CN114026238A - 用于转化真菌孢子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于将多核苷酸分子引入真菌孢子的方法，其包括使真菌孢子和携带多核苷酸的磁性纳米粒子的混合物暴露于磁体和/或磁场。本发明还提供用于转化真菌的方法，其包括本文公开的方法步骤的步骤，并允许所述多核苷酸分子整合到所述孢子的基因组中，从而转化孢子。本发明还提供用于将核酸递送到真菌孢子的系统，其包含装载有核酸的磁性纳米粒子；用于利用多核苷酸转化真菌孢子的试剂盒，其包含装载有多核苷酸的MNP和真菌孢子；以及包含装载有核酸分子的MNP和真菌孢子的组合物。

Description

用于转化真菌孢子的方法
技术领域
本发明涉及真菌孢子的转化。
发明概述
真菌是优良的细胞工厂，在许多有用的复杂化合物的生产中有着广泛的应用。它们可以在简单廉价的培养基中快速生长。遗传转化技术允许对真菌基因组进行遗传修饰。由于真核生物真菌含有较大的基因组，因此可以用较大的构建体进行转化，其产物通常比来自细菌的产物更适合人类使用。真菌的转化不仅允许研究真菌的代谢，还允许插入新的遗传元件和修饰内源基因。因此，真菌的转化是开发用于生物技术方法的新的真菌菌株的关键步骤。对于至少在培养基中培养的所有真菌物种，应可能转化真菌(Fincham,Microbiol Rev.1989年3月；53(1):148–170)。
已知真菌遗传转化的许多一般方法，包括原生质体介导转化、农杆菌介导转化、电穿孔、生物射弹法和冲击波介导转化(Li,D.,Tang,Y.,Lin,J.等人，Microb Cell Fact 16,168(2017))
因此，尽管本领域已知许多真菌转化方法，但许多真菌难以用这些方法进行转化，并且这些方法通常耗时且不是非常有效。
鉴于上述情况，本发明提供用于转化真菌孢子的新组合物和新方法。
因此，本发明提供用于将多核苷酸分子引入真菌孢子的方法，其包括使真菌孢子和携带多核苷酸的磁性纳米粒子的混合物暴露于磁体和/或磁场。
此外，本发明提供用于将多核苷酸分子引入真菌孢子的方法，其包括以下步骤：
a.将要转移入孢子的多核苷酸分子装载在磁性纳米粒子(MNP)上，和
b.将装载在所述磁性纳米粒子上的所述多核苷酸分子(DNA-MNP)加至所述孢子，和
c.使混合物暴露于磁力，例如磁体和/或磁场，
d.在所述磁体存在下孵育混合物，以允许将多核苷酸分子引入所述孢子，
从而将多核苷酸分子引入所述孢子。
本发明还提供用于转化真菌的方法，其包括本文公开的方法步骤的步骤，并允许将所述多核苷酸分子整合入所述孢子的基因组，从而转化孢子。
本发明还提供用于将核酸递送到真菌孢子的包含装载有核酸的磁性纳米粒子的系统，以及用于利用多核苷酸转化真菌孢子的包含装载有多核苷酸的MNP和真菌孢子的试剂盒，以及包含装载有核酸分子的MNP和真菌孢子的组合物。
发明详述
将遗传物质递送入靶细胞是操纵或改变细胞中核酸活性的有力工具。在靶细胞中引入DNA的一种成熟方法是电穿孔法。如US2008075701中概述，电穿孔法有两个主要致命缺点：低递送率和低细胞存活率。
用于将遗传物质递送入靶细胞的一种相对较新的方法是磁转染。对于磁转染，将遗传物质装载在包被有阳离子分子的磁性纳米粒子(MNP)上。然后，在外部磁场的影响下，磁性颗粒-遗传物质复合物转运入细胞。许多报告已经证明，磁转染无毒、高效且多用途(US2008075701)。
在磁转染中，缀合的磁性纳米粒子(MNP)与靶分子(如核酸)结合，然后对分子结合的MNP施加磁场，故意将颗粒引入并浓缩到一个或多个靶细胞中。然后核酸可以通过多种不同的机制释放到细胞的细胞质中。
真菌具有复杂的生命周期，转化方法流程必须与每个新物种相适应，例如，它们的特定生命周期阶段、生长条件、细胞壁组成、环境等。例如，即使对于一个物种(如酿酒酵母(S.cerevisiae))的不同阶段，也已经开发了不同的转化流程。因此，取决于真菌种类，遗传物质通过原生质体介导转化、农杆菌介导转化、电穿孔、生物射弹法和冲击波介导转化等方法递送入例如整个细胞、分生孢子(conidiospores)、分生孢子(conidia)、孢子、原生质体、菌丝体等。效率通常非常低。
递送DNA至真菌孢子的报道并不多。
现已发现，包被带正电荷的聚合物的磁性纳米粒子(MNP)适用于真菌孢子，并为将多核苷酸引入非常独特的真菌物种的真菌孢子提供了一种高效、快速的方法。
将遗传物质递送至真菌孢子比现有方法更有效、更快速。该方法允许将核酸递送至迄今为止无法递送多核苷酸的真菌物种，或仅在艰难且耗时地过渡到真菌生命周期的其他阶段(例如原生质体)之后。例如，一些专性植物病原体真菌需要植物宿主才能生长和扩增，并且只能作为孢子从所述宿主植物分离出来。这些真菌的修饰即使不是不可能，也是困难的。此外，孢子易于收获、储存，并可承受严酷的条件，所有这些都便于在许多情况下处理生物材料。
因此，本发明提供用于将多核苷酸分子引入真菌孢子的方法，其包括使真菌孢子和携带多核苷酸的磁性纳米粒子的混合物暴露于磁体和/或磁场。
在一个实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：
a.例如，提供真菌孢子，
b.将要转移入孢子的多核苷酸分子装载在磁性纳米粒子(MNP)上，和
c.将装载在所述磁性纳米粒子上的所述多核苷酸分子(DNA-MNP)加至所述孢子，和
d.使混合物暴露于磁力，例如磁体和/或磁场，
e.在所述磁体存在下孵育混合物，以允许将多核苷酸分子引入所述孢子，
从而将多核苷酸分子引入所述孢子。
如本文所示，磁转染可以作为一种高效的基因递送方法，用于广泛的真菌孢子。
最近，报道了一种利用聚乙烯亚胺包被的磁性纳米粒子转化植物花粉的方法(Zhao等人,2017,nature plants 3,956-964)。
植物花粉包含内壁和外壁。外壁含有孔。花粉内的水分会使花粉膨胀和收缩。孔的外壁允许吸收水分。内壁由纤维素和半纤维素组成，也含有胼胝质。外壁主要由孢粉素组成，孢粉素是多种生物聚合物的混合物，主要包括长链脂肪酸、苯丙素、酚类、类胡萝卜素和叶黄素。植物花粉的外层由蛋白质组成，称为外壁。Zhao等人指出，在外壁上有孔是纳米磁体转化植物花粉能力的一个重要决定因素。赵等人使用的棉花花粉在外壁(外)细胞壁上有大约5-10□m的孔。
相反，真菌细胞壁的组成和结构与植物花粉完全不同。真菌孢子细胞非常坚硬，能够承受较高的细胞内膨压。真菌孢子细胞壁几乎完全由□-葡聚糖组成(Noothalapati等人，2016,Scientific Reports 27789)，缺乏明显的内壁和外壁结构。
植物花粉的结构是不同的，并且在多种方面与真菌孢子的结构不同，例如，孢子主要由□□葡聚糖组成，其中花粉主要包含纤维素、半纤维素、胼胝质和孢粉素组成(Zimmermann等人，2015,PLoS 10(4))。
对几个真菌物种的孢子细胞壁的孔径进行了研究。Money和Webster(1988；Experimental Mycology 12(2),169-179)估计Achlya intricate的孔径约为2-3nm。
因此，令人惊奇的是，直径100nm且表面包被DNA(甚至200nm)的磁转染珠能够通过真菌孢子的刚性细胞壁，将DNA递送到细胞，并允许产生经遗传操作的真菌孢子和细胞。
当将要转染的多核苷酸(例如线性DNA或质粒DNA)连接到易受磁力吸引的部分(如MNP)时，将多核苷酸递送至真菌孢子的效率显著提高，并且通过施加磁场将所述多核苷酸递送至真菌孢子。用于本发明的方法的术语“效率”是指将多核苷酸(例如DNA)递送到真菌孢子的某个亚组的频率。多核苷酸(例如线性或质粒DNA)递送效率的提高可表现为增加转化频率，或减少转移给定量的多核苷酸(例如DNA)进入给定数量的细胞所需的时间，和/或增加在给定时间单位内转移入给定数量的细胞中的多核苷酸的量。备选地，转染效率可以以给定多核苷酸的剂量-反应曲线的形式表示。术语“剂量-反应曲线”是指为达到预期效果而在流程中应用的每单位核酸(或蛋白质-DNA复合物或核酸类似物等)剂量可达到的预期效果程度。对于基因转移实验，术语“剂量-反应曲线”例如可涉及转染实验中应用的每单位多核苷酸(例如DNA或RNA)剂量可达到的转染基因的表达水平，或例如，不依赖于所递送的多核苷酸特征的整合事件数量。
本文理解，术语“引入”、“递送”或“转化”多核苷酸或核酸到真菌孢子中，意味着将RNA、DNA(例如线性DNA或质粒DNA)、双链或单链核糖核苷酸和核酸类似物引入真菌孢子。因此，本发明的方法中的MNP可装载RNA、DNA(例如线性DNA或质粒DNA)、双链或单链核糖核苷酸、核酸类似物或调节RNA(例如microRNA、dsRNA或反义RNA)。例如，装载到MNP的多核苷酸是质粒DNA或线性DNA，并且包含真菌调节元件序列、编码在真菌中(例如在孢子或另一生命周期阶段)具有活性的多肽的序列或源自真菌基因组的序列。调节元件例如选自5'-UTR、内含子、终止子、增强子、NEENA和启动子。异源调节元件可以例如来自与所转染的真菌相同的真菌物种或者来自另一物种，只要它在真菌生命周期的一个时期或阶段具有功能。
因此，在本发明的方法的一个实施方案中，多核苷酸分子包含DNA或RNA或核酸类似物。类似物、DNA或RNA分子可以是单链或双链，它们可以是线性或环状。例如，本发明的多核苷酸分子可以是编码至少一个序列的DNA，例如调节元件、包括或源自真菌基因组的序列、功能性连接至启动子的目的基因和/或在所源自的相应真菌孢子或真菌细胞中具有功能的序列。在另一实例中，该多核苷酸分子可是调节RNA，例如用于在所源自的相应真菌孢子或真菌细胞中诱导RNAi的microRNA、反义或dsRNA分子。
在一个实施方案中，本发明涉及用于转化真菌的方法，其包括其中所述方法的步骤，例如，使真菌孢子和携带多肽的磁性纳米粒子的混合物暴露于磁体和/或磁场，例如，如步骤(a)至(e)中所述，并允许所述多核苷酸分子整合入所述孢子的基因组，从而转化该孢子。多核苷酸或其片段可暂时维持在细胞中或稳定整合到孢子DNA的基因组中。多核苷酸可以整合入真菌基因组，例如，或作为质粒保留在细胞或孢子中。
在一个实施方案中，在本发明的方法中，从真菌孢子培养真菌培养物。有利地，从转化孢子(例如稳定的转化孢子)产生真菌，允许产生具有新性状和/或特征的新真菌菌株。用于产生转化真菌的方法可包括本发明的方法，例如其包括以下步骤：
a.将要转移入孢子中的多核苷酸分子装载在磁性纳米粒子上，和
b.将装载在所述磁性纳米粒子上的所述多核苷酸分子添加至所述孢子，和
c.使混合物暴露于磁体，和
d.在所述磁体存在下孵育混合物，以允许所述DNA分子整合入所述孢子的基因组，和
e.从所述孢子长出真菌细胞，从而转化真菌。
在选择和/或在长出真菌细胞之后，选择存在所述多核苷酸的细胞。在一个实施方案中，该多核苷酸或其片段稳定整合入所述孢子的基因组。该多核苷酸也可以作为质粒存在。在一个实施方案中，该真菌孢子和/或细胞由此稳定转化。该多核苷酸或其片段可稳定整合入孢子DNA的基因组。可在步骤a之前提供真菌孢子。
发现根据本发明的方法，孢子密度影响孢子的转染和转化效率。因此，在一个实施方案中，孵育步骤中每毫升的孢子数为105个或更高，例如106个或更高，优选107个或更高。
此外，本发明的方法的效率可通过在孵育步骤中提供每个多核苷酸量的优选孢子密度来提高。因此，例如，每100-500ng多核苷酸，例如大于150ng、200ng或约250ng且小于500ng、小于400ng、例如约300ng，孢子密度大于105/ml。因此，在一个实施方案中，多核苷酸的量在200ng和300ng DNA之间，例如250ng DNA。
与装载的MNP孵育，例如DNA的递送和/或转染反应，进行超过0分钟、10分钟，例如20分钟或30分钟且少于24小时、20小时、16小时、12小时、8小时、6小时或2小时。此外，当将该方法应用于转染超过30分钟且少于2小时时，也可获得增加。
在一个实施方案中，孵育期始于芽管的出现，或芽管出现后5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、25分钟、60分钟、75分钟、90分钟或120分钟或以上且小于48小时、小于24小时、小于12小时、小于6小时、小于2小时、小于90分钟。因此，真菌孢子在转化前的萌发时间例如在0小时到12小时之间，例如在5分钟到6小时之间，例如在萌发后10分钟到2小时之间。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法使用每毫升105至107个孢子的孢子密度，200ng至300ng DNA，孵育时间10分钟至30分钟。例如，本发明的方法使用约107个孢子/毫升的孢子密度，约250ng DNA，孵育30分钟。
在本发明的方法的另一实施方案中，引入孢子中的DNA分子整合入真菌基因组，从而产生稳定的转化真菌细胞，或者DNA分子未整合入真菌基因组，从而产生瞬时转化的真菌孢子和/或真菌细胞。
在本发明的另一实施方案中，本发明的方法的例如步骤d中的磁场在0.1至0.6T之间，0.2至0.5T之间，优选磁场为0.3T。本发明的方法的步骤e中孢子在磁场中的孵育时间在5到60分钟之间，10到50分钟之间，20至40分钟之间，优选孵育时间为30分钟。
在本发明的方法的一个实施方案中，磁性纳米粒子包含Fe3O4或Fe2O3，优选Fe3O4。在本发明的方法的另一实施方案中，磁性纳米粒子包含磁芯和带正电荷的壳，其中带正电荷的壳包含聚乙烯亚胺(PEI)或由聚乙烯亚胺(PEI)组成。在另一个实施方案中，包被的磁性纳米粒子具有+30到+60mV之间、+35到+55mV之间或+40和+50mV之间的电荷。优选地，包被的磁性纳米粒子具有+48.2mV的电荷。
在本发明的方法的一个实施方案中，包被的磁性纳米粒子的平均直径为50至200nm、70至180nm或80至130nm。优选地，包被的磁性纳米粒子的平均直径为100至120nm。
在一个实施方案中，本发明涉及用于在磁转染中用多核苷酸转化真菌孢子的包含装载有多核苷酸的MNP的试剂盒。例如，该试剂盒包含一种或多种缓冲液或产生缓冲液的手段，该缓冲液允许用多核苷酸装载MNP或用装载有多核苷酸的MNP孵育真菌孢子。例如，该试剂盒包含对孢子施加磁场的装置。例如，该装置可以是这样装置，其包含一个或多个靠近容器(如平板中的孔或试管)的磁体，所述容器包含装载有多核苷酸的MNP和真菌孢子的孵育缓冲液。
在一个实施方案中，本发明还涉及用于用多核苷酸转化真菌孢子的包含装载有核酸分子的磁性纳米粒子的系统。该系统可以包含用于对包含装载的孢子和MNP的组合物施加磁场的装置。该系统还可以包含读出装置，其可测量本发明的方法所达到的转染效率，例如通过测量报告基因的活性或存在或对选择的抗性。
此外，本发明涉及包含装载有核酸分子的MNP和真菌孢子的组合物。孢子的数量、密度和多核苷酸(如DNA)的量取决于具体的真菌物种、DNA种类和磁场。例如，本发明的组合物允许组合物中的孢子密度大于105/ml、106/ml或107/ml，例如在106/ml和107/ml之间，然后用于以100ng到500ng多核苷酸(例如200ng到300ng多核苷酸，例如DNA)的量转染。
在该试剂盒、组合物或系统中，磁性纳米粒子具有上文定义的特征。此外，本发明的方法、本发明的试剂盒、本发明的系统或本发明的组合物中所用的多核苷酸可以是RNA、DNA，例如线性DNA或质粒DNA、双链或单链核糖核苷酸和/或核酸类似物。
此外，在一个实施方案中，在本发明的方法或系统、或试剂盒或组合物中，装载到MNP的多核苷酸是质粒DNA或线性DNA，其例如包含调节元件、包含或源自真菌基因组的序列、功能性连接到启动子的目的基因、和/或在所来源的相应真菌孢子或真菌细胞中具有功能的序列，或RNA，例如iRNA、microRNA、dsRNA或反义RNA。
在一个实施方案中，本发明的方法、本发明的试剂盒、本发明的系统或本发明的组合物中所提供的真菌孢子是新鲜收获的或已经萌发的，例如，在与装载的MNP孵育之前，真菌孢子的萌发时间在0小时和24小时之间，例如0.5小时、1小时、2小时或24小时。
本发明中待转化的真菌孢子可以源自任何真菌。优选地，它们源自层锈菌属物种(Phakopsora spec)，例如豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)，Zymoseptoria spec，例如小麦叶枯病菌(Zymoseptoria tritici)，壳针孢属(Septoria)，球腔菌属(Mycosphaerella)，Phythopthora spec.，例如马铃薯晚疫病菌(Phytopthorainfestans)，柄锈菌属(Puccinia)，单丝壳属(Sphaerotheca)，布氏白粉菌属(Blumeria)，白粉菌属(Erysiphe)，链格孢属(Alternaria)，葡萄孢属(Botrytis)，黑粉菌属(Ustilago)，黑星菌属(Venturia)，轮枝孢属(Verticillium)，梨孢属(Pyricularia)，Magnaporthe，单轴霉属(Plasmopara)，腐霉属(Pythium)，核盘菌属(Sclerotinia)，炭疽菌属(Colletotrichum)，青霉属(Penicillium)，链孢霉属(Neurospora)，曲霉属(Aspergillus)，Ashbya或青霉属。
定义
应理解，本发明不限于具体方法或流程。还应理解，本文所用术语仅是为了描述具体实施方案的目的，并非旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅通过所附权利要求书限制。必须指出，除非文中另有明确说明，本文和所述权利要求书中所用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代物。因此，例如，提到“一个载体”是提到一个或多个载体，包括本领域技术人员已知的其等同物，等等。本文中用术语“约”来指大致上、粗略地、大约或在…区域。在术语“约”与数字范围结合使用时，它通过在所示数值之上和之下扩展边界来修饰该范围。通常，本文中用术语“约”来修饰所述值之上和之下20％的变异的数值，优选向上或向下(更高或更低)10％。本文所用的词语“或”指具体列出的任意一个成员，也包括该所列成员的任意组合。在本说明书中和以下权利要求中使用时，词语“包含”、“含有”和“包括”旨在指定一个或多个所述特征、整数、成分或步骤的存在，但它们不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、成分、步骤或其组。为了清晰性，本说明书中使用的某些术语定义和使用如下：
编码区：在用于提及结构基因时，本文所用的术语“编码区”指核苷酸序列，其由于mRNA分子的翻译而编码见于新生多肽中的氨基酸。在真核生物中，编码区在5’侧以编码起始甲硫氨酸的核苷酸三联体“ATG”为界，原核生物还用三联体“GTG”和“TTG”作为起始密码子。在3’侧，它以指定终止密码子(即TAA、TAG、TGA)的三种三联体之一为界。此外，基因可以包含存在于RNA转录物上的定位在该序列5’和3’两端的序列。这些序列称为“侧翼”序列或区域(这些侧翼序列定位在存在于mRNA转录物上的非翻译序列的5’或3’。5’侧翼区域可以包含调节序列，如控制或影响基因转录的启动子和增强子。3’侧翼区域可以包含指导转录终止、转录后切割和聚腺苷酸化的序列。
互补：“互补”或“互补性”指包含反向平行核苷酸序列的两个核酸序列能够通过在反向平行核苷酸序列中的互补碱基残基之间形成氢键而彼此配对(通过碱基配对规则)。例如，序列5'-AGT-3'与序列5'-ACT-3'互补。“互补性”可以是“部分的”或“总的”。“部分”互补性是其中一个或多个核酸碱基按照碱基配对规则不匹配。核酸分子间的“总”或“完全”互补性是其中各个和每一个核酸碱基在碱基配对规则下与另一碱基匹配。核酸分子链间的互补性程度对两条核酸分子链间杂交的效率和强度具有显著影响。本文所用的核酸序列的“互补序列”指这样的核苷酸序列，其核酸分子显示与该核酸序列的核酸分子完全互补。
内源的：“内源”核苷酸序列指存在于野生型微生物基因组中的核苷酸序列。
增强的表达：“增强”或“提高”核酸分子在微生物中的表达在本文中同等地使用，指与参考微生物例如野生型相比，核酸分子在微生物中的表达水平更高。本文所用的术语“增强的”或“提高的”在本文中指更高、优选显著更高的待表达的核酸分子的表达。如本文所使用，物质如蛋白质、mRNA或RNA的水平的“增强”或“提高”指该水平相对于在基本相同的条件下培养的基本相同的微生物提高。如本文所使用，物质如由靶基因表达的preRNA、mRNA、rRNA、tRNA和/或由它编码的蛋白质产物的水平的“增强”或“提高”指该水平相对于适宜的参考微生物提高50％或更多，例如100％或更多，优选200％或更多，更优选5倍或更多，甚至更优选10倍或更多，最优选20倍或更多，例如50倍。可以通过技术人员熟悉的方法来测定增强或提高。因此，可以例如通过蛋白质的免疫学检测来测定核酸或蛋白质的量的增强或提高。此外，可以利用诸如蛋白质测定法、荧光、Northern杂交、凝胶中核酸浓度的密度测量、核酸酶保护测定法、反转录(定量RT-PCR)、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、Western印迹法、放射免疫测定法(RIA)或其他免疫测定法和荧光激活细胞分析(FACS)的技术来测量微生物中的特定蛋白质或RNA。取决于所诱导的蛋白质产物的类型，还可以测定其活性或对微生物表型的影响。用于测定蛋白质的量的方法为技术人员已知。可以提到的实例是：micro-Biuret法(Goa J(1953)Scand J Clin Lab Invest 5:218-222)、Folin-Ciocalteau法(Lowry OH等人，(1951)J Biol Chem 193:265-275)或测量CBB G-250吸光度(Bradford MM(1976)Analyt Biochem 72:248-254)。
表达：“表达”指基因产物的生物合成，优选指细胞中核苷酸序列(例如内源基因或异源基因)的转录和/或翻译。例如，在结构基因的情况下，表达涉及结构基因转录为mRNA，及任选地，随后mRNA翻译为一条或多条多肽。在其他情况下，表达可仅指含有RNA分子的DNA的转录。
外来的：术语“外来的”指任何核酸分子(例如基因序列)，其通过实验操作引入细胞，且可以包含存在于该细胞中的序列，只要所引入的序列包含某种修饰(例如点突变、存在选择标记基因等)并因此相对于天然存在的序列不同。
功能性片段：术语“功能性片段”指任何核酸和/或蛋白质，其仅包含本发明的全长核酸和/或全长多肽的一部分，但仍提供相同的功能，即AAT酶催化丙烯酰-CoA和丁醇反应生成n-BA和CoA的功能。优选地，该片段包含它所衍生自的序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％。优选地，该功能性片段包含该功能性片段所衍生自的核酸和/或蛋白质的连续核酸或氨基酸。核酸分子的编码蛋白质的功能性片段指该核酸分子的编码蛋白质功能性片段的片段。
功能性连接：术语“功能性连接”或“功能性连接的”等同于术语“有效连接”或“有效连接的”，理解为意指例如调节元件(例如启动子)与待表达的核酸序列和(如果适当)其他调节元件(如终止子)以这样的方式顺次排列，使得各调节元件可以执行其预期功能，以允许、改变、便于或以其他方式影响该核酸序列的表达。作为同义词，可以使用词语“有效连接”或“有效连接的”。取决于核酸序列相对于有义或反义RNA的排列，可产生表达。为此，并非必然需要化学意义上的直接连接。遗传控制序列例如增强子序列可以从相隔更远的位置或甚至从其他DNA分子发挥其对靶序列的功能。优选的排列是这样，其中待重组表达的核酸序列放置在作为启动子发挥作用的序列之后，使得两个序列彼此共价连接。在一个优选的实施方案中，待转录的核酸序列以这样的方式定位在启动子之后，使得转录起点与所希望的本发明的嵌合RNA的起点相同。可以借助(例如Sambrook J,Fritsch EF和Maniatis T(1989)；Silhavy等人，(1984)Experiments with Gene Fusions,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor(NY)；Ausubel等人，(1987)Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience；Gelvin等人，(编辑)(1990)Plant Molecular Biology Manual；Kluwer Academic Pub-lisher,Dordrecht,荷兰)所述的常规重组和克隆技术来产生功能性连接和表达构建体。但是，也可以在两个序列之间放置其他例如作为具有限制酶特异性切割位点的接头或作为信号肽发挥作用的序列。序列的插入也可以导致融合蛋白的表达。优选地，由调节区例如启动子和待表达的核酸序列的连接组成的表达构建体可以以载体整合形式存在或可以例如通过转化插入基因组。
基因：术语“基因”指与能够以某种方式调节基因产物(例如多肽或功能性RNA)的表达的适当调节序列有效连接的区域。基因包括编码区(可读框，ORF)之前(上游)和之后(下游)的非翻译调节区DNA(例如启动子、增强子、阻遏子等)。本文所用的术语“结构基因”旨在指这样的DNA序列，其转录为mRNA，然后该mRNA翻译为特定多肽的特征性氨基酸序列。
基因组和基因组DNA：术语“基因组”或“基因组DNA”指宿主生物的可遗传的遗传信息。该基因组DNA包含核质体的DNA以及自我复制质粒的DNA。
异源的：关于核酸分子或DNA的术语“异源的”指与它在自然界中未与之有效连接或它在自然界中在不同位置与之有效连接的第二核酸分子有效连接或经操作变得有效连接的核酸分子。包含核酸分子和一个或多个与之连接的调节核酸分子(如启动子或转录终止信号)的异源表达构建体例如是通过实验操作产生的构建体，其中a)该核酸分子或b)该调节核酸分子或c)二者(即(a)和(b))不定位在其自然(天然)遗传环境中或已通过实验操作进行修饰，修饰的实例是取代、添加、缺失、倒位或插入一个或多个核苷酸残基。天然遗传环境指来源生物中的天然基因组基因座，或指存在于基因组文库中。在基因组文库的情况下，该核酸分子的序列的天然遗传环境优选至少部分保留。该环境至少在一侧处于该核苷酸序列侧翼，且具有长度为至少50bp、优选至少500bp、尤其优选至少1000bp、极其优选至少5000bp的序列。在通过非天然、合成的“人工”方法(例如诱变)修饰它时，天然存在的表达构建体(例如启动子与相应基因的天然存在的组合)变为转基因表达构建体。已描述了这类方法(US 5,565,350；WO 00/15815)。例如，认为与不是此分子的天然启动子的启动子有效连接的蛋白质编码核酸分子对该启动子而言是异源的。优选地，异源DNA对它所引入的细胞而言不是内源的或并非与它所引入的细胞天然相关，而是获自另一细胞或是合成的。异源DNA还包括含有某种修饰的内源DNA序列、非天然存在的多拷贝的内源DNA序列、或并非与与之物理连接的另一DNA序列天然相关的DNA序列。通常，虽然并非必然，但异源DNA编码它在其中表达的细胞正常情况下不产生的RNA或蛋白质。
杂交：本文所用的术语“杂交”包括“核酸分子的链通过碱基互补与互补链结合的任何过程”(J.Coombs(1994)Dictionary of Biotechnology,Stockton Press,New York)。杂交和杂交的强度(即核酸分子间结合的强度)受诸如核酸分子间的互补性程度、所涉及的条件的严格、所形成的杂合体的Tm和核酸分子内的G:C比的因素影响。如本文所使用，术语“Tm”用于指“解链温度”。解链温度是双链核酸分子群体一半解离为单链的温度。计算核酸分子Tm的方程为本领域公知。如标准参考文献所示，在核酸分子处于1M NaCl的水溶液中时，可通过以下方程计算简单估计Tm值：Tm＝81.5+0.41(％G+C)[参见例如Anderson和Young,Quantitative Filter Hybridization,Nucleic Acid Hybridization(1985)]。其他参考文献包括更复杂的计算，其对Tm的计算考虑了结构以及序列特征。严格条件为本领域技术人员已知，可见于Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中。
适宜的杂交条件是例如在等同于在50℃在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mM EDTA中杂交，在50℃在2X SSC、0.1％SDS中洗涤(低严格)的条件下与包含序列的互补序列的至少50、优选至少100、更优选至少150、甚至更优选至少200、最优选至少250个连续核苷酸的核酸分子杂交。其他适宜的杂交条件是在50℃在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交，在50℃(中等严格)或65℃(高严格)下在1X SSC、0.1％SDS中洗涤，与包含序列的互补序列的至少50、优选至少100、更优选至少150、甚至更优选至少200、最优选至少250个连续核苷酸的核酸分子杂交。其他适宜的杂交条件是在50℃在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交，在65℃在0.1X SSC、0.1％SDS中洗涤(极高严格)，与包含序列的互补序列的至少50、优选至少100、更优选至少150、甚至更优选至少200、最优选至少250个连续核苷酸的核酸分子杂交。
“同一性”：在用于两个或多个核酸或氨基酸分子的比较时，“同一性”指所述分子的序列具有某种程度的序列相似性，序列部分相同。
为了测定两个或多个氨基酸或两个或多个核苷酸序列的百分同一性，开发了若干计算机软件程序。可以用例如fasta软件计算两个或多个序列的同一性，该软件目前以版本fasta 3(W.R.Pearson和D.J.Lipman,PNAS 85,2444(1988)；W.R.Pearson,Methods inEnzymology 183,63(1990)；W.R.Pearson和D.J.Lipman,PNAS 85,2444(1988)；W.R.Pearson,Enzymology 183,63(1990))使用。用于计算不同序列的同一性的另一有用的程序是标准blast程序，其包括在Biomax pedant软件(Biomax,Mu-nich,德意志联邦共和国)中。这有时不幸地产生次优结果，因为blast并非总是包括完整的目标序列和查询序列。然而，由于此程序非常有效，可以用它来进行大量序列的比较。以下设定通常用于这类序列比较：
-p程序名称[字符串]；-d数据库[字符串]；默认＝nr；-i查询文件[文件输入]；默认＝stdin；-e期望值(E)[实际]；默认＝10.0；-m比对视图选项:0＝配对；1＝查询-比上区域，显示同一性；2＝查询-比上区域，不显示同一性；3＝查询-比上区域的屏文形式，显示同一性；4＝查询-比上区域的屏文形式，不显示同一性；5＝查询-比上区域，不显示同一性，无突然结束；6＝查询-比上区域的屏文形式，不显示同一性，无突然结束；7＝XML Blast输出；8＝表格；9带注释行的表格[整数]；默认＝0；-o BLAST报告输出文件[文件输出]可选；默认＝stdout；-F过滤查询序列(blastn用DUST，其他用SEG)[字符串]；默认＝T；-G空位开放罚分(0调用默认行为)[整数]；默认＝0；-E空位扩展罚分(0调用默认行为)[整数]；默认＝0；-X空位比对的X下拉值(比特)(0调用默认行为)；blastn 30,megablast20,tblastx 0,所有其他15[整数]；默认＝0；-I提示行中显示GI[T/F]；默认＝F；-q核苷酸错配罚分(仅blastn)[整数]；默认＝-3；-r核苷酸匹配加分(仅blastn)[整数]；默认＝1；-v(V)的整行描述显示的数据库序列数[整数]；默认＝500；-b(B)的比对显示的数据库序列数[整数]；默认＝250；-f延伸匹配阈值，0为默认；blastp 11,blastn 0,blastx 12,tblastn 13；tblastx13,megablast 0[整数]；默认＝0；-g执行空位比对(tblastx不可用)[T/F]；默认＝T；-Q所使用的查询遗传密码[整数]；默认＝1；-D DB遗传密码(仅用于tblast[nx])[整数]；默认＝1；-a使用的处理器数目[整数]；默认＝1；-O SeqAlign文件[文件输出]可选；-J相信查询提示行[T/F]；默认＝F；-M矩阵[字符串]；默认＝BLOSUM62；-W字长，0为默认(blastn 11,megablast 28,所有其他3)[整数]；默认＝0；-z数据库有效长度(实际大小用0)[实际]；默认＝0；-K一个区域需保留的最佳匹配数(默认关闭，如果使用，建议使用100的值)[整数]；默认＝0；-P 0为多字长匹配，1为单字长匹配[整数]；默认＝0；-Y搜索空间有效长度(实际大小用0)[实际]；默认＝0；-S搜索数据库的查询链(用于blast[nx]和tblastx)；3为二者,1为输入序列,2为反向互补序列[整数]；默认＝3；-T产生HTML输出[T/F]；默认＝F；-l数据库搜索限于GI列表[字符串]可选；-U使用FASTA序列的小写字母过滤[T/F]可选；默认＝F；-y以比特表示的非空位延伸X下拉值(0.0调用默认行为)；blastn 20,megablast 10,所有其他7[实际]；默认＝0.0；-Z以比特表示的最终空位比对的X下拉值(0.0调用默认行为)；blastn/megablast 50,tblastx 0,所有其他25[整数]；默认＝0；-R PSI-TBLASTN检验点文件[文件输入]可选；-n MegaBlast搜索[T/F]；默认＝F；-L查询序列上的位置[字符串]可选；-A多字长匹配窗口大小,0为默认(blastn/megablast 0,所有其他40[整数]；默认＝0；-w移码罚分(blastx的OOF算法)[整数]；默认＝0；-t tblastn中连接HSP允许的最大内含子长度(0停用连接)[整数]；默认＝0。
通过使用Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法达到高质量结果。因此，优选基于所述算法的程序。有利地，可以用程序PileUp(J.Mol.Evolution.,25,351(1987),Higgins等人,CABIOS 5,151(1989))或优选用程序“Gap”和“Needle”(二者都基于Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48；443(1970)的算法)及“BestFit”(基于Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2；482(1981)的算法)进行序列的比较。“Gap”和“BestFit”是GCG软件包(Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wisconsin,USA53711(1991)；Altschul等人,(Nucleic Acids Res.25,3389(1997))的一部分，“Needle”是欧洲分子生物学开放软件包(EMBOSS)(Trends in Genetics 16(6),276(2000))的一部分。因此，优选地，用程序“Gap”或“Needle”在整个序列范围内进行测定序列同一性百分比的计算。将以下核酸序列比较标准调整用于“Needle”：矩阵：EDNAFULL，空位罚分：10.0，延伸罚分：0.5。将以下核酸序列比较标准调整用于“Gap”：空位权重：50，长度权重：3，平均匹配：10.000，平均错配：0.000。
例如，将称之为在核酸水平与序列SEQ ID NO:1具有80％同一性的序列理解为指这样的序列，在按以上参数设置通过以上程序“Needle”与SEQ ID NO:1所代表的序列比较时，该序列具有80％同一性。优选地，基于查询序列例如SEQ ID NO:1的全长计算该同一性。
分离的：本文所用的术语“分离的”指物质已人为取出，远离其最初的天然环境存在，因此不是自然的产物。分离的物质或分子(如DNA分子或酶)可以以纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境中，例如转基因宿主细胞中。例如，存在于活细胞中的天然存在的核酸分子或多肽不是分离的，但从天然系统中的一些或全部共存物质分开的同一核酸分子或多肽是分离的。这类核酸分子可以是载体的一部分和/或这类核酸分子或多肽可以是组合物的一部分，且可以是分离的，因为这种载体或组合物不是其最初环境的一部分。优选地，在与核酸分子关联使用时，如在“分离的核酸序列”中，术语“分离的”指经鉴定的并与其天然来源中通常结合的至少一种污染核酸分子分开的核酸序列。分离的核酸分子是以不同于它见于自然界中的形式或环境存在的核酸分子。相反，非分离的核酸分子是以它们存在于自然界中的状态出现的核酸分子，如DNA和RNA。例如，给定的DNA序列(例如基因)靠近邻近基因见于宿主细胞染色体上；RNA序列(如编码特定蛋白质的特定mRNA序列)作为与编码多种蛋白质的许多其他mRNA的混合物见于细胞中。但是，包含例如SEQ ID NO:1的分离的核酸序列作为实例包括细胞中的通常含有SEQ ID NO:1的这类核酸序列，其中该核酸序列处在不同于天然细胞的位置的基因组或质粒位置中，或者侧翼为不同于见于自然界中的核酸序列。分离的核酸序列可以以单链或双链形式存在。在用分离的核酸序列来表达蛋白质时，该核酸序列至少将包含有义链或编码链的至少一部分(即该核酸序列可以是单链)。备选地，它可以包含有义链和反义链二者(即该核酸序列可以是双链)。
非编码的：术语“非编码的”指不编码所表达的蛋白质的部分或全部的核酸分子序列。非编码序列包括但不限于增强子、启动子区、3’非翻译区和5’非翻译区。
核酸和核苷酸：术语“核酸”和“核苷酸”指天然存在或合成或人工的核酸或核苷酸。术语“核酸”和“核苷酸”包含脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或任何核苷酸类似物及其单链或双链、有义或反义形式的聚合物或杂合体。除非另有说明，特定的核酸序列还暗含其保守修饰变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。术语“核酸”在本文中可与“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“核酸分子”互换使用。核苷酸类似物包括具有碱基、糖和/或磷酸的化学结构中的修饰(包括但不限于5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、胞嘧啶外环胺修饰、5-溴-尿嘧啶取代，等等)及2’-位糖修饰(包括但不限于糖修饰的核糖核苷酸，其中选自H、OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基团取代2'-OH)的核苷酸。短发夹RNA(shRNA)还可以包含非天然元件，如非天然碱基，例如肌苷和黄嘌呤，非天然糖，例如2’-甲氧核糖，或非天然磷酸二酯键，例如甲基磷酸酯、硫代磷酸酯；和肽。
核酸序列：短语“核酸序列”指从5’至3’端读出的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。它包括染色体DNA、自我复制质粒、DNA或RNA的聚合物和发挥初步结构作用的DNA或RNA。“核酸序列”还指代表核苷酸的缩写、字母、字符或词语的连续罗列。在一个实施方案中，核酸可以是“探针”，探针是相对短的核酸，长度通常小于100个核苷酸。通常，核酸探针从长度约50个核苷酸至长度约10个核苷酸。核酸的“靶区域”是核酸的鉴定为目标的部分。核酸的“编码区”是核酸的部分，在放置在适当的调节序列控制下时，其以序列特异的方式转录和翻译来产生特定的多肽或蛋白质。称该编码区编码这种多肽或蛋白质。
寡核苷酸：术语“寡核苷酸”指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的寡聚物或多聚物，以及具有相似地发挥功能的非天然存在的部分的寡核苷酸。这类修饰或取代的寡核苷酸常由于希望得到的特性(例如细胞摄取增强、对核酸靶标的亲和力增强和核酸酶存在下的稳定性提高)而比天然形式更优选。寡核苷酸优选包含通过连接(例如磷酸二酯)或取代连接彼此共价偶联的两个或多个核苷酸单体(nucleomonomer)。
突出端：“突出端”是双链寡核苷酸分子的5’-或3’-羟基端的相对短的单链核苷酸序列(也称为“延伸”、“凸起端”或“黏端”)。
多肽：术语“多肽”、“肽”、“寡肽”、“多肽”、“基因产物”、“表达产物”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指连续氨基酸残基的多聚物或寡聚物。
启动子：术语“启动子”或“启动子序列”是等同术语，如本文中所使用，指在与目的核苷酸序列有效连接时能够控制该目的核苷酸序列转录为RNA的DNA序列。启动子定位在5’(即上游)，靠近它控制其转录为mRNA的目的核苷酸序列的转录起始位点，为起始转录的RNA聚合酶和其他转录因子的特异性结合的提供位点。启动子不包含编码区或5’非翻译区。启动子对该细胞而言可以是例如异源的或同源的。如果核酸分子序列源自外来物种，或如果源自同一物种但从其原始形式修改，则它对生物或第二核酸分子序列而言是“异源的”。例如，启动子与异源编码序列有效连接指编码序列来自不同于启动子所衍生自的物种的物种，或者如果来自同一物种，则编码序列并非与启动子天然相关(例如遗传改造的编码序列或来自不同生态型或变种的等位基因)。适宜的启动子可以源自其中应发生表达的宿主细胞的基因或源自此宿主的病原体。
纯化的：本文所用的术语“纯化的”指从其天然环境取出、分离或分开的分子(核酸或氨基酸序列)。“基本纯化的”分子是至少60％游离、优选至少75％游离和更优选至少90％游离于它们天然与之结合的其他成分。纯化的核酸序列可以是分离的核酸序列。
显著提高：例如酶活性、基因表达、某种产物的生产力或产率的大于测量技术固有误差幅度的提高，优选地相对于对照酶的活性、表达、生产力或产率或对照细胞中的表达、对照细胞的生产力或产率提高约10％或25％、优选50％或75％、更优选2倍或5倍或更多，甚至更优选提高约10倍或更多。
显著降低：例如酶活性、基因表达、某种产物的生产力或产率的大于测量技术固有误差幅度的降低，优选降低至少约5％或10％、优选至少约20％或25％、更优选至少约50％或75％、甚至更优选至少约80％或85％、最优选至少约90％、95％、97％、98％或99％。
基本互补：在其最广泛的含义上，在本文中与参考或靶核苷酸序列关联用于核苷酸序列时，术语“基本互补”指在该基本互补的核苷酸序列和该参考或靶核苷酸序列的精确互补的序列之间具有至少60％、更希望至少70％、更希望至少80％或85％、优选至少90％、更优选至少93％、还更优选至少95％或96％、还更优选至少97％或98％、还更优选至少99％或最优选100％(在本上下文中，后者等同于术语“同一的”)的百分同一性的核苷酸序列。优选地，在该参考序列的至少19个核苷酸、优选至少50个核苷酸、更优选全长的长度内评估同一性(如果下文未以其他方式指定)。用基于Needleman和Wunsch(Needleman和Wunsch(1970)J Mol.Biol.48:443-453；如上文所定义)算法的威斯康星大学GCG,SEQWEB应用GAP的默认GAP分析进行序列比较。与参考序列“基本互补”的核苷酸序列在低严格条件、优选中等严格条件、最优选高严格条件(如上文所定义)下与参考核苷酸序列杂交。
转基因：本文所用的术语“转基因”指通过实验操作引入细胞基因组的任何核酸序列。转基因可以是“内源DNA序列”或“异源DNA序列”(即“外来DNA”)。术语“内源DNA序列”指天然见于它所引入的细胞中的核苷酸序列，只要它相对于天然存在的序列不包含某种修饰(例如点突变、存在选择标记基因等)即可。
转基因的：在提到生物时，术语“转基因的”指用至少一个重组核酸分子转化、优选稳定转化。
载体：本文所用的术语“载体”指能够转运与之连接的另一核酸分子的核酸分子。一类载体是基因组整合载体，或“整合载体”，其可以整合入宿主细胞的基因组DNA。另一类载体是附加型载体，即能够染色体外复制的质粒或核酸分子。能够指导与之有效连接的基因表达的载体在本文中称为“表达载体”。在本说明书中，除非文中另有明确说明，“质粒”和“载体”可互换使用。
野生型：对于生物，术语“野生型”、“天然的”或“天然来源”指该生物未人为改变、突变或以其他方式操作。对于多肽或核酸序列，指该多肽或核酸序列是天然存在的或可在未人为改变、突变或以其他方式操作的至少一种天然存在的生物中获得。
野生型微生物指这样的微生物，该微生物的基因组以引入某基因的遗传修饰之前的状态存在。遗传修饰可以是例如缺失基因或其部分或点突变或引入基因。
术语“生产”或“生产力”为本领域公知，包括在给定时间和给定发酵体积内形成的发酵产物(例如dsRNA)的浓度(例如千克产物/小时/升)。术语“生产效率”包括达到特定生产水平所需的时间(例如细胞达到最终化学品的特定输出率所耗费的时间)。
术语“产率”或“产物/碳产率”为本领域公知，包括碳源转化为产物(例如精细化学产品)的效率。这通常书写为例如千克产物/千克碳源。通过提高化合物的产率或生产，在给定量的时间内在给定量的培养物中回收的分子或回收的该化合物的有用分子的量提高。
术语“重组微生物”包括这样的微生物，该微生物已这样进行遗传修饰，使得它们与衍生它的野生型微生物相比显示改变或不同的基因型和/或表型(例如，在该遗传修饰影响该微生物的编码核酸序列时)。重组微生物包含至少一个重组核酸分子。
对于核酸分子，术语“重组的”指用重组核酸技术人为产生的核酸分子。该术语包括这样的核酸分子，该核酸分子不这样存在于自然界中或不存在于该核酸分子所衍生自的生物中，而是人为修饰、改变、突变或以其他方式操作。优选地，“重组核酸分子”是因至少一个核酸而在序列上不同于天然存在的核酸分子的非天然存在的核酸分子。“重组核酸分子”还可以包含“重组构建体”，其包含(优选有效连接)不以该顺序天然存在的核酸分子序列。用于产生该重组核酸分子的优选方法可以包括克隆技术、定向或非定向诱变、基因合成或重组技术。
这种重组核酸分子的实例是已插入异源DNA序列的质粒或与该重组核酸分子所衍生自的基因或启动子相比已突变的基因或启动子。可以借助本领域已知的定向诱变技术或通过随机诱变技术(如化学、UV或x射线诱变)或定向进化技术引入突变。
术语“定向进化”与术语“代谢进化”在本文中作为同义词使用，涉及应用有利于具有目的性状的突变体生长的选择压力。选择压力可以基于不同培养条件、ATP和生长偶联的选择及氧化还原相关选择。可以用伴随系列转移接种的分批发酵或使用相同压力的连续培养实施选择压力。
术语“表达”或“基因表达”指一个或多个特定基因或特定遗传载体构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”尤其指一个或多个基因或遗传载体构建体转录为mRNA。该过程包括DNA的转录，且可以包括所得到的RNA产物的加工。术语“表达”或“基因表达”还可以包括mRNA的翻译和随之发生的所编码的蛋白质的合成，即蛋白质表达。
附图简述
图1：载体pSJ+GFP(HPT)-MF
图2：载体pSJ(basic)-MF
图3：表1：真菌孢子磁转染的结果概述
实施例
化学品和常用方法
除非另有说明，为本发明的目的而进行的克隆方法，包括限制性消化、琼脂糖凝胶电泳、核酸纯化、核酸连接、转化、细菌细胞的选择和培养，按(Sambrook J,Fritsch EF和Maniatis T(1989))所述进行。重组DNA的序列分析用使用Sanger技术(Sanger等人,1977)的激光荧光DNA测序仪(Applied Biosys-tems,Foster City,CA,USA)进行。除非另有说明，化学品和试剂购自Sigma Aldrich(Sigma Aldrich,St.Louis,USA)、Promega(Madison,WI,USA)、Duchefa(Haarlem,荷兰)或Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)。限制性核酸内切酶购自New England Biolabs(Ipswich,MA,USA)或Roche Diagnostics GmbH(Penzberg,德国)。寡核苷酸由Eurofins MWG Operon(Ebersberg,德国)合成。
实施例1.Nano Fe3O4/PEI粒子的产生
按专利申请CN103233042中所述制备Nano Fe3O4/PEI。
实施例2.Nano Fe3O4/PEI基因载体介导的基因转移至豆薯层锈菌(Phakopsorapachyrhizi)孢子
含有驱动与杀真菌剂抗性相关的SucDH1(H254Y)基因和DsRed报告基因二者的真菌Uf-PMA1启动子和终止子的载体(Djulic等人，Fungal Biology 115,633-642(2011))可通过限制性酶消化来线性化，并与包被有PEI的磁性纳米粒子混合。通过轻轻敲打受感染的叶片并收集孢子，可以收集到豆薯层锈菌的真菌孢子。
包被PEI的磁性纳米粒子可与质粒DNA以1:2的比例混合，即1mg磁性纳米粒子和2mg质粒DNA，随后加至含有约106个孢子的1mL水溶液中。然后，将该混合物放入0.3T磁场中进行常规混合。
按照Djulic等人(同上)概述的流程进行抗性真菌的选择。使用50mg/mL萎锈灵(Carboxin)处理的植物选择显示真菌孢子的成功转化。
实施例3.DNA与MNP的结合
MNP与质粒DNA混合，通过正电荷(MNP)和负电荷(DNA)之间的吸引形成复合物(MNP/DNA复合物)。如果MNP完全装载DNA，则MNP/DNA复合物没有电荷，将在电泳实验时停留在凝胶孔中。当有超过MNP能结合的DNA时，它将进入凝胶中，可以检测到DNA条带。未检测到DNA带的最高MNP/DNA比率决定了MNP与质粒DNA的最佳比率。Magnetofection技术厂家提供了两种类型的MNP(PolyMAG和CombiMAG)，并对二者都进行了测试。
结果显示，质粒DNA不结合CombiMAG珠，而是结合PolyMAG珠。此外，PCR衍生的线性DNA结合PolyMAG珠。
实施例4.稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)和小麦叶枯病菌的转化
使用两种以潮霉素为选择标记并携带GFP表达盒的载体。这些载体对这两种真菌很有效。质粒pSJ+GFP(HPT)-MF和pSJ(basic)-MF分别如图1和图2所示。在96孔板：200μl/孔(DNA+MNP的体积)和24孔板：500μl/孔(DNA+MNP的体积)中测试了4℃磁珠与DNA的0.5小时、1小时和2小时结合时间。DNA量/孔设置为250ng/孔。分别测试了104/ml、105/ml、106/ml和107/ml的所述Magnaporthe和Zymoseptoria真菌孢子密度。
对于DNA装载到MNP的结合时间1h或2h，孢子密度105/ml、106/ml或107/ml，以及孢子在磁性平板上的孵育时间30min，转染成功。
实施例5.递送DNA至来自小麦叶枯病菌的孢子的结果
使用萌发0小时、0.5小时、1小时、2小时和24小时的真菌孢子，用质粒DNA达到了成功递送DNA至孢子。如果与孢子孵育的DNA/MNP复合物浓度增加，则可将线性DNA递送至新鲜收获的孢子。发现105/ml、106/ml和107/ml的孢子密度可递送DNA至孢子，转化率随着孢子密度的增加而增加。例如，转化率为105/ml，低于106/ml，低于107/ml。
实施例6.萌发时间和转化效率
在孢子密度为105/ml、106/ml和107/ml的情况下，如果磁转染发生在真菌孢子开始萌发后0小时、0.5小时、1小时、2小时或24小时，则可观察到DNA递送至孢子。在较高密度和0小时萌发时间下观察到DNA向孢子的最高递送。
在southern印迹中，可以确认DNA整合入基因组，转化率低于农杆菌介导的转化。
实施例7.递送DNA至来自稻瘟病菌的孢子的结果
使用萌发0小时、0.5小时、1小时、2小时的真菌孢子，用质粒DNA达到了成功递送DNA至孢子。如果与孢子孵育的DNA/MNP复合物浓度增加，则可将线性DNA递送至萌发0小时、0.5小时、1小时、2小时和24小时的孢子。不依赖于DNA/MNP复合物密度，在萌发2小时后达到线性DNA以及质粒DNA的最高递送率。发现105/ml、106/ml和107/ml的孢子密度可递送DNA至孢子，转化率随着孢子密度的增加而增加。例如，转化率为105/ml，低于106/ml，低于107/ml。
Figure IDA0003431718530000011
Figure IDA0003431718530000021
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Claims (16)

1.用于将多核苷酸分子引入真菌孢子的方法，其包括使真菌孢子和携带该多核苷酸的磁性纳米粒子的混合物暴露于磁力，例如磁体和/或磁场。
2.根据权利要求1所述的用于将多核苷酸分子引入真菌孢子的方法，其包括以下步骤：
a.将要转移入孢子的多核苷酸分子装载在磁性纳米粒子(MNP)上，和
b.将装载在所述磁性纳米粒子上的所述多核苷酸分子(DNA-MNP)加至所述孢子，和
c.使该混合物暴露于磁力，例如磁体和/或磁场，
d.在所述磁体存在下孵育该混合物，以允许将多核苷酸分子引入所述孢子，
从而将多核苷酸分子引入所述孢子。
权利要求1至2所述的方法，其中孵育步骤中的孢子密度大于105/ml/250ng多核苷酸。
3.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中孵育步骤中每毫升的孢子数为105个或更高，例如106个或更高，优选地107个或更高。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中装载到MNP的多核苷酸为DNA或RNA或核苷酸类似物。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中孢子转化为未萌发或萌发孢子。
6.根据权利要求1至55中任一项所述的方法，其中孢子在转化前的孢子萌发时间在0至2h之间。
7.用于产生转化真菌的方法，其包括权利要求1至6中任一项所述的方法的步骤，以及选择存在所述多核苷酸的真菌孢子和/或真菌细胞，例如，所述多核苷酸整合入所述孢子的基因组。
8.根据权利要求7所述的方法，其中多核苷酸或其片段稳定整合入孢子DNA的基因组。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其包括从真菌孢子生长出真菌。
10.用于将核酸递送至真菌孢子的系统，其包含装载有核酸的磁性纳米粒子。
11.用于用多核苷酸转化真菌孢子的试剂盒，其包含装载有多核苷酸的MNP和用于磁转染孢子的工具。
12.组合物，其包含装载有核酸分子的MNP、真菌孢子和缓冲液。
13.根据权利要求12的组合物，其中对于100ng至500ng多核苷酸，组合物中的孢子密度大于105个/ml。
14.根据权利要求12或13的组合物，其中对于200ng至300ng之间的DNA量的转染，组合物中每毫升的孢子数为105个至107个。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法、系统、试剂盒或组合物，其中多核苷酸是双链或单链核糖核苷酸，例如RNA，例如microRNA、反义RNA或dsRNA，或DNA，例如线性DNA或质粒DNA，和/或核酸类似物。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法、系统、试剂盒或组合物，其中装载至MNP的多核苷酸是质粒DNA或线性DNA。
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