gruppen enthalten jeweils Aminosäuren, die konservative Substitutionen füreinander darstellen:

1) Alanin (A), Serin (S), Threonin (T);
2) Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E);
3) Asparagin (N), Glutamin (Q);
4) Arginin (R), Lysin (K);
5) Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Valin (V); und
6) Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W). (Siehe z.B. Creighton, Proteins (1984).)

Ein Anzeichen dafür, dass zwei Nucleinsäuresequenzen oder Polypeptide im Wesentlichen identisch sind, ist, dass das von der ersten Nucleinsäure kodierte Polypeptid immunologisch kreuzreaktiv mit den gegen das Polypeptid erzeugten Antikörpern ist, das von der zweiten Nucleinsäure kodiert wird. Ein Polypeptid ist daher z.B. in jenen Fällen typischerweise im Wesentlichen identisch mit einem zweiten Polypeptid, in denen sich die zwei Peptide nur durch konservative Substitutionen unterscheiden. Ein weiteres Anzeichen dafür, dass zwei Nucleinsäuresequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist, dass die beiden Moleküle oder ihre Komplemente, wie unten beschrieben, unter stringenten Bedingungen aneinander hybridisieren.
Der Ausdruck „hybridisiert selektiv (oder spezifisch) an" bezieht sich auf die Bindung, Duplex-Bildung oder Hybridisierung eines Moleküls unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an lediglich eine bestimmte Nucleotidsequenz, wenn diese Sequenz in einem komplexen Gemisch vorhanden ist (z.B. gesamte zelluläre oder Bibliotheks-DNA oder -RNA).
Der Ausdruck „stringente Hybridisierungsbedingungen" bezieht sich auf Bedingungen, unter denen eine Sonde an ihre Ziel-Subsequenz hybridisiert, typischerweise in einem komplexen Gemisch aus Nucleinsäure, jedoch an keine anderen Sequenzen. Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und unterscheiden sich je nach unterschiedlichen Umständen. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Eine umfassende Anleitung zu der Hybridisierung von Nucleinsäuren ist in Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology – Hybridization with Nucleic Probes, Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays (1993), zu finden. Im Allgemeinen werden hochgradig stringente Bedingungen so ausgewählt, dass sie etwa 5–10 °C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz bei einem definierten Ionenstärken-pH sind. Bedingungen niedriger Stringenz werden im Allgemeinen so ausgewählt, dass sie etwa 15–30 °C unter dem T_m liegen. Der T_m ist jene Temperatur (unter definierter Ionenstärke, pH und Kernkonzentration), bei der 50 % der als komplementär zum Ziel charakterisierten Sonden im Gleichgewicht an die Zielsequenz hybridisieren (da die Zielsequenzen im Übermaß vorhanden sind, werden bei T_m 50 % der Sonden im Gleichgewicht besetzt). Stringente Bedingungen sind jene, bei denen die Salzkonzentration weniger als etwa 1,0 M Natriumionen-, typischerweise etwa 0,01 bis 1,0 M Natriumionenkonzentration (oder andere Salze), bei einem pH von 7,0 bis 8,3 beträgt und die Temperatur zumindest etwa 30 °C für kurze Sonden (z.B. 10 bis 50 Nucleotide) und zumindest etwa 55 °C, manchmal 60 °C und manchmal 65 °C, für lange Sonden (z.B. mehr als 50 Nucleotide) beträgt. Stringente Bedingungen können ebenso durch die Hinzufügung von destabilisierenden Agenzien, wie z.B. Formamid, erreicht werden. Für eine selektive oder spezifische Hybridisierung beträgt ein positives Signal zumindest zwei Mal, vorzugsweise 10-mal, der Hintergrundhybridisierung.
Nucleinsäuren, die unter stringenten Bedingungen nicht aneinander hybridisieren, sind im Wesentlichen identisch, wenn die Polypeptide, für die sie kodieren, im Wesentlichen identisch sind. Dies tritt z.B. auf, wenn eine Kopie einer Nucleinsäure unter Verwendung der maximalen Codon-Degeneration, die durch den genetischen Code ermöglicht wird, erzeugt wird. In solchen Fällen hybridisieren die Nucleinsäuren typischerweise unter moderat stringenten Hybridisierungsbedingungen.
In der vorliegenden Erfindung kann genomische DNA oder cDNA, die DMT-Nucleinsäuren der Erfindung umfasst, in Standard-Southern-Blots unter stringenten Bedingungen unter Verwendung der hierin offenbarten Nucleinsäuresequenzen identifiziert werden. Für die Zwecke dieser Offenbarung sind geeignete stringente Bedingungen für solche Hybridisierungen jene, die eine Hybridisierung in einem Puffer von 40 % Formamid, 1 M NaCl, 1 % SDS bei 37 °C und zumindest einen Waschschritt in 0,2 X SSC bei einer Temperatur von zumindest etwa 50 °C, normalerweise etwa 55 °C bis etwa 60 °C und manchmal 65 °C, für eine Zeitspanne von 20 Minuten oder äquivalente Bedingungen umfassen. Eine positive Hybridisierung ist zumindest eine zweifache Hintergrundhybridisierung. Der Fachmann wird leicht erkennen, dass alternative Hybridisierungs- und Waschbedingungen verwendet werden können, um Bedingungen ähnlicher Stringenz bereitzustellen.
Ein weiterer Hinweis darauf, dass zwei Polynucleotide im Wesentlichen identisch sind, ist, wenn die Referenzsequenz, die von einem Paar Oligonucleotidprimern amplifiziert wird, anschließend unter stringenten Hybridisierungsbedingungen als eine Sonde verwendet werden kann, um die Testsequenz aus einer cDNA- oder genomischen Bibliothek zu isolieren oder um die Testsequenz z.B. in einem Northern- oder Southern-Blot zu identifizieren.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Diese Erfindung stellt molekulare Strategien für die Steuerung der Pflanzenentwicklung bereit, umfassend die Methylierung von chromosomaler DNA, die Endospermentwicklung und die Blütezeit.
Die Reproduktion bei blühenden Pflanzen involviert zwei Befruchtungsereignisse im haploiden weiblichen Gametophyten. Ein Spermiennucleus befruchtet das Ei, um den Keimling zu bilden. Ein zweiter Spermiennucleus befruchtet die Zentralzelle, um das Endosperm zu bilden, ein einzigartiges Gewebe, das das Wachstum des Keimlings unterstützt. Die Befruchtung aktiviert ebenso eine mütterliche Gewebedifferenzierung, die Samenanlagen-Integumente bilden die Samenschale, und der Fruchtknoten bildet die Frucht.
Die vorliegende Erfindung basiert, zumindest teilweise, auf der Entdeckung einer Reihe an weiblichen Gametophytenmutationen und dem darauf folgenden Klonieren des involvierten Gens, genannt DEMETER (DMT), formal als ATROPOS (ATR) be kannt. Zwei Mutantenallele des hierin offenbarten DMT wurden unter Verwendung einer T-DNA-Markierung erzeugt, wodurch ein Exon des Gens zerstört wurde. Die DMT-Mutationen beeinflussen die Endospermproduktion, was zu einer verstärkten Endospermentwicklung führt. Im Allgemeinen werden die Mutanten-dmt-Allele nicht durch den weiblichen Gametophyten weitergegeben. Die Vererbung eines Mutantendmt-Allels durch den weiblichen Gametophyten führt normalerweise zu einem Keimling-Abort und einer Endosperm-Überproduktion, sogar dann, wenn der Pollen das Wildtyp-DMT-Allel in sich trägt.
Im Gegensatz dazu ist die Übertragung von dmt-Mutanten-Allelen durch den männlichen Gametophyten (d.h. Pollen) bei Arabidopsis vom Öcotypus abhängig. Bei einigen Ökotypen (z.B. Columbia) beträgt die Übertragung von dmt-Mutanten-Allelen weniger als 50 %. Bei Landsberg erecta ist die Übertragung jedoch beinahe normal.
DMT ist ein Endosperm-Repressor sowohl vor als auch nach der Befruchtung. DMT ist für die MEDEA-Transkription sowohl notwendig als auch ausreichend. DMT ist mit 5-Methylcytosin-Glykosylasen verwandt. DMT reguliert die Transkription spezifischer Zielgene (d.h. MEA) durch einen Demethylierungsmechanismus. DMT ist ebenso für den Erhalt des korrekten Gesamtmusters der Methylierung chromosomaler DNA in Zellen erforderlich.
Die wie hierin beschrieben hergestellten isolierten Sequenzen können in einer Reihe an Verfahren verwendet werden, z.B. um die endogene DMT-Gen-Expression zu inhibieren oder zu verstärken. Die Modulation der DMT-Gen-Expression oder der DMT-Aktivität in Pflanzen ist z.B. bei der Produktion von keimlinglosen Samen oder Samen mit verringerter Keimlingzahl, Samen mit vermehrtem Endosperm, als Teil eines Systems zur Samenerzeugung, bei der Modulation der Zeit bis zur Blüte, der Organ-Identität, -Größe und/oder -Anzahl, der Meristem-Größe oder -Aktivität in Pflanzen oder bei der Modulation der Methylierung und daher der Gen-Expression in Pflanzen besonders von Nutzen. Eine weitere Verwendung ist die Expression von DMT-Polynucleotiden in Tierzellen, z.B. als ein DNA-Reparaturenzym, das aufgrund von chromosomalen Läsionen in der Prävention der unnatürlichen Proliferation von Zellen (unter anderem Krebs) nützlich ist. Siehe z.B. Bruner et al., Nature 403, 859 (2000).
Wie unten stehend ausführlicher beschrieben, führt eine Reduktion der Expression von DMT in Pflanzen zu einer Reihe unterschiedlicher Phänotypen. Ohne die Erfindung auf bestimmte Ausführungsformen einschränken zu wollen, wird davon ausgegangen, dass einige der Phänotypen, die in Pflanzen erzeugt werden, epigenetische Mutationen sind, d.h. Wirkungen aufgrund von Unterschieden im Methylierungsstadium des Chromosoms, die zu einer veränderten Gen-Expression führen. Daher stellt DMT ein wirkungsvolles Werkzeug zur Entwicklung einer beliebigen Anzahl an Pflanzenlinien mit einer Reihe an gewünschten Phänotypen bereit.
Isolation von DMT-Nucleinsäuren
Im Allgemeinen sind die Nomenklatur und die Laborverfahren in DNA-Rekombinationsverfahren, wie sie unten stehend beschrieben werden, jene, die nach dem Stand der Technik wohlbekannt sind und im Allgemeinen verwendet werden. Für die Klonierung, die DNA- und RNA-Isolation, -Amplifikation und -Reinigung werden Standardverfahren verwendet. Im Allgemeinen werden enzymatische Reaktionen, die die DNA-Ligase, DNA-Polymerase, Restriktions-Endonucleasen und dergleichen involvieren, gemäß der Beschreibungen des Herstellers durchgeführt. Diese Verfahren und verschiedene andere Verfahren werden im Allgemeinen gemäß Sambrook et al., Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989), durchgeführt.
Die Isolation von DMT-Nucleinsäuren kann durch eine Reihe an Verfahren erreicht werden. Oligonucleotidsonden, die auf den hierin offenbarten Sequenzen basieren, können z.B. zur Identifikation des gewünschten Gens in einer cDNA- oder genomischen DNA-Bibliothek verwendet werden. Um genomische Bibliotheken zu konstruieren, werden große Segmente genomischer DNA mittels Zufalls-Fragmentierung, z.B. unter Verwendung von Restriktions-Endonucleasen, erzeugt und mit Vektor-DNA ligiert, um Konkatemere zu bilden, die in den geeigneten Vektor gepackt werden kön nen. Um eine cDNA-Bibliothek herzustellen, wird mRNA aus dem gewünschten Organ, wie z.B. den Samenanlagen, isoliert, und es wird eine cDNA-Bibliothek, die das DMT-Gen-Transkript enthält, aus der mRNA hergestellt. Alternativ dazu kann cDNA aus der aus anderen Geweben, in denen DMT-Gene oder -Homologe exprimiert werden, extrahierten mRNA hergestellt werden.
Die cDNA- oder genomische Bibliothek kann anschließend unter Verwendung einer auf der Sequenz eines hierin offenbarten, geklonten DMT-Gens basierenden Sonde gescreent werden. Es können Sonden verwendet werden, um mit genomischen DNA- oder cDNA-Sequenzen zu hybridisieren, um homologe Gene in derselben oder verschiedenen Pflanzenspezies zu isolieren. Alternativ dazu können Antikörper, die gegen ein DMT-Polypeptid gezüchtet wurden, verwendet werden, um eine mRNA-Expressionsbibliothek zu screenen.
Alternativ dazu können die Nucleinsäuren von Interesse aus Nucleinsäure-Proben unter Verwendung von Amplifikationsverfahren amplifiziert werden. Es kann z.B. Polymerasekettenreaktions-(PCR-)Technologie verwendet werden, um die Sequenzen des DMT-Gens direkt aus genomischer DNA, aus cDNA, aus genomischen Bibliotheken oder cDNA-Bibliotheken zu amplifizieren. PCR und andere In-vitro-Amplifikationsverfahren können ebenso nützlich sein, um z.B. Nucleinsäuresequenzen zu klonieren, die für zu exprimierende Proteine kodieren, um Nucleinsäuren herzustellen, die als Sonden zur Detektion der Gegenwart der gewünschten mRNA in Proben verwendet werden, zur Nucleinsäuresequenzierung und für andere Zwecke. Für einen allgemeinen Überblick über die PCR siehe PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (M. Innis, D. Gelfand, J. Sninsky und T. White (Hrsg.)), Academic Press, San Diego (1990).
Geeignete Primer und Sonden zur Identifikation von DMT-Sequenzen aus Pflanzengeweben werden aus Vergleichen der hierin bereitgestellten Sequenzen mit anderen verwandten Genen erzeugt. DMT kann z.B. mit den anderen Endonuclease-III-Genen verglichen werden, wie z.B. Genbank-Zugriffsnr. AE002073. Unter Verwendung dieser Verfahren kann ein Fachmann konservierte Regionen in den hierin of fenbarten Nucleinsäuren identifizieren, um die geeigneten Primer- und Sonden-Sequenzen herzustellen. Primer, die spezifisch an konservierte Regionen in DMT-Genen hybridisieren, können verwendet werden, um Sequenzen aus sehr unterschiedlichen Pflanzenspezies zu amplifizieren. Geeignete Primer zur Amplifikation der genomischen Region oder der cDNA von DMT umfassen die folgenden Primer:
Die Amplifikationsbedingungen sind typischerweise wie folgt. Reaktionskomponenten: 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM Kaliumchlorid, 1,5 mM Magnesiumchlorid, 0,001 % Gelatine, 200 μM dATP, 200 µM dCTP, 200 µM dGTP, 200 µM dTTP, 0,4 µM Primer und 100 Einheiten pro ml Taq-Polymerase. Programm: 96 °C 3 Minuten lang, 30 Zyklen bei 96 °C 45 Sek. lang, 50 °C 60 Sek. lang, 72 °C 60 Sek. lang, gefolgt von 72 °C 5 Min. lang.
Standard-Nucleinsäure-Hybridisierungsverfahren unter Verwendung der oben offenbarten Bedingungen können danach verwendet werden, um cDNA- oder genomische Klone voller Länge zu identifizieren.
Alternativ dazu sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung eine Reihe von Verfahren zum Design von Modifikationen von Polynucleotidsequenzen bekannt. Die oligonucleotidgerichtete Mutagenese kann z.B. verwendet werden, um ortsspezifische Mutationen in eine Nucleinsäuresequenz von Interesse einzuführen. Beispiele solcher Verfahren sind in den oben genannten Verweisen zu finden und etwa in Reidhaar-Olson et al., Science 241, 53-57 (1988), und Ausubel et al. Auf ähnliche Art und Weise kann Gen-Shuffling (Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10747-10751 (1994); Ostermeier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 3562-67 (1999)) verwendet werden, um Variationen in eine oder mehrere DMT-Sequenzen oder -Subsequenzen einzuführen. Orthologe (zwischen Spezies) oder homologe (innerhalb einer Spezies) DMT-Nucleinsäuren können z.B. ausgetauscht, kombiniert oder hin- und hergeschoben werden, um innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung neue Variationen zu erzeugen.
Zusätzlich dazu kann fehleranfällige PCR ebenso verwendet werden, um Variationen in eine Nucleinsäuresequenz einzuführen. Siehe Leung et al., Technique 1, 11-15 (1989), und Caldwell et al., PCR Methods Applic. 2, 28-33 (1992).
Steuerung der DMT-Aktivität oder -Gen-Expression
Da DMT-Gene in die Steuerung der Samen-, insbesondere der Endosperm-, Entwicklung involviert sind, ist die Inhibierung der endogenen DMT-Aktivität oder -Gen-Expression in einer Reihe verschiedener Kontexte von Nutzen. Eine Reduktion der DMT-Aktivität kann z.B. für die Produktion von Samen mit verstärkter Endospermausbildung verwendet werden. Durch eine Reduktion und/oder Elimination der DMT-Aktivität können Pflanzen mit Samen, die verstärkt Endosperm enthalten, produziert werden.
Alternativ dazu kann eine wesentliche Inhibierung der DMT-Aktivität nach der Befruchtung für eine Produktion von Früchten mit kleinen und/oder zurückgebildeten Samen (hierin als „samenlose Früchte" bezeichnet) verwendet werden. Bei vielen Pflanzen, besonders bei Dikotylen, ist das Endosperm nicht beständig und wird schlussendlich zurückgebildet. Daher sind bei Pflanzen der Erfindung, bei denen die DMT-Aktivität inhibiert ist, keimlinglose Samen nicht von Bestand, und es werden samenlose Früchte produziert. Für die Produktion von Dikotylen mit verstärktem Endosperm kann die vorteilhafteste Wirkung sein, die DMT-Aktivität zu reduzieren, je doch nicht zu eliminieren. Auf der anderen Seite ist es bei Monokotylen, die ein beständiges Endosperm aufweisen, vorteilhaft, die DMT-Aktivität zu eliminieren.
Alternativ dazu können Pflanzen der Erfindung verwendet werden, um das Keimen in Samen vor der Ernte zu verhindern, besonders bei jenen, die von Getreidekörnern abstammen. Bei diesen Pflanzen besteht das Endosperm weiter fort und ist die Hauptkomponente des reifen Samens. Vorzeitiges Wachstum der Keimlinge bei gelagertem Getreide führt zu der Freisetzung von abbauenden Enzymen, die Stärke und andere Komponenten des Endosperms verdauen. Pflanzen der vorliegenden Erfindung sind nützlich, um dieses Problem zu lösen, da den Samen der Keimling fehlt und sie daher nicht keimen.
Weiters kann, wie hierin beschrieben, die Zeit bis zur Blüte und die DNA-Methylierung ebenso durch eine Modulation der DMT-Aktivität in einer Zelle moduliert werden. DMT kann z.B. verwendet werden, um die Menge an methylierter DNA in einer Zelle zu modulieren. Da die Expression vieler Gene von ihrem Methylierungsstatus abhängt, kann die Modulation der DMT-Aktivität tatsächlich die Gen-Expression in einer Zelle modulieren. Beispiele für Gene, deren Expression durch DMT moduliert wird, umfassen MEDEA.
Ein Fachmann wird erkennen, dass eine Reihe an Verfahren verwendet werden können, um die DMT-Aktivität oder -Gen-Expression zu modulieren. Die DMT-Aktivität kann in der Pflanzenzelle auf Gen-Niveau, transkriptionellem, posttranskriptionellem, translationellem oder posttranslationellem Niveau moduliert werden. Verfahren zur Modulation der DMT-Aktivität auf jeder dieser Ebenen sind dem Fachmann nach dem Stand der Technik im Allgemeinen wohlbekannt und werden unten stehend kurz beschrieben.
Verfahren zur Einführung genetischer Mutationen in Pflanzengene sind wohlbekannt. Samen oder anderes Pflanzenmaterial kann z.B. gemäß den Standardverfahren mit einer mutagenen chemischen Substanz behandelt werden. Solche chemischen Substanzen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, die Folgenden: Diethylsulfat, Ethylenimin, Ethylmethansulfonat und N-Nitroso-N-ethylharnstoff. Alternativ dazu kann ionisierende Strahlung aus Quellen, wie z.B. Röntgenstrahlen oder γ-Strahlen, verwendet werden.
Alternativ dazu kann die homologe Rekombination verwendet werden, um gezielte Gen-Zerstörungen durch spezifisches Deletieren oder Verändern des DMT-Gens in vivo zu induzieren (siehe im Allgemeinen Grewal und Klar, Genetics 146, 1221-1238 (1997), und Xu et al., Genes Dev. 10, 2411-2422 (1996)). Die homologe Rekombination wurde in Pflanzen gezeigt (Puchta et al., Experientia 50, 277-284 (1994), Swoboda et al., EMBO J. 13, 484-489 (1994); Offringa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7346-7350 (1993); und Kempin et al., Nature 389, 802-803 (1997)).
Bei der Anwendung der homologen Rekombinationstechnologie auf die Gene der Erfindung werden Mutationen in ausgewählten Teilen einer DMT-Gen-Sequenz (unter anderem stromauf gelegene 5'-, stromab gelegene 3'- und intragene Regionen), wie z.B. jene, die hierin offenbart werden, in vitro hergestellt und anschließend unter Verwendung von Standard-Verfahren in die gewünschte Pflanze eingeführt. Da die Wirksamkeit der homologen Rekombination bekannterweise von den verwendeten Vektoren abhängt, werden passenderweise dicistronische Gen-Targeting-Vektoren, wie sie von Mountford et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4303-4307 (1994), und Vaulont et al., Transgenic Res. 4, 247-255 (1995), beschrieben werden, zur Steigerung der Wirksamkeit der Selektion für die veränderte DMT-Gen-Expression in transgenen Pflanzen verwendet. Das mutierte Gen wechselwirkt mit dem Ziel-Wildtyp-Gen auf solch eine Art und Weise, dass es in transgenen Pflanzenzellen zu einer homologen Rekombination und zu einem gezielten Ersatz des Wildtyp-Gens kommt, was zu der Suppression der DMT-Aktivität führt.
Alternativ dazu können Oligonucleotide, die aus einem zusammenhängenden Abschnitt aus RNA- und DNA-Resten in einer Duplex-Konformation mit doppelten Haarnadel-Kappen an den Enden bestehen, verwendet werden. Die RNA/DNA-Sequenz ist so kreiert, dass sie mit der Sequenz des Ziel-DMT-Gens angeordnet werden kann und dass sie die gewünschte Nucleotidveränderung enthält. Die Einfüh rung des chimären Oligonucleotids auf einem extrachromosomalen T-DNA-Plasmid führt zu einer wirksamen und spezifischen DMT-Gen-Konversion, die von chimären Molekülen in einer kleinen Anzahl an transformierten Pflanzenzellen gesteuert wird. Dieses Verfahren wird in Cole-Strauss et al., Science 273, 1386-1389 (1996), und Yoon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 2071-2076 (1996), beschrieben.
Die Gen-Expression kann unter Verwendung von DNA-Rekombinationsverfahren durch die Transformation von Pflanzenzellen mit Konstrukten, die Transposons oder T-DNA-Sequenzen umfassen, deaktiviert werden. DMT-Mutanten, die durch diese Verfahren hergestellt wurden, werden gemäß Standardverfahren identifiziert. Mutanten können z.B. mittels PCR oder durch die Detektion der Gegenwart oder Abwesenheit von DMT-mRNA, z.B. durch Northern-Blot-Tests, detektiert werden. Die Mutanten können ebenso durch Testen auf die Entwicklung des Endosperms in Abwesenheit einer Befruchtung ausgewählt werden.
Die isolierten Nucleinsäuresequenzen, hergestellt wie hierin beschrieben, können ebenso in einer Reihe an Verfahren zur Steuerung der endogenen DMT-Gen-Expression in verschiedenen Stadien verwendet werden. Subsequenzen aus den hierin offenbarten Sequenzen können verwendet werden, um die Transkription, RNA-Akkumulation, Translation und dergleichen zu steuern.
Es kann eine Reihe an Verfahren zur Inhibierung der Gen-Expression in Pflanzen verwendet werden. Es kann z.B. die Antisense-Technologie leicht verwendet werden. Um dies zu erreichen, wird ein Nucleinsäure-Segment aus dem gewünschten Gen kloniert und operabel an einen Promotor gebunden, so dass der Antisense-Strang der RNA transkribiert wird. Das Konstrukt wird anschließend in Pflanzen transformiert, und der Antisense-Strang der RNA wird hergestellt. Bei Pflanzenzellen wurde vorgeschlagen, die Antisense-Suppression könnte auf allen Ebenen der Gen-Regulation agieren, inkludierend die Suppression der RNA-Translation (siehe z.B. Bourque, Plant Sci. (Limerick) 105, 125-149, (1995); Pantopoulos, in: Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, Band 48, 181-238, W.E. Cohn und K. Moldave (Hrsg.), Academic Press, Inc., San Diego, Kalifornien, USA, London, Eng land, UK; Heiser et al., Plant Sci. (Shannon) 127, 61-69, (1997)) sowie durch das Verhindern der Akkumulation der mRNA, die für das Protein von Interesse kodiert (siehe Baulcombe, Plant Mol. Bio. 32, 79-88 (1996); Prins und Goldbach, Arch. Virol. 141, 2259-2276 (1996), Metzlaff et al., Cell 88, 845-854 (1997) ; Sheehy et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85, 8805-8809 (1988), und Hiatt et al., US-Patent Nr. 4.801.340).
Das einzuführende Nucleinsäure-Segment ist im Allgemeinen im Wesentlichen mit zumindest einem Teil des/der endogenen DMT-Gens oder -Gene, das/die zu unterdrücken ist/sind, identisch. Die Sequenz muss jedoch nicht vollkommen identisch sein, um die Expression zu inhibieren. Die Vektoren der vorliegenden Erfindung können so kreiert werden, dass die inhibitorische Wirkung andere Gene innerhalb einer Genfamilie betrifft, die eine Homologie oder beträchtliche Homologie mit dem Ziel-Gen aufweisen.
Für die Antisense-Suppression muss die eingeführte Sequenz in Bezug auf entweder das primäre Transkriptionsprodukt oder die vollständig verarbeitete mRNA ebenso nicht in voller Länge vorhanden sein. Im Allgemeinen kann eine höhere Homologie verwendet werden, um für die Verwendung einer kürzeren Sequenz zu kompensieren. Weiters muss die eingeführte Sequenz nicht dasselbe Intron- oder Exon-Muster aufweisen, und die Homologie von nicht kodierenden Segmenten kann genauso wirksam sein. Normalerweise sollte eine Sequenz von zwischen etwa 30 oder 40 Nucleotiden und Nucleotiden von etwa voller Länge verwendet werden, obwohl eine Sequenz von zumindest etwa 100 Nucleotiden bevorzugt ist, eine Sequenz von zumindest etwa 200 Nucleotiden noch stärker bevorzugt ist und eine Sequenz von etwa 500 bis etwa 7000 Nucleotiden besonders bevorzugt ist.
Eine Reihe an Gen-Regionen kann als Ziel verwendet werden, um die DMT-Gen-Expression zu unterdrücken. Die Ziele können z.B. die kodierenden Regionen, Introns, Sequenzen aus Exon/Intron-Verbindungspunkten, untranslatierte 5'- oder 3'-Regionen und dergleichen umfassen. In einigen Ausführungsformen können die Konstrukte so gebaut sein, dass sie die Fähigkeit von Regulationsproteinen, sich an DMT-Gensequenzen zu binden, die für deren zell- und/oder gewebespezifische Expression erforderlich sind, eliminieren. Solche Transkriptionsregulationssequenzen können sich entweder 5'-, 3'- oder innerhalb der kodierenden Region des Gens befinden und können die Gentranskription entweder fördern (positives Regulationselement) oder unterdrücken (negatives Regulationselement). Diese Sequenzen können unter Verwendung von Standard-Deletionsanalysen, die dem Fachmann nach dem Stand der Technik wohlbekannt sind, identifiziert werden. Sind die Sequenzen einmal identifiziert, so wird ein Antisense-Konstrukt, das auf diese Sequenzen abzielt, in Pflanzen eingeführt, um die Gen-Transkription in besonderem Gewebe, z.B. in sich entwickelnden Samenanlagen und/oder Samen, zu steuern. In einer Ausführungsform werden transgene Pflanzen für DMT-Aktivität ausgewählt, die reduziert, jedoch nicht eliminiert ist.
Eine oligonucleotidbasierte Tripelhelix-Formation kann verwendet werden, um die DMT-Genexpression zu zerstören. Triplex-DNA kann die DNA-Transkription und -Replikation inhibieren, ortsspezifische Mutationen erzeugen, DNA spalten und homologe Rekombination induzieren (siehe z.B. Havre und Glazer, J. Virology 67, 7324-7331 (1993); Scanlon et al., FASEB J. 9, 1288-1296 (1995); Giovannangeli et al., Biochemistry 35, 10539-10548 (1996); Chan und Glazer, J. Mol. Medicine 75, 267-282, Berlin (1997)). Tripelhelix-DNAs können verwendet werden, um auf dieselben Sequenzen abzuzielen, die für die Antisense-Regulation identifiziert wurden.
Katalytische RNA-Moleküle oder Ribozyme können ebenso verwendet werden, um die Expression von DMT-Genen zu inhibieren. Es ist möglich, Ribozyme zu kreieren, die sich spezifisch mit beinahe einer jeden Ziel-RNA paaren und das Phosphodiester-Rückgrat an einer bestimmten Stelle spalten, wodurch die Ziel-RNA funktionell deaktiviert wird. Bei der Durchführung dieser Spaltung wird das Ribozym selbst nicht verändert und ist daher in der Lage, andere Moleküle zu wiederzuverwerten und zu spalten, was es zu einem wahren Enzym macht. Die Inklusion von Ribozymsequenzen innerhalb der Antisense-RNAs verleiht ihnen RNA-spaltende Aktivität, wodurch die Aktivität der Konstrukte erhöht wird. Die Ribozyme können daher ver wendet werden, um auf dieselben Sequenzen abzuzielen, die für die Antisense-Regulation identifiziert wurden.
Es wurde eine Reihe an Ribozym-Klassen identifiziert. Eine Klasse der Ribozyme stammt von einer Reihe kleiner zirkulärer RNAs ab, die zu einer Selbstspaltung und einer Replikation in Pflanzen in der Lage sind. Die RNAs replizieren sich entweder alleine (viroide RNAs) oder mit einem Helfer-Virus (Satelliten-RNAs). Beispiele umfassen RNAs vom Avocado-Sunblotch-Viroid und die Satelliten-RNAs vom Tabak-Ringspot-Virus, dem Lucerne-Transient-Streak-Virus, dem Velvet-Tobacco-Mottle-Virus, dem Solanum-nodiflorum-Mottle-Virus und dem Subterranean-Clover-Mottle-Virus. Das Design und die Verwendung von Ziel-DNA-spezifischen Ribozymen wird in Zhao und Pick, Nature 365, 448-451 (1993); Eastham und Ahlering, J. Urology 156, 1186-1188 (1996); Sokol und Murray, Transgenic Res. 5, 363-371 (1996); Sun et al., Mol. Biotechnology 7, 241-251 (1997), und Haseloff et al., Nature 334, 585-591 (1988), beschrieben.
Ein weiteres Verfahren der Suppression ist die Sense-Co-Suppression. Von der Einführung von Nucleinsäure, die in der Sense-Ausrichtung konfiguriert wurde, wurde vor kurzem gezeigt, dass sie ein wirksames Mittel zum Blockieren der Transkription von Ziel-Genen darstellt. Für ein Beispiel der Verwendung dieses Verfahrens zur Modulation der Expression von endogenen Genen siehe Assaad et al., Plant Mol. Biol. 22, 1067-1085 (1993); Flavell, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3490-3496 (1994); Stam et al., Annals Bot. 79, 3-12 (1997); Napoli et al., The Plant Cell 2, 279-289 (1990), und US-Patente Nr. 5.034.323, 5.231.020 und 5.283.184.
Die unterdrückende Wirkung kann dort auftreten, wo die eingeführte Sequenz keine kodierende Sequenz per se enthält, sondern nur Intron- oder untranslatierte Sequenzen, die zu den Sequenzen homolog sind, die sich im primären Transkript der endogenen Sequenz befinden. Die eingeführte Sequenz ist im Allgemeinen im Wesentlichen identisch mit der endogenen Sequenz, die unterdrückt werden soll. Diese minimale Identität ist typischerweise größer als etwa 65 %, eine höhere Identität könnte jedoch eine wirksamere Unterdrückung der Expression der endogenen Sequenzen ausüben. Eine wesentlich größere Identität von mehr als etwa 80 % wird bevorzugt, obwohl etwa 95 % bis zu absoluter Identität am stärksten bevorzugt würde. Wie bei der Antisense-Regulation sollte die Wirkung auf jedes beliebige andere Protein innerhalb einer ähnlichen Familie an Genen zutreffen, die eine Homologie oder eine im Wesentlichen bestehende Homologie zeigen.
Für die Sense-Suppression muss die eingeführte Sequenz, die weniger als eine absolute Identität benötigt, auch nicht die volle Länge in Bezug auf entweder das primäre Transkriptionsprodukt oder die vollständig bearbeitete mRNA aufweisen. Dies kann bevorzugt werden, um die gleichzeitige Produktion einiger Pflanzen zu vermeiden, die für eine Überexpression bekannt sind. Eine höhere Identität in einer kürzeren als eine Sequenz voller Länge kompensiert für eine längere, weniger identische Sequenz. Weiters muss die eingeführte Sequenz nicht dasselbe Intron- oder Exonmuster aufweisen, und die Identität von nicht kodierenden Segmenten wird ebenso wirksam sein. Normalerweise wird eine Sequenz in den Bandbreiten der oben genannten Größen für die Antisense-Regulation verwendet. Zusätzlich kann auf dieselben Gen-Regionen, die für die Antisense-Regulation erwähnt wurden, unter Verwendung der Co-Suppressionsverfahren abgezielt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Expression einer Nucleinsäure von Interesse durch die gleichzeitige Expression von sowohl Sense- als auch Antisense-Konstrukten unterdrückt werden (Waterhouse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 13959-13964 (1998). Siehe auch Tabara et al., Science 282, 430-431 (1998).
Alternativ dazu kann die DMT-Aktivität durch die Elimination der Proteine moduliert werden, die für eine DMT-zellspezifische Gen-Expression erforderlich sind. Daher kann die Expression der Regulationsproteine und/oder der Sequenzen, die die DMT-Gen-Expression steuern, unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren moduliert werden.
Ein weiteres Verfahren ist die Verwendung von gentechnisch veränderter tRNA-Suppression der DMT-mRNA-Translation. Dieses Verfahren umfasst die Verwen dung von Suppressor-tRNAs, um Zielgene, die frühreife Stoppcodons enthalten, zu transaktivieren (siehe Betzner et al., Plant J. 11, 587-595 (1997); und Choisne et al., Plant J. 11, 597-604 (1997)). Eine Pflanzenlinie, die ein konstitutiv exprimiertes DMT-Gen enthält, das ein Amber-Stoppcodon enthält, wird zuerst kreiert. Multiple Pflanzenlinien, von denen jede tRNA-Suppressor-Genkonstrukte unter der Steuerung von zelltypspezifischen Promotoren enthält, werden ebenso erzeugt. Das tRNA-Genkonstrukt wird anschließend in die DMT-Linie gekreuzt, um die DMT-Aktivität auf eine gezielte Art und Weise zu aktivieren. Diese tRNA-Suppressorlinien könnten ebenso verwendet werden, um die Expression einer beliebigen Genart auf dieselben Zell- oder Gewebetypen abzielen zu lassen.
DMT-Proteine können in vivo homogene oder heterologe Komplexe bilden. Daher ist die Produktion dominant-negativer Formen von DMT-Polypeptiden, die defekt in ihren Fähigkeiten sind, an andere Proteine im Komplex zu binden, ein passendes Mittel zur Inhibierung der endogenen DMT-Aktivität. Dieser Ansatz involviert die Transformation von Pflanzen mit Konstrukten, die für Mutanten-DMT-Polypeptide kodieren, die defekte Komplexe bilden und dadurch die korrekte Bildung des Komplexes verhindern. Das Mutanten-Polypeptid kann sich von der natürlich vorkommenden Sequenz auf der primären Strukturebene durch Aminosäure-Substitutionen, -Additionen, -Deletionen und dergleichen unterscheiden. Diese Modifikationen können in einer Reihe an Kombinationen verwendet werden, um die modifizierte End-Proteinkette herzustellen. Die Verwendung von dominanten Negativ-Mutanten zur Inaktivierung von Ziel-Genen wird in Mizukami et al., Plant Cell 8, 831-845 (1996), beschrieben.
Eine weitere Strategie zur Beeinflussung der Fähigkeit eines DMT-Proteins, mit sich selbst oder mit anderen Proteinen wechselzuwirken, umfasst die Verwendung von Antikörpern, die für DMT spezifisch sind. Bei diesem Verfahren wird eine zellspezifische Expression von DMT-spezifischen Antikörpern verwendet, um funktionelle Domänen durch Antikörper-Antigen-Erkennung zu deaktivieren (siehe Hupp et al., Cell 83, 237-245 (1995)).
Nachdem Pflanzen mit verminderter DMT-Aktivität identifiziert wurden, kann ein rekombinantes Konstrukt, das in der Lage ist, geringe Mengen an DMT in Keimlingen zu exprimieren, unter Verwendung der unten beschriebenen Verfahren eingeführt werden. Auf diese Art und Weise kann das Ausmaß der DMT-Aktivität reguliert werden, um bevorzugte Pflanzen-Phänotypen zu produzieren. Ein relativ schwacher Promotor, wie z.B. der Ubiquitin-Promotor (siehe z.B. Garbarino et al., Plant Physiol. 109 (4), 1371-8 (1995); Christensen et al., Transgenic Res. 5 (3), 213-8 (1996); und Holtorf et al., Plant. Mol. Biol. 29 (4), 637-46 (1995)), ist etwa bei der Produktion von Pflanzen mit verringertem Ausmaß der DMT-Aktivität oder -Expression von Nutzen. Solche Pflanzen sind z.B. für die Produktion von Pflanzen nützlich, die Samen mit verstärktem Endosperm produzieren.
Verwendung von Nucleinsäuren der Erfindung zur Verbesserung der DMT-Gen-Expression
Wie hierin beschrieben hergestellte, isolierte Sequenzen können ebenso in eine Pflanzenzelle eingeführt werden, wodurch die Expression einer bestimmten DMT-Nucleinsäure moduliert wird, um die endogene Gen-Expression zu verbessern oder zu steigern. Ohne dabei z.B. an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, glauben die Anmelder im Lichte der Beziehung von DMT zu Exonuclease III und den DNA-Glykosylasen, dass DMT an DNA oder Chromatin bindet und eine Modulation der Transkription durch eine Modulation des Methylierungsstatus der DNA bewirkt. Eine verstärkte Expression kann daher verwendet werden, um die Pflanzenmorphologie zu steuern, und zwar durch Steuerung der Expression von Genen, die sich unter der Kontrolle von DMT befinden, wie z.B. MEDEA, in den gewünschten Geweben oder Zellen. Eine verstärkte Expression kann z.B. ebenso verwendet werden, um das vegetative Wachstum durch das Hindern der Pflanze an der Samenbildung zu steigern. In Fällen, in denen die Überexpression eines Gens gewünscht ist, kann das gewünschte Gen aus einer anderen Spezies verwendet werden, um potentielle Sense-Suppressionswirkungen zu verringern.
Weiters kann, wie hierin beschrieben, die Zeit bis zur Blüte und die DNA-Methylierung ebenso durch Modulation der DMT-Aktivität in einer Zelle moduliert werden. Eine erhöhte Expression von DMT in einer Pflanze führt z.B. zu einer Verzögerung der Zeit bis zur Blüte. Auf ähnliche Art und Weise kann DMT verwendet werden, um die Menge an methylierter DNA in einer Zelle zu modulieren. Da die Expression vieler Gene von ihrem Methylierungsstatus abhängt, moduliert die Modulation der DMT-Aktivität tatsächlich die Gen-Expression in einer Zelle. Beispiele für Gene, deren Expression von DMT moduliert wird, umfassen MEDEA.
Ein Fachmann erkennt, dass die Polypeptide, für die die Gene der Erfindung kodieren, wie andere Proteine verschiedene Domänen besitzen, die verschiedene Funktionen ausführen. Daher müssen die Gen-Sequenzen nicht voller Länge sein, solange die gewünschte funktionelle Domäne des Proteins exprimiert wird.
Modifizierte Proteinketten können ebenso unter Verwendung verschiedener DNA-Rekombinationsverfahren leicht kreiert werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind und unten stehend ausführlich beschrieben werden. Die Ketten können sich z.B. von der natürlich auftretenden Sequenz auf der primären Strukturebene durch Aminosäure-Substitutionen, -Additionen, -Deletionen und dergleichen unterscheiden. Diese Modifikationen können in einer Reihe von Kombinationen verwendet werden, um die modifizierte End-Proteinkette zu erzeugen.
Herstellung rekombinanter Vektoren
Um in den oben genannten Verfahren isolierte Sequenzen zu verwenden, werden rekombinante DNA-Vektoren, die für die Transformation von Pflanzenzellen geeignet sind, hergestellt. Verfahren zur Transformation einer großen Bandbreite an blühenden Pflanzenspezies sind wohlbekannt und werden in der fachlichen und wissenschaftlichen Literatur beschrieben. Siehe z.B. Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22, 421-477 (1988). Eine DNA-Sequenz, die für das gewünschte Polypeptid kodiert, z.B. eine cDNA-Sequenz, die für ein Protein voller Länge kodiert, wird vorzugsweise mit Transkriptions- und Translationsinitiations-Regulationssequenzen kombiniert, die die Transkription der Sequenz aus dem Gen in den jeweiligen Geweben der transformierten Pflanze steuern.
Für eine Überexpression kann z.B. ein Pflanzen-Promotor-Fragment verwendet werden, das die Expression des Gens in allen Geweben einer regenerierten Pflanze steuert. Solche Promotoren werden hierin als „konstitutive" Promotoren bezeichnet und sind unter den meisten Umweltbedingungen und Entwicklungs- oder Zelldifferenzierungs-Stadien aktiv. Beispiele konstitutiver Promotoren umfassen die Blumenkohlmosaik-Virus-(CaMV-)35S-Transkriptionsinitiationsregion, den 1'- oder 2'- Promotor, der aus T-DNA von Agrobacterium tumafaciens stammt, sowie andere Transkriptionsinitiationsregionen aus verschiedenen Pflanzengenen, die dem Fachmann bekannt sind. Solche Gene umfassen z.B. ACT11 aus Arabidopsis (Huang et al., Plant Mol. Biol. 33, 125-139 (1996)), Cat3 aus Arabidopsis (GenBank Nr. U43147, Zhong et al., Mol. Gen. Genet. 251, 196-203 (1996)), das für das Stearoyl-Acyl-Trägerprotein Desaturase aus Brassica napus kodierende Gen (Genbank Nr. X74782, Solocombe et al., Plant Physiol. 104, 1167-1176 (1994)), GPc1 aus Mais (Genbank Nr. X15596, Martinez et al., J. Mol. Biol. 208, 551-565 (1989)) und Gpc2 aus Mais (Genbank Nr. U45855, Manjunath et al., Plant Mol. Biol. 33, 97-112 (1997)).
Alternativ dazu kann der Pflanzenpromotor die Expression der DMT-Nucleinsäure in einem spezifischen Gewebe steuern oder kann sich auf eine andere Art und Weise unter genauerer Umwelt- oder Entwicklungssteuerung befinden. Beispiele der Umweltbedingungen, die die Transkription mittels induzierbarer Promotoren ausführen können, umfassen anaerobe Bedingungen, erhöhte Temperatur oder das Vorhandensein von Licht. Diese Promotoren werden hier als „induzierbare" oder „gewebespezifische" Promotoren bezeichnet. Ein Fachmann wird erkennen, dass ein gewebespezifischer Promotor die Expression von operabel gebundenen Sequenzen in anderen Geweben als im Ziel-Gewebe vorantreiben kann. Daher ist ein gewebespezifischer Promotor, wie er hierin verwendet wird, einer, der die Expression vorzugsweise im Ziel-Gewebe vorantreibt, jedoch auch in anderen Geweben zu einem gewissen Ausmaß an Expression führen kann.
Beispiele für Promotoren unter Entwicklungssteuerung umfassen Promotoren, die nur (oder primär nur) die Transkription in gewissen Geweben, wie z.B. Frucht, Samen oder Blüten, initiieren. Promotoren, die die Expression von Nucleinsäuren in Samenanlagen, Blüten oder Samen steuern, sind besonders in der vorliegenden Erfindung von Nutzen. Wie hierin verwendet, ist ein samenspezifischer Promotor einer, der die Expression in Samengeweben steuert, solche Promotoren können z.B. samenanlagenspezifisch (was Promotoren inkludiert, die die Expression in mütterlichen Geweben oder dem weiblichen Gametophyten, wie z.B. Eizellen oder der Zentralzelle, steuern), keimlingspezifisch, endospermspezifisch, integumentspezifisch, samenschalenspezifisch oder eine bestimmte Kombination daraus sein. Beispiele umfassen einen Promotor aus dem samenanlagenspezifischen BEL1-Gen, das in Reiser et al., Cell 83, 735-742 (1995), (GenBank Nr. U39944) beschrieben wird. Andere geeignete samenspezifische Promotoren stammen von den folgenden Genen: MAC1 aus Mais (Sheridan et al., Genetics 142, 1009-1020 (1996)), Cat3 aus Mais (GenBank Nr. L05934, Abler et al., Plant Mol. Biol. 22, 10131-1038 (1993)), dem für Oleosin-18kD kodierenden Gen aus Mais (GenBank Nr. J05212, Lee et al., Plant Mol. Biol. 26, 1981-1987 (1994)), Vivparous-1 aus Arabidopsis (GenBank Nr. U93215), dem für Oleosin aus Arabidopsis kodierenden Gen (GenBank Nr. Z17657), Atmyc1 aus Arabidopsis (Urao et al., Plant Mol. Biol. 32, 571-576 (1996)), der 2s-Samen-Speicherprotein-Genfamilie aus Arabidopsis (Conceicao et al., Plant 5, 493-505 (1994)), dem für Oleosin-20kD kodierenden Gen aus Brassica napus (GenBank Nr. M63985), napA aus Brassica napus (GenBank Nr. J02798, Josefsson et al., JBL 26, 12196-1301 (1987)), der Napin-Genfamilie aus Brassica napus (Sjodahl et al., Planta 197, 264-271 (1995)), dem für das 2S-Speicherprotein aus Brassica napus kodierenden Gen (Dasgupta et al., Gene 133, 301-302 (1993)), den für Oleosin A (GenBank Nr. U09118) und Oleosin B (GenBank Nr. U09119) kodierenden Genen aus Sojabohnen und dem für das schwefelreiche niedermolekulare Protein aus Sojabohnen kodierenden Gen (Choi et al., Mol. Gen. Genet. 246, 266-268 (1995)).
Zusätzlich dazu können die Promotorsequenzen aus den hierin offenbarten DMT-Genen verwendet werden, um die Expression der DMT-Polynucleotide der Erfindung oder heterologer Sequenzen voranzutreiben. Die Sequenzen der Promotoren werden unten stehend identifiziert.
Wird eine korrekte Polypeptidexpression gewünscht, so sollte eine Polyadenylierungsregion am 3'-Ende der kodierenden Region inkludiert werden. Die Polyadenylierungsregion kann vom natürlichen Gen stammen, aus einer Reihe anderer Pflanzengene oder aus T-DNA.
Der Vektor, der die Sequenzen (z.B. Promotoren oder kodierende Regionen) aus Genen der Erfindung umfasst, umfasst typischerweise ein Marker-Gen, das Pflanzenzellen einen selektierbaren Phänotyp verleiht. Der Marker kann z.B. für eine Biozid-Resistenz kodieren, insbesondere für eine Antibiotika-Resistenz, wie z.B. eine Resistenz gegen Kanamycin, G418, Bleomycin, Hygromycin, oder eine Herbizid-Resistenz, wie z.B. eine Resistenz gegen Chlorosulfuron oder Basta.
Promotor- und Enhancer-Nucleinsäuren der Erfindung
Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind Polynucleotide, die als Promotoren und Enhancer von Nutzen sind. Zur Verwendung in der Erfindung geeignet sind Verfahren zum Targeting heterologer Polypeptide auf einen weiblichen Gametophyten einer Pflanze, unter anderem z.B. die polaren Nuclei, die Eier und Synergiden und Zentralzellen. Promotor-Polynucleotide, die für die Verwendung in der Erfindung geeignet sind, umfassen z.B. Sequenzen und Subsequenzen der 5'-flankierenden DMT-DNA (Seq.-ID Nr. 3), der 5'-UTR-Region (Seq-ID Nr. 6) und der 3'-flankierenden Region (Seq-ID Nr. 4). In einigen Ausführungsformen sind die Promotor-Sequenzen operabel an das 5'-Ende der kodierenden Region von DMT gebunden, die wiederum an ein Polynucleotid von Interesse fusioniert ist, das typischerweise für ein Polypeptid kodiert. Eine beispielhafte Promotor-Sequenz umfasst zumindest 3424 Nucleotide aus Seq.-ID Nr. 3, die an die ersten 1478 Nucleotide aus Seq.-ID Nr. 5 gebunden sind. In einigen Ausführungsformen werden weitere 444 Nucleotide (z.B. die ersten 444 Nucleotide der kodierenden Region von DMT) in den Promotor inkorporiert. In einigen Ausführungsformen steuern die für die Verwendung in der Erfindung geeigneten Promotor-Sequenzen die Expression von Polynucleotiden spezifisch zu dem weiblichen Gametophyten und steuern hingegen keine Expression in Geweben nach der Befruchtung.
Produktion transgener Pflanzen
DNA-Konstrukte der Erfindung können in das Genom des gewünschten Pflanzenwirts mittels einer Reihe herkömmlicher Verfahren eingeführt werden. Das DNA-Konstrukt kann z.B. unter Verwendung von Verfahren, wie z.B. Elektroporation und Mikroinjektion von Pflanzenzellen-Protoplasten, direkt in die genomische DNA der Pflanzenzelle eingeführt werden, oder die DNA-Konstrukte können unter Verwendung ballistischer Verfahren, wie z.B. der DNA-Gentransfertechnik mit Hilfe der Partikelkanone, direkt in Pflanzengewebe eingeführt werden.
Mikroinjektionsverfahren sind nach dem Stand der Technik bekannt und wurden in der wissenschaftlichen und in der Patentliteratur ausführlich beschrieben. Die Einführung von DNA-Konstrukten unter Verwendung der Polyethylenglykol-Fällung wird in Paszkowski et al., Embo J. 3, 2717-2722 (1984), beschrieben. Elektroporationsverfahren werden in Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1995), beschrieben. Ballistische Transformationsverfahren werden in Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987), beschrieben.
Alternativ dazu können die DNA-Konstrukte mit geeigneten T-DNA-flankierenden Regionen kombiniert werden und in einen herkömmlichen Agrobacteriumtumefaciens-Wirtsvektor eingeführt werden. Die Virulenzfunktionen des Agrobacterium-tumefaciens-Wirts steuern die Insertion des Konstrukts und des danebenliegenden Markers in die Pflanzenzellen-DNA, wenn die Zelle durch das Bakterium infiziert wird. Agrobacterium-tumefaciens-vermittelte Transformationsverfahren, unter anderem das Unschädlichmachen und die Verwendung von binären Vektoren, wurden in der wissenschaftlichen Literatur oftmals beschrieben. Siehe z.B. Horsch et al., Science 233, 496-498 (1984), und Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4803 (1983).
Transformierte Pflanzenzellen, die durch ein beliebiges der oben genannten Transformationsverfahren erzeugt wurden, können kultiviert werden, um erneut eine vollständige Pflanze zu erzeugen, die den transformierten Genotyp und daher den gewünschten Phänotyp besitzt, wie z.B. eine erhöhte Samenmasse. Diese Regenerationsverfahren beruhen auf der Manipulation gewisser Phytohormone in einem Gewebekultur-Wachstumsmedium, wobei dies typischerweise auf einem Biozid- und/oder Herbizid-Marker basiert, der zusammen mit den gewünschten Nucleotidsequenzen eingeführt wurde. Die Pflanzenregeneration aus kultivierten Protoplasten wird in Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, 124-176, MacMillian Publishing Company, New York (1983); und Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, 21-73, CRC Press, Boca Raton (1985), beschrieben. Die Regeneration kann ebenso aus dem Pflanzenkallus, aus Explantaten, Organen oder Teilen davon erhalten werden. Diese Regenerationsverfahren werden im Allgemeinen in Klee et al., Ann. Rev. Of Plant Phys. 38, 467-486 (1987), beschrieben.
Die Nucleinsäuren der Erfindung können verwendet werden, um die gewünschten Merkmale auf im Wesentlichen jede beliebige Pflanze zu übertragen. Daher kann die Erfindung an einer großen Bandbreite an Pflanzen Verwendung finden, unter anderem Spezies aus den Gattungen Anacardium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannesetum, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna und Zea.
Ein Fachmann wird erkennen, dass, nachdem die Expressionskassette stabil in transgene Pflanzen inkorporiert wurde und nachdem bestätigt wurde, dass sie operabel ist, diese mittels geschlechtlicher Kreuzung in andere Pflanzen eingeführt werden kann. In Abhängigkeit von der zu kreuzenden Spezies kann ein beliebiges einer Reihe von Standard-Zuchtverfahren verwendet werden.
Samen, die von Pflanzen der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, können gemäß wohlbekannter Verfahren analysiert werden, um Pflanzen mit dem gewünschten Merkmal zu identifizieren. Werden Antisense- oder andere Verfahren verwendet, um die DMT-Gen-Expression zu steuern, so kann die Northern-Blot-Analyse verwendet werden, um nach den gewünschten Pflanzen zu screenen. Zusätzlich kann die Gegenwart einer befruchtungsunabhängigen reproduktiven Entwicklung detektiert werden. Pflanzen können z.B. auf die Fähigkeit, keimlinglose Samen zu bilden, Samen zu bilden, die nach der Befruchtung verkümmern, oder Früchte trotz Fehlens der Befruchtung anzusetzen, gescreent werden. Diese Verfahren hängen teilweise von den speziellen verwendeten Pflanzenspezies ab, werden jedoch gemäß dem Fachmann wohlbekannter Verfahren durchgeführt.
DMT-Mutationen, -Fragmente und -Fusionen
Wie oben beschrieben, sind die DMT-Polynucleotide und -Polypeptide nicht auf die hierin offenbarten Sequenzen eingeschränkt. Dem Fachmann ist bekannt, dass konservative Aminosäure-Substitutionen sowie Aminosäure-Additionen oder -Deletionen nicht zu einer Veränderung der biologischen Aktivität führen müssen. Weiters werden ebenso Sequenzvarianten mit zumindest einer modulierten biologischen Aktivität von DMT in Betracht gezogen. So kann z.B. durch die Einführung einzelner oder multipler Aminosäure-Veränderungen aus den hierin offenbarten Sequenzen zumindest eine DMT-Aktivität erhöht oder verringert werden. Ein Fachmann wird erkennen, dass konservative Aminosäure-Substitutionen in wichtigen funktionellen Domänen typischerweise bei der Erzeugung von aktiveren DMT-Polypeptiden von Nutzen sind. Umgekehrt ist es wahrscheinlich, dass nicht konservative Substitutionen von Aminosäure-Resten in funktionellen Domänen, wie z.B. der HhH-Region von DMT (z.B. Aminosäuren 1271-1304 aus Seq.-ID Nr. 2), zumindest eine biologische Aktivität, wie z.B. die DNA-Bindung, zerstören.
Fragmente der hierin offenbarten Polypeptid-Sequenzen können zumindest eine biologische Aktivität von DMT besitzen. Aminosäure-Sequenzen, die die DMT-Domäne B umfassen, stellen z.B. Polypeptid-Fragmente mit Glykosylase- oder Demethylase- Aktivität dar. Ein Fragment, das die Aminosäuren 1167-1404, 1192-1404, 1192-1368 oder 1167-1368 aus Seq.-ID Nr. 2 umfasst, kann ebenso eine Glykosylase-Aktivität besitzen.
Mutationen, Fragmente und Fusionen sind ebenso als dominante negative Mutationen nützlich. Verschiedene Regionen des DMT-Proteins sind z.B. für verschiedene biologische Aktivitäten verantwortlich. Daher kann die Mutation oder Deletion einer funktionellen Domäne eine, jedoch nicht alle, Aktivitäten) eliminieren. Die Mutation oder Deletion der DNA-Bindungsdomäne kann z.B. zu Proteinen führen, die mit Proteinen wechselwirken, die für die DMT-Funktion notwendig sind, wodurch diese Proteine auf wirksame Art und Weise heraustitriert werden und ein aktives DMT-Protein daran gehindert wird, zu agieren. Auf ähnliche Art und Weise sind DMT-Fragmente, die den DNA-Bindungsteil des Proteins mit einer inaktiven enzymatischen Domäne umfassen oder denen eine enzymatische Domäne fehlt, als dominante negative Mutanten von Nutzen, indem sie mit aktiven DMT-Polypeptiden um DNA-Bindungsstellen konkurrieren. Wie hierin beschrieben, inkludieren DMT-Domänen, die moduliert werden können, Folgende: den Leucin-Zipper, die Kernlokalisierungssequenz, die HhH-Domäne, die Asparaginsäure der GPD-Domäne sowie die DMT-Domänen A, B oder C. Ohne den Umfang der Erfindung einschränken zu wollen, besitzt DMT, basierend auf den hierin offenbarten Daten, eine Glykosylase- und Demethylase-Aktivität und ist ein DNA-Reparatur-Enzym.
Das Abzielen auf chromosomale Regionen mit den Polypeptiden der Erfindung
Ohne den Umfang der Erfindung einschränken zu wollen, wird davon ausgegangen, dass DMT, basierend auf den hierin offenbarten Daten, eine Glykosylase- und/oder Demethylase-Aktivität besitzt und ein DNA-Reparatur-Enzym ist. Die DNA-Methylierung spielt eine wichtige Rolle in der Unterdrückung der Gen-Transkription während der Tierentwicklung, unter anderem der Keimlingsgenese (Embryogenese), der Myogenese und der Entwicklung der Blutzellen. Die methylierte DNA wird von MeCP2 erkannt, die wiederum die Gen-Transkription durch das Rekrutieren des Sin3-Repressor-Komplexes unterdrückt, der katalytisch aktive Histon-Deacetylase enthält (Jones et al., Nature Genetics 19 (2), 187-191 (1998)). Die Histon-H3- und -H4-Deacetylierung trägt zu der Bildung von transkriptionell inaktivem Chromatin bei. Daher kann DMT für den Zweck der Modulation der Aktivität von Zielzellen durch die Chromatin-Architektur in Tierzellen sowie in Pflanzenzellen verwendet werden. In einigen Ausführungsformen wird DMT verwendet, um 5-MeC aus Zielzellen-DNA katalytisch auf verschiedene Arten zu entfernen: z.B. (1) durch Fusionierung von DMT an ein sequenzspezifisches DNA-Bindungsprotein oder (2) durch Fusionierung von DMT an eine Untereinheit des Ziel-Repressorkomplexes, wie z.B. McCP2 oder Sin3. In Kombination mit Zellen-, Gewebe- oder entwicklungsspezifischen Promotoren kann DMT verwendet werden, um spezifische Sets an Ziel-Genen zu modulieren.
Zusätzlich dazu sind reaktive Sauerstoffspezies, teilweise reduzierte Spezies, die als Intermediate der aeroben Atmung produziert werden, starke oxidierende Agenzien, die den Mitochondrien entkommen und sich über zelluläre Komponenten binden. Ionisierende Strahlung und andere Agenzien, die freie Radikale erzeugen, produzieren ebenso reaktive Sauerstoffspezies, die das Genom angreifen können und Läsionen hervorrufen können, von denen angenommen wird, sie würden in der Verursachung von Krebs und dem Alterungsprozess eine Schlüsselrolle spielen. 7,8-Dihydro-8-oxoguanin (oxoG) ist z.B. ein sehr schädliches Addukt, das durch die Oxidation der Guaninbase in der DNA erzeugt wird. Das oxoG-Protein kann sich während der DNA-Replikation entweder mit Cytosin oder Adenin paaren. Daher führen oxoG-Reste in der DNA zu G/C- bis T/A-Transversionsmutationen. Diese Transversionen sind häufig auftretende somatische Mutationen, die in menschlichen Krebsarten zu finden sind. HhH-GPD-Enzyme, wie die hierin beschriebenen, stellen durch das Katalysieren der Expulsion von oxoG ein Mittel zur Verteidigung gegen oxoG dar. In einigen Ausführungsformen ist die verstärkte DMT-Aktivität daher ein Mittel zur Reduktion des Auftretens von Mutationen in Tierzellen. DMT kann ebenso verwendet werden, um oxoG durch das Fusionieren von DMT an ein sequenzspezifisches DNA-Bindungsprotein von einem Zielgen katalytisch zu entfernen. In Kombination mit Zellen-, Gewebe- oder entwicklungsspezifischen Promotoren kann DMT verwendet werden, um die Reparatur von Zielgenen zu modulieren.
Wie oben beschrieben, kann auf die chromosomalen Regionen von Interesse mit den Polypeptiden der Erfindung abgezielt werden, und zwar durch Binden der Polypeptide der Erfindung, unter anderem Fragmente mit Demethylase-Aktivität, an eine DNA-Bindungsdomäne, die eine Zielsequenz bindet. Es ist z.B. bekannt, dass ein Enzym, das DNA methyliert (Dam-Methylase), auf spezifische Stellen im Genom abzielen kann (B.V. Steensel und S. Henikoff, Nature Biotechnology 18, 424-428 (2000)). Genauer gesagt, wurde die Methylase an eine DNA-Bindungsdomäne von GAL4 gebunden. Als das rekombinante GAL4-Methylase-Protein in transgener Drosophila exprimiert wurde, kam es in einer Region von ein paar Kilobasen, die die GAL4-DNA-Bindungssequenz umgab, zu einer gezielten Methylierung. Analog dazu kann DMT oder ein Teil von DMT, der eine biologische Aktivität besitzt (z.B. ein Teil, der die HhH-GpD-Motiv-Aminosäuren, wie etwa 1167 bis 1368 aus Seq.-ID Nr. 2, enthält), an Proteine gebunden werden (z.B. als eine translationelle Fusion oder durch chemische Bindung), die an spezifischen Stellen im Genom wechselwirken. Als ein Resultat werden spezifische Regionen im Genom, auf die abgezielt wird, durch DMT hypomethyliert. Wie oben beschrieben, fördert eine Hypomethylierung typischerweise die Transkription von Genen (S.E. Jacobsen, Current Biology 9, 617 (1999)). Die Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren zur Methylierung eines gewünschten Gebiets des Chromosoms durch das Abzielen von DMT auf jene Regionen bereit. Daher stellen diese Ausführungsformen zusätzliche Wege zur Aktivierung der Transkription eines gewünschten Gens in einer chromosomalen Region bereit, auf die abgezielt wird.
Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung, nicht zur Einschränkung.
BEISPIEL
Beispiel 1
Dieses Beispiel zeigt die Charakterisierung von dmt-Mutanten-Pflanzen und die Isolierung von DMT.
Arabidopsis-Pflanzen wurden durch Infiltration mit Agrobacterium, das den SKI15-T-DNA-Vektor (großzügigerweise von D. Weigel (Salk Institute, La Jolla, CA) zur Verfügung gestellt) enthielt, transformiert. T1-Samen wurden geerntet. Der SKI15-Vektor besitzt das Bialaphos-Resistenz-(BAR-)Gen, das den Erfindern eine direkte Selektion transgener Pflanzen in Erde ermöglichte, nachdem mit im dem Handel erhältlichen Herbizid, Basta, gespritzt wurde. Die Schoten von etwa 5.000 Basta-resistenten Pflanzen wurden geöffnet, und jene, die in etwa eine Samenverkümmerung von 50 % aufwiesen, wurden identifiziert.
Zwei Linien, B13 und B33, wurden zur weiteren Charakterisierung identifiziert. Eine genetische Analyse der Mutanten zeigte, dass die dmt-Mutanten weiblichsteril waren. Die männliche Fertilität hing jedoch vom genetischen Hintergrund der Mutanten-Allele ab. Im Columbia-Hintergrund beträgt die Transmission der dmt-Mutation weniger als 50 %. Im Landsberg-erecta-Hintergrund verlief die Transmission durch männliche Pflanzen jedoch beinahe normal.
Eine Molekularanalyse bestätigte, dass die beiden Mutationen allelisch waren. Sowohl die B13- als auch die B33-Allele tragen z.B. die SKI15-T-DNA innerhalb eines DMT-Exons, was bestätigt, dass eine Zerstörung des DMT-Gens zu den beobachteten B13- und B33-Phänotypen führte.
5'- und 3'-RACE wurden verwendet, um die 5'- und 3'-Enden der jeweiligen cDNA darzustellen. 5'-RACE wurde unter Verwendung von Reagenzien und Protokollen durchgeführt, die vom „5'-RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends" (5'-RACE-System für rasche Amplifikation von cDNA-Enden), Version 2.0, GIBCO BRL, LIFE TECHNOLOGIES, Grand Island, NY, und dem cDNA-Amplifikationsset von Marathon, Clontech, Palo Alto, CA, bereitgestellt wurden. Die finalen genspezifischen 5'-RACE-Primer waren SKES-4 (GGGAACAAGTGCACCATCTCC) und SKES3.5 (CGATGATACTGTCTCTTCGAGC). 3'-RACE wurde unter Verwendung von Reagenzien und Protokollen durchgeführt, die vom cDNA-Amplifikationsset von Marathon, Clontech, Palo Alto, bereitgestellt wurden. Das finale genspezifische 3'-Ende wurde aus dem cDNA-Bibliothek-Screening erhalten.
Die Nucleotidsequenz der genomischen Kopie von DMT wurde ebenso bestimmt (Seq.-ID Nr. 1). Das 5'-Ende der DMT-RNA befindet sich an Position 3.425 in Seq.-ID Nr. 1. Die Position des 3'-Endes der DMT-RNA befindet sich an Position 12.504 in Seq.-ID Nr. 1. Die Position des ATG-Translationsinitiations-Codons befindet sich an Position 4.903 in Seq.-ID Nr. 1. Die Position des TAA-Translationsterminations-Codons befindet sich an Position 12.321 in Seq.-ID Nr. 1.
Ein Teil der DMT-Polynucleotidsequenz, unter anderem das erste Exon, ist vom künstlichen Bakterienchromosom-(BAC-)Klon T9J15TRB umfasst. Die Sequenzen 3820-4299, 4319-4558, 4546-5025 und 9320-9777 aus Seq.-ID Nr. 1 wurden bereits zuvor unter Verwendung des BAC-Klons als Matrize bestimmt. Weiters überlappt ebenso eine separate, getrennt sequenzierte Region (C. Bork et al., Gene 28, 147-153 (1998)) mit der DMT-Sequenz an den Positionen 11.087 bis 12.785 aus Seq.-ID Nr. 1.
Das prognostizierte DMT-Protein besitzt 1.729 Aminosäuren. Diese Sequenz wurde unter Verwendung von BLAST mit bekannten Proteinsequenzen verglichen und zeigte eine Homologie zu einigen Endonuclease-III-Proteinen. Die größte Homologie war im Vergleich zum Endonuclease-III-Protein aus Deinococcus radiodurans, Genbank-Zugriffsnr. AE002073, vorhanden (siehe z.B. O. White et al., Science 286, 1571-1577 (1999)). Andere DMT-Motive umfassen zwei konsekutive Kernlokalisierungssignale an den Positionen 43-60 und 61-78 und einen Leucin-Zipper an den Positionen 1330-1351.
Beispiel 2
Dieses Beispiel stellt weitere Beweise dafür bereit, dass Mutanten-Phänotypen durch Funktionsverlust-Mutationen hervorgerufen werden.
Es wurde ein neues Allel, dmt-3, erhalten. Das dmt-3-Allel wurde durch Insertion des einfachen pD991-T-DNA-Vektors (M.R. Sussman et al., Plant Physiol. 124, 1465 (2000)) in das 2. Exon des DMT-Gens hervorgerufen. Im Gegensatz dazu wurden die vorigen beiden Allele, dmt-1 und dmt-2, durch Insertion des Aktivierungs-T-DNA-Vektors, SK1015-Vektors, hervorgerufen. Die von allen drei dmt-Allelen erzeugten Mutanten-Phänotypen sind dieselben. Da pD991 keine Aktivierungssequenzen besitzt, deutet dies darauf hin, dass alle drei Mutanten-Allele Funktionsverlust-Allele sind. Im Einklang mit dieser Schlussfolgerung kann die Samenverkümmerung mit einem Transgen mit 3.373 Basenpaaren aus 5'-flankierenden DMT-Sequenzen plus 1.478 Basenpaaren aus 5'-UTR gerettet werden, die an eine cDNA ligiert sind, die für das DMT-Polypeptid voller Länge kodiert (d.h. DMTp::DMT). Daher zeigten dmt/DMT-heterozygote Pflanzen, die für das DMTp::DMT-Transgen hemizygot sind, eine Samenverkümmerung von 25 %. Dmt/DMT-Kontrollpflanzen zeigten eine Samenverkümmerung von 50 %.
Beispiel 3
Dieses Beispiel zeigt, dass DMT notwendig und ausreichend für die Expression des MEA-Gens ist.
Wie oben beschrieben, wurde eine befruchtungsunabhängige Endospermentwicklung beobachtet, als die Befruchtung von dmt/dmt-homozygoten Mutanten-Blumen verhindert wurde. Dies ähnelt dem Fall, in dem die Befruchtung von Mea-Mutanten-Blumen verhindert wird, sehr. Daher hindern vor der Befruchtung sowohl DMT als auch MEA, ein Polycomb-Protein (T. Kiyosue et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 4186 (1999)), die Zentralzelle des weiblichen Gametophyten daran, das Endosperm auszubilden. Dies steht in Einklang mit der Tatsache, dass DMT ein positiver Regulator von MEDEA (MEA) ist.
Als weiteren Beweis dieses Verhältnisses akkumuliert MEA-RNA in unreifen Blütenknospen (IF-Knospen) und offenen Blüten (OF). In dmt/dmt-Mutanten-Pflanzen gab es jedoch keine detektierbare MEA-RNA. DMT ist daher für die MEA-Gen-Expression erforderlich.
Zusätzlich haben die Erfinder Pflanzen mit einem Transgen, CaMV::DMT, erzeugt, das dazu kreiert wurde, DMT überzuexprimieren. Die DMT-cDNA voller Länge wurde an den konstitutiven Blumenkohlmosaik-Viruspromotor, CaMV, ligiert (S.G. Rogers, H.J. Klee, R.B. Horsch, R.T. Fraley, Meth. Enzymol. 153, 253 (1987)). Bei Wildtyp-Kontrollpflanzen wurden die DMT- und MEA-Gene im Blatt nicht signifikant exprimiert. Bei 35S::DMT-Pflanzen stiegen sowohl die DMT- als auch die MEA-RNA-Spiegel signifikant an. Dies zeigt, dass DMT ausreicht, um die MEA-Gen-Expression im Blatt zu induzieren.
Beispiel 4
Dieses Beispiel zeigt, dass DMT ein Mitglied der HhH-GPD-Überfamilie der DNA-Reparatur-Enzyme ist.
Eine BLAST-Suche, gefolgt von einer Suche nach konservierten Domänen, zeigte, dass DMT hochgradig mit der HhH-GPD-Überfamilie der Basenexzisions-DNA-Reparatur-Proteine verwandt ist (d.h. ein Score von 70,1, E-Wert von 8e^-13). Diese Familie enthält eine variierende Bandbreite an strukturell verwandten DNA-Reparatur-Proteinen. Die Überfamilie wird als HhH-GPD-Familie nach ihrem Kennzeichen, Helix-Haarnadel-Helix und Gly/Pro-reiche Schleife, gefolgt von einem konservierten Aspartat, bezeichnet (S.D. Bruner et al., Nature 403, 859 (2000)). Dies umfasst Endonuclease III (EC:4.9.99.18), 8-Oxoguanin-DNA-Glykosylasen (d.h. Hefe-OGG1), die Thymin-DNA-Glykosylase des Methyl-CPG-bindenden Proteins MBD4 (B. Hendrich et al., Nature 401, 301 (1999)) und DNA-3-Methyladeninglykosylase II (EC:3.2.2.21). Die prognostizierte Aminosäuresequenz von DMT enthält viele der konservierten Aminosäuren dieser Überfamilie.
Das Merkmal der Überfamilie der Basenexzisions-DNA-Reparatur-Proteine ist ein Helix-Haarnadel-Helix-Strukturelement, gefolgt von einer Gly/Pro-reichen Schleife und einer konservierten Asparaginsäure (d.h. HhH-GPD-Motiv). Das DMT-Polypeptid ist 1.729 Aminosäuren lang. Die Aminosäuren 1.271 bis 1.304 entsprechen dem konservierten HhH-GPD-Motiv. Die DMT-Sequenz ist DKAKDYLLSIRGLGLKSVECVRLLTLHNLAFPVD. Die katalytischen Lysin- (K1286) und der Asparaginsäurereste (D1304) sind im HhH-GPD-Motiv von DMT konserviert. Die sekundäre Strukturprognose (Jpred-Programm) deutet darauf hin, dass DMT zwei α-Helices besitzt (Aminosäuren 1.271-1.279 und 1.286 bis 1.295), die den konservierten αK- und αL-Helices im HhH-GPD-Motiv des kristallisierten hOGG1-DNA-Reparaturproteins entsprechen (Bruner et al., Nature 403, 859-866 (2000)).
Die kodierenden DMT-Sequenzen aus Arabidopsis wurden ebenso verwendet, um homologe Sequenzen unter Verwendung sowohl der BLAST- als auch der PSI-BLAST-Computer-Algorithmen in öffentlichen und auch in urheberrechtlich geschützten Datenbanken zu identifizieren. Diese Analyse zeigte Aminosäuresequenzen aus einigen Pflanzenspezies, unter anderem Weizen, Mais, Reis, Sojabohnen und Arabidopsis (Seq.-ID Nr. 7–29). Basierend auf diesen Sequenzen wurden die folgenden Konsensussequenzen für DMT bestimmt: DMT-Domäne A
DMT-Domäne B
DMT-Domäne C
Die erste oben aufgelistete Konsensussequenz entspricht den Aminosäurepositionen 586 bis 937 aus Seq.-ID Nr. 2. Die zweite oben aufgelistete Konsensussequenz entspricht den Aminosäurepositionen 1117 bis 1722 aus Seq.-ID Nr. 2. Die Konsensussequenz stellt Aminosäuresequenzen nach Positionen unter Verwendung von Einbuchstaben-Aminosäureabkürzungen bereit. Die Zahlen in den Kleiner- und Größerals-Zeichen („<" oder ">") beziehen sich auf Aminosäurepositionen, in denen es keinen Konsens gibt und die daher eine beliebige Aminosäure sein können. Aminosäureabkürzungen in runden Klammern geben alternative Aminosäuren an derselben Position an. Groß geschriebene Buchstaben beziehen sich auf vorherrschende Konsensus-Aminosäuren, und klein geschriebene Buchstaben beziehen sich auf Aminosäuren, die häufig in DMT-Sequenzen zu finden sind, jedoch nicht vorherrschend sind.
Beispiel 5
Dieses Beispiel zeigt das Verhältnis zwischen DNA-Reparatur und Demethylierung.
Für viele Jahre fokussierte sich die Aufmerksamkeit auf die Fähigkeit von DNA-Glykosylasen, DNA zu reparieren. Glykosylasen sind z.B. in die Reparatur von G/T-fehlgepaarten Basen während der Depurinierung der Thymidinbasengruppierung involviert. Vor kurzem wurde gezeigt, dass aviäre (B. Zhu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 5135 (2000)) und von Säugetieren stammende (B. Zhu et al, Nucl. Acid Res. 28, 4157 (2000)) G/T-Fehlpaarungs-DNA-Glykosylasen ebenso eine 5-Methylcytosin-DNA-Glykosylaseaktivität besitzen. Das heißt, diese Enzyme sind Demethylasen, die 5-Methylcytosin, das später von Cytosin ersetzt wird, entfernen. Ohne den Umfang der Erfindung einschränken zu wollen, wird davon ausgegangen, dass DMT als ein Mitglied dieser Überfamilie eine Demethylase ist (d.h. 5-Methylcytosin-Glykosylase).
Der Methylierungsstatus (d.h. die Menge an 5-Methylcytosin) eines Gens kann eine tiefgehende Wirkung auf seine Expression haben. Im Allgemeinen wird eine Hypomethylierung mit einer erhöhten Gen-Expression assoziiert, während eine Hypermethylierung mit einer verringerten Gen-Expression assoziiert wird (S.E. Jacobsen, Current Biology 9, 617 (1999)). Es ist daher wahrscheinlich, dass DMT die MEA-Gen-Expression durch das Reduzieren seines Methylierungsausmaßes aktiviert.
Mutationen im DDM1-Gen in Arabidopsis reduzieren die allgemeine Genom-Cytosin-Methylierung um 70 % (E.J. Finnegan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 8449 (1996); M.J. Ronemus et al., Science 273, 654 (1996)). Solche Pflanzen entwickeln eine Reihe an phänotypischen Abnormalitäten, unter anderem florale Phänotypen (T. Kakutani et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 12406 (1996)). Auf ähnliche Art und Weise wurde die Entwicklung von phänotypischen Abnormalitäten in dmt/dmt-homozygoten Pflanzen beobachtet, die die Anzahl der Blütenblätter, die Fusion des Blühorgans und die Identität des Blühorgans beeinflussen. Weiters sind unabhängige CaMV::DMT-transgene Linien, die DMT häufig überexprimieren, spätblühend. Dies ist besonders von Interesse, da gezeigt wurde, dass die späte Blüte von ddm1-Pflanzen auf die Hypomethylierung des FWA-Gens zurückzuführen war (W.J.J. Soppe et al., Mol Cell 6, 791 (2000)). Ohne daher den Umfang der Erfindung einschränken zu wollen, wird davon ausgegangen, dass sowohl ddm1-Funktionsverlust-Mutationen als auch die Überexpression von DMT (d.h. CaMV::DMT) zu einer Genom-Hypomethylierung führen können.
Beispiel 6
Dieses Beispiel zeigt das Abzielen mit der Gen-Expression auf den weiblichen Gametophyten unter Verwendung einer DMT-Promotor-Sequenz.
DMT-RNA akkumuliert in vielen Pflanzenorganen wie z.B. in unentwickelten Blüten, entwickelten Blüten, geöffneten Blüten, Stängel und, in geringerem Ausmaß, Blätter. Um die räumliche und zeitliche Regulierung der DMT-RNA-Akkumulation zu verstehen, wurde die Expression des DMT-Promotors, der an Reporter-Gene fusioniert ist, analysiert. Die Erfinder fusionierten 2.282 Basenpaare aus 5'-DMT-Sequenzen, die 5'-UTR voller Länge (1.478 Basenpaare), 444 Basenpaare aus kodierenden Sequenzen für DMT, die ein Kernlokalisierungssignal enthalten, an zwei Reporter-Gene, das grünfluoreszierende Protein (GFP; (Y. Niwa et al., Plant J. 18, 455 (1999))) und β-Glukuronidase (GUS; (R.A. Jefferson, T.A. Kavanagh, M.V. Bevan, EMBO J. 6, 3901 (1987))). Die Reporter-Gen-Expression wurde in dem sich entwickelnden weiblichen Gametophyten beobachtet, in den polaren Nuclei, bevor sie verschmelzen, im Ei und in den Synergiden und in der Zentralzelle. Eine Expression nach der Befruchtung wurde nicht beobachtet. Dieser Promotor ist daher für das Targeting der Gen-Expression auf den weiblichen Gametophyten von Nutzen.
Es wird davon ausgegangen, dass die hierin beschriebenen Beispiele und Ausführungsformen lediglich illustrativen Zwecken dienen und dass verschiedene Modifikationen oder Veränderungen hinsichtlich dieser einem Fachmann nach dem Stand der Technik vorgelegt werden und im Geiste und Anwendungsbereich dieser Anwendung sowie im Schutzumfang der im Anhang befindlichen Ansprüche inkludiert werden sollen. Alle hierin zitierten Publikationen, Patente und Patentanmeldungen sind hierin in ihrer Gesamtheit für alle Zwecke durch Verweis aufgenommen. SEQ.-ID NR. 1: genomische DMT-Sequenz Genomische DMT-Sequenz (12.785 bp)

SEQ.-ID NR. 2: DMT-Aminosäure-Sequenz

SEQ.-ID NR. 3: 5'-flankierende DMT-Sequenz

SEQ.-ID NR. 4: 3'-flankierende DMT-Sequenz
SEQ.-ID NR. 5: DMT-cDNA-Sequenz

SEQ.-ID NR. 6: untranslatierte 5'-Region aus DMT
SEQ.-ID NR. 7: Arabidopsis-thaliana-DMT1- (1 DMT5-) Gensequenz aus BAC T32M21 (gi 7406444);

SEQ.-ID NR. 8: Arabidopsis-thaliana-DMT2 >DMT2 (1 DMT2);
SEQ.-ID NR. 9 >neuer 480-Aminosäure-Amino-Terminus von DMT2 (1DMT2);

SEQ.-ID NR. 10 >DMT2-(1DMT2-)Nucleotidsequenz aus BAC F1011 (gi 6598632);

SEQ.-ID NR. 11 Arabidopsis-thaliana-DMT3 >DMT3 (1 DMT3);
SEQ.-ID NR. 12 >neuer 375-Aminosäure-Amino-Terminus von DMT3 (1DMT3);

SEQ.-ID NR. 13 >DMT3-(1DMT3-)Nucleotidsequenz aus BAC T22K18 (gi 12408726);

SEQ.-ID NR. 14 Arabidopsis-thaliana-DMT4 >DMT4 (1DMT4);
SEQ.-ID NR. 15 >neuer 372-Aminosäure-NH2-Terminus von DMT4;

SEQ.-ID NR. 16 >DMT4-Nucleotidsequenz BAC F28A23 (gi 7228244);

SEQ.-ID NR. 17 Reis-(Oryza-sativa-)DMT1 >DMTRICE (1DMTRICE);

SEQ.-ID NR. 18 >neuer 723-Aminosäure-NH2-Terminus von DMTRICE;
SEQ.-ID NR. 19 >DMTRICE-Nucleotidsequenz aus PAC PO489G09;

SEQ.-ID NR. 20 Mais-(ZEA-MAYS-)DMT.1 Mais-DMT.1 660990 (688512 Selclone-ID);
SEQ.-ID NR. 21 Mais-DMT.1-cDNA 660990 (668512 Selclone-ID);

SEQ.-ID NR. 22 Mais-(ZEA-MAYS-)DMT.2 Mais-DMT.2 371537 (441428 Selclone-ID);
SEQ.-ID NR. 23 Mais-DMT.2-cDNA 371537 (441428 Selclone-ID);

SEQ.-ID NR. 24 Mais-(ZEA-MAYS-) DMT.3 >Mais-DMT.3 218853;
SEQ.-ID NR. 25 Weizen-DMT.1 >Weizen-DMT.1 614028 (887053 Selclone-ID);
SEQ.-ID NR. 26 >Weizen-DMT.1 614028 (887053 Selclone-ID);
SEQ.-ID NR. 27 Weizen-DMT.2 >Weizen-DMT.2 568842 (908118 Selclone-ID);
SEQ.-ID NR. 28 >Weizen-DMT.2 568842 (Selclone-ID 908118);
SEQ.-ID NR. 29 Weizen-DMT.3 >Weizen-DMT.3 611792 (838515 Selclone-ID);
SEQ.-ID NR. 30 >Weizen-DMT.3 611792 (838515 Selclone-ID);
SEQ.-ID NR. 31 Weizen-DMT.4 >Weizen-DMT.4 615131 (861906 Selclone-ID);
SEQ.-ID NR. 32 >Weizen-DMT.4 615131 (861906 Sefclone-ID);
SEQ.-ID NR. 33 Sojabohnen-(Glycine-max-)DMT.1 >Soja-DMT.1 449122 (557119 Selclone-ID);
SEQ.-ID NR. 34 >Soja-DMT.1 449122 (557119 Selclone-ID);

SEQ.-ID NR. 35 Sojabohnen-(Glycine-max-)DMT.2 >Soja-DMT.2 387990 (473695 Selclone-ID);
SEQ.-ID NR. 36 >Soja-DMT.2 387990 (473695 Selclone-ID);

SEQ.-ID NR. 37 Sojabohnen-(Glycine-max-)DMT.3 >Soja-DMT.3 657152 (546665 Selclone-ID);
SEQ.-ID NR. 38 >Soja-DMT.3 657152 (546665 Selclone-ID);

SEQ.-ID NR. 39 Sojabohnen-(Glycine-max-)DMT.4 >Soja-DMT.4 432980 (663678 Selclone-ID);
SEQ.-ID NR. 40 >Soja-DMT.4 432980 (663678 Selclone-ID);
SEQ.-ID NR. 41 >Medicago 6654943;
SEQ.-ID NR. 42 >Medicago 6654943 EST306265;
SEQ.-ID NR. 43 >Tomate 12624037
SEQ.-ID NR. 44 >Tomate 12624037 EST469495

SEQ.-ID NR. 45 >Gerste 13256964;
SEQ.-ID NR. 46 >Gerste 13256964 HVSMEI0014B12F

SEQ.-ID NR. 47 >Mais 1BE511860;
SEQ.-ID NR. 48 >Mais 1BE511860 946063H01.Y1 946
SEQ.-ID NR. 49 >Baumwolle 11206330;
Seq.-ID Nr. 50 >Baumwolle 11206330 GA EB0023J04F

SEQ.-ID NR. 51 >Sojabohne 5606759
SEQ.-ID NR. 52 >Sojabohne 5606759 SB95C12
SEQ.-ID NR. 53 >Weizen 12019155
SEQ.-ID NR. 54 >Weizen 12019155
SEQ.-ID NR. 55 >Tomate 8106032
SEQ.-ID NR. 56 >Tomate 8106032 EST356474

SEQ.-ID NR. 57 >Mais 1AW042334;
SEQ.-ID NR. 58 >Mais 1AW042334 614027C01.y1 614-
SEQ.-ID NR. 59 >Mais AW076298
SEQ.-ID NR. 60 >Mais AW076298 614065C03.Y1 614-
SEQ.-ID NR. 61 >Mais BE639158;
SEQ.-ID NR. 62 >Mais BE639158 946021 E09.Y1 946-
SEQ.-ID NR. 63 >Mais T25243;
SEQ.-ID NR. 64 >Mais T25243;
SEQ.-ID NR. 65 >Mais AW453174;
SEQ.-ID NR. 66 >Mais AW453174 660032D01.Y1 660-;
SEQ.-ID NR. 67 Mais BE509759;
SEQ.-ID NR. 68 Mais BE509759 946021 E09.X1 946-
SEQ.-ID NR. 69 >Mais 1AW017984;
SEQ.-ID NR. 70 >Mais 1AW017984;

Claims

Isolierte Nucleinsäure, umfassend eine Polynucleotidsequenz, oder ein Komplement davon, die für ein DMT-Polypeptid kodiert, das zumindest 70 % Sequenzidentität mit Seq.-ID Nr. 2 aufweist, worin die Nucleinsäure nach Einführung in eine Pflanze zur Hemmung der Expression von endogenem DMT zu einer Pflanze mit verstärkter Endospermentwicklung führt und worin das DMT-Polypeptid einen Leucin-Zipper und eine Kernlokalisierungs-Signalsequenz umfasst.
Isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 1, worin das DMT-Polypeptid zumindest 80 % Sequenzidentität mit Seq.-ID Nr. 2 aufweist.
Isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 1, worin das DMT-Polypeptid Seq.-ID Nr. 2 umfasst.
Isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 1, worin die Polynucleotidsequenz Seq.-ID Nr. 5 umfasst.
Isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 1, worin die Polynucleotidsequenz Seq.-ID Nr. 1 umfasst.
Isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 1, worin die Nucleinsäure weiters einen operabel mit der Polynucleotidsequenz verbundenen Promotor umfasst.
Isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 6, worin der Promotor ein konstitutiver Promotor ist.
Isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 6, worin die Polynucleotidsequenz in Antisense-Ausrichtung mit dem Promotor verbunden ist.
Verfahren zum Einführen von isolierter Nucleinsäure in eine Wirtszelle, Folgendes umfassend: (a) die Bereitstellung einer isolierten Nucleinsäure nach Anspruch 1; und (b) das Kontaktieren der Nucleinsäure mit der Wirtszelle unter Bedingungen, die die Insertion der Nucleinsäure in die Wirtszelle ermöglichen.
Expressionskassette, umfassend einen Promotor, der mit einer heterologen Polynucleotidsequenz, oder einem Komplement davon, die für ein DMT-Polypeptid kodiert, das zumindest 70 % Sequenzidentität mit Seq.-ID Nr. 2 aufweist, operabel verbunden ist, worin die Nucleinsäure nach Einführung in eine Pflanze zur Hemmung der Expression von endogenem DMT zu einer Pflanze mit verstärkter Endospermentwicklung führt und worin das DMT-Polypeptid einen Leucin-Zipper und eine Kernlokalisierungs-Signalsequenz umfasst.
Expressionskassette nach Anspruch 10, worin das DMT-Polypeptid zumindest 80 % Sequenzidentität mit Seq.-ID Nr. 2 aufweist.
Expressionskassette nach Anspruch 11, worin das DMT-Polypeptid Seq.-ID Nr. 2 umfasst.
Expressionskassette nach Anspruch 12, worin die Polynucleotidsequenz Seq.-ID Nr. 5 umfasst.
Expressionskassette nach Anspruch 10, worin die Polynucleotidsequenz Seq.-ID Nr. 1 umfasst.
Expressionskassette nach Anspruch 10, worin der Promotor ein konstitutiver Promotor ist.
Expressionskassette nach Anspruch 10, worin die Polynucleotidsequenz in Antisense-Ausrichtung mit dem Promotor verbunden ist.
Wirtszelle, umfassend exogene Nucleinsäure, die eine Polynucleotidsequenz, oder ein Komplement davon, umfasst, die für ein DMT-Polypeptid kodiert, das zumin dest 70 % Sequenzidentität mit Seq.-ID Nr. 2 aufweist, worin die Nucleinsäure nach Einführung in eine Pflanze zur Hemmung der Expression von endogenem DMT zu einer Pflanze mit verstärkter Endospermentwicklung führt und worin das DMT-Polypeptid einen Leucin-Zipper und eine Kernlokalisierungs-Signalsequenz umfasst.
Wirtszelle nach Anspruch 17, worin die Nucleinsäure weiters einen operabel mit der Polynucleotidsequenz verbundenen Promotor umfasst.
Wirtszelle nach Anspruch 18, worin der Promotor in Antisense-Ausrichtung operabel mit der Polynucleotidsequenz verbunden ist.
Wirtszelle nach Anspruch 18, worin der Promotor konstitutiv ist.
Verfahren zur Modulation der Transkription eines DMT-Polynucleotids, wobei das Verfahren das Einführen einer Expressionskassette, die einen Promotor umfasst, der operabel mit einem DMT-Polynucleotid, oder einem Komplement davon, verbunden ist, das für ein DMT-Polypeptid, das zumindest 70 % Sequenzidentität mit Seq.-ID Nr. 2 aufweist, in eine Wirtszelle umfasst, worin das DMT-Polypeptid einen Leucin-Zipper und eine Kernlokalisierungs-Signalsequenz umfasst; sowie das Nachweisen einer Wirtszelle umfasst, die im Vergleich mit einer Wirtszelle, in die die Expressionskassette nicht eingeführt wurde, modulierte Transkription eines Polynucleotids zeigt, das für ein DMT-Polypeptid kodiert, das zumindest 70 % Sequenzidentität mit Seq.-ID Nr. 2 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 21, worin das DMT-Polynucleotid für Seq.-ID Nr. 2 kodiert.
Verfahren nach Anspruch 21, worin das DMT-Polynucleotid Seq.-ID Nr. 5 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 21, worin das DMT-Polynucleotid Seq.-ID Nr. 1 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 21, worin die Expressionskassette mittels eines Agrobakteriums eingeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 21, worin die Expressionskassette mittels geschlechtlicher Kreuzung eingeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 21, worin die Modulation der Transkription zu einer Modulation der Endospermentwicklung in einer Pflanze führt.
Verfahren nach Anspruch 27, worin die Endospermentwicklung verstärkt wird.
Verfahren nach Anspruch 27, worin die Endospermentwicklung verringert wird.
Verfahren nach Anspruch 21, worin das DMT-Polynucleotid für Seq.-ID Nr. 2 kodiert und der Promotor in Antisense-Ausrichtung operabel mit dem DMT-Polynucleotid verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 21, worin die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist.
Transgene Pflanzenzelle oder transgene Pflanze, die heterologe Nucleinsäure umfasst, die eine Polynucleotidsequenz, oder ein Komplement davon, umfasst, die für ein DMT-Polypeptid kodiert, das zumindest 70 % Sequenzidentität mit Seq.-ID Nr. 2 aufweist, worin die Nucleinsäure nach Einführung in eine Pflanze zur Hemmung der Expression von endogenem DMT zu einer Pflanze mit verstärkter Endospermentwicklung führt und worin das DMT-Polypeptid einen Leucin-Zipper und eine Kernlokalisierungs-Signalsequenz umfasst.
Transgene Pflanzenzelle oder transgene Pflanze nach Anspruch 32, worin das DMT-Polypeptid Seq.-ID Nr. 2 umfasst.
Transgene Pflanzenzelle oder transgene Pflanze nach Anspruch 32, worin die Polynucleotidsequenz Seq.-ID Nr. 5 umfasst.
Transgene Pflanzenzelle oder transgene Pflanze nach Anspruch 32, worin die Polynucleotidsequenz Seq.-ID Nr. 1 umfasst.
Transgene Pflanzenzelle oder transgene Pflanze nach Anspruch 32, worin die Nucleinsäure weiters einen operabel mit der Polynucleotidsequenz verbundenen Promotor umfasst.
Transgene Pflanzenzelle oder transgene Pflanze nach Anspruch 36, worin der Promotor ein konstitutiver Promotor ist.
Transgene Pflanzenzelle oder transgene Pflanze nach Anspruch 32, worin die Polynucleotidsequenz in Antisense-Ausrichtung mit dem Promotor verbunden ist.
Pflanze, die gemäß Anspruch 32 aus einer Pflanzenzelle regeneriert worden ist.
Isolierte Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder Expressionskassette nach einem der Ansprüche 10 bis 18 zur Verwendung bei der: (a) Modulation von Organidentität; (b) Modulation von Organgröße und/oder Anzahl; (c) Modulation der Größe oder der Aktivität des Meristems; oder (d) Vergrößerung des Endosperms.
Isolierte Nucleinsäure oder Expressionskassette nach Anspruch 40, worin die Polynucleotidsequenz zumindest 30 zusammenhängende Nucleotide eines Polynucleotids umfasst, das für Seq.-ID Nr. 2 kodiert.
Isolierte Nucleinsäure oder Expressionskassette nach Anspruch 40, worin die Polynucleotidsequenz zumindest 100 zusammenhängende Nucleotide eines Polynucleotids umfasst, das für Seq.-ID Nr. 2 kodiert.
Isolierte Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder Expressionskassette nach einem der Ansprüche 10 bis 16 zur Verwendung bei der Modulation der Zeit bis zur Blüte bei einer Pflanze.
Expressionskassette nach Anspruch 40 oder 41, worin der Promotor ein gewebespezifischer Promotor ist.