CN111394378A - 一种体外表达mRNA的质粒载体及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种体外表达mRNA的质粒载体及其构建方法和应用。该质粒载体包括位于待插入表达的基因尾部3’‑端的长度大于30的多聚腺苷脱氧核酸poly(A)片段。本发明构建的体外表达mRNA的质粒载体，包括表达目标蛋白基因和60个poly(A)，表达的mRNA直接拥有poly(A)，不需要额外的加尾操作。另外，体外转录所得mRNA在转染细胞后，呈现出更强的mRNA稳定性和更高的蛋白表达能力检测。

Description

一种体外表达mRNA的质粒载体及其构建方法和应用
技术领域
本发明本涉及分子生物学技术、细胞培养、免疫生物学和图像分析等技术领域。具体而言，包括通过酶切、连接等方式将60个多聚腺苷脱氧核酸片段替换已有质粒中原来的30个腺苷脱氧核酸序列，构建为一种可在细胞内表达mRNA的质粒载体pNeoCura-Exp060；随后将绿色荧光蛋白(eGFP)基因片段插入此载体中构成示例质粒，将此示例质粒转化入适当的大肠杆菌菌株、培育后提取质粒、在体外进行酶切线性化、转录得到带有对应60个多聚腺苷核酸尾部的示例mRNA；并将此示例mRNA转染细胞，最后通过检测细胞中不同时间点此mRNA含量和所表达的eGFP荧光蛋白强度定量评估此类载体所表达的mRNA稳定性和翻译表达能力。
背景技术
信使核糖核酸(mRNA)是真核生物基因表达的重要一环，在DNA-(转录)-mRNA、mRNA-(翻译)蛋白的中心法则中处于居中的重要地位。成熟mRNA由5’-帽、5’-非翻译区域(5’-UTR)、蛋白编码序列(CDS)、3’-非翻译区域(3’-UTR)、3’-多聚腺苷核酸(3’-poly(A))尾部组成。其中5’-帽和3’-poly(A)尾部对mRNA在体内或培养细胞系内的稳定性起到重要作用，进而对mRNA翻译为蛋白或多肽的效率存在影响。
目前在分子生物学领域，大量DNA质粒载体设计为可在体外转录为信使核糖核酸(mRNA，随后这些mRNA可用于生物医学研究、临床应用领域等。体外人工转录所得mRNA在一定程度上模拟了真核生物体内转录的mRNA，其5’-帽通常来自于体外转录试剂盒，而3’-poly(A)尾部则来自于DNA载体自身所包含的多聚腺苷脱氧核糖核酸序列(同样简称为3’-poly(A))模板。
天然或人工合成的mRNA的3’-poly(A)尾部在生物体或细胞内均起到保护mRNA、防止核酸外切酶降解的作用。目前学术界和工业界绝大部分使用的体外转录用载体仅包含长度为30的3’-poly(A)模板。
发明内容
一般来说对学术研究，要求在体外转录mRNA同时立即添加长poly(A)尾的需求并不多，大部分时候30个已经够用了，而如果需要更长poly(A)尾的实验，可以使用不带poly(A)的质粒模板，在转录之后使用额外的商业化加尾试剂盒添加更长的poly(A)尾。而用于工业化生产的质粒载体，时转录、加尾分两步操作在某些情况下不太现实。
本发明的目的是构建具有可提高所得mRNA的体内或细胞内稳定性和翻译表达能力的具有更长3’-poly(A)尾部模板的mRNA体外转录用载体。因此自行构建了这个能够在转录同时添加长度为60的poly(A)质粒载体且发现确实具有更长3’-poly(A)尾部的mRNA稳定性更佳、可翻译表达为蛋白或多肽的能力更强。
具体来说，以pNeoCura-Exp060为基础，本发明采用将pSP64-Poly(A)载体中原长度为30的3’-poly(A)区段替换为长度为60的类似区段来解决。本发明使用限制性内切酶SacI和EcoRI将pSP64-Poly(A)载体中长度为30的3’-poly(A)区段移除，并连接插入一段带有SacI位点粘性末端、KpnI位点、XhoI位点、长度为60的3’-poly(A)区段、MluI位点、EcoRI位点粘性末端的人工合成序列，构建为pNeoCura-Exp060质粒载体。
本发明的第一方面在于提供一种体外表达mRNA的质粒载体，包括位于待插入表达的基因尾部3’-端的长度大于30的多聚腺苷脱氧核酸poly(A)片段。
在本发明的一些实施方式中，所述多聚腺苷脱氧核酸poly(A)的长度为60。
在本发明的一些实施方式中，还包括pSP64-Poly(A)载体除30个poly(A)及Xhol和Xbal之间序列以外的其它序列。
在本发明的一些实施方式中，还包括启动子序列。
在本发明的一些实施方式中，所述启动子序列为T7。
在本发明的一些实施方式中，还包括目标蛋白基因。
在本发明的一些实施方式中，所述目标蛋白基因为绿色荧光蛋白基因。
本发明的第二方面在于提供第一方面所述的所述的体外表达mRNA的质粒载体的方法，包括以下步骤：
S1，使用限制性内切酶SacI和EcoRI将pSP64-Poly(A)载体中长度为30的3’-poly(A)区段移除，并连接插入一段带有SacI位点粘性末端、KpnI位点、XhoI位点、长度为60的3’-poly(A)区段、MluI位点、EcoRI位点粘性末端的人工合成序列，构建为pNeoCura-Exp060质粒载体；
S2，使用XbaI和XhoI限制性内切酶，移除pNeoCura-Exp060中的长度为30bp的片段，随后连接插入一段带有XbaI位点粘性末端、T7 RNA聚合酶识别片段、eGFP基因编码表达片段、XhoI位点粘性末端的人工合成序列，构建为pNeoCura-Exp060-eGFP体外转录表达示例质粒。
在本发明的一些实施方式中，包括以下步骤：
S11酶切pSP64-Poly(A)质粒并回收长片段：
将pSP64-Poly(A)质粒和SacI-HF、EcoRI-HF内切酶、CutSmart Buffer、水按如下比例混合：
pSP64-Poly(A) 100ng
SacI-HF 0.5μL
EcoRI-HF 0.5μL
CutSmart Buffer 1μL
水补至10μL
混合物在37℃放置4小时，随后在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，使用DNA凝胶回收试剂盒回收长度约为4000bp的片段，溶于20μL Tris-HCl缓冲液中。
在本发明的一些实施方式中，包括以下步骤：
S12合成携带有长度60的poly(A)区段的插入序列：
将两条DNA单链序列DNA序列1和序列2，分别溶解于Tris-HCl缓冲液中使得终浓度为100ng/μL，各取5μL混合，随后使用加热块加热到95℃，自然冷却至室温，得到带有SacI位点粘性末端、KpnI位点、XhoI位点、长度为60的3’-poly(A)区段、MluI位点、EcoRI位点粘性末端的插入序列双链DNA片段；
DNA序列1：
5’-CGGTACCCTCGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGCGTG-3’；
DNA序列2：
5’-AATTCACGCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTCGAGGGTACCGAGCT-3’。
在本发明的一些实施方式中，包括以下步骤：
S13连接为pNeoCura-Exp060载体、扩增：
将以上片段和T4连接酶试剂盒中的T4连接酶、T4 Buffer缓冲液按以下比例混合：
pSP64-Poly(A)酶切回收长片段 8μL
插入序列双链DNA片段 0.5μL
T4连接酶 0.5μL
T4 Buffer 1μL
混合物在16℃放置1小时。
在本发明的一些实施方式中，包括以下步骤：
S21酶切pNeoCura-Exp060质粒并回收长片段：
将pNeoCura-Exp060质粒和XbaI、XhoI内切酶、CutSmart Buffer、水按如下比例混合：
pNeoCura-Exp060 100ng
XbaI 0.5μL
XhoI 0.5μL
CutSmart Buffer 1μL
水补至10μL
混合物在37℃放置4小时，随后在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，使用DNA凝胶回收试剂盒回收长度约为4000bp的片段，溶于20μL Tris-HCl缓冲液中。
在本发明的一些实施方式中，包括以下步骤：
S22制备T7-EGFP基因扩增酶切片段：
将DNA单链序列DNA序列3和DNA序列4，分别溶解于Tris-HCl缓冲液中使得终浓度为10μmmol/L；
DNA序列3：
5’-ATCGTCTAGATAATACGACTCACTATAGGGATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’
DNA序列4：
5’-ATCGCTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’
将以上片段和PCR模板pcDNA-EGFP质粒、Taq MasterMix按以下比例混合：
PCR模板 10ng
DNA序列3 0.5μL
DNA序列4 0.5μL
Taq MasterMix 10μL
水补至20μL
PCR扩增，反应产物随后在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，使用DNA凝胶回收试剂盒回收长度约为780bp的片段，溶于20μL Tris-HCl缓冲液中；
将以上片段和和XbaI、XhoI内切酶、CutSmart Buffer按如下比例混合：
pNeoCura-Exp060 18μL
XbaI 0.5μL
XhoI 0.5μL
CutSmart Buffer 1μL
混合物在37℃放置4小时，随后在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，使用DNA凝胶回收试剂盒回收长度约为780bp的片段，溶于20μL Tris-HCl缓冲液中，即得T7-EGFP基因扩增酶切片段。
在本发明的一些实施方式中，包括以下步骤：
S23连接为pNeoCura-Exp060-T7-EGFP质粒、扩增：
将以上片段和T4连接酶试剂盒中的T4连接酶、T4 Buffer缓冲液按以下比例混合：
pNeoCura-Exp060酶切回收长片段 1μL
EGFP基因扩增片段 7.5μL
T4连接酶 0.5μL
T4 Buffer 1μL
混合物在16℃放置1小时。
本发明的第三方面在于提供第一方面所述的体外表达mRNA的质粒载体的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明构建的体外表达mRNA的质粒载体，包括表达目标蛋白基因和60个poly(A)，表达的mRNA直接拥有poly(A)，不需要额外的加尾操作。另外，体外转录所得mRNA在转染细胞后，呈现出更强的mRNA稳定性和更高的蛋白表达能力检测。
附图说明
图1为DNA序列1、DNA序列2，以及两者退火形成的带有SacI位点粘性末端、KpnI位点、XhoI位点、长度为60的3’-poly(A)区段、MluI位点、EcoRI位点粘性末端的插入序列双链DNA片段；
图2为使用pSP64-Poly(A)质粒和上述插入序列双链DNA片段连接为pNeoCura-Exp060载体的过程；
图3为使用pNeoCura-Exp060载体质粒和T7-EGFP基因扩增酶切片段连接为pNeoCura-Exp060-T7-EGFP质粒的过程；
图4为pNeoCura-Exp060-T7-EGFP质粒与对照质粒体外转录所得mRNA在转染HEK293T细胞后0小时、4小时、8小时各时间点的mRNA稳定性检测(qPCR检测mRNA剩余量)和蛋白表达能力检测(蛋白质印迹检测EGFP)结果。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1
(一)构建体外转录表达载体pNeoCura-Exp060
为了克服现有体外转录用载体pNeoCura-Exp060长度不够、从而导致所转录得到的mRNA稳定性不够强和翻译表达能力不够高的缺陷，本发明采用将pSP64-Poly(A)载体中原长度为30的3’-poly(A)区段替换为长度为60的类似区段来解决。
具体来说，本发明使用限制性内切酶SacI和EcoRI将pSP64-Poly(A)载体中长度为30的3’-poly(A)区段移除，并连接插入一段带有SacI位点粘性末端、KpnI位点、XhoI位点、长度为60的3’-poly(A)区段、MluI位点、EcoRI位点粘性末端的人工合成序列，构建为pNeoCura-Exp060质粒载体。
(二)构建体外转录表达示例质粒pNeoCura-Exp060-T7-EGFP并测试其体外转录产物特性
本发明使用XbaI和XhoI限制性内切酶，移除pNeoCura-Exp060中的长度为30bp的片段，随后连接插入一段带有XbaI位点粘性末端、T7 RNA聚合酶识别片段、eGFP基因编码表达片段、XhoI位点粘性末端的人工合成序列，构建为pNeoCura-Exp060-eGFP体外转录表达示例质粒。
本发明在大肠杆菌中充分克隆pNeoCura-Exp060-T7-EGFP质粒后，提取纯化此质粒，使用MluI限制性内切酶将其线性化，使用T7 Ultra体外转录试剂盒将其在体外转录为携带有EGFP编码序列和长度为60的3’-poly(A)尾部的mRNA。
本发明使用脂质体转染技术将以上mRNA转染至体外培育的HEK 293T细胞系，并检测4小时、8小时后细胞系内的剩余mRNA含量与EGFP蛋白量，以确定mRNA在细胞内的稳定性和翻译表达强度。
(一)主要试剂和仪器
Figure BDA0002438667680000071
Figure BDA0002438667680000081
本发明涉及的主要仪器 供应商
PCR仪 BioRad
凝胶电泳仪 New England Biolabs
16℃培养箱 New England Biolabs
37℃细胞培养箱 New England Biolabs
-20℃冰箱 中科美菱
4℃冰箱 中科美菱
6孔细胞培养板 Thermo Fisher Scientific
(二)实验方法
1.构建体外转录表达载体pNeoCura-Exp060
1.1酶切pSP64-Poly(A)质粒并回收长片段
首先，将pSP64-Poly(A)质粒和SacI-HF、EcoRI-HF内切酶、CutSmart Buffer、水按如下比例混合：
pSP64-Poly(A) 100ng
SacI-HF 0.5μL
EcoRI-HF 0.5μL
CutSmart Buffer 1μL
水补至10μL
混合物在37℃放置4小时。随后在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，使用DNA凝胶回收试剂盒回收长度约为4000bp的片段，溶于20μL Tris-HCl缓冲液中。
1.2合成携带有长度60的poly(A)区段的插入序列
通过第三方供应商合成两条DNA单链序列(DNA序列1和序列2)，分别溶解于Tris-HCl缓冲液中使得终浓度为100ng/μL。各取5μL混合，随后使用加热块加热到95℃，自然冷却至室温，得到带有SacI位点粘性末端、KpnI位点、XhoI位点、长度为60的3’-poly(A)区段、MluI位点、EcoRI位点粘性末端的插入序列双链DNA片段(参见图1)。
DNA序列1：
5’-CGGTACCCTCGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGCGTG-3’
DNA序列2：
5’-AATTCACGCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTCGAGGGTACCGAGCT-3’
1.3连接为pNeoCura-Exp060载体、扩增并验证
将以上片段和T4连接酶试剂盒中的T4连接酶、T4 Buffer缓冲液按以下比例混合：
pSP64-Poly(A)酶切回收长片段 8μL
插入序列双链DNA片段 0.5μL
T4连接酶 0.5μL
T4 Buffer 1μL
混合物在16℃放置1小时。随后根据第三方供应商标准说明书将连接后的质粒转化到TOP10大肠杆菌感受态细胞。取适当转化细胞涂抹于LB固体培养基平板，于37℃培养14-16小时。
挑取8个单菌落置于5mL LB液体培养基中，于37℃培养14-16小时。随后使用DNA质粒提取试剂盒分别提取质粒，送去第三方测序公司使用SP6引物进行测序，选择序列正确的质粒储存。即得到pNeoCura-Exp060载体(参见图2)。
2.载体pNeoCura-Exp060的应用示例：构建体外转录表达示例质粒pNeoCura-Exp060-T7-EGFP并测试其体外转录产物特性
2.1酶切pNeoCura-Exp060质粒并回收长片段
首先，将pNeoCura-Exp060质粒和XbaI、XhoI内切酶、CutSmart Buffer、水按如下比例混合：
pNeoCura-Exp060 100ng
XbaI 0.5μL
XhoI 0.5μL
CutSmart Buffer 1μL
水补至10μL
混合物在37℃放置4小时。随后在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，使用DNA凝胶回收试剂盒回收长度约为4000bp的片段，溶于20μL Tris-HCl缓冲液中。
2.2制备T7-EGFP基因扩增酶切片段
通过第三方供应商合成DNA单链序列3和序列4。其中序列3包括4个保护碱基、XbaI酶切位点、T7启动子、EGFP基因编码序列的前20个碱基；序列4包括4个保护碱基、XbaI酶切位点、终止密码子TAA的反义互补序列(TTA)、EGFP基因编码序列的后20个碱基的反义互补序列。分别溶解于Tris-HCl缓冲液中使得终浓度为10μmmol/L。
序列3：
5’-ATCGTCTAGATAATACGACTCACTATAGGGATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’
序列4：
5’-ATCGCTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’
将以上片段和PCR模板(pcDNA-EGFP质粒)、Taq MasterMix按以下比例混合：
PCR模板 10ng
DNA单链序列3 0.5μL
DNA单链序列4 0.5μL
Taq MasterMix 10μL
水补至20μL
使用以下程序在PCR仪上进行反应：95℃ 3分钟、30个循环(95℃ 20秒、55℃ 20秒、72℃ 1分钟)、72℃ 6分钟。
反应产物随后在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，使用DNA凝胶回收试剂盒回收长度约为780bp的片段，溶于20μL Tris-HCl缓冲液中。
将以上片段和和XbaI、XhoI内切酶、CutSmart Buffer按如下比例混合：
pNeoCura-Exp060 18μL
XbaI 0.5μL
XhoI 0.5μL
CutSmart Buffer 1μL
混合物在37℃放置4小时。随后在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，使用DNA凝胶回收试剂盒回收长度约为780bp的片段，溶于20μL Tris-HCl缓冲液中。即得T7-EGFP基因扩增酶切片段。
2.3连接为pNeoCura-Exp060-T7-EGFP质粒、扩增并验证
将以上片段和T4连接酶试剂盒中的T4连接酶、T4 Buffer缓冲液按以下比例混合：
pNeoCura-Exp060酶切回收长片段 1μL
EGFP基因扩增片段 7.5μL
T4连接酶 0.5μL
T4 Buffer 1μL
混合物在16℃放置1小时。随后根据第三方供应商标准说明书将连接后的质粒转化到TOP10大肠杆菌感受态细胞。取适当转化细胞涂抹于LB固体培养基平板，于37℃培养14-16小时。
挑取8个单菌落置于5mL LB液体培养基中，于37℃培养14-16小时。随后使用DNA质粒提取试剂盒分别提取质粒，送去第三方测序公司使用SP6引物进行测序，选择序列正确的质粒储存。即得到pNeoCura-Exp060-T7-EGFP质粒(参见图3)。
与此同时，使用类似方法获得插入有编码EGFP基因、及长度为30的poly(A)的第三方参考质粒作为对照(对照质粒)。
2.4体外转录合成编码EGFP基因的mRNA
将pNeoCura-Exp060-T7-EGFP质粒和MluI-HF限制性内切酶、CutSmart Buffer缓冲液按以下比例混合：
pNeoCura-Exp060-T7-EGFP 500ng
MluI-HF 0.5μL
CutSmart Buffer 1μL
水补至10μL
混合物在37℃放置4小时。随后使用DNA凝胶回收试剂盒纯化回收，溶于20μLTris-HCl缓冲液中。即得pNeoCura-Exp060-T7-EGFP质粒线性化产物。
使用mMessager mMachine T7 Ultra体外转录试剂盒，参考第三方提供说明书标准操作，将上述pNeoCura-Exp060-T7-EGFP质粒线性化产物在体外转录并纯化为编码EGFP基因、并携带有长度为60的poly(A)尾部的mRNA(EGFP-poly(A)60mRNA)。
与此同时，使用类似方法将对照质粒体外转录为编码EGFP基因、并携带有长度为30的poly(A)尾部的mRNA作为对照(对照mRNA)。
2.5体外转录所得mRNA转染细胞并测试特性
将HEK 293T细胞株以5×105细胞/孔的密度接种到6孔细胞培养板中，加入2mL完全培养基(由DMEM细胞培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素混合液构成)，37℃培养过夜。
使用PBS缓冲液冲洗细胞，使用胰蛋白酶/EDTA混合液悬浮细胞，使用Lipofectamine2000转染试剂盒按照第三方提供说明书标准步骤转染500ng EGFP-poly(A)60mRNA或对照mRNA。转染后细胞37℃培养。
在转染后的4小时、8小时分别取一部分等量细胞，使用细胞RNA提取试剂盒提取总RNA，使用M-MLV反转录试剂盒反转录为cDNA，并使用EGFP实时荧光定量PCR引物-探针套装进行qPCR检测EGFP-poly(A)60mRNA或对照mRNA残余量。
在转染后的4小时、8小时分别取一部分等量细胞，使用细胞蛋白提取试剂盒提取总蛋白，使用Western Blot蛋白质印迹检测试剂盒按照第三方提供说明书标准步骤检测EGFP-poly(A)60mRNA或对照mRNA的EGFP蛋白表达量。
(三)实验结果
pNeoCura-Exp060-T7-EGFP示例质粒与对照质粒相比，体外转录所得mRNA在转染HEK293T细胞后，呈现出更强的mRNA稳定性(qPCR检测mRNA剩余量高)和更高的蛋白表达能力检测(蛋白质印迹检测EGFP信号更强)(见图4，其中，pNeoCura示例质粒＝pNeoCura-Exp060-T7-EGFP质粒)。
以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。
Figure BDA0002438667680000141
Figure BDA0002438667680000151
序列表
<120> 一种体外表达mRNA的质粒载体及其构建方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
cggtaccctc gagaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaacgcgtg 80
<210> 2
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
aattcacgcg tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
tttttttttt tctcgagggt accgagct 88
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
atcgtctaga taatacgact cactataggg atggtgagca agggcgagga 50
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
atcgctcgag ttacttgtac agctcgtcca tgc 33

Claims (10)

1.一种体外表达mRNA的质粒载体，包括位于待插入表达的基因尾部3’-端的长度大于30的多聚腺苷脱氧核酸poly(A)片段。
2.根据权利要求1所述的质粒载体，其特征在于，所述多聚腺苷脱氧核酸poly(A)的长度为60。
3.根据权利要求1或2所述的质粒载体，其特征在于，还包括pSP64-Poly(A)载体除30个poly(A)及Xhol和Xbal之间序列以外的其它序列。
4.根据权利要求1-3任一所述的质粒载体，其特征在于，还包括启动子序列。
5.根据权利要求1-4任一所述的质粒载体，其特征在于，所述启动子序列为T7。
6.根据权利要求1-5任一所述的质粒载体，其特征在于，还包括目标蛋白基因。
7.根据权利要求1-6任一所述的质粒载体，其特征在于，所述目标蛋白基因为绿色荧光蛋白基因。
8.一种根据权利要求1-7任一所述的体外表达mRNA的质粒载体的构建方法，包括以下步骤：
S1，使用限制性内切酶SacI和EcoRI将pSP64-Poly(A)载体中长度为30的3’-poly(A)区段移除，并连接插入一段带有SacI位点粘性末端、KpnI位点、XhoI位点、长度为60的3’-poly(A)区段、MluI位点、EcoRI位点粘性末端的人工合成序列，构建为pNeoCura-Exp060质粒载体；
S2，使用XbaI和XhoI限制性内切酶，移除pNeoCura-Exp060中的长度为30bp的片段，随后连接插入一段带有XbaI位点粘性末端、T7 RNA聚合酶识别片段、eGFP基因编码表达片段、XhoI位点粘性末端的人工合成序列，构建为pNeoCura-Exp060-eGFP体外转录表达示例质粒。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S11酶切pSP64-Poly(A)质粒并回收长片段：
将pSP64-Poly(A)质粒和SacI-HF、EcoRI-HF内切酶、CutSmart Buffer、水按如下比例混合：
pSP64-Poly(A) 100ng
SacI-HF 0.5μL
EcoRI-HF 0.5μL
CutSmart Buffer 1μL
水 补至10μL
混合物在37℃放置4小时，随后在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，使用DNA凝胶回收试剂盒回收长度约为4000bp的片段，溶于20μL Tris-HCl缓冲液中；
和/或，S12合成携带有长度60的poly(A)区段的插入序列：
将两条DNA单链序列DNA序列1和序列2，分别溶解于Tris-HCl缓冲液中使得终浓度为100ng/μL，各取5μL混合，随后使用加热块加热到95℃，自然冷却至室温，得到带有SacI位点粘性末端、KpnI位点、XhoI位点、长度为60的3’-poly(A)区段、MluI位点、EcoRI位点粘性末端的插入序列双链DNA片段；
DNA序列1：
5’-CGGTACCCTCGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGCGTG-3’；
DNA序列2：
5’-AATTCACGCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTCGAGGGTACCGAGCT-3’；
和/或，S13连接为pNeoCura-Exp060载体、扩增：
将以上片段和T4连接酶试剂盒中的T4连接酶、T4 Buffer缓冲液按以下比例混合：
pSP64-Poly(A)酶切回收长片段 8μL
插入序列双链DNA片段 0.5μL
T4连接酶 0.5μL
T4 Buffer 1μL
混合物在16℃放置1小时；
和/或，S21酶切pNeoCura-Exp060质粒并回收长片段：
将pNeoCura-Exp060质粒和XbaI、XhoI内切酶、CutSmart Buffer、水按如下比例混合：
pNeoCura-Exp060 100ng
XbaI 0.5μL
XhoI 0.5μL
CutSmart Buffer 1μL
水 补至10μL
混合物在37℃放置4小时，随后在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，使用DNA凝胶回收试剂盒回收长度约为4000bp的片段，溶于20μL Tris-HCl缓冲液中；
和/或，S22制备T7-EGFP基因扩增酶切片段：
将DNA单链序列DNA序列3和DNA序列4，分别溶解于Tris-HCl缓冲液中使得终浓度为10μmmol/L；
DNA序列3：
5’-ATCGTCTAGATAATACGACTCACTATAGGGATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’
DNA序列4：
5’-ATCGCTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’
将以上片段和PCR模板pcDNA-EGFP质粒、Taq MasterMix按以下比例混合：
PCR模板 10ng
DNA序列3 0.5μL
DNA序列4 0.5μL
Taq MasterMix 10μL
水 补至20μL
PCR扩增，反应产物随后在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，使用DNA凝胶回收试剂盒回收长度约为780bp的片段，溶于20μL Tris-HCl缓冲液中；
将以上片段和和XbaI、XhoI内切酶、CutSmart Buffer按如下比例混合：
pNeoCura-Exp060 18μL
XbaI 0.5μL
XhoI 0.5μL
CutSmart Buffer 1μL
混合物在37℃放置4小时，随后在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，使用DNA凝胶回收试剂盒回收长度约为780bp的片段，溶于20μL Tris-HCl缓冲液中，即得T7-EGFP基因扩增酶切片段；
和/或，S23连接为pNeoCura-Exp060-T7-EGFP质粒、扩增：
将以上片段和T4连接酶试剂盒中的T4连接酶、T4 Buffer缓冲液按以下比例混合：
pNeoCura-Exp060酶切回收长片段 1μL
EGFP基因扩增片段 7.5μL
T4连接酶 0.5μL
T4 Buffer 1μL
混合物在16℃放置1小时。
10.一种根据权利要求1-7任一所述的体外表达mRNA的质粒载体的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117568348A (zh) * 2024-01-15 2024-02-20 苏州左旋星生物科技有限公司 用于维持多聚腺苷质粒单体超螺旋的基因及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104120129A (zh) * 2014-07-15 2014-10-29 中国科学院海洋研究所 牙鲆原始生殖细胞Nanos3基因的调控序列及其应用
US20170166905A1 (en) * 2014-07-11 2017-06-15 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Stabilization of poly(a) sequence encoding dna sequences

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5648235A (en) * 1992-07-03 1997-07-15 Q.B.I. Enterprises Ltd. Method and means for the production of gene products, novel recombinant DNA vectors therefor and kits employing them

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170166905A1 (en) * 2014-07-11 2017-06-15 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Stabilization of poly(a) sequence encoding dna sequences
CN104120129A (zh) * 2014-07-15 2014-10-29 中国科学院海洋研究所 牙鲆原始生殖细胞Nanos3基因的调控序列及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XINYU ZHUANG: "mRNA Vaccines Encoding the HA Protein of Influenza A H1N1 Virus Delivered by Cationic Lipid Nanoparticles Induce Protective Immune Responses in Mice", 《》 *
XINYU ZHUANG: "mRNA Vaccines Encoding the HA Protein of Influenza A H1N1 Virus Delivered by Cationic Lipid Nanoparticles Induce Protective Immune Responses in Mice", 《VACCINES》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117568348A (zh) * 2024-01-15 2024-02-20 苏州左旋星生物科技有限公司 用于维持多聚腺苷质粒单体超螺旋的基因及其应用
CN117568348B (zh) * 2024-01-15 2024-04-16 苏州左旋星生物科技有限公司 用于维持多聚腺苷质粒单体超螺旋的基因及其应用

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