CN108220314B - Dna片断与载体快速连接转化的新方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基因克隆技术，即对传统的分子克隆技术进行了改良，具体地说是运用PCR扩增技术替代常规的连接酶反应步骤，将待克隆的DNA片断与载体快速连接并直接转化到大肠杆菌感受态细胞的实验方法。与传统方法相比，该技术不受限制性内切酶酶切位点限制，根据DNA片段和载体末端序列设计接头引物，利用PCR反应可将任何DNA片段与载体连接起来，实现分子克隆的目的。该方法作为一种通用方法,不仅缩短了分子克隆反应时间，提高了克隆转化效率，而且适用于不同长度基因与载体的连接及转化，具有广泛的应用价值。

Description

DNA片断与载体快速连接转化的新方法及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地说涉及一种基因克隆改良技术，即采用PCR扩增方法替代传统的DNA连接酶反应步骤，将待克隆的DNA片段和线性载体作为PCR反应模板，利用待克隆的DNA片断和线性载体两端接头引物，通过PCR扩增反应，将DNA片断与线性载体连接起来，并将PCR产物直接转化大肠杆菌感受态细胞的分子克隆新方法及其应用。与传统方法相比，用于克隆的DNA片段和载体两端不受限制性内切酶位点限制，不受平滑末端或粘性末端影响，通过设计简单的接头引物，可将任何DNA片段与载体拼接起来，具有操作简单，实用性强、应用广泛的特点。
背景技术
基因克隆技术在生物学中发挥着重要作用，广泛应用于分子生物学、细胞生物学以及肿瘤生物学等领域，具有巨大的市场需求。传统的分子克隆实验包括：DNA片段制备、载体线性化处理、DNA片段与载体连接以及大肠杆菌感受态细胞转化等。为了将DNA片段与载体连接在一起，提高连接反应效率，通常需要预先分析载体和DNA片段序列，寻找单一特异的限制性内切酶酶切位点，将DNA片段和载体末端连接起来，以便后续连接、转化和筛选阳性克隆。然而，当DNA片断与载体序列上限制性酶切位点重合较多的情况下，选择特异性限制性酶切位点变得非常困难，严重的影响了连接转化效率。虽然利用DNA连接酶也可以将平滑末端DNA片段与线性载体连接起来，但是通常连接反应时间较长，并且连接反应效率很低。因此，发明一种通用的分子克隆方法，使得DNA片段和线性载体不受限制性内切酶酶切位点影响，不受平滑末端或粘性末端影响，并且可以在短时间内高效率完成克隆反应，无疑具有重要的应用价值。
为了提高基因克隆效率，满足不同长度基因克隆需求，各大生物公司不断推出种类繁多的载体，如质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、染色体载体等。载体上不仅含有多克隆位点,还含有氨苄霉素或卡那霉素抗性筛选基因，方便基因编辑操作。一些质粒载体(如pBR322、pUC18/19)含有可表达β-半乳糖苷酶活性的LacZ基因，PCR产物克隆后可利用α-互补性直接进行蓝白菌落筛选。目前应用较为广泛的载体是T-vector，由于线性载体3'末端带有“T”核苷酸，而PCR产物末端通常带有“A”核苷酸末端，因此DNA连接酶可以将PCR产物直接克隆到T载体上。然而利用“TA”克隆获得的产物，无法有效控制DNA片段连接方向，经常不能有效表达目的蛋白，而且容易出现假阳性，后续筛选工作量较大。因此很多载体带有多克隆位点，使用单一限制酶处理后，可以产生黏性末端，然后将带有相同酶切位点的PCR产物和线性载体连接，可以有效的提高转化效率。然而在连接酶的作用下，线性载体容易发生自身环化而造成假阳性，因此很多载体会使用两种不同的限制性内切酶进行线性化处理，从而产生不同的粘性末端，防止载体末端自连而降低克隆转化效率。这就要求目的基因两端带有与载体末端相同的酶切位点，对限制性内切酶位点的选择变得非常重要，需要了解目的基因和载体的全部序列信息，但是无法对未知基因进行克隆，通常需要在PCR引物上引入特异的酶切位点，以便后续进行克隆反应，因此操作步骤非常繁琐。
随着基因克隆技术的快速发展，各种快速反应的限制性内切酶、连接酶层出不穷。近些年，一些生物公司推出了“In fusion”技术，采用DNA重组酶代替原来的限制性内切酶和连接酶反应，通过在目的基因和载体两端设计同源引物序列，将目的基因与载体末端进行“置换”，从而达到基因克隆的目的。该方法虽然简化了实验操作，但是重组酶反应在引物设计方面较为复杂，同样存在难于控制基因片段插入的方向性问题，需要克隆载体上含有多种抗性筛选基因，以方便后续筛选阳性克隆。
发明内容
本发明的目的是提供一种通用的分子克隆方法，使待克隆的DNA片段和线性载体两端不受限制性内切酶酶切位点影响，不受平滑末端或粘性末端影响，可以在短时间内方便高效完成分子克隆反应的新方法。即采用PCR扩增方法替代传统的DNA连接酶反应，将待克隆的DNA片段和线性载体同时作为PCR反应模板，利用待克隆的DNA片断和线性载体两端接头引物，通过PCR扩增反应，将DNA片断与线性载体连接起来，并将PCR产物直接转化大肠杆菌感受态细胞的分子克隆新方法及其应用。具体方法如下：
(1)F adaptor序列包含线性载体3'末端和DNA片断5'末端核苷酸序列，引物长度为20～30bp，GC含量为45％～55％；R adaptor序列包含DNA片断3'末端和线性载体5'末端核苷酸序列，引物长度为20～30bp，GC含量为45％～55％。
(2)将(1)中线性载体和DNA片断作为模板，按照1：1比例，同时添加到PCR反应体系中。具体添加量如下：线性载体1～100ng，DNA片断1～100ng，F和/R adaptor终浓度0.2μM～0.4μM。采用高保真聚合酶进行PCR反应。
(3)将上述含有DNA片段和载体连接产物的PCR反应液，取少量直接添加到大肠杆菌感受态细胞中进行热转化。PCR反应液添加比例5％～20％，最适添加量10％，例如5μlPCR反应液/50μl菌液。对于容易转化的大肠杆菌感受态细胞，PCR反应液添加量可降低到菌液体积的5％。将转化后的感受态细胞涂在含有氨苄霉素或卡那霉素LB平板，然后放入37℃培养箱过夜培养。
(4)次日，观察菌落生长状况。收集菌体。如果载体带有LacZ基因可以表达β-半乳糖苷酶活性，可利用蓝白菌落筛选阳性克隆；否则，根据载体两端序列设计引物，采用PCR方法检测阳性克隆。
本发明对传统的分子克隆技术进行了改良，取代了连接酶反应步骤，提高了克隆转化效率，适用于不同长度基因与载体的连接及转化。与传统方法相比，用于克隆的DNA片段和载体两端不受限制性内切酶位点限制，不受平滑末端或粘性末端影响，通过设计简单的接头引物，可将任何DNA片段与载体拼接起来，具有操作简单，实用性强、应用广泛的特点。
附图说明
图1：本发明的基因克隆技术原理图。根据线性载体和DNA片段两端序列，设计接头引物。采用PCR技术进行扩增连接，然后将含有连接产物的PCR反应液直接转化大肠杆菌感受态细胞，最后筛选阳性克隆菌落。
图2：采用PCR方法将YBX1基因克隆到pMD19-T载体后电泳检测。
图3：YBX1基因克隆到pMD19-T载体后测序鉴定。
具体实施方式
实施例
1、将YBX1基因克隆到载体实验例
(1)参考NCBI数据库中YBX1基因序列(GenBank：BC070084.1)设计两端特异性引物，以人正常肝细胞(L-O2)cDNA为模板扩增YBX1全长基因序列。PCR Ⅰ引物序列为：
YBX1 Forward Primer：5'-ATGAGCAGCGAGGCCGAGACCCAG-3'
YBX1 Reverse Primer：5'-TTACTCAGCCCCGCCCTGCTCAGC-3'
PCR Ⅰ反应体系如下：
Figure BDA0001176523390000031
PCR Ⅰ反应条件：
Figure BDA0001176523390000032
(2)采用PCR方法，将上述扩增的人YBX1全长基因克隆到pMD19-T载体中，构建pMD19-YBX1重组载体。具体操作如下：
a.将上述PCR Ⅰ产物进行切胶回收。采用宝生物公司TaKaRa MiniBEST AgaroseGel DNA Extraction Kit，操作方法参照说明书。
b.采用PCR方法将YBX1基因克隆到载体上。根据YBX1和pMD19-T载体两端序列，设计PCR Ⅱ接头引物，序列如下：
F adaptor:AGGTCGACGATTATGAGCAGCGAG
R adaptor:TCCTCTAGAGATTTACTCAGCCC
PCR Ⅱ反应体系如下：
Figure BDA0001176523390000041
PCR Ⅱ反应条件：
Figure BDA0001176523390000042
(3)将上述含有目的基因和线性载体连接产物的PCR Ⅱ反应液，取少量直接添加到大肠杆菌感受态细胞中进行转化。操作方法如下：取5μl PCR Ⅱ反应液直接添加到E.coli.DH5a感受态细胞里(添加比例10％)，混合均匀。42℃热击45秒，冰上放置1min，然后添加1ml SOC培养基，放入37℃、200rpm摇床培养1小时。最后取部分菌液涂LB/Amp+平板，放于37℃培养箱过夜培养。
(4)第二天，取出LB平板观察菌落状态，通过蓝白菌落筛选阳性克隆。挑取白色菌落，放入LB/Amp+液体培养基，于37℃培养箱过夜培养。次日提取质粒，送测序鉴定。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院大连化学物理研究所
<120> DNA片断与载体快速连接转化的新方法及其应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> DNA
<222> (1)..(24)
<400> 1
atgagcagcg aggccgagac ccag 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> DNA
<222> (1)..(24)
<400> 2
ttactcagcc ccgccctgct cagc 24

Claims (3)

1.一种用于分子生物学中基因克隆的实验方法，该方法包括如下内容：（1）设计接头引物：根据线性载体及待克隆的DNA片断两端序列，设计连接线性载体与DNA片断的接头引物，包含带有载体3'末端序列与DNA 5'末端序列的F adaptor引物，以及带有载体5'末端序列与DNA3'末端序列的R adaptor引物；（2）连接反应：不用DNA连接酶，将线性载体、DNA片断及接头引物按照所需比例混合，通过PCR扩增反应，将DNA片段与线性载体连接起来；PCR产物中含有DNA和载体的连接产物；（3）转化：将上述PCR反应液，直接添加到大肠杆菌感受态细胞中进行热转化；（4）筛选：采用PCR方法或蓝白菌落方法筛选阳性克隆；
其中（1）中连接线性载体与DNA片断的接头引物长度介于20~30个核苷酸，GC含量40%~60%，如果接头引物序列中GC含量超过60%，调整接头引物长度至31~40个核苷酸；
其中（2）中PCR反应体系，线性载体添加量1~100ng，DNA片断添加量1~100ng，接头引物添加终浓度0.2μM~0.4μM；
其中（3）中用于直接转化大肠杆菌感受态细胞的PCR反应液为大肠杆菌感受态细胞总体积的5%~20%。
2.权利要求1中所述的方法，其中（3）中用于直接转化大肠杆菌感受态细胞的PCR反应液为大肠杆菌感受态细胞总体积的10%。
3.权利要求1中所述的方法，其中（4）中筛选阳性克隆的方法，根据所用载体确定；
如果载体带有LacZ基因表达β-半乳糖苷酶活性，利用蓝白菌落筛选阳性克隆；否则，根据载体两端序列设计引物，采用PCR方法检测阳性克隆。
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