CN110628799A - 一种细菌启动子报告载体的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细菌启动子报告载体的构建方法及其应用，首先构建含有β‑半乳糖苷酶lacZ基因的载体，将目的基因启动子插入到该载体中的lacZ基因上游，得到用于检测基因启动子活性的报告载体。将此报告载体导入待测菌株中，通过检测和比较菌株β‑半乳糖苷酶活性推测目的基因启动子活性的变化。本发明的报告载体既可以用于检测细菌中基因启动子活性，判断基因表达的强弱，又可以用于检测细菌中未知DNA片段有无启动子活性，判断基因启动子的位置，操作成本低，结果稳定可靠。

Description

一种细菌启动子报告载体的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种细菌启动子报告载体的构建方法及其应用。

背景技术

原核生物中转录和翻译是连续的，因此转录水平上的调控是原核生物中最重要的调控方式。基因的转录表达需要启动子，启动子的活性决定基因的表达水平。检测和比较基因启动子活性对于了解基因的功能和调控方式有重要意义。目前常用检测基因启动子活性的方法为荧光定量PCR。大体步骤为抽提总RNA，反转录得到cDNA，利用带荧光染料的PCR体系定量cDNA的量，以此评估总RNA中目的基因转录出的mRNA的量，用以比较基因启动子的活性。由于RNA不稳定容易被降解，反转录的效率高低有波动，而且荧光染料的价格不菲，这些因素会导致荧光定量PCR的结果不稳定，且成本较高。LacZ基因的产物是β-半乳糖苷酶，其底物为半乳糖苷，被分解后生成的产物有颜色，因此可以采用吸光值法检测半乳糖苷酶活性，通过目的基因启动子启动表达的半乳糖苷酶活性来判断启动子活性，操作方便简单，成本低。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了一种细菌启动子报告载体的构建方法，该报告载体既可以用来检测基因启动子活性，判断基因表达的强弱，又可以用来检测未知DNA片段有无启动子活性，来预测基因启动子的位置，操作简单方便，结果稳定可靠。

本发明的技术方案是这样实现的：

第一方面，本发明提供了一种细菌启动子报告载体的构建方法，包括如下步骤：

S1、以pBBR1MCS-5质粒为模板，反向扩增得到质粒骨架片段，包括庆大霉素抗性基因、复制子和mob转移基因；

S2、以pSH18-34质粒为模板，扩增得到β-半乳糖苷酶lacZ基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

S3、用限制性内切酶对步骤S1所述质粒骨架片段和步骤S2所述lacZ基因进行酶切，然后连接得到报告载体pBBRMCS-lacZ；

S4、以细菌基因组总DNA为模板，扩增得到目的基因x的启动子xpro；

S5、将启动子xpro连接到报告载体pBBRMCS-lacZ上，得到报告载体pBBRMCS-xpro-lacZ。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述报告载体pBBRMCS-lacZ的完整核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S2中，在扩增所述lacZ基因的过程中，上游引物设置有多克隆位点，用于插入待检测基因启动子。

进一步地，优选的，所述多克隆位点包括KpnI、XhoI、HindIII、EcoRI、PstI、SmaI和BamHI。

在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S3中，所述限制性内切酶为KpnI和XbaI。

第二方面，本发明提供了报告载体pBBRMCS-xpro-lacZ在检测细菌基因启动子活性中的应用，包括将所述报告载体pBBRMCS-xpro-lacZ转入细菌细胞中，通过检测细胞中β-半乳糖酶活性判断所述细菌基因启动子的活性。

第三方面，本发明还提供了一种检测细菌未知DNA片段有无启动子活性的方法，包括在报告载体pBBRMCS-lacZ的lacZ基因上游插入所述未知DNA片段，然后导入细菌细胞中，通过检测细胞中β-半乳糖酶活性判断所述未知DNA片段有无启动子活性。

本发明的一种细菌启动子报告载体的构建方法及其应用相对于现有技术具有以下有益效果：

1、本发明不需要进行RNA抽提、反转录、荧光定量PCR等操作，无需购买荧光染料，而通过构建启动子报告载体，利用半乳糖苷酶活性判断基因启动子启动表达的情况，结果稳定可靠，重复性好，成本低；

2、lacZ基因上游的多克隆位点有7种常用限制性内切酶酶位点，包容性强，可用于插入各种目的基因的启动子，根据其碱基数目插入到合适酶切位点之间，使得目的基因启动子与lacZ蛋白能融合表达；

3、载体以pBBR1MCS-5为骨架，因该载体属于广宿主载体，可适用于多种细菌的启动子活性检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1报告载体pBBRMCS-lacZ的构建示意图。

图2为不同菌株中β-半乳糖苷酶活性的检测图，WT为野生型恶臭假单胞菌KT2440菌株，WT+pBBRMCS-lacZ为导入pBBRMCS-lacZ载体的野生型恶臭假单胞菌KT2440菌株，DH5α为代表大肠杆菌DH5α菌株。

图3为实施例2报告载体pBBRMCS-fleSpro-lacZ的图谱。

图4为实施例2pBBRMCS-fleSpro-lacZ载体在不同菌株中表达的β-半乳糖苷酶活性的检测，WT为野生型恶臭假单胞菌KT2440菌株，ΔfleQ为fleQ缺失突变体。

图5为实施例3中报告载体pBBRMCS-PP_1493pro-lacZ的图谱。

图6为实施例3中报告载体pBBRMCS-PP_1494pro-lacZ的图谱。

图7为实施例3将载体pBBRMCS-lacZ、pBBRMCS-PP_1493pro-lacZ、pBBRMCS-PP_1494pro-lacZ分别导入野生型恶臭假单胞菌KT2440菌株中检测β-半乳糖苷酶活性的结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实验用的大肠杆菌DH5α和恶臭假单胞菌KT2440购买于北京全式金公司，生长于常规的LB培养基，选择生长所用的抗生素浓度为：40μg/mL庆大霉素Gm。实验所用的原始质粒pBBR1MCS-5、pSH18-34和pUC19均购买于生物技术公司，常见于市面。载体的克隆、感受态细胞的制备和电转化步骤见分子克隆实验指南。

实施例1、报告载体的构建

S1、报告载体pBBRMCS-lacZ的构建

报告载体pBBRMCS-lacZ的构建示意图如图1所示，利用引物对P1/P2，以pBBR1MCS-5质粒为模板，反向扩增得到质粒骨架片段，包括庆大霉素抗性基因、复制子和mob转移基因；利用引物对P3/P4，以pSH18-34质粒为模板，扩增lacZ基因；将上述两种PCR产物用KpnI和XbaI酶切，并利用T4 DNA连接酶连接，测序验证，得到载体pBBRMCS-lacZ。引物P3上有7种常见限制性内切酶的识别序列(KpnI，XhoI，HindIII，EcoRI，PstI，SmaI和BamHI)，连接后为载体提供多克隆位点。如图1所示的报告载体pBBRMCS-lacZ中，tac启动子和lacI构成诱导型表达元件；gentamicin-R为庆大霉素抗性基因用于筛选；mob基因可以让质粒通过接合转移在不同菌株中转移；lacZ基因上游无启动子，lacZ基因不能转录表达；lacZ基因上游是多克隆位点，有7种常用的限制性内切酶酶切位点，可以将目的基因的启动子通过这些酶切位点连入报告载体pBBRMCS-lacZ中，实现与lacZ基因的融合表达。

S2、报告载体pBBRMCS-lacZ的验证

通过电转化将pBBRMCS-lacZ载体和pUC19质粒分别导入恶臭假单胞菌KT2440和大肠杆菌DH5α中，将野生型恶臭假单胞菌KT2440、导入pBBRMCS-lacZ载体的KT2440菌株和导入pUC19质粒的大肠杆菌DH5α均培养至对数中期，其中在大肠杆菌的培养过程中需添加0.5mM的IPTG，用于诱导表达lacZ，然后检测三株菌细胞中β-半乳糖苷酶活性。

β-半乳糖苷酶能将底物邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)水解为半乳糖和黄色的邻-硝基苯酚(ONP)，在一定范围内，产物颜色深度和产物量成正比，即产物颜色深度与β-半乳糖苷酶酶活成正比，因此可以通过检测产物的颜色，计算出酶活，用于评估基因启动子的活性。β-半乳糖苷酶活性检测及计算的具体方法如下：

1)取适当体积的培养物，12,000×g离心1min，弃上清液，加入2mL Z Buffer悬浮菌体；

2)取1.4mL的样品用于菌液浓度A₆₀₀测定，另取一定体积(V mL)的菌液，转移到新的离心管中，用Z Buffer补足到1mL，再加入100μL氯仿和50μL0.01％SDS，混匀后，置于28℃水浴锅中平衡5min，向样品中加入200μL底物ONPG(4mg/mL)溶液，混匀后置于28℃水浴锅中开始反应，并记录反应起始时间t₀；

3)待样品出现淡黄色(A₄₂₀＝0.6-0.9)，加入0.5mL 1mol/L的Na₂CO₃溶液，混匀以终止反应，记录反应终止时间t；

4)样品在13,441×g离心3min后，用岛津UV-160A型紫外分光光度计测定上清液的A₄₂₀和A₅₅₀；

5)计算β-半乳糖苷酶活性，公式如下：

Miller Units＝1000×[(A₄₂₀-1.75×A₅₅₀)]/(T×V×A₆₀₀)

其中，T(反应时间)＝t-t₀，单位为min。

Z Buffer：0.06mol/L Na₂HPO₄，0.04mol/L NaH₂PO₄，0.01mol/L KCl，0.001mol/LMgSO₄，0.05mol/Lβ-巯基乙醇，pH 7.0。β-巯基乙醇要在用前加入。

β-半乳糖苷酶活性检测结果如图2所示，由于野生型恶臭假单胞菌KT2440基因组中没有lacZ基因，因此通过酶反应产物吸光值计算的酶活力单位极低，同样地，因pBBRMCS-5载体构建过程中去掉了lacZ基因上游的启动子，导致报告载体pBBRMCS-lacZ中的lacZ基因无法表达，因此导入pBBRMCS-lacZ载体的恶臭假单胞菌KT2440中β-半乳糖苷酶活性也极低，约为10个单位；而作为正对照，因为pU19质粒上lacZ基因上游有启动子，可以启动lacZ基因表达β-半乳糖苷酶，所以大肠杆菌DH5α+pUC19所测出的半乳糖苷酶活性约为1300个单位。

S3、报告载体pBBRMCS-xpro-lacZ的构建

利用多克隆位点将目的基因x的启动子xpro连入pBBRMCS-lacZ载体中，形成启动子xpro的报告载体pBBRMCS-xpro-lacZ。

实施例2、检测fleS基因的启动子活性

S1、报告载体pBBRMCS-fleSpro-lacZ的构建

报告载体pBBRMCS-fleSpro-lacZ的图谱如图3所示。FleS是假单胞菌中的一种组氨酸激酶，其基因启动子活性受FleQ正调控，缺失fleQ会导致fleS启动子活性下降。本发明用fleS启动子作为目的启动子来检验本发明的可行性。以恶臭假单胞菌KT2440基因组总DNA为模板，利用引物对P5/P6扩增出fleS基因的启动子，然后用BamHI和EcoRI连入pBBRMCS-lacZ载体，测序验证，确定启动子序列正确，最终得到报告载体pBBRMCS-fleSpro-lacZ。

S2、检测fleS启动子的活性

通过电转化将pBBRMCS-fleSpro-lacZ载体分别导入野生型恶臭假单胞菌KT2440和fleQ缺失突变体中，28℃条件下培养12h，同样地用实施例1步骤S2中所述β-半乳糖苷酶活性检测方法检测比较两株菌中的β-半乳糖苷酶活性。结果如图4所示，在野生型菌株中β-半乳糖苷酶活性约为310个单位，而在fleQ突变体中大幅下降，仅为35个单位，说明fleQ缺失导致fleS启动子活性下降，与已有报道结果一致。

实施例3、检测未知DNA片段有无启动子活性

S1、报告载体pBBRMCS-PP_1493pro-lacZ和pBBRMCS-PP_1494pro-lacZ的构建

PP_1493和PP_1494是恶臭假单胞菌KT2240的wsp操纵子中的两个基因，PP_1494负责合成第二信使c-di-GMP，PP_1493抑制PP_1494的合成活性，两个基因与菌株生物被膜形成有密切关联。关于PP_1493和PP_1494基因前面的序列是否有启动子活性目前尚不清楚，本发明检测PP_1493和PP_1494基因上游一段未知序列有无启动子活性来检验本发明的可行性。用引物对P7/P8扩增PP_1493基因上游500bp的序列，用EcoRI+BamHI酶切，并连接到pBBRMCS-lacZ载体上，得到pBBRMCS-PP_1493pro-lacZ，质粒图谱如图5所示。用引物对P9/P10扩增PP_1494基因上游500bp的序列，用EcoRI+BamHI酶切，并连接到pBBRMCS-lacZ载体上，得到pBBRMCS-PP_1494pro-lacZ，质粒图谱如图6所示。

S2、检测PP_1493和PP_1494基因上游未知片段的启动子活性

通过电转化将载体pBBRMCS-lacZ、pBBRMCS-PP_1493pro-lacZ和pBBRMCS-PP_1494pro-lacZ分别导入野生型恶臭假单胞菌KT2440中，28℃条件下培养12h，同样地用实施例1步骤S2中所述β-半乳糖苷酶活性检测方法检测比较三株菌中的β-半乳糖苷酶活性。结果如图7所示，导入pBBRMCS-lacZ载体的野生型菌株中β-半乳糖苷酶活性约为13个单位，导入pBBRMCS-PP_1493pro-lacZ载体的野生型菌株中β-半乳糖苷酶活性约为10个单位，导入pBBRMCS-lacZ和pBBRMCS-PP_1493pro-lacZ载体的野生型菌株中β-半乳糖苷酶活性均非常低，而导入pBBRMCS-PP_1494pro-lacZ载体的野生型菌株中β-半乳糖苷酶活性约为230个单位，说明PP_1493基因上游的DNA序列无启动子活性，无法启动lacZ基因的表达，而PP_1494基因前面的DNA序列具有启动子活性，可以启动lacZ基因表达β-半乳糖苷酶。

表1本发明所用的引物序列

以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉博欧特生物科技有限公司

<120> 一种细菌启动子报告载体的构建方法及其应用

<130> 2019-9-25

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3072

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

ggagcttggc tgttgcccgt ctcactggtg aaaagaaaaa ccaccctggc gcccaatacg 60

caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc 120

cgacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc 180

cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggcg ctttgcctgg 240

tttccggcac cagaagcggt gccggaaagc tggctggagt gcgatcttcc tgaggccgat 300

actgtcgtcg tcccctcaaa ctggcagatg cacggttacg atgcgcccat ctacaccaac 360

gtaacctatc ccattacggt caatccgccg tttgttccca cggagaatcc gacgggttgt 420

tactcgctca catttaatgt tgatgaaagc tggctacagg aaggccagac gcgaattatt 480

tttgatggcg ttaactcggc gtttcatctg tggtgcaacg ggcgctgggt cggttacggc 540

caggacagtc gtttgccgtc tgaatttgac ctgagcgcat ttttacgcgc cggagaaaac 600

cgcctcgcgg tgatggtgct gcgttggagt gacggcagtt atctggaaga tcaggatatg 660

tggcggatga gcggcatttt ccgtgacgtc tcgttgctgc ataaaccgac tacacaaatc 720

agcgatttcc atgttgccac tcgctttaat gatgatttca gccgcgctgt actggaggct 780

gaagttcaga tgtgcggcga gttgcgtgac tacctacggg taacagtttc tttatggcag 840

ggtgaaacgc aggtcgccag cggcaccgcg cctttcggcg gtgaaattat cgatgagcgt 900

ggtggttatg ccgatcgcgt cacactacgt ctgaacgtcg aaaacccgaa actgtggagc 960

gccgaaatcc cgaatctcta tcgtgcggtg gttgaactgc acaccgccga cggcacgctg 1020

attgaagcag aagcctgcga tgtcggtttc cgcgaggtgc ggattgaaaa tggtctgctg 1080

ctgctgaacg gcaagccgtt gctgattcga ggcgttaacc gtcacgagca tcatcctctg 1140

catggtcagg tcatggatga gcagacgatg gtgcaggata tcctgctgat gaagcagaac 1200

aactttaacg ccgtgcgctg ttcgcattat ccgaaccatc cgctgtggta cacgctgtgc 1260

gaccgctacg gcctgtatgt ggtggatgaa gccaatattg aaacccacgg catggtgcca 1320

atgaatcgtc tgaccgatga tccgcgctgg ctaccggcga tgagcgaacg cgtaacgcga 1380

atggtgcagc gcgatcgtaa tcacccgagt gtgatcatct ggtcgctggg gaatgaatca 1440

ggccacggcg ctaatcacga cgcgctgtat cgctggatca aatctgtcga tccttcccgc 1500

ccggtgcagt atgaaggcgg cggagccgac accacggcca ccgatattat ttgcccgatg 1560

tacgcgcgcg tggatgaaga ccagcccttc ccggctgtgc cgaaatggtc catcaaaaaa 1620

tggctttcgc tacctggaga gacgcgcccg ctgatccttt gcgaatacgc ccacgcgatg 1680

ggtaacagtc ttggcggttt cgctaaatac tggcaggcgt ttcgtcagta tccccgttta 1740

cagggcggct tcgtctggga ctgggtggat cagtcgctga ttaaatatga tgaaaacggc 1800

aacccgtggt cggcttacgg cggtgatttt ggcgatacgc cgaacgatcg ccagttctgt 1860

atgaacggtc tggtctttgc cgaccgcacg ccgcatccag cgctgacgga agcaaaacac 1920

cagcagcagt ttttccagtt ccgtttatcc gggcaaacca tcgaagtgac cagcgaatac 1980

ctgttccgtc atagcgataa cgagctcctg cactggatgg tggcgctgga tggtaagccg 2040

ctggcaagcg gtgaagtgcc tctggatgtc gctccacaag gtaaacagtt gattgaactg 2100

cctgaactac cgcagccgga gagcgccggg caactctggc tcacagtacg cgtagtgcaa 2160

ccgaacgcga ccgcatggtc agaagccggg cacatcagcg cctggcagca gtggcgtctg 2220

gcggaaaacc tcagtgtgac gctccccgcc gcgtcccacg ccatcccgca tctgaccacc 2280

agcgaaatgg atttttgcat cgagctgggt aataagcgtt ggcaatttaa ccgccagtca 2340

ggctttcttt cacagatgtg gattggcgat aaaaaacaac tgctgacgcc gctgcgcgat 2400

cagttcaccc gtgcaccgct ggataacgac attggcgtaa gtgaagcgac ccgcattgac 2460

cctaacgcct gggtcgaacg ctggaaggcg gcgggccatt accaggccga agcagcgttg 2520

ttgcagtgca cggcagatac acttgctgat gcggtgctga ttacgaccgc tcacgcgtgg 2580

cagcatcagg ggaaaacctt atttatcagc cggaaaacct accggattga tggtagtggt 2640

caaatggcga ttaccgttga tgttgaagtg gcgagcgata caccgcatcc ggcgcggatt 2700

ggcctgaact gccagctggc gcaggtagca gagcgggtaa actggctcgg attagggccg 2760

caagaaaact atcccgaccg ccttactgcc gcctgttttg accgctggga tctgccattg 2820

tcagacatgt ataccccgta cgtcttcccg agcgaaaacg gtctgcgctg cgggacgcgc 2880

gaattgaatt atggcccaca ccagtggcgc ggcgacttcc agttcaacat cagccgctac 2940

agtcaacagc aactgatgga aaccagccat cgccatctgc tgcacgcgga agaaggcaca 3000

tggctgaata tcgacggttt ccatatgggg attggtggcg acgactcctg gagcccgtca 3060

gtatcggcgt aa 3072

<210> 2

<211> 7027

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

ctcgggccgt ctcttgggct tgatcggcct tcttgcgcat ctcacgcgct cctgcggcgg 60

cctgtagggc aggctcatac ccctgccgaa ccgcttttgt cagccggtcg gccacggctt 120

ccggcgtctc aacgcgcttt gagattccca gcttttcggc caatccctgc ggtgcatagg 180

cgcgtggctc gaccgcttgc gggctgatgg tgacgtggcc cactggtggc cgctccaggg 240

cctcgtagaa cgcctgaatg cgcgtgtgac gtgccttgct gccctcgatg ccccgttgca 300

gccctagatc ggccacagcg gccgcaaacg tggtctggtc gcgggtcatc tgcgctttgt 360

tgccgatgaa ctccttggcc gacagcctgc cgtcctgcgt cagcggcacc acgaacgcgg 420

tcatgtgcgg gctggtttcg tcacggtgga tgctggccgt cacgatgcga tccgccccgt 480

acttgtccgc cagccacttg tgcgccttct cgaagaacgc cgcctgctgt tcttggctgg 540

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ttaattttct ctggggaaaa gcctccggcc tgcggcctgc gcgcttcgct tgccggttgg 1260

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gggttgcgca gcaacccgta agtgcgctgt tccagactat cggctgtagc cgcctcgccg 2520

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ccagcaatag acataagcgg ctatttaacg accctgccct gaactctaga ttacgccgat 2820

actgacgggc tccaggagtc gtcgccacca atccccatat ggaaaccgtc gatattcagc 2880

catgtgcctt cttccgcgtg cagcagatgg cgatggctgg tttccatcag ttgctgttga 2940

ctgtagcggc tgatgttgaa ctggaagtcg ccgcgccact ggtgtgggcc ataattcaat 3000

tcgcgcgtcc cgcagcgcag accgttttcg ctcgggaaga cgtacggggt atacatgtct 3060

gacaatggca gatcccagcg gtcaaaacag gcggcagtaa ggcggtcggg atagttttct 3120

tgcggcccta atccgagcca gtttacccgc tctgctacct gcgccagctg gcagttcagg 3180

ccaatccgcg ccggatgcgg tgtatcgctc gccacttcaa catcaacggt aatcgccatt 3240

tgaccactac catcaatccg gtaggttttc cggctgataa ataaggtttt cccctgatgc 3300

tgccacgcgt gagcggtcgt aatcagcacc gcatcagcaa gtgtatctgc cgtgcactgc 3360

aacaacgctg cttcggcctg gtaatggccc gccgccttcc agcgttcgac ccaggcgtta 3420

gggtcaatgc gggtcgcttc acttacgcca atgtcgttat ccagcggtgc acgggtgaac 3480

tgatcgcgca gcggcgtcag cagttgtttt ttatcgccaa tccacatctg tgaaagaaag 3540

cctgactggc ggttaaattg ccaacgctta ttacccagct cgatgcaaaa atccatttcg 3600

ctggtggtca gatgcgggat ggcgtgggac gcggcgggga gcgtcacact gaggttttcc 3660

gccagacgcc actgctgcca ggcgctgatg tgcccggctt ctgaccatgc ggtcgcgttc 3720

ggttgcacta cgcgtactgt gagccagagt tgcccggcgc tctccggctg cggtagttca 3780

ggcagttcaa tcaactgttt accttgtgga gcgacatcca gaggcacttc accgcttgcc 3840

agcggcttac catccagcgc caccatccag tgcaggagct cgttatcgct atgacggaac 3900

aggtattcgc tggtcacttc gatggtttgc ccggataaac ggaactggaa aaactgctgc 3960

tggtgttttg cttccgtcag cgctggatgc ggcgtgcggt cggcaaagac cagaccgttc 4020

atacagaact ggcgatcgtt cggcgtatcg ccaaaatcac cgccgtaagc cgaccacggg 4080

ttgccgtttt catcatattt aatcagcgac tgatccaccc agtcccagac gaagccgccc 4140

tgtaaacggg gatactgacg aaacgcctgc cagtatttag cgaaaccgcc aagactgtta 4200

cccatcgcgt gggcgtattc gcaaaggatc agcgggcgcg tctctccagg tagcgaaagc 4260

cattttttga tggaccattt cggcacagcc gggaagggct ggtcttcatc cacgcgcgcg 4320

tacatcgggc aaataatatc ggtggccgtg gtgtcggctc cgccgccttc atactgcacc 4380

gggcgggaag gatcgacaga tttgatccag cgatacagcg cgtcgtgatt agcgccgtgg 4440

cctgattcat tccccagcga ccagatgatc acactcgggt gattacgatc gcgctgcacc 4500

attcgcgtta cgcgttcgct catcgccggt agccagcgcg gatcatcggt cagacgattc 4560

attggcacca tgccgtgggt ttcaatattg gcttcatcca ccacatacag gccgtagcgg 4620

tcgcacagcg tgtaccacag cggatggttc ggataatgcg aacagcgcac ggcgttaaag 4680

ttgttctgct tcatcagcag gatatcctgc accatcgtct gctcatccat gacctgacca 4740

tgcagaggat gatgctcgtg acggttaacg cctcgaatca gcaacggctt gccgttcagc 4800

agcagcagac cattttcaat ccgcacctcg cggaaaccga catcgcaggc ttctgcttca 4860

atcagcgtgc cgtcggcggt gtgcagttca accaccgcac gatagagatt cgggatttcg 4920

gcgctccaca gtttcgggtt ttcgacgttc agacgtagtg tgacgcgatc ggcataacca 4980

ccacgctcat cgataatttc accgccgaaa ggcgcggtgc cgctggcgac ctgcgtttca 5040

ccctgccata aagaaactgt tacccgtagg tagtcacgca actcgccgca catctgaact 5100

tcagcctcca gtacagcgcg gctgaaatca tcattaaagc gagtggcaac atggaaatcg 5160

ctgatttgtg tagtcggttt atgcagcaac gagacgtcac ggaaaatgcc gctcatccgc 5220

cacatatcct gatcttccag ataactgccg tcactccaac gcagcaccat caccgcgagg 5280

cggttttctc cggcgcgtaa aaatgcgctc aggtcaaatt cagacggcaa acgactgtcc 5340

tggccgtaac cgacccagcg cccgttgcac cacagatgaa acgccgagtt aacgccatca 5400

aaaataattc gcgtctggcc ttcctgtagc cagctttcat caacattaaa tgtgagcgag 5460

taacaacccg tcggattctc cgtgggaaca aacggcggat tgaccgtaat gggataggtt 5520

acgttggtgt agatgggcgc atcgtaaccg tgcatctgcc agtttgaggg gacgacgaca 5580

gtatcggcct caggaagatc gcactccagc cagctttccg gcaccgcttc tggtgccgga 5640

aaccaggcaa agcgccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg 5700

cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt 5760

cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt 5820

tgcgtattgg gcgccagggt ggtttttctt ttcaccagtg agacgggcaa cagccaagct 5880

ccggatcccc cgggctgcag gaattcgata tcaagcttga cctcgagccc ggtaccggca 5940

tcagcacctt gtcgccttgc gtataatatt tgcccatgga cgcacaccgt ggaaacggat 6000

gaaggcacga acccagttga cataagcctg ttcggttcgt aaactgtaat gcaagtagcg 6060

tatgcgctca cgcaactggt ccagaacctt gaccgaacgc agcggtggta acggcgcagt 6120

ggcggttttc atggcttgtt atgactgttt ttttgtacag tctatgcctc gggcatccaa 6180

gcagcaagcg cgttacgccg tgggtcgatg tttgatgtta tggagcagca acgatgttac 6240

gcagcagcaa cgatgttacg cagcagggca gtcgccctaa aacaaagtta ggtggctcaa 6300

gtatgggcat cattcgcaca tgtaggctcg gccctgacca agtcaaatcc atgcgggctg 6360

ctcttgatct tttcggtcgt gagttcggag acgtagccac ctactcccaa catcagccgg 6420

actccgatta cctcgggaac ttgctccgta gtaagacatt catcgcgctt gctgccttcg 6480

accaagaagc ggttgttggc gctctcgcgg cttacgttct gcccaggttt gagcagccgc 6540

gtagtgagat ctatatctat gatctcgcag tctccggcga gcaccggagg cagggcattg 6600

ccaccgcgct catcaatctc ctcaagcatg aggccaacgc gcttggtgct tatgtgatct 6660

acgtgcaagc agattacggt gacgatcccg cagtggctct ctatacaaag ttgggcatac 6720

gggaagaagt gatgcacttt gatatcgacc caagtaccgc cacctaacaa ttcgttcaag 6780

ccgagatcgg cttcccggcc gcggagttgt tcggtaaatt gtcacaacgc cgccaggtgg 6840

cacttttcgg ggaaatgtgc gcgcccgcgt tcctgctggc gctgggcctg tttctggcgc 6900

tggacttccc gctgttccgt cagcagcttt tcgcccacgg ccttgatgat cgcggcggcc 6960

ttggcctgca tatcccgatt caacggcccc agggcgtcca gaacgggctt caggcgctcc 7020

cgaaggt 7027

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

cggggtaccg gcatcagcac cttgtcg 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

tgctctagag ttcagggcag ggtcgtt 27

<210> 5

<211> 75

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 5

cggggtaccg ggctcgaggt caagcttgat atcgaattcc tgcagcccgg gggatccgga 60

gcttggctgt tgccc 75

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 6

tgctctagat tacgccgata ctgacgggct 30

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 7

ccggaattcc ctggacctca aggactacc 29

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 8

cgcggatccg ggggctcggg atacgtg 27

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 9

ccggaattcg atgatggctc ggtggtcc 28

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 10

cgcggatccc atccctgagc aactccg 27

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 11

ccggaattcc ccgtgaaggc gaaccg 26

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 12

cgcggatccc gagttttcgt tggtggtc 28

Claims (7)

1.一种细菌启动子报告载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、以pBBR1MCS-5质粒为模板，反向扩增得到质粒骨架片段，包括庆大霉素抗性基因、复制子和mob转移基因；

S2、以pSH18-34质粒为模板，扩增得到β-半乳糖苷酶lacZ基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；

S3、用限制性内切酶对步骤S1所述质粒骨架片段和步骤S2所述lacZ基因进行酶切，然后连接得到报告载体pBBRMCS-lacZ；

S4、以细菌基因组总DNA为模板，扩增得到目的基因x的启动子xpro；

S5、将启动子xpro连接到报告载体pBBRMCS-lacZ上，得到报告载体pBBRMCS-xpro-lacZ。

2.如权利要求1所述的细菌启动子报告载体的构建方法，其特征在于：所述报告载体pBBRMCS-lacZ的完整核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.如权利要求1所述的细菌启动子报告载体的构建方法，其特征在于：步骤S2中，在扩增所述lacZ基因的过程中，上游引物设置有多克隆位点。

4.如权利要求3所述的细菌启动子报告载体的构建方法，其特征在于：所述多克隆位点包括KpnI、XhoI、HindIII、EcoRI、PstI、SmaI和BamHI。

5.如权利要求1所述的细菌启动子报告载体的构建方法，其特征在于：步骤S3中，所述限制性内切酶为KpnI和XbaI。

6.利用权利要求1得到的报告载体pBBRMCS-xpro-lacZ在检测细菌基因启动子活性中的应用，其特征在于：将所述报告载体pBBRMCS-xpro-lacZ转入细菌细胞中，通过检测细胞中β-半乳糖酶活性判断所述细菌基因启动子的活性。

7.一种检测细菌未知DNA片段有无启动子活性的方法，其特征在于：在权利要求1步骤S3得到的报告载体pBBRMCS-lacZ的lacZ基因上游插入所述未知DNA片段，然后导入细菌细胞中，通过检测细胞中β-半乳糖酶活性判断所述未知DNA片段有无启动子活性。