KR101531923B1 - 식물체의 포자체형 조직 또는 중심세포 특이적 외래 유전자의 발현을 유도하는 전사조절인자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 DEMETER 프로모터의 식물체 조직 특이적 활성을 조절하는 서열번호 2의 염기서열 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 시스-조절인자, 서열번호 1의 염기서열과 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 포자체형 조직(sporophytic tissue) 특이적으로 외래 유전자의 발현을 유도하는 유전자, 서열번호 1의 염기서열과 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 중심 세포(central cell) 특이적으로 외래 유전자의 발현을 유도하는 유전자에 관한 것으로, 본 발명의 시스-조절 인자들은 유전자 발현 조절 메커니즘 규명 연구에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 특정한 단계에서의 유전자 발현을 조절하는 인위적인 유전자 조작에도 유용한 도구로서 활용될 수 있을 것이다.

Description

식물체의 포자체형 조직 또는 중심세포 특이적 외래 유전자의 발현을 유도하는 전사조절인자 및 이의 용도{Transcriptional regulatory element which induces sporophytic tissue or central cell-specific expression of foreign gene in plant and uses thereof}

본 발명은 식물체의 포자체형 조직 또는 중심세포 특이적 외래 유전자의 발현을 유도하는 전사조절인자에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 DEMETER 프로모터의 활성을 조절하는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 전사조절인자, 서열번호 1의 염기서열과 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 포자체형 조직(sporophytic tissue) 특이적으로 외래 유전자의 발현을 유도하는 유전자, 서열번호 1의 염기서열과 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 중심 세포(central cell) 특이적으로 외래 유전자의 발현을 유도하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 식물 발현 벡터를 식물 세포에 형질전환하여 식물체의 포자체형 조직 또는 중심 세포 특이적으로 외래 유전자를 발현하는 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물체 및 이의 종자 및 유효성분으로 서열번호 1의 염기서열과 서열번호 2의 염기서열 또는 서열번호 1의 염기서열과 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 식물체의 조직 특이적으로 외래 유전자의 발현을 유도하기 위한 조성물에 관한 것이다.

DEMETER 유전자는 글리코실라제(glycosylase) 도메인을 가지고 있는 1,729개의 아미노산으로 구성되어 있는 거대한 단백질을 만들어내는 유전자로, 이 유전자에 이상이 생기면 배(embryo)는 하트단계(heart stage)에서 성장을 멈추고, 배에 영양을 공급하는 역할을 하는 배젖(endosperm)은 마치 암세포와 마찬가지로 비정상적인 세포분열을 거듭하다가 배젖이 과대생산(endosperm over-production)되어 결국 정상적인 씨를 형성하지 못하고 발달이 정지된다. DEMETER 유전자는 극히 짧은 시간에 제한적으로 발현이 되는데, 꽃이 피어 수정이 되기 바로 직전 암술에 있는 생식세포 중의 하나인 중심 세포(central cell)에서만 발현을 하고 수정 후는 발현이 되지 않는다.

흥미롭게도, 돌연변이 표현형질이 모계에서 오는 DEMETER 유전자가 정상인가 비정상인가에 따라 전적으로 결정이 되며, 부계에서 오는 DEMETER 유전자는 아무런 영향을 미치지 못한다. 즉, 아무리 부계에서 받은 DEMETER 유전자가 정상이라도 모계에서 받은 DEMETER 유전자가 비정상이면 자식인 씨앗은 정상적인 발달을 하지 못하고 결국 돌연변이 형질이 나타나게 되는 것이다. 고등 생물체의 경우, 모계 쪽에서 받은 유전자 세트와 부계 쪽에서 받은 유전자 세트가 있어서 이 중 하나가 돌연변이가 생겨도 나머지 하나가 정상이면 돌연변이 표현형질이 나타나지 않으나, 몇몇 유전자의 경우, 한쪽에서만 발현이 되며 다른 한쪽에서는 발현이 되지 않도록 조절이 되어있기 때문에, 발현이 되어야 하는 쪽에서 돌연변이가 생기면 그대로 표현형질이 나타나게 된다. 이러한 현상을 유전체 각인(genomic imprinting)이라고 하는데 주로 동물의 경우에서는 태아의 발달에 관련되어 있는 유전자들, 그리고 식물에서는 배젖 발달에 관계되어 있는 유전자에서 이런 현상을 찾아볼 수 있다.

생물체는 각인되어 있는 여러 유전자들의 균형이 이뤄져야 정상적인 태아와 배젖 형성이 이뤄진다. 식물체에서 각인되어 있는 유전자로 최근에 관심의 대상이 되고 있는 MEDEA 유전자 역시 모계 쪽에서만 발현을 하며 DEMETER 유전자의 돌연변이 형질과 거의 비슷한데, 그 이유는 DEMETER 유전자가 MEDEA 유전자의 발현을 조절하기 때문이다. DEMETER 유전자가 오로지 암술의 중심 세포에서 발현이 되어 MEDEA 유전자의 프로모터를 작동시키는 반면, 수술 쪽에서는 DEMETER가 발현이 되지 않으므로 MEDEA는 부계 쪽에서는 발현이 되지 못한다. 특히 DEMETER는 자신의 글리코실라제 도메인을 이용하여 MEDEA 유전자의 프로모터에 nicking을 유도하여 DNA 구조를 변하게 함으로써 MEDEA 발현을 유도하는 것을 밝혀냈다.

이렇듯 유전자 각인에 중요하며 성공적인 종자 생산에 필수적임에도 불구하고, DEMETER 유전자에 대한 현재까지의 국내외 연구 동향은 주로 DEMETER의 하부 유전자인 각인 유전자들의 연구에 초점이 맞추어져 왔다. DEMETER의 발현이 어떻게 특이적으로 조절되는지의 연구는 유전자 각인과 후생학적(epigenetic) 조절, 더 나아가 종자발달의 이해에 절실히 필요하다.

프로모터는 유전자의 발현을 조절하는 조절 유전자로서 특정 프로모터를 사용했을 경우 유용한 유전자를 적절한 시기에 또는 식물체의 특정한 부위에서 발현시킬 수 있어 생명공학을 이용한 새로운 품종 개발에 있어 중요한 기술이라고 할 수 있다. 특히, 조직 특이적 발현을 유도하는 프로모터의 개발은 그 활용도 및 중요성이 매우 크다 할 것이다. 따라서 관련 지적 재산권 확보를 위한 경쟁이 우리나라뿐만 아니라 전 세계적으로 광범위하게 이루어지고 있다.

한편, 한국등록특허 제0593809호에는 '수도로부터 분리한 칼모듈린에 결합하는 전사조절인자 오에스씨지-1의 유전자 서열 및 기능'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0382167호에는 '벼에서 병 방어 유전자군의 발현을 조절하는 전사인자유전자 및 이를 이용하여 벼의 획득저항성을 강화시키는 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 식물체의 포자체형 조직 또는 중심세포 특이적 외래 유전자의 발현을 유도하는 전사조절인자에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 애기장대 DEMETER 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 및 번역 시작 위치 전까지의 프로모터 하류 부위의 다양한 결실 및 절단 형태의 리포터 구조를 만들고, 상기 리포터 구조를 사용하여 형질전환 식물체를 제조하여 리포터 유전자의 발현 경향을 분석한 결과, DEMETER 유전자 프로모터 하류의 특정 염기서열로 이루어진 인자(element)를 포함하는 리포터 구조로 형질전환된 애기장대 식물체의 포자체형 조직 또는 자성 배우체의 중심 세포에서 리포터 유전자가 특이적으로 발현되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 DEMETER 프로모터의 활성을 조절하는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 전사조절인자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 DEMETER 프로모터의 활성을 조절하는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 전사조절인자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열과 서열번호 2의 염기서열을 포함하는, 포자체형 조직(sporophytic tissue) 특이적으로 외래 유전자의 발현을 유도하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열과 서열번호 3의 염기서열을 포함하는, 중심 세포(central cell) 특이적으로 외래 유전자의 발현을 유도하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 식물 발현 벡터를 식물 세포에 형질전환하여 식물체의 포자체형 조직 또는 중심 세포 특이적으로 외래 유전자를 발현하는 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 포자체형 조직 또는 중심 세포 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 유효성분으로 서열번호 1의 염기서열과 서열번호 2의 염기서열을 포함하는, 포자체형 조직(sporophytic tissue) 특이적으로 외래 유전자의 발현을 유도하기 위한 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 유효성분으로 서열번호 1의 염기서열과 서열번호 3의 염기서열을 포함하는, 중심 세포(central cell) 특이적으로 외래 유전자의 발현을 유도하기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, DEMETER 유전자의 프로모터 하류의 조절 인자(regulatory element) 서열은 식물체의 포자체형 조직 또는 중심 세포에서 특이적으로 유전자를 발현 유도할 수 있어, 유전자 발현 조절 메커니즘 규명 연구에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 특정한 단계에서의 유전자 발현을 조절하는 인위적인 유전자 조작에도 유용한 도구로서 활용될 수 있을 것이다. 특히 DEMETER 유전자는 식물체의 배발생 단계에서 유전체 각인(imprinting)에 중요하며 종자 형성에 필수적인 유전자이므로, 본 발명의 조절 인자 서열과 DEMETER 유전자의 프로모터 서열을 포함하는 유전자는 산업적으로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 애기장대 꽃차례(inflorescence)의 RNA를 이용하여 DEMETER(이하 DME)의 5'-RACE 분석을 수행한 결과로, (A)는 DME 유전자의 5' 부위의 두 가지 다른 형태를 가진 전사체의 구조를 나타낸 그림이다. 그림의 표시 기호는 각각 다음과 같다; 밝은 회색 상자, 5'-UTR; 어두운 회색 상자, 번역되는 엑손; 첫 번째 실선, 프로모터; 두 번째 실선, 인트론; 검정 화살표, 5'-RACE 프라이머. (B)는 5'-RACE 분석 결과물의 아가로스 겔 전기영동 사진이며, (C)는 5'-RACE를 통해 결정된 DME 전사 시작 지점(transcription start site)의 상대적인 분포도를 보여주는 결과이다.
도 2는 2.3kb DME : GUS 레퍼런스 라인의 발현 경향을 확인한 결과로, (A)는 발아 후 7일째의 유식물로 검정 화살표 및 하얀색 화살표 머리는 각각 줄기 및 뿌리에서 활발히 증식하는 조직을 가리키며, (B)는 줄기 생장점과 어린 잎원기(leaf primoria)를, (C)는 뿌리 생장점과 분화 구역을, (D)는 실편이 없는 암술을 그리고 (E)는 FG7(Female gametophyte 7)의 배젖을 보여준다. CCN은 중앙 세포 핵(central cell nucleus)을 의미한다. 각 패널의 bar 크기는 (A)=1,000㎛, (B)~(E)=200㎛이다.
도 3은 DME 유전자가 화분 발달의 후기 이세포성 단계(late bi-cellular stage)의 영양핵에서 특이하게 발현하고 있음을 확인한 결과이다.
도 4는 애기장대 야생형 식물체에서 화분 발달 동안 DME RNA의 수준 변화를 실시간 정량적 역전사 중합효소연쇄반응을 통해 확인한 결과로, 4단계 성숙 화분에서의 DME RNA의 발현 수준을 1.0의 값으로 설정하고 상대적인 수준을 비교한 결과이다. 모든 결과는 세 번 반복 수행하여 평균값 및 표준편차를 구한 값이며, 범례의 숫자는 화분 발달 단계를 표시한 것이며, Ler ovlue는 배주를 의미한다.
도 5는 DME 프로모터 분석에 사용된 다양한 리포터 구조(construct)를 나타낸 그림으로, (A)는 결손 구조이고, (B)는 시스-조절 인자의 기능 규정에 사용된 5'-UTR 절단형태의 구조(TU)이고 (C)는 내부 결손 구조를 나타낸다. SDL는 유식물, VG는 암술의 영양조직, CC는 중심 세포를 의미하며, 각 구조를 사용하여 형질전환한 식물체에서 조직별 리포터 유전자의 상대적인 염색 강도를 다음과 같이 표시하였다; -, 발현없음; +, 약함; ++, 중간; +++, 강함.
도 6은 다양한 DME : GUS 리포터 구조를 사용하여 형질전환한 식물체에서 조직별 발현 양상을 확인한 결과로, 하얀색 화살표는 경정분열조직을, 검정 화살표는 중심 세포 핵을 그리고 검정 화살표 머리는 조세포(synergid cell)를 나타낸다. Bar 크기는 유식물(seedling)은 1,000㎛, 줄기 생장점(shoot meristem)과 암술(pistil)은 200㎛ 그리고 배주(ovule)는 50㎛이다.
도 7은 반접합성 형질전환 식물체의 중심 세포에서 GUS를 발현하는 배주의 비율을 확인하여 나타낸 결과이다.
도 8은 DME의 5'-UTR 절단형태 리포터 구조의 조직별 발현 경향을 확인한 결과로, bar 크기는 유식물(seedling)은 1,000㎛, 줄기 생장점(shoot meristem)과 암술(pistil)은 200㎛ 그리고 배주(ovule)는 50㎛이다.
도 9는 DME의 5'-UTR 절단형태 리포터 구조로 형질전환된 식물체의 꽃차례에서 추출한 총 RNA를 사용하여 5'-RACE 분석을 수행한 결과이다.
도 10은 5'-UTR 절단형태 TU0 구조로부터 포자체형 조직과 중심 세포에서 DME의 발현을 위한 시스-조절 인자를 각각 제거한 형태의 리포터 구조로 형질전환된 식물체에서 조직별 GUS 발현 경향을 확인한 결과이다. Bar 크기는 유식물(seedling)은 1,000㎛, 암술(pistil)은 200㎛, 배주(ovule)는 50㎛ 그리고 화분(pollen)은 20㎛이다.
도 11은 35S 최소의 프로모터 부위와 추정상의 종렬중복(tandem repeat)을 가지는 5'-UTR 절단형태의 구조(TU) 시리즈를 나타낸 그림으로, VG는 암술의 영양조직을 CC는 중심 세포를 나타낸다.
도 12는 1^st 및 2^nd 인트론 및 결손된 프로모터를 가지는 DME의 cDNA 구조를 나타낸 그림이다.
도 13은 T-DNA 삽입을 가진 dme 돌연변이체와 변형된 DME 유전자의 발현을 나타낸 결과로, (A)는 dme 돌연변이체의 T-DNA 삽입 위치를 나타낸 것이고, (B)와 (C)는 각각의 dme 대립형질에 있어서 DME의 발현수준을 유식물과 꽃차례에서 확인한 결과이다.
도 14는 DME 프로모터에서 유전자 발현을 조절하는 시스-조절 인자를 요약한 그림으로, 어두운 회색 상자는 번역 엑손을, 밝은 회색 상자는 5'-UTR을, 첫 번째 실선은 프로모터, 두 번째 실선은 인트론을 나타내며, 붉은 실선은 포자체형 조직에서 DME 발현을 위한 시스-조절 인자를, 푸른색 실선은 중심 세포에서 DME 발현을 위한 시스-조절 인자 위치를 각각 나타낸다. 점선은 유전자 발현의 양적인 조절을 위한 조절 인자를 의미한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 DEMETER 프로모터의 활성을 조절하는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 전사조절인자 또는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 DEMETER 프로모터의 활성을 조절하는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 전사조절인자를 제공한다.

본 발명의 서열번호 2의 염기서열은 TCTCTCTATCTCT의 염기서열로 이루어져 있으며, 서열번호 3의 염기서열은 TCATTTATTGCATTT의 염기서열로 이루어져 있다.

본 발명의 전사조절인자는 서열번호 2 또는 3으로 표시되는 염기서열뿐만 아니라 상기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상동체는 염기서열은 변화되지만, 서열번호 2 또는 3의 염기서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기서열이다. 구체적으로, 상기 서열은 서열번호 2 또는 3의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열 (추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제 (즉, 갭)를 포함할 수 있다.

용어 '전사조절인자'는 전사인자 중에 전사조절에 관여하는 것으로, 전사조절인자는 전사조절을 담당하고, 유전자 특이적으로 존재하는 전사조절배열(상류조절배열, 증폭자)로의 결합을 매개로 하여 전사반응을 촉진 또는 억제한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열과 서열번호 2의 염기서열을 포함하는, 포자체형 조직(sporophytic tissue) 특이적으로 외래 유전자의 발현을 유도하는 유전자 또는 서열번호 1의 염기서열과 서열번호 3의 염기서열을 포함하는, 중심 세포(central cell) 특이적으로 외래 유전자의 발현을 유도하는 유전자를 제공한다.

본 발명의 상기 포자체형 조직 또는 중심 세포 특이적으로 외래 유전자의 발현을 유도하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프로모터 서열과 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 상기 프로모터의 조직 특이적 전사 활성을 조절하는 전사조절인자로 구성되어 있다.

본 발명의 상기 전사조절인자는 시스-조절 인자로, 용어 '시스-조절 인자(cis-regulatory element)' 또는 시스 인자는 DNA 상의 조절 영역을 의미하며, 전사 제어 인자(트랜스 인자)나 RNA 중합효소의 표적이 되는 조절 염기배열을 의미한다. 본 발명의 시스-조절 인자는 프로모터의 전사 활성을 식물체의 조직 특이적으로 조절할 수 있는 특징이 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기서열은 서열번호 1의 염기서열 하류(downstrem)에 위치할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "포자체형 조직(sporophytic tissue)"은 화분이 생산된 포자체(2n 상태의 접합체)의 유전자형에 의해 지배되는 조직으로서, 본 발명에서 포자체형 조직은 발아 후의 유식물, 줄기 생장점 또는 암술 등의 식물체 조직을 뜻할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "특이적"은 프로모터의 발현 활성이 동일한 식물체 내의 적어도 하나 이상의 다른 조직보다 특정한 조직 내에서 더 높다는 것을 의미한다. 프로모터의 발현 활성의 수준은 일반적으로 사용되는 방법을 이용하여 미리 측정된 조직 내에서의 프로모터의 발현수준을 다른 조직 내에서의 것과 비교함으로써 평가된다. 일반적으로 프로모터의 발현수준은 프로모터의 조절 하에서 발현된 유전자 생성물, 예를 들어 단백질 및 RNA 등의 생성량에 의해 측정될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 1의 염기서열과 서열번호 2의 염기서열을 포함하는, 포자체형 조직 특이적으로 외래 유전자의 발현을 유도하는 유전자 또는 서열번호 1의 염기서열과 서열번호 3의 염기서열을 포함하는, 중심 세포 특이적으로 외래 유전자의 발현을 유도하는 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 식물체 포자체형 조직 또는 중심 세포 특이적 발현 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적(transient) 발현 벡터 및 외래 유전자를 도입한 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 이용될 수 있는 바이너리 벡터는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 Ti 플라스미드와 함께 존재시 식물체를 형질전환시킬 수 있는 T-DNA의 RB(right border)과 LB(left border)을 함유하는 어떤 바이너리 벡터도 될 수 있으나, 바람직하게는 당업계에서 자주 사용되는 pBI101(Cat#: 6018-1, Clontech, 미국), pBIN19(Genbank 수탁번호 U09365), pBI121, pCAMBIA 벡터 등을 사용하는 것이 좋다. 본 발명에 따른 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래 될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 식물 발현 벡터에서, 상기 식물 발현 벡터는 본 발명의 프로모터의 하류(downstream)에 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 작동가능하게 연결시켜 제조된 것일 수 있다. 본 발명에서, "작동가능하게 연결된"은 이종 단백질을 발현하기 위한 단위로서 기능하는 발현 카세트의 성분을 말한다. 예를 들면, 단백질을 코딩하는 이종 DNA에 작동가능하게 연결된 프로모터는 이종 DNA에 해당하는 기능적 mRNA의 생산을 촉진한다.

상기 목적 단백질은, 모든 종류의 단백질일 수 있으며, 예컨대 식물체의 배발생 과정 또는 종자 발달에 관여하는 유전자 등 육종학적 활용성이 있거나, 효소, 호르몬, 항체, 사이토카인 등의 의학적 활용성이 있거나, 사람을 포함한 동물의 건강을 증진시킬 수 있는 영양성분을 다량 축적할 수 있는 단백질 및 셀룰로오스를 분해할 수 있는 효소 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 본 발명의 식물체 포자체형 조직 또는 중심 세포 특이적 식물 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 상기 숙주세포는 대장균(E. coli), 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 식물세포 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은

상기 본 발명의 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터에 외래 유전자를 재조합하여 식물 세포에 형질전환시키는 단계; 및

상기 형질전환된 식물 세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 식물체의 포자체형 조직 도는 중심 세포 특이적으로 외래 유전자를 발현하는 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 식물 발현 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미 주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 식물체의 포자체형 조직 또는 중심 세포 특이적 식물 발현 벡터에 재조합된 상기 외래 유전자는 식물체의 포자체형 조직 또는 중심 세포에서 발현을 원하는 어떤 유전자도 될 수 있으며, 본 발명의 식물체 포자체형 조직 또는 중심 세포 특이적 발현 벡터에서 상기 프로모터의 뒤에 위치하며 필요에 따라 리포터 유전자와 융합되어 발현될 수도 있다. 상기 재조합된 식물체의 포자체형 조직 또는 중심 세포 특이적 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같이 실시할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 포자체형 조직 또는 중심 세포에 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

본 발명의 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알팔파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료 작물류일 수 있다. 바람직하게는 상기 식물체는 애기장대, 감자, 고구마, 토마토, 사과나무, 복숭아, 클로버, 당근, 명아주, 배추 및 콩으로 이루어진 군에서 선택되는 쌍자엽 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 식물체는 애기장대일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 유효성분으로 서열번호 1의 염기서열과 서열번호 2의 염기서열을 포함하는, 포자체형 조직(sporophytic tissue) 특이적으로 외래 유전자의 발현을 유도하기 위한 조성물 또는 유효성분으로 서열번호 1의 염기서열과 서열번호 3의 염기서열을 포함하는, 중심 세포(central cell) 특이적으로 외래 유전자의 발현을 유도하기 위한 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 1의 염기서열과 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 또는 유효성분으로 서열번호 1의 염기서열과 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하며, 상기 유전자 또는 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체에 포자체형 조직 또는 중심 세포 특이적으로 외래 유전자의 발현을 유도할 수 있는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

식물 재료 및 성장 조건

프로모터 분석을 위한 GUS 및 GFP 발현 분석에 사용된 식물체는 gl1 돌연변이를 가진 애기장대 콜롬비아 생태형(Arabidopsis thaliana Col-gl)이고 상기 식물체를 야생형으로 사용하였다. 상보성 실험(complementation test)에 사용된 식물체는 Col-gl 유전적 배경(background)의 dme -2 돌연변이체이다. dme -2 돌연변이체는 이전 연구에서 활성 태깅 돌연변이 라이브러리로부터 분리되었고, 이를 erecta 돌연변이를 가지고 있는 애기장대 랜즈버그 생태형(Arabidopsis thaliana Ler)과 5번 교배하였다. Ler 배경 dme -2 돌연변이체는 Col-gl dme -2와 달리 동형접합체(homozygote) 돌연변이체가 존재한다. CS857766, SALK -036171 대립형질은 애기장대 생물자원센터(Arabidopsis Biological Resource Center, 미국)로부터 구입하였다. 애기장대 식물체는 22℃ 온도, 60% 상대습도 및 백색형광등(100 dic con²/s) 아래에서 장일(16시간 명/8시간 암)의 광주기 조건으로 키웠다.

5'- RACE ( rapid amplification of cDNA ends ) 분석

RACE 분석에 사용된 총 RNA는 애기장대 Col-gl 식물체의 꽃차례(DAG 30)에서 RNAqueous^TM(Ambion, 미국)을 사용하여 추출하였고, RNase-free DNase (TaKaRa Bio, 일본) 처리 후에 5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, 버전 2.0 (Invitrogen, 미국) 키트를 이용하여 내생의 DME와 이식 유전자의 전사체를 분석하였다. 얻어진 5'-RACE 결과물을 pGEM-T Easy vector system (Promega, 미국)을 이용하여 서브클로닝 하였으며, 서울대학교 농생명과학공동기기원에서 시퀀싱 분석을 수행하였다.

유전자 발현 분석

유전자 발현 분석에 사용된 총 RNA는 애기장대 Col-gl 식물체의 유식물(DAG12), 로제트(DAG30), 경생(cauline, DAG30), 줄기(DAG30), 꽃차례(DAG30), 약(화아(floral) 단계 9, 10, 11 및 12)에서 RNAqueous^TM(Ambion, 미국)을 사용하여 추출하였고, RNase-free DNase (TaKaRa Bio, 일본) 처리 후에 3㎍의 RNA와 올리고-dT 프라이머 및 M-MLV 역전사효소(Ambion, 미국)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 정량적 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(quantitative real-time RT-PCR)은 CFX96(Bio-Rad, 미국) 장비와 iQ SYBR Green Supermix(Bio-rad) 시약을 사용하여 수행하였고, CFX manager(Bio-Rad) 프로그램을 사용하여 결과를 분석하였다. 상대적인 전사체 수준은 Actin1, Actin3, Actin12 유전자의 발현 수준으로 표준화하여 계산하였다.

재조합 플라스미드 구축

DME : GUS , DME : GFP를 제작하기 위해 DME 유전자 gDNA의 5' 일부분(2.0kb)과 5' 상위 부위(2.3kb)를 포함하는 4.3kb 조각을 pBI101, pBI-GFP(S65T) 벡터로 클로닝하였다. 조절 시스 인자(regulatory cis-element)의 분석을 위해, 5' 상위 부위의 길이를 줄여가며 일련의 DME : GUS 라인들을 pBI101.1 벡터로 클로닝하였다. 그리고 시스 인자의 위치와 기능을 좀 더 명확히 하기 위해 pDW137 벡터를 이용하여 TU:GUS 라인들을 제작하였다. 상기의 이식 유전자들은 Col-gl 야생형 식물체 내로 직접적으로 형질전환 하였다. 제한된 DNA 서열의 발현의 상보성을 확인하기 위해 첫 두 인트론을 포함하고 있는 DME 유전자의 cDNA 전체 부위 (6.7kb)에 5' 상위 부위(2.3kb)를 포함하고 있는 또는 포함하지 않는 두 개의 재조합 플라스미드를 pBI-GFP(S65T)로 제작하였다. 이 두 이식 유전자들은 DME / dme -2 이형접합성 식물체 내로 직접적으로 형질전환 하였다.

GUS , GFP 발현 분석 및 화분 DAPI 분석

모든 GUS 도입 식물체의 GUS(β-Glucuronidase) 발현분석은 GUS 염색 버퍼(50mM NaPO₄ (pH 7.0), 1mM X-Gluc, 1mM K₃Fe(CN)₆, 1mM K₄Fe(CN)₆)를 이용하여 37℃에서 16시간 반응시킨 후, 시료를 Axio Imager A1 현미경(Carl Zeiss, 독일)으로 관찰하였다. DAPI 염색은 꽃눈으로부터 떼어낸 수술(stamen)을 수집하여 1㎍/㎖ DAPI 염색 용액(/PBS)을 사용하여 염색하였고, GFP를 발현하는 식물체의 배우체와 DAPI 염색 화분 샘플들은 LSM700(Carl Zeiss, 독일) 공초점 레이저 현미경을 사용하여 관찰하였다.

종자 세트 분석

입체경에서 장각과(DAP 14-16)를 분석하였고, 정상적인 종자의 수, 퇴화된 종자의 수를 계산하였다.

실시예 1. DEMETER 유전자의 전사 시작 지점( TSS ) 재논의

이전의 연구에서 DEMETER(이하 DME) 유전자는 두 개의 선택가능한 스플라이싱 변이체를 가진 것으로 보고되었다(Choi et al., 2002, Cell, 110:33-42). 그 중 긴 전사체인 At5g04560 .1은 첫 번째 383bp 길이의 인트론을 전사 시작 지점(TSS, transcription start site) 근처에 가지고 있으며, 더 짧은 At5g04560 .2 전사체로 스플라이싱된다(도 1A). 꽃눈으로부터 추출한 총 RNA와 GSP1 프라이머(5'-GGTTTTTTGGGTGTAAATGG-3'; 서열번호 4)를 사용하여 5'-RACE(rapid amplification of cDNA ends) 분석을 수행한 결과, 두 전사체 중 짧은 길이의 At5g04560.2 전사체가 DME 유전자의 주요 형태임이 확인되었다(도 1B). 또한 At5g04560.2의 TSS에 관하여 상류(upstream) -610부터 -680까지의 뉴클레오타이드 사이에 다중의 TSS가 존재함을 확인하였다(도 1C). 많은 수의 5'-RACE 산물들이 At5g04560 .2의 TSS 상류 -638, -637 및 -636 지역 부근에서 확인되고, DME 유전자의 길고 짧은 각 전사체들 모두 검출되는 것을 고려하여, At5g04560 . 1와 At5g04560 .2의 기존 TSS 위치로부터 각각 상류 45bp와 53bp 위치인 시작 코돈 상류 -638 뉴클레오타이드 위치를 TSS로 새롭게 정의하였다.

실시예 2. DME 의 발현 양상 분석

DME 유전자의 5' 조절 부위의 범위를 정하기 위해서, DME 유전자의 게노믹 조각들에 의한 B-글루쿠로니다제(GUS, glucuronidase) 리포터 유전자의 발현 경향을 분석하였다. 프로모터 분석을 위한 레퍼런스 라인으로서, 2.3kb DME : GUS 구조 즉, DME 5' 측면 서열의 2.3kb와 638bp-길이 DME 5' UTR 및 GUS에 융합되어 있는 핵 위치 신호(NLS, nuclear localization signal)를 포함하는 아미노산 말단의 406개 아미노산의 1.9kb로 구성된 구조를 사용하였다. 이전의 보고와 일치하는, 강한 GUS 신호가 자성 배우체(female gametophyte)의 중심 세포 핵 뿐만 아니라 영양 조직 예를 들면, 경정분열조직(SAM, shoot apical meristem), 잎원기(leaf primordial), 어린 잎 및 근단 등에서 검출되었다(도 2). 이러한 조직들은 비록 영양 조직에서 DME 단백질의 기능이 밝혀지지 않았지만, 주로 활발하게 증식하는 세포를 포함하는 특징이 있다.

최근, DME 전사체가 정세포(sperm)의 핵에서는 검출되지 않았으나, 화분립(pollen grain)에서는 확인이 되었고, 이러한 결과는 DME 유전자가 웅성 배우체(male gametophyte)의 영양 세포에서 발현되고 있음을 시사했다. 하지만, 본 발명의 리포터 구조는 성숙한 화분립에서는 어떠한 활성도 보이지 않았고, 아마 DME 유전자가 화분 발달 동안 일시적으로만 발현하는 것으로 판단되었다. 이를 검사하기 위해, 소포자 단계부터 삼세포성 성숙 단계까지 GUS의 발현을 확인하였고, GUS 신호가 삼세포성 화분에서는 검출되지 않고, 단지 후기 이세포성 화분의 영양핵에서만 검출되는 것을 발견하였다(도 3A 및 3B). GUS 발현 결과와 일치하게, DME : GFP도 이세포성 단계의 영양핵에서만 GFP 활성이 확인되었고, 생식핵 및 성숙 화분에서는 확인되지 않았다(도 3C). 웅성 배우체 발달 동안에 상대적인 DME RNA의 발현수준을 알아보기 위해서, 시료를 꽃밥의 모계 조직에서 GUS 신호가 검출되지 않는 4가지 다른 단계로 구분하였다. DME 전사체의 발현 수준을 확인하기 위해, 정방향 프라이머(5'-CAGAAGTGTGGAGGGAAAGCGTCTGGC-3'; 서열번호 5) 및 역방향 프라이머(5'-GCAATGCGTTTGCTTTCTTCCAGTCATCT-3'; 서열번호 6)를 사용하여 정량적 역전사 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)을 수행하였고, 전사체 발현양의 표준화는 액틴 유전자의 발현양을 사용하였다. 그 결과, 이세포성 화분 단계가 삼세포성 또는 성숙 화분 단계에서보다 높은 수준의 DME RNA를 보여주었고(도 4A), 이는 DME 유전자가 단지 후기 이세포성 화분의 영양핵에서만 일시적으로 발현한다는 것을 확인시켰다(도 3C). 흥미롭게도 이세포성 화분의 DME 전사체의 양이 배주에서의 DME 전사체 양보다 훨씬 적게 확인되었다(도 4B).

실시예 3. 포자체형 조직( sporophytic tissue ) 및 중심 세포에서 DME 유전자의 발현 조절을 위한 시스 - 조절인자 분석

DME 유전자의 발현을 위한 시스-조절인자(cis-regulatory element)를 확인하기 위해서, 체계적인 DME 프로모터 결손 구조를 만들었다. DME 전사 시작 지점(TSS)의 서열 -2.3kb부터 +473까지 일련의 5' 결손을 유도하였다(도 5A). 놀랍게도, 0.5kb DME : GUS 구조와 +7bp DME : GUS 구조를 이용한 형질전환 식물체는 2.3kb DME : GUS 레퍼런스 구조로 형질전환시킨 식물체와 발현 경향이 동일하게 확인되었다(도 6A-D). 이 결과는 대부분의 다른 유전자들과는 달리, TSS의 DME 5' 측면 서열 상류와 하위로 +6까지의 서열은 DME 발현에 있어서 불필요한 것임을 의미했다. 또한, 생식 및 영양 조직에서 DME 발현을 지배하는 프로모터 활성 및 시스-조절인자들이 전사 단위 내에 있음을 의미했다.

+20 DME :: GUS 형질전환 식물체는 다른 포자체형 조직에서는 발현되지 않고, 중심 세포의 핵에서만 GUS가 발현되는 것이 관찰되었고(도 6E-H), 이는 +7부터 +20까지의 서열이 포자체형 조직에서 DME의 발현에 관여함을 시사했다. +33 DME :: GUS와 +46 DME :: GUS 형질전환 식물체에서 GUS의 발현 경향은 +20 DME :: GUS 형질전환 식물체와 같았다(도 6E-H). +395 DME :: GUS 형질전환 식물체는 오직 중심 세포에서만 GUS 활성을 나타내었다. 하지만, GUS 신호의 강도는 +20 DME :: GUS, +33 DME :: GUS 및 +46 DME :: GUS 형질전환 식물체보다 감소되었고, 이는 +46부터 +395 사이의 서열이, 최소한 부분적으로, 중심 세포에서 DME 발현을 위한 시스-인자를 포함하고 있는 것을 의미한다. 리포터 구조가 +473 이하부터 절단되었을 때, 어떠한 조직 및 세포에서도 GUS 발현을 확인할 수 없었고(도 6I-L), 이 결과는 중심 세포에서 질적인 발현 및/또는 일반적인 전사를 위한 시스-인자가 +395와 +472 사이에 존재함을 설명한다.

결손 구조를 가진 형질전환 식물체의 배주에서 중심 세포의 GUS 발현 비율을 비교하기 위해서, 우리는 야생형 식물체를 형질전환 식물체에 교배한 후 항생제 저항성을 이용하여 반접합성(hemizygous) 식물체를 선별하였고, 중심 세포 핵에서 GUS가 발현하는 배주의 수를 계산하였다. 발현 비율은 5'-UTR이 연속적으로 결손됨에 따라 감소하는 것으로 확인되었다(도 7). +46 DME :: GUS 부터 +395 DME :: GUS 식물체까지 GUS 발현의 뚜렷한 감소가 확인되었다. 이 결과는 인핸서 유사 요소 또는 일반적인 전사 요소가 최소한 부분적으로, +46에서 +394 사이의 서열에 존재함을 의미한다. +473 DME :: GUS 식물체부터는 중심 세포에서 GUS의 발현이 어떠한 배주에서도 확인되지 않았으며, +395와 +472 사이 서열에 중심 세포에서 DME 발현을 위한 요소의 존재를 더 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명에서는 +83부터 하위의 서열을 삭제하고 GUS 유전자를 바로 융합한 2.3kb의 Pro DME :: GUS 구조의 형질전환 식물체를 제조하였다. 전술한 결과들을 기반으로, 중심 세포에서의 발현이 아닌 포자체에서의 발현을 위한 시스-요소가 상기 2.3kb Pro DME :: GUS 구조 내에 함유되어 있는 것으로 판단되었다. 그와 일치하게, 2.3kb의 Pro DME :: GUS 구조의 형질전환 식물체에서 GUS 발현이 비록 강도는 감소되었지만 포자체형 조직에서의 발현은 검출되었고(도 6M-P), 성숙 배주의 중심 세포에서는 GUS 발현이 검출되지 않았다(도 6P, 화살표). 흥미롭게도, 강한 이소성(ectopic)의 GUS 활성이 성숙한 자성 배우체의 주공극(micropylar)의 끝에서 관찰되었다(도 6P, 화살표머리). 2.3kb Pro DME :: GUS 구조의 형질전환 식물체에서 GUS 발현은 자성 배우자형성 과정 동안 조세포(synergid cell)에서 매우 일시적으로 확인되었고, GUS 신호는 정상적으로는 성숙한 배주의 조세포에서는 관찰되지 않았다. 성숙한 배낭(embryo sac)의 조세포에서 DME 발현의 안정적인 억제를 위한 시스-인자들은 상기 구조 내에는 빠진 것으로 사료되며, 2.3kb Pro DME :: GUS 구조 내에 핵 위치 신호의 부재로 인해, 조세포의 세포질이 염색된 것으로 생각되었다. 그리고 본 발명은 +647로부터 +1363까지의 내부 게노믹 서열이 결손된 2.3kb Δ5' DME :: GUS 구조를 제조하였다. 2.3kb Δ5' DME :: GUS 식물체의 GUS 염색 경향은 변화되지 않았고, 이는 +647부터 +1363까지의 서열이 DME 발현에 있어서 불필요함을 보여주었다(도 6A-D).

요약하면, 두 개의 구분되는 모티프가 DME 발현을 조절하는데, 하나는 포자체형 조직에서의 발현을 위한 +7과 +19 사이의 서열이고, 다른 하나는 자성 배우자의 중심 세포에서의 발현을 위한 +395와 +472 사이의 서열이다. 또한, +46부터 +394까지의 서열은 포자체형 조직 뿐만 아니라 중심 세포에서도 잠재적인 전사 인핸서 활성을 가지고 있는 부위이다.

상기 추정상의 DME 조절 부위를 더욱 좁히기 위해, 본 발명에서는 5'-UTR의 순차적인 절단(TU, truncated) 구조를 고안하였다. DME 번역 시작 코돈이 +639 위치인 것을 고려하여, 먼저 전사 시작 지점(TSS)의 90bp 상류(-90)부터 658bp 하류(+658)까지를 포함하고 GUS에 융합된 구조를 제작하였다. 이 구조를 TU0로 명시하였고, TU0 구조는 상기에서 찾은 모든 조절 인자들을 포함하는 구조이다(도 5B). TU0 조각을 두 개의 다른 GUS 포함 벡터, pBI101.1과 pDW137로 라이게이션시켜 벡터 효율을 확인하였다. 두 벡터로 형질전환시킨 식물체는 TU0 구조에 핵 위치 신호(NLS)가 결여되어 있기 때문에 세포질에서 GUS가 발현되는 것을 제외하고는, 2.3kb DME :: GUS 구조와 같은 발현 양상을 보였다(도 8).

추가로 TU0의 5' 말단 및 3' 말단으로부터 점진적으로 절단된 일련의 리포터 구조를 고안하였고(도 5B), 이러한 구조 가운데, TU12(-90/+259) 및 TU13(-90/+415)은 포자체에서 DME 발현의 조절 부위(+7/+19)를 포함하고, 중심 세포에서 DME 발현의 조절 요소(+395/+472)는 포함하지 않는 것으로 확인되었다. 그래서, TU12 및 TU13 구조의 형질전환 식물체는 단지 포자체형 조직에서만 GUS 발현이 확인되었다(도 8). 그러나, TU12 식물체에서의 GUS 활성은 TU13 식물체에 비해 약하고, 경정분열조직(SAM) 및 근단에 제한적으로 GUS 활성이 확인되었다. 이를 통해 +259와 +415 사이 서열 부위는 포자체에서 DME의 발현을 위한 추정상의 정량적인 조절 인자를 포함할 수 있음이 확인되었다. 또 다른 리포터 구조인 TU14(-90/+559)는 포자체를 위한 조절 인자(+7/+19)와 중심 세포를 위한 조절 인자(+395/+472)를 모두 포함하는 구조로, TU14 형질전환 식물체는 중심 세포에서 강한 GUS 발현을 나타내었다. 하지만, TU13 식물체보다 약한 포자체형 조직에서의 GUS 발현을 나타내었다(도 8). 그 외, TU23(+46/+415) 형질전환 식물체가 어떠한 조직에서도 GUS 발현을 보이지 않았고, TU24(+46/+559) 식물체는 중심 세포에서만 GUS 활성을 보여주었다(도 8). 이상의 결과는 +416와 +559 사이의 단편은 중심 세포에서 DME의 발현을 위한 조절 인자들을 포함하고 있는 것을 나타낸다. 도 8의 결과들을 토대로 중심 세포를 위한 조절 인자가 +395와 +472 사이임을 확인하였고, 중심 세포에서 DME의 발현을 조절하는 인자의 위치를 +416과 +472 사이로 좁혔다.

TU25, TU34, TU35 및 TU45 이식 유전자들은 중심 세포에서 DME 발현을 위한 시스-조절 인자(+416/472)를 포함하고 있고, 포자체를 위한 조절 인자(+7/+19)는 포함하지 않으므로, 전술된 결과들과 일관되게 TU25, TU34, TU35 및 TU45 식물체에서는 GUS 활성을 오직 중심 세포에서만 관찰할 수 있었다(도 8). 흥미롭게도 TU45(+363/+658) 식물체에서 GUS 발현은 다른 식물체들과 비교하여 강도가 감소하였는데, 이는 +202와 +362 사이에 양적인 중심 세포에서의 DME 발현을 위한 조절 인자가 존재함을 의미했다.

TU0 이식 유전자와는 달리, TU23, TU24, TU25, TU34, TU35 및 TU45 이식 유전자는 DME 유전자의 전사 시작 지점(TSS) 서열을 가지고 있지 않다. 이식 유전자 전사체의 5' 말단을 확인하기 위해서, TU0, TU25 및 TU35 형질전환 식물체의 꽃차례(inflorescence)로부터 총 RNA를 추출하여 5'-RACE 분석을 수행하였다. 그 결과 온전한 DME의 5'-UTR을 포함하는 TU0 이식 유전자의 전사의 대부분은 내인성(endogenous) DME 유전자와 유사한 위치에서 시작하였다(도 9). 놀랍게도, TU25 및 TU35 이식 유전자의 전사체는 내인성 DME의 TSS가 위치할 것으로 추정되는 위치 근처의 벡터 서열에서 전사가 시작되었다(도 9). 일시적인 스플라이싱 또한 TU35 이식 유전자의 DME의 첫 번째 인트론의 3' 말단과 벡터 사이에서 발생하였다(도 9).

포자체형 조직과 중심 세포에서 DME의 발현을 위한 두 개의 시스-조절 인자의 추가 확인을 위해서, TU0 구조로부터 포자체형 조직과 중심 세포를 위한 인자를 각각 제거한 TU0 _Δ VG(Δ+7/+45)와 TU0 _Δ CC(Δ+416/+462) 두 이식 유전자를 제작하였다. 결과적으로, TU0 _Δ VG 형질전환 식물체는 중심 세포에서만 GUS 활성을 나타내었고(도 10A-C), TU0 _Δ CC 형질전환 식물체는 포자체형 조직에서만 GUS 활성을 나타내었다(도 10E-G). 중심 세포에 있어서 DME 발현의 시스-조절 인자를 좁히기 위해서, TU0 _Δ CC1(Δ+416/+431), TU0 _Δ CC2(+432/+447) 및 TU0 _Δ CC3(Δ+448/+462) 구조를 추가로 제작하였다. 중심 세포에서 GUS의 활성은 TU0 _Δ CC1와 TU0_Δ CC2 식물체에서는 확인되었지만, TU0 _Δ CC3 식물체에서는 확인되지 않았다(도 10S). 이 결과는 중심 세포에서의 DME 발현을 위한 시스-조절 인자가 +448과 +462 사이에 위치함을 확인해주었다.

본 발명의 상기 다양한 리포터 구조 제작에 사용된 PCR용 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.

이름	서열정보(5'→3')(서열번호)	이름	서열정보(5'→3')(서열번호)
CAR	TGTGATTGTGATTGTGTGTGTGTGTGGTGAGATGAAGAAGGA (7)	+219 BamHI	GGATCCGATCAGAAAACAGGAACATG (30)
CAF	CACACACACAATCACAATCACAAACGGCATAGCTGACTCAGT (8)	+1 HindⅢ	AAGCTTGTTCTCCGGCATTGACTCGC (31)
ATR	ATATATATATATATATATATATTGTGGTGAGATGAAGAAGGA (9)	+219 PstI	CTGCAGGATCAGAAAACAGGAACATG (32)
ATF	ATATATATATATATATATATATAACGGCATAGCTGACTCAGT (10)	+156 XbaI	TCTAGATCACGAGAAGAATCACTGGG (33)
CC_REPEAT_F1	TTTTGTTGATGAGAAAAATA (11)	+369 BamHI	GGATCCGAGAAACACATTGAATAGCG (34)
CC_REPEAT_R1	CTGCACCATAAAATGCAATA (12)	+156 HindⅢ	AAGCTTTCACGAGAAGAATCACTGGG (35)
CC_REPEAT_F2	TATGGTGCAGTTTTGTTGATGAGAAAAATA (13)	+369 PstI	CTGCAGGAGAAACACATTGAATAGCG (36)
CC_REPEAT_R2	ATCAACAAAACTGCACCATAAAATGCAATA (14)	+318 XbaI	TCTAGACTTCTTTTACCGTTTCCAGC (37)
+1922_BamHI	GCGGATCCAGACTCAGAGTCACCTTGCC (15)	+514 BamHI	GGATCCCTCTCTCCAAACACCAAAAC (38)
+1901_BamHI	GCGGATCCCGCATCTCCAGGATTCTCCA (16)	+318 HindⅢ	AAGCTTCTTCTTTTACCGTTTCCAGC (39)
-2282_XbaI	GCTCTAGAGATCACAAAATCTTTCCTTT (17)	+514 PstI	CTGCAGCTCTCTCCAAACACCAAAAC (40)
-2248_XbaI	GCTCTAGAGGGAGTTCAACTCTCTCTCC (18)	+436 XbaI	TCTAGATAATGTCGCCTTCTCTAACC (41)
+417_CCF	GTGTTTCTCGTATGGTGCAGATTCTTAGTT (19)	+614 BamHI	GGATCCGGATCAGCCCTCGAATTC (42)
+370_CCR	CTGCACCATACGAGAAACACATTGAATAGC (20)	+436 HindⅢ	AAGCTTTAATGTCGCCTTCTCTAACC (43)
-40_VGR	GCCGGAGAACGAGTGTGGTGAGATGAAGAA (21)	+616 Pst1	CTGCAGCCGGATCAGCCCTCGAATTC (44)
+1_VGF	CACCACACTCGTTCTCCGGCATTGACTCGC (22)	TU0_dHD_F	CTGACAAAAAATCCGGCCGGGCATTTTATGGTGCAG (45)
SphI -26 DME	CGCGCATGCATCTCTAACGGCATAGCTGA (23)	TU0_dHD_R	CTGCACCATAAAATGCCCGGCCGGATTTTTTGTCAG (46)
SphI -13 DME	CGCGCATGCTAGCTGACTCAGTGTTCTCC (24)	CC1F	GTGTTTCTCGAATATCTGACAAAAAATCAT (47)
-135 XbaI	TCTAGAGCAACAACGTCCTCGTGAA (25)	CC1R	GTCAGATATTCGAGAAACACATTGAATAGC (48)
+62 BamHI	GGATCCATGGAGCTAAAAGCTCACCG (26)	CC2F	TGATGAGAAATCATTTATTGCATTTTATGG (49)
-135 HindⅢ	AAGCTTGCAACAACGTCCTCGTGAA (27)	CC2R	CAATAAATGATTTCTCATCAACAAAACGAG (50)
+62 PstI	CTGCAGATGGAGCTAAAAGCTCACCG (28)	CC3F	TGACAAAAAATATGGTGCAGATTCTTAGTT (51)
+1 XbaI	TCTAGAGTTCTCCGGCATTGACTCGC (29)	CC3R	CTGCACCATATTTTTTGTCAGATATTTTTC (52)

실시예 4. 시스 -조절 인자 단편들의 유전자 발현 유도 활성 분석

포자체형 조직과 중심 세포에 있어서, 포자체형 조직을 위한 조절 인자(+7/+19)와 중심 세포를 위한 조절 인자(+448/+462)가 GUS 리포터와 융합된 CaMV 35S 유전자의 최소의 프로모터에서 활성을 유도할 수 있는지를 확인하기 위해, 3' 말단에 GUS 서열을 가진 35S 최소 프로모터의 앞 또는 뒤에 TU0 하위 단편들(TU1~TU5)을 가진 일련의 리포터 유전자를 제작하였다(도 11). 포자체형 조직을 위한 조절 인자와 중심 세포를 위한 조절 인자를 가지는 구조에서조차 GUS 발현을 확인할 수 없었다. 이는 이종 기원의(heterologous) 계(system)에 있어서 하위 단편들에 있는 DME 발현을 위해 필수적인 인자들이 GUS 리포터의 발현에 충분하지 않다는 것을 의미한다.

또한 +416와 +472 사이의 중심 세포를 위한 조절 인자가 이종 기원의 계에서 그들이 하나 내지 네 카피로 종렬중복(tandem repeat) 내에 35S 최소 프로모터와 함께 또는 그렇지 않게 존재할 때에 중앙 세포에 있어서 GUS의 발현을 확인하였다. 이식 유전자의 형질전환 식물체 모두가 어떠한 조직에서도 GUS를 발현하지 않았고, 이 결과는 +416에서 +472까지의 단편이 중심 세포에서 DME 발현에 필요하긴 하지만 +416에서 +472까지의 단편만으로는 DME 발현을 유도하기에는 충분하지 않다는 것을 의미한다.

실시예 5. 전사 개시 지점( TSS )의 하류에 의해 유도된 DME 발현의 dme -2 매개 종자 유산( abortion ) 상보성 분석

이전의 연구는 dme 이형접합성 식물체에서 부계 대립형질 유전자가 종자 생존에 불필요한 데 반해, dme 돌연변이 대립형질의 유전은 50% 종자 유산을 유발한다는 것을 보고하였다. dme-2는 강한 무효(null) 대립형질이기 때문에, d me-2 동형접합성 식물체는 얻을 수가 없다. 이에 이식 유전자를 발현하는 중심 세포의 DME cDNA가 dme-2 돌연변이 대립형질을 보완할 수 있다면, dme-2 동형접합성 식물체를 얻을 수 있을 것으로 가정하고, 상기 가능성을 확인하기 위해서 이형접합성 dme-2 식물체내로 첫 번째 및 두 번째 인트론과 함께 2.3kb 상류 서열을 가진 DME cDNA(2.3kb cDME)를 도입하였다(도 12). 그리고 항생제 저항 비율에 따라 2.3kb cDME 이식 유전자 단일 카피를 가진 이형접합성 dme-2 돌연변이를 선별하였다. dme-2/DME;2.3kb cDME/- 유전자형의 식물체들은 dme-2 이협접합성 식물체들의 50.5% 종자 유산율(n=287)과 비교하여 감소된 29.9%의 종자 유산율(n=491)을 보여주었다. 이는 cDME가 모계 dme-2 대립형질에 의해 유발되는 종자 유산 표현형을 보완할 수 있음을 의미한다(표 2). 그들의 자손에서, 유전자형 분석을 토대로 2.3kb cDME 이식 유전자의 반접합성 또는 동형접합성을 가진 dme-2/dme-2 동형접합성의 식물체를 얻을 수 있었다. 그들의 종자 유산 비율은 각각 47.8% 및 2.2%로 확인되었다.

dme 돌연변이체에서 종자 유산 표현형에 대한 DME cDNA(cDME)의 상보성 분석

유전자형	생존한 종자	유산된 종자	종자 유산 비율(%)
Col-gl	374	0	0
2.3kb cDME/-:dme-2/DMEF1	344	147	29.9±5.9
+46 cDME/-:dme-2/DMEF1	324	132	28.9±5.2
dme-2/DME	142	145	50.5±9.5

그 후, 본 발명에서는 이형접합성 dme -2 돌연변이 식물체 내로 +46 cDME를 도입하였다(도 12). 중심 세포에서의 GUS 발현 경향과 일치하게(도 6E-H), dme-2/DME;+46 cDME/- 형질전환 식물체는 50.5%에서 28.9%로 감소된 종자 유산을 보여주었고(표 2), 이는 +46 서열의 하류(downstream)에 의해 유도되는 cDME 발현이 dme-2 종자 유산을 구제하는 것을 나타냈다. 이 결과는 +46 서열의 하류가 중심 세포에서 기능적인 cDME를 발현하기에 충분함을 나타내고, 요약하면, GUS 발현은 기능적인 수준에서 +46 DME :: GUS 이식 유전자로부터 기인함을 의미하였다.

dme-1 이형접합성 식물체는 영양 생장 동안에 명백한 발달상의 표현형은 없다. dme-1은 약한 대립형질이기 때문에, dme-1 대립형질로부터의 전사는 일부 영양 생장 동안에 DME의 결손을 감출 수 있다. +46 DME :: GUS 이식 유전자가 영양 조직에서는 발현하지 않고, 단지 중심 세포에서만 발현하는 것을 고려하면, dme-2/dme-2;+46 cDME/- 유전자형의 식물체에 있어서 영양 생장 동안에 발달상의 표현형을 관찰할 수 있을 것으로 예상하였다. 그러나, 어떠한 표현형적 결함도 관찰할 수 없었고, 이는 포자체형 조직에서 DME의 기능을 명확히 규정하기가 어려움을 뜻했다.

실시예 6. DME 5' 측면 부위의 T- DNA 돌연변이에 의한 내인성 DME 발현 양상 분석

DME 프로모터 분석의 연구는 DME 기능을 위해 요구되는 시스-조절 인자가 DME 자체의 전사 시작 지점(TSS) 하류에 존재함을 밝혔다. 만약 그것이 사실이라면, DME의 5' 측면 서열에 T-DNA 삽입에 의한 파괴는 DME 발현 및 기능에 영향을 미치지 않을 것으로 생각됐다. 이를 증명하기 위해서, 우리는 애기장대 생물자원센터(ABRC, Arabidosis Biological Resource Center)로부터 TSS의 72bp 상류에 T-DNA가 삽입된 CS857766 돌연변이체와 TSS의 25bp 상류에 T-DNA가 삽입된 SALK -036171 돌연변이체를 얻었다(도 13A). 상기 식물체에서는 어떠한 결함도 관찰할 수 없었고, 두 식물체의 계통으로부터 동형접합성의 돌연변이 식물체를 얻어 종자 유산 비율을 분석하였다(표 3). 새로 얻은 두 동형접합성의 돌연변이체는 dme -2 이형접합성의 돌연변이 식물체와는 다르게 종자 유산 표현형을 확인할 수 없었다.

유전자형	생존한 종자	유산된 종자	종자 유산 비율(%)
Col(gl)	374	0	0
CS857766/-	321	1	ND
SALK036171/-	348	1	ND
dme-2/+	181	185	50.5±9.5

또한 CS857766 식물체와 SALK -036171 식물체에서 DME 유전자의 발현 수준을 확인한 결과, 두 돌연변이 식물체는 야생형 식물체와 유사한 수준으로 DME 유전자를 발현하고 있는 것으로 확인되었다(도 13B 및 13C). 종합하면, 이러한 결과들은 TSS의 5' 측면 부위 상류 부위는 DME 발현에 불필요하고 DME 유전자는 TSS의 하류에 위치하는 서열에 의해 그 발현이 조절됨을 의미했다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Transcriptional regulatory element which induces sporophytic tissue or central cell-specific expression of foreign gene in plant and uses thereof <130> PN13378 <160> 52 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2278 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 aaatagaaat gattgagcaa acctcaaaaa tgtcttctta ggatcacaaa atctttcctt 60 tagcttatta aagccgggag ttcaactctc tctcccttgt agactttttg ttttcaaatc 120 tttttctttc aaaaaatcaa taattagtta atgggcataa tatttggttt taattaagtc 180 catagatttt ttaggaccat ctctaatcac gacaaatatc ctaaattgta acacatttaa 240 aacttaaaag tattgcattc acaatcctta aaatatatat atatatatat atatatatat 300 atatatatat atatgaaagt tatatagaaa cgataactcc ttactcaaca attagcccaa 360 aaaaacatcc ataatgcatt taaactagga attttaacaa actcaaatag gttggtagtt 420 aaaaaaaaac aaatagtaga tgtacatacg tacctttaaa aatatatact catatcgaaa 480 gttttaaatt ttgcgaaatt aaatacattt atctatcaat taaaatacat ttaataatgc 540 ataattctgt aatatctatc tttaatttcc atatagaacc aaaacaaaat aaacatatca 600 aatagtttta acttaacaaa aacgttaggg aaaagttgac ctaactagct tgattgacgt 660 tgaacttgtc aatgcgaaag cgatatttcc aatatatact acatgtagta ttatttatat 720 ggaagtttct aaaaaggtgt tgagtggatt gttacttgtt ggaggatgct attttttcct 780 tcttgccata atattttacg agtatgggat aactacatac tcatgattat gaaacgctca 840 ctttatttga aaaacctcct aatacaccaa atatgtcact agattccaaa acgtagacca 900 attgtatcta atctcaaatt ctcaatcaaa gtattaattt accgatggta agaaaagtta 960 accgatataa ttatcaaaag aaagaataag tcaacagatt cttaatctct ttattttggt 1020 atatgaacat ttgtacaaaa atctcaaaag atatgtaact gtttaaaata taaattcact 1080 gagattaatt cttcagactc gtgttagcta taataatgtc aagagttctt cttgtttcaa 1140 ggaaaaacct taaagatatg tatattttct gtaattatga tgatataatt tgctattcat 1200 tgtcacaaac attactttaa aaaatcgtat tttcattact acaatgttga ctaagaacaa 1260 aaatacattg attattgata tatcgtcaac tgaattttct tccgagggat ataattctca 1320 aacatagcaa gaatctcata ataatgtttc gtgactacct ttagacgaaa tttttttaag 1380 attcgtaacg tgacttatgg tctcttgctg tgggggtcaa tgcgaataaa tctaaatgta 1440 tgggagtcaa ataaaatacc aagaaaaata aaggagcagc acccaataaa ctatatggga 1500 ccagaaatcc tttcattggt ttaaaatagg attatcccga aagatgaagg actaaattga 1560 aactgattgg gggtaggaag agatccgtca caatcattaa tggcttccac gcggaaactt 1620 gtcgtttata caatttcatt aactttcggg tcgggtttat attccaaatg ggtcaaataa 1680 tattagttta atacactaac ggagtaatta attggtgact acaattttat cagtttggtg 1740 caattagaaa cgaacatagt cgtaaaatac gagttcggtg ttataccttt atttacgtta 1800 aaaaaatacg agaattttgt gtcaaatttc aaattaattt catgaatata tggaaattat 1860 tagatactct agcgaaaata gtgattatga gcgttttaca aaaatacgat tttagcattg 1920 aacttccttt atgtaattcg gtcaaatgtt ggcatgaaga agcaagtttg caacattaaa 1980 tttcatttaa aaatcgtgtt gacatacttt aaaatctaaa tataggaaga agaccaaaac 2040 attaaattta gtaagattct aatgaacatt tataagttat aacttataac caacaaaagt 2100 tgggtttagc gttgttgctt tatctgaaaa cttgcaaact aaaccatttt aataggacta 2160 atgacaatta acaacaaaat acacttaagc aacaacgtcc tcgtgaatat aatttgggcc 2220 tcaggcccat attgctaacg ccaactgata tttcacttta ttccttcttc atctcacc 2278 <210> 2 <211> 13 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 tctctctatc tct 13 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 3 tcatttattg cattt 15 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggttttttgg gtgtaaatgg 20 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cagaagtgtg gagggaaagc gtctggc 27 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gcaatgcgtt tgctttcttc cagtcatct 29 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tgtgattgtg attgtgtgtg tgtgtggtga gatgaagaag ga 42 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cacacacaca atcacaatca caaacggcat agctgactca gt 42 <210> 9 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 atatatatat atatatatat attgtggtga gatgaagaag ga 42 <210> 10 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 atatatatat atatatatat ataacggcat agctgactca gt 42 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ttttgttgat gagaaaaata 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ctgcaccata aaatgcaata 20 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tatggtgcag ttttgttgat gagaaaaata 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 atcaacaaaa ctgcaccata aaatgcaata 30 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gcggatccag actcagagtc accttgcc 28 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gcggatcccg catctccagg attctcca 28 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gctctagaga tcacaaaatc tttccttt 28 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gctctagagg gagttcaact ctctctcc 28 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gtgtttctcg 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gcattttatg gtgcag 36 <210> 46 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 ctgcaccata aaatgcccgg ccggattttt tgtcag 36 <210> 47 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 gtgtttctcg aatatctgac aaaaaatcat 30 <210> 48 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 gtcagatatt cgagaaacac attgaatagc 30 <210> 49 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 tgatgagaaa tcatttattg cattttatgg 30 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 caataaatga tttctcatca acaaaacgag 30 <210> 51 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 tgacaaaaaa tatggtgcag attcttagtt 30 <210> 52 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 ctgcaccata ttttttgtca gatatttttc 30

Claims (12)

1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 DEMETER 프로모터의 활성을 조절하는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 전사조절인자.
2. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 DEMETER 프로모터의 활성을 조절하는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 전사조절인자.
3. 서열번호 1의 염기서열과 서열번호 2의 염기서열을 포함하는, 포자체형 조직(sporophytic tissue) 특이적으로 외래 유전자의 발현을 유도하는 유전자.
4. 서열번호 1의 염기서열과 서열번호 3의 염기서열을 포함하는, 중심 세포(central cell) 특이적으로 외래 유전자의 발현을 유도하는 유전자.
5. 제3항 또는 제4항의 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터.
6. 제5항의 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포.
7. 제5항의 재조합 식물 발현 벡터에 외래 유전자를 재조합하여 식물 세포에 형질전환시키는 단계; 및
   상기 형질전환된 식물 세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 식물체의 포자체형 조직 또는 중심 세포 특이적으로 외래 유전자를 발현하는 형질전환 식물체의 제조 방법.
8. 제7항의 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 포자체형 조직 또는 중심 세포 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체.
9. 제8항에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
10. 제8항의 형질전환 식물체의 형질전환된 종자.
11. 유효성분으로 서열번호 1의 염기서열과 서열번호 2의 염기서열을 포함하는, 포자체형 조직(sporophytic tissue) 특이적으로 외래 유전자의 발현을 유도하기 위한 조성물.
12. 유효성분으로 서열번호 1의 염기서열과 서열번호 3의 염기서열을 포함하는, 중심 세포(central cell) 특이적으로 외래 유전자의 발현을 유도하기 위한 조성물.

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