WO2013143438A1 - 基于同源重组的核酸分子克隆方法及相关试剂盒 - Google Patents

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WO2013143438A1
WO2013143438A1 PCT/CN2013/073186 CN2013073186W WO2013143438A1 WO 2013143438 A1 WO2013143438 A1 WO 2013143438A1 CN 2013073186 W CN2013073186 W CN 2013073186W WO 2013143438 A1 WO2013143438 A1 WO 2013143438A1
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WO
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vector
sequence
target dna
exonuclease
homologous
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PCT/CN2013/073186
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于浩洋
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深圳市中联生物科技开发有限公司
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1082—Preparation or screening gene libraries by chromosomal integration of polynucleotide sequences, HR-, site-specific-recombination, transposons, viral vectors

Definitions

  • This application relates to the field of DNA recombination technology. More specifically, the present application relates to nucleic acid molecule cloning methods based on homologous recombination, their use, and related kits. Background technique
  • the conventional method of cloning a target DNA into a predetermined position in a vector such as a plasmid generally includes six steps: (1) enzymatic cleavage of the vector DNA by restriction endonuclease to purify the linearized vector; (2) small Bovine intestinal alkaline phosphatase (CIP) treatment of the linearized vector minimizes the degree of self-cyclization of the linearized vector during ligation; (3) amplification of the target DNA by polymerase chain reaction (PCR) using PCR primers, wherein The primer will add an restriction enzyme endonuclease recognition site for linearizing the vector DNA at the 5th and 3rd ends of the amplified target DNA; (4) using a restriction nucleus for linearizing the vector DNA.
  • CIP small Bovine intestinal alkaline phosphatase
  • the endonuclease digests the amplified target DNA, and then purifies the digested target DNA; (5) ligating the purified target DNA with the purified linear vector using DNA ligase; and (6) connecting
  • the product is transformed into a host cell, such as E. coli competent cells, and the transformed cell containing the desired cloned product is then selected, wherein the target DNA is inserted into the vector at the desired cloning site.
  • Traditional cloning methods are cumbersome, time consuming, and relatively low in cloning efficiency, and are also limited by the availability of appropriate restriction endonuclease recognition sites on the vector and target DNA.
  • homologous recombination can greatly improve the efficiency of gene cloning.
  • cloning methods based on homologous recombination.
  • the target DNA is first amplified by PCR, and a sequence homologous to the linearized vector DNA is added to both ends of the amplified target DNA by PCR primers; then, by the action of the enzyme in vitro, Source Recombination PCR primers are cloned into a vector, or the linearized vector and the PCR product are co-transformed or co-transfected into a host cell, and the PCR primers are cloned into the vector by homologous recombination under the action of an enzyme in vivo.
  • the present application solves the above problems by providing a nucleic acid molecule cloning method based on homologous recombination. Summary of the invention
  • One aspect of the present application provides a nucleic acid molecule cloning method based on homologous recombination.
  • the application provides a method of cloning a target DNA into a vector, comprising:
  • step (a) can be carried out as follows:
  • the first primer comprises the first sequence as a 5' end and a sequence specific to a first region of the vector as a 3' end
  • the second primer comprises as 5,
  • the second sequence of the terminus and the sequence specific to the second region of the vector as the 3' terminus preferably the sequence specific for the first region of the vector is the first region of the vector a sequence complementary to the domain, preferably a sequence specific for the second region of the vector is a sequence that is i or mutated to the second region i;
  • the vector as a template for the polymerase chain reaction may be a linearized vector, and the first and second regions are preferably linearized first and second ends, respectively.
  • the vector used as a template for the polymerase chain reaction may also be a circular vector, and preferably the polymerase chain reaction is carried out in the presence of a helicase.
  • step (a) can be carried out as follows:
  • the application provides a method of cloning a target DNA into a vector, comprising:
  • the homologous recombination can be carried out in the presence of an exonuclease and a single-stranded DNA binding protein or an annealing protein or a functionally equivalent enzyme thereof.
  • the exonuclease is preferably selected from the group consisting of Escherichia coli exonuclease I, E. coli exonuclease III, E. coli exonuclease VII, ⁇ phage exonuclease, ⁇ 7 phage exonuclease, Red o, RecE and their mixtures.
  • the single-stranded DNA binding protein or annealing The protein is preferably selected from the group consisting of an extremely thermostable single-stranded DNA-binding protein (ET SSB), a Rec A, a T4 gene 32 protein, a Thermophilic bacterium Thermoa (Tth RecA), an Escherichia coli single-stranded DNA-binding single strand (SSB), Red ⁇ , RecT and their mixtures.
  • ET SSB extremely thermostable single-stranded DNA-binding protein
  • Rec A Rec A
  • T4 gene 32 protein a Thermophilic bacterium Thermoa
  • Tth RecA Thermophilic bacterium Thermoa
  • SSB Escherichia coli single-stranded DNA-binding single strand
  • Red ⁇ RecT and their mixtures.
  • Homologous recombination can be carried out in any combination of exonuclease and single-stranded DNA binding protein or annealing protein.
  • the homologous recombination is carried out in the presence of RecE and RecT.
  • the homologous recombination is carried out in the presence of Red alpha and Red P.
  • the homologous recombination is carried out in the presence of RecE, RecT, Red alpha and Red beta.
  • Homologous recombination can also be carried out in the presence of other enzymes.
  • the other enzyme is, for example, a helicase, a nucleic acid repair protein or the like.
  • the application provides a kit for cloning a target DNA into a vector, comprising:
  • the exonuclease may be a prokaryotic exonuclease or a viral exonuclease, preferably selected from the group consisting of E. coli exonuclease I, E. coli exonuclease III, E. coli exonuclease VII, and ⁇ phage nucleic acid. Dicer, ⁇ 7 phage exonuclease, Red ⁇ , RecE, and mixtures thereof.
  • the single-stranded DNA-binding protein or annealing protein may be selected from the group consisting of an extremely thermostable single-stranded DNA-binding protein (ET SSB), a Rec A, a T4 gene 32 protein, a Thermophilic bacterium, RecA (Tth RecA), and an E. coli single-stranded DNA binding cassette. Chain (SSB), Red beta, RecT and mixtures thereof.
  • ET SSB extremely thermostable single-stranded DNA-binding protein
  • Rec A Rec A
  • T4 gene 32 protein a Thermophilic bacterium
  • RecA Tth RecA
  • Chain SSB
  • Red beta Red beta
  • RecT Red beta
  • the enzyme mixture may comprise any combination of an exonuclease and a single-stranded DNA binding protein or an annealing protein.
  • the enzyme mixture comprises RecE and RecT.
  • the enzyme mixture comprises Red o and Red P.
  • the enzyme mixture comprises RecE, RecT, Red o and Red ⁇ .
  • the enzyme mixture may also contain a helicase and/or a nucleic acid repair protein.
  • the enzyme mixture comprises an exonuclease, a helicase, a single-stranded DNA binding protein or an annealing protein and a nucleic acid repair protein.
  • the reaction buffer preferably contains 1 - 10 mg/mL of Tris, 1 - 10 mg/mL of NaCl, 0.1 - 10 mg/mL of EDTA, 0.1 - 10 mg/mL of MgCl 2 , 10 - 200 mg/mL glycerol, 10 - 50 mg/mL bovine serum albumin (BSA), 0.1-10 mg/mL ATP, 1 - 10 mg/mL Na 2 HP0 4 , 0.1 - 10 mg/mL KH 2 P0 4 , 0.1 - 10 mg/mL dithiothreitol (DDT); pH approximately 6.8 _ 7.4.
  • BSA bovine serum albumin
  • DDT dithiothreitol
  • Figure 1 is a schematic representation of one embodiment of the method of the present application, wherein SM is a selection marker.
  • Figure 2 is a schematic representation of another embodiment of the method of the present application wherein SM is a selectable marker.
  • Figure 3 is a schematic diagram showing the position of one, two, three and four (different fragment 2 _ 4) of the DHRS4 gene on the full-length DHRS4 gene (fragment 1).
  • Figure 4 is an electropherogram of the PCR product of a positive (ampicillin resistant) clone plasmid.
  • One is the amplified full-length DHRS4 gene (fragment 1), the second to fourth lanes are fragments 2 - 5, and the M-channel is the DNA molecular weight marker.
  • Figure 5 shows the Pstl restriction map.
  • lane 1 is the DNA molecular weight marker and lane 2 is the standard restriction map of the mouse TFIIA gene.
  • Fig. B one lane is a DNA molecular marker, and the second lane is a restriction map of a PCR amplification product using plasmid DNA extracted from a positive clone (transformant) as a template.
  • the present inventors have found that the abundance of the target DNA in the prepared DNA sample (for example, the extracted genomic DNA sample) is sufficient to allow the target DNA to be cloned into the vector by homologous recombination in vitro without the need to introduce the target DNA into the vector before the target is introduced into the vector. DNA expansion Increased, thus completing the application.
  • the prepared DNA sample for example, the extracted genomic DNA sample
  • a linearized vector to which a sequence homologous to a sequence of a target DNA or a flanking sequence thereof that is, a target DNA-specific homology arm
  • a target DNA-specific homology arm a sequence homologous to a specific region of the vector
  • the target DNA is not required to be subjected to PCR amplification, no artificial mutation is introduced, and there is no limitation on the size of the target DNA (ie, the fragment to be amplified) encountered during PCR amplification, and it is possible to be 10 kb or more. Large DNA fragments (eg 10 - 100 kb) were cloned. Furthermore, since the method of the present application introduces a target DNA into a vector in vitro, the problem of low conversion rate due to co-transformation or co-transfection in in vivo recombination is solved. Accordingly, the present application solves the problems in the prior art by providing such a method.
  • Carrier ie, the fragment to be amplified
  • the term "vector” as used herein, refers to a nucleic acid that is capable of transporting another nucleic acid to which it is linked.
  • the vector may be any vector such as a plasmid, cosmid, virus, etc., or may be a bacterial artificial chromosome (BAC) or a yeast artificial chromosome (YAC) and a phagemid.
  • the vector may be an autonomously replicating vector or an integrating vector.
  • the autonomously replicating vector is capable of autonomous replication in the host cell into which it is introduced, such as a bacterial vector having a bacterial origin of replication and an episomal mammalian vector.
  • the integration vector is integrated into the genome of the host cell as it is introduced into the host cell, thereby replicating with the host genome, e.g., a non-episomal mammalian vector.
  • certain vectors i.e., expression vectors
  • the vector of the present application may also be a specially designed vector that allows for the cloning of DNA in different hosts or for allowing DNA to shuttle between hosts, i.e., a shuttle vector.
  • the above vectors are known to those skilled in the art and can be selected as needed, for example, depending on the host cell used and the method used to add the first and second sequences according to the present application.
  • the vectors of the present application may contain various elements for cloning, expression and screening.
  • the vector contains an origin of replication for replication in a host cell, such as a ColEl origin of replication for replication in an E. coli host cell, a 2 ⁇ origin of replication for replication in a yeast host cell, or The origin of the virus replication, such as the origin of replication of the SV40.
  • the vector contains a selection marker for selecting the correct recombinant, such as a drug resistance gene, such as, but not limited to, ampicillin, streptomycin, kanamycin, chloramphenicol, Hygromycin, ampicillin, etc.
  • the selection marker may also be a reporter gene, such as but not limited to, encoding green fluorescent protein (GFP), ⁇ -galactosidase, luciferase, chloramphenicol acetyltransferase, --glucuronidase, neomycin phosphotransferase, and the like.
  • GFP green fluorescent protein
  • a marker gene which is differentially expressed in the original vector and the recombinant vector can also be used.
  • the transformed host cell containing the recombinant vector can be readily identified by various methods known in the art, for example, by PCR amplification (PCR screening) of the target DNA fragment on the vector contained in the positive clone.
  • the target DNA can be cloned at any predetermined location on the vector.
  • the clone location can be selected as needed.
  • the first and second regions of the vector as well as the sequences corresponding thereto in the primers and ligated fragments of the present invention can be readily determined.
  • the vector is a plasmid
  • the predetermined position for inserting the target DNA may be located at a restriction endonuclease cleavage site or at two restriction endonuclease cleavage sites. between.
  • the plasmid can be digested with the one or more restriction endonucleases to obtain a linearized vector.
  • the target DNA molecule can be derived from prokaryotic organisms, such as bacterial genomic DNA, cDNA, or genomic DNA, cDNA from eukaryotes such as yeast, mammals (such as humans), or DNA fragments mediated by PCR reactions.
  • the target DNA can be an encoded egg White matter genes, sequences carrying gene mutations or lesions, etc.
  • the target DNA can be a small fragment of DNA or a large fragment of DNA.
  • the method of the present application is particularly applicable to the cloning of large fragment DNA, e.g., large fragment DNA of 10 kb - 100 kb.
  • the large fragment DNA may be 10 kb - 100 kb, such as 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 kb. Large fragment DNA.
  • the first sequence and the second sequence are respectively added to the sides of the linearized vector to prepare an extended linearized vector, wherein the first sequence comprises a sequence homologous to the first end of the target DNA or a flanking sequence thereof, and The second sequence comprises a sequence homologous to the second end of the target DNA or to its flanking sequence such that the linearized vector to which the first sequence and the second sequence are flanked, respectively, can be ligated to the target DNA by homologous recombination.
  • the first sequence and the second sequence may be sequences homologous to the corresponding ends of the target DNA or flanking sequences thereof.
  • sequence identity is meant a certain sequence identity or homology between two nucleotide sequences that allows for ligation by homologous recombination under the action of a recombinase or recombinant system.
  • the “homologous” includes, but is not limited to, at least 80% sequence identity between two nucleotide sequences, for example, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% , 96%, 97%, 98%, 99% or 100% identity.
  • sequence identity is well known to those skilled in the art and means the percentage of nucleotide or amino acid residues of two nucleic acid sequences or polypeptide sequences that are optimized for alignment and analysis. Methods of calculating sequence identity are well known to those skilled in the art.
  • the homology of the first and second sequences as homologous arms to the corresponding sequences of the target DNA is not limited as long as the resulting elongated linearized vector is capable of homologous recombination with the target DNA.
  • the first sequence has 100% sequence identity to the first end of the target DNA or to its flanking sequences
  • the second sequence has 100% sequence identity to the second end of the target DNA or its flanking sequences.
  • the first sequence and the second sequence are each independently at least 12 nucleotides in length, preferably 15 to 50 nucleotides, such as 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 nucleotides, more preferably 35 long. -50 nucleotides.
  • the sequence and length of the first and second sequences can be designed based on the enzyme used for homologous recombination based on the ends of the target DNA or its flanking sequences.
  • the first sequence and the second sequence can be added to both sides of the linearized vector by various methods.
  • a first primer comprising a first sequence and a vector-specific sequence and a second primer comprising a second sequence and a vector-specific sequence can be used, using the vector as a template, and the first sequence and the first The two sequences are added to both sides of the linearized vector, respectively.
  • the first primer contains a first sequence and a sequence specific for the first region of the vector
  • the second primer contains a second sequence and a sequence specific for the second region of the vector.
  • a PCR primer can be designed as: a 15 - 50 bp homologous sequence derived from the target DNA at the 5' end and a primer sequence specific for the 18 - 25 bp plasmid DNA template immediately following the 3' end.
  • the plasmid DNA template-specific primer sequence in the PCR primer may be a sequence complementary to the plasmid DNA template.
  • the so-called "complementary" means 100% complementary.
  • the PCR reaction can be carried out using any method well known in the art.
  • the conditions of the PCR reaction can be selected or optimized by routine experimentation. See, for example, Joseph Sambrook et al, Molecular Clonning: A Laboratory Manual, 3 rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; and Carl W. Dieffenbach and Gabriela S. Dveksler, PCR primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995.
  • the carrier may be a linearized vector or a circular vector.
  • a ligation fragment containing both a target DNA-specific homology arm and a vector-specific homology arm such as a first ligation fragment and a second ligation fragment
  • the ligation fragment is contacted with the vector, and an extended linearized vector is obtained by homologous recombination, that is, a linearized vector to which both the first sequence and the second sequence are added, respectively.
  • the ligation fragment contains both a target-specific homology arm and a vector-specific homology arm. That is, the ligated fragment contains both a sequence homologous to the end of the target DNA or its flanking sequence, and also contains a specific region of the vector. A homologous sequence.
  • the first ligation fragment comprises a sequence homologous to the first end of the target DNA or a flanking sequence thereof and a sequence homologous to the first region of the vector
  • the second ligation fragment comprising a homologous to the second end of the target DNA or a flanking sequence thereof A sequence and a sequence homologous to a second region of the vector.
  • the vector may be a linearized vector or a circular vector.
  • the homologous recombination reaction can be carried out under the action of a helicase.
  • Homologous recombination techniques are well known in the art. Homologous recombination can be carried out using any method known in the art, any suitable enzyme, enzyme mixture or enzyme system, for example, the methods described below can be used to add the first and second sequences to linearity by homologous recombination. Both sides of the carrier.
  • Homologous recombination can be carried out using any enzyme, enzyme mixture or enzyme system known for homologous recombination.
  • the method of the present application can be carried out using an enzyme mixture.
  • the enzyme mixture may comprise an exonuclease and a single-stranded DNA binding protein or an annealing protein, or an enzyme or protein that functions in substantially the same manner as the enzyme described above.
  • the exonuclease may be a prokaryotic exonuclease or a viral exonuclease, and may be selected from the group consisting of Escherichia coli exonuclease I, E. coli exonuclease III, E. coli exonuclease VII, and ⁇ phage nucleic acid. Dicer, ⁇ 7 phage exonuclease, R e do, RecE and mixtures thereof.
  • the single-stranded DNA-binding protein or annealing protein may be selected from the group consisting of an extremely thermostable single-stranded DNA-binding protein (ET SSB), Rec A, a T4 gene 32 protein, a thermophilic bacterium, RecA (Tth RecA), and an E. coli single-stranded DNA binding cassette. Chain (SSB), Red p, RecT and mixtures thereof.
  • the enzyme mixture may contain any combination of the above exonuclease and single-stranded DNA binding protein or annealing protein.
  • the enzyme mixture comprises RecE and RecT. In another preferred embodiment, the enzyme mixture comprises Red alpha and Red beta. In a further preferred embodiment, the enzyme mixtures are RecE, RecT, Red alpha and Red beta.
  • the enzyme mixture may also contain other enzymes, such as helicase and/or nucleic acid repair eggs. White.
  • the enzyme mixture comprises an exonuclease, a helicase, a single-stranded DNA binding protein or an annealing protein and a nucleic acid repair protein. Homologous reorganization
  • Homologous recombination techniques are well known in the art. Homologous recombination can be carried out using any method known in the art, any suitable enzyme, enzyme mixture or enzyme system.
  • the extended linearized vector, the sample containing the target DNA, and the enzyme or enzyme mixture are contacted in the reaction mixture, i.e., incubated in vitro to achieve homologous recombination between the target DNA and the extended linearized vector.
  • the vector, the sample containing the target DNA, and the above-described ligation fragment containing both the target DNA-specific homology arm and the vector-specific homology arm can be directly reacted in the reaction mixture with the enzyme or The enzyme mixture is incubated together to clone or link (e.g., directional or ligated) the target DNA into the vector by homologous recombination.
  • the vector may be a linearized vector and may be a circular vector.
  • the reaction mixture contains, in addition to the target DNA, vector and ligation fragment or extended linearization vector, enzyme or enzyme mixture and reaction buffer.
  • the reaction mixture contains, for example, 1 - 100 mg/L of exonuclease and 1 - 100 mg/L of single-stranded DNA-binding protein (single-stranded DNA annealing protein, stranded invading protein).
  • the reaction mixture may also contain other enzymes, such as DNA helicases, such as 1-100 mg/L DNA helicase; and/or nucleic acid repair proteins, such as 1-100 mg/L nucleic acid repair proteins.
  • the reaction buffer can be determined depending on the enzyme or mixture of enzymes used, and can be optimized by routine experimentation.
  • the reaction buffer contains a buffer, a salt, and ATP, and may contain: Tris, NaCl, EDTA, MgCl 2 , glycerin, bovine serum albumin, ATP, phosphate, and dithiothreitol.
  • the reaction buffer comprises: 1 - 10 mg/mL of Tris, 1 - 10 mg/mL of NaCl, 0.1 - 10 mg/mL of EDTA, 0.1 - 10 Mg/mL of MgCl 2 , 10 - 200 mg/mL of glycerol, 10 - 50 mg/mL of bovine serum albumin (BSA), 0.1-10 mg/mL of ATP, 1 - 10 mg/mL of Na 2 HP0 4 , 0.1 - 10 mg / mL KH 2 P0 4 , 0.1 - 10 mg / mL of dithiothreitol (DDT); pH of about 6.8 _ 7.4.
  • BSA bovine serum albumin
  • kits for cloning a target DNA into a vector comprising: (1) an enzyme mixture comprising an exonuclease and a single-stranded binding protein; and (2) a reaction buffer .
  • the enzyme mixture contains other enzymes.
  • the intermediate exonuclease and single-stranded binding protein, as well as other enzymes, can be found in the "Enzymes" section above.
  • the reaction buffer may be the reaction buffer described above. Conversion
  • the recombinant DNA of the target DNA and the vector can be transformed or transfected into a host cell by a conventional method.
  • transformation or transfection methods include, but are not limited to, calcium phosphate or calcium chloride co-precipitation, electroporation, lipofection, DEAE-dextran mediated transfection, viral infection, and the like.
  • the host cell may be a bacterial cell, a fungal cell, a mammalian cell or the like.
  • One skilled in the art can select suitable transformation or transfection methods and suitable host cells as desired.
  • the recombinant containing the target DNA can be selected based on whether or not the selection marker contained in the vector is present. In the case of homologous recombination using a circular vector, screening can also be carried out based on the selection marker such as the disappearance of resistance (e.g., cloning of the target DNA destroys the resistance gene).
  • the selected cell clone or colony can be confirmed to contain the correct target DNA, for example, by performing a PCR reaction on the target DNA.
  • the cloning method of the present application can be used for subcloning of direct cloning of target DNA, and can capture large fragment genes (10 - 100 kb, for example, 10 - 60 kb) in genomic studies, and can be used to construct recombinant plasmids and perform bacterial chromosomes. Modifications, for gene correction, rapid construction of general and conditional knockout animals (such as murine animals), and for single nucleotide polymorphism (SNP) studies (alternative gene chip technology).
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the ligation reaction is carried out in the body OW ro), avoiding the low abundance of the target genome and the transformation caused by co-transfection in the target DNA without PCR amplification under the condition of in vivo OW) reaction. a contradiction of low rates;
  • Example 1 Easy to operate, fast and efficient. The method of how to implement the present application is explained in more detail below by way of specific examples. However, the method of the present application is not limited to these embodiments. Example 1
  • the human DHRS4 gene cluster has three gene copies, DHRS4 (15.569 bp), DHRS4L2 (about 35 kb) and DHRS4L1 (also known as DHRS4X), of which the first two are highly homologous (90%-98%), belonging to the fragment. Segmental duplication.
  • the homology between DHRS4L1 and DHRS4 and DHRS4L2 was 77.8% and 77.7%, respectively.
  • the high homology between the three genes limits the application of conventional molecular biology methods, creating difficulties for sequencing the DHRS4 gene (15.569 bp in length), through a new generation of gene sequencing technology and gene chip capture technology (from Agilent). And Nalgene) is difficult to perform accurate sequencing and SNP studies of this gene.
  • the DHRS4 gene was homologously recombined into the pl5A vector (Purutin Biotechnology (Beijing) Co., Ltd.) with an enzyme mixture containing RecE and RecT.
  • the sequence of 15-50 bp on both sides of the DHRS4 gene is used as the homologous arm sequence.
  • the resulting PCR product (300 ng), whole genome DNA from human blood was mixed 1:20-30 (6000 ng - 9000 ng) and the appropriate amount (0.5 - 2.0 U) enzyme mixture (RecE and RecT were mixed in equal ratio) in Eppendorf The tubes were mixed and incubated at 30-37 ° C for 30-60 minutes and then transformed into competent E. coli JM109. The transformed Escherichia coli was recovered at 37 ° C for 70 minutes, and then applied to an LB plate containing 100 g / ml of ampicillin, and cultured at 37 ° C overnight.
  • the DHRS4 gene on the plasmid extracted from the ampicillin (Amp) resistant monoclonal strain was used as a template, and was divided into four specific fragments or a full-length fragment by PCR (see Fig. 3). The obtained fragment was:
  • Fragment 1 DHRS4 full-length gene (15.569 bp); Fragment 2: one of the DHRS4 gene fragments (length 7.24 kb); Fragment 3: DHRS4 gene fragment two (length 2.502 kb); Fragment 4: DHRS4 gene fragment Third (length 3.618 kb); Fragment 5: Four of the DHRS4 gene fragment (length 2.351 kb); M: DNA molecular weight marker.
  • the primers for the above PCR detection reactions are as follows:
  • Fragment 1 Primer for DHRS4 gene (full length gene, 15.569 bp):
  • Upstream primer 5, -TCACCGCCCCTGGGAAGAGTGGAAC-3, (SEQ ID ⁇ : 1)
  • Downstream primer 5 -AAGCACCCAACACTGAGAAATGAAC-3 ' (SEQ ID NO: 2)
  • Fragment 2 Primer of one of the DHRS4 gene fragments (7.24 kb):
  • Upstream primer 5 '-GACAGTAGTATGGTAGACAGAATAG-3 ' (SEQ ID NO: 3)
  • Downstream primer 5,-AGATGCCATGTAGGGCTTTAATAGC-3, (SEQ ID NO: 4)
  • Fragment 3 Primer of the DHRS4 gene fragment (2.502 kb): upstream primer: 5,-CATGAGGATGGGCAGTTTCTTCCCT-3, (SEQ ID NO: 5)
  • Downstream primer 5 -AAGCACCCAACACTGAGAAATGAAC-3 ' (SEQ ID NO: 6)
  • Fragment 4 Three of the DHRS4 gene fragment (3.618 kb) primer:
  • Upstream primer 5,-GCTATTAAAGCCCTACATGGCATCT-3, (SEQ ID NO: 7)
  • Downstream primer 5,-TTACAGGCATGAGCCACCCCACCCA-3, (SEQ ID NO: 8)
  • Fragment 5 Four of the DHRS4 gene fragment (2.351 kb) primer:
  • Upstream primer 5, -TCACCGCCCCTGGGAAGAGTGGAAC-3, (SEQ ID NO: 9)
  • Downstream primer 5 -CTATTCTGTCTACCATACTACTGTC-3 ' (SEQ ID NO: 10)
  • the primers of Fragment 3 and the primers of Fragment 4 overlap in design, i.e., there is an overlap between the PCR product of Fragment 3 and the PCR product of Fragment 4.
  • the PCT test results are shown in Figure 4.
  • the results of Figure 4 demonstrate that a large DNA fragment of more than 15 kb was successfully cloned into a vector by the method of the present application.
  • Example 2 The appropriate PCR primers were designed according to the method described in Example 1.
  • the mouse TFIIA gene transcription factor II A
  • the PCR product of the plasmid obtained from the positive clone was verified by Pstl restriction map.
  • Figure 4 shows the cleavage map of the PCR product obtained from a partially positive clone.
  • the correct cloning rate for each of the following Tables 1 is the correct cloning rate (ie, successful ligation rate) as verified by restriction enzyme digestion (the cleavage map of the Pstl enzyme).

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Abstract

本申请提供基于同源重组的核酸分子克隆方法。按照本申请的方法，通过提供两端添加有分别与目标DNA两端序列或其侧翼序列同源的序列（即目标DNA特异性同源臂）的线性化载体，或者利用同时含有目标DNA特异性同源臂和载体特异性同源臂（与载体特定区域同源的序列）的连接片段，将目标DNA通过同源重组克隆到载体中。本申请的方法尤其适用于大DNA片段的克隆和单核苷酸多态性研究。本申请还提供相关的试剂盒。

Description

基于同源重组的核酸分子克隆方法及相关试剂盒 技术领域
本申请涉及 DNA重组技术领域。 更具体而言， 本申请涉及基于 同源重组的核酸分子克隆方法、 其应用以及相关的试剂盒。 背景技术
在分子生物学研究和生物技术行业， 始终需要将所需的 DNA分 子克隆至载体内， 尤其是克隆在载体的特定位置。
将目标 DNA克隆至诸如质粒之类的载体内预定位置的传统方法 通常包括六大步骤： （1)利用限制性核酸内切酶对载体 DNA 进行酶 切， 纯化线性化载体； （2)用小牛肠碱性磷酸酶 (CIP)处理线性化载 体， 使连接过程中线性化载体的自环化程度最小； （3)利用 PCR 引物 借助聚合酶链反应 (PCR)扩增目标 DNA, 其中所述引物将在所扩增 的目标 DNA的 5，和 3，端添加使载体 DNA线性化所用的限制性核酸 内切酶的酶识别位点； （4)利用使载体 DNA线性化所用的限制性核苷 酸内切酶对所扩增目标 DNA 进行酶切， 接着纯化经酶切的目标 DNA; (5)利用 DNA连接酶将纯化的目标 DNA与纯化的线性载体连 接起来； 以及 (6)将连接产物转化到宿主细胞、 例如大肠杆菌感受态 细胞中， 然后选择含有所要克隆产物的转化细胞， 其中目标 DNA于 所需克隆位点插入至载体内。 传统克隆方法繁瑣、 费时， 克隆效率 相对较低， 也受限于载体和目标 DNA上适当限制性内切酶识别位点 的可用性。
利用同源重组可大大提高基因克隆的效率。 目前已有各种各样 的基于同源重组的克隆方法。 通常的作法是， 首先通过 PCR对目标 DNA进行扩增， 利用 PCR引物在所扩增的目标 DNA两端添加与线 性化载体 DNA两端同源的序列； 然后在体外通过酶的作用， 通过同 源重组将 PCR引物克隆到载体中， 或者将线性化载体和 PCR产物共 转化或共转染到宿主细胞中， 在体内酶的作用下， 通过同源重组将 PCR引物克隆到载体中。 然而， 现有的基于同源重组的克隆方法还存在一些问题， 特别 是在对来自真核生物的大片段基因组 DNA 进行克隆或对人基因组 DNA中单核苷酸多态性 (SNP)进行研究的情况下。 例如， 目前还难以 通过 PCR扩增 10kb 以上的大片段基因组 DNA。 对于体内同源重 组， 由于其涉及将经 PCR扩增的目标 DNA片段与载体 DNA分子共 转化或共转染到宿主细胞中， 导致转化率低下。 另外， 在进行 SNP 研究时， 难以区分所检测出的单个核苷酸突变是基因组中本身存在 的还是因 PCR扩增人为引入的。 因此， 还需要能够解决这些问题的 新的克隆方法。
本申请通过提供一种基于同源重组的核酸分子克隆方法， 解决 了上述问题。 发明内容
本申请的一个方面提供基于同源重组的核酸分子克隆方法。 在 一个实施方案中， 本申请提供将目标 DNA克隆到载体中的方法， 其 包括：
(a)将第一序列和第二序列分别添加到线性化载体的两端， 其中 第一序列与目标 DNA的第一末端或其侧翼序列同源的序列， 第二序 列与目标 DNA的第二末端或其侧翼序列同源的序列， 获得两端分别 具有第一序列和第二序列的延长的线性化载体， 所述第一序列和第 二序列各自独立地长至少 12个核苷酸， 优选 15-50个核苷酸， 更优 选 35-50个核苷酸；
(b)使延长的线性化载体与含有目标 DNA 的样品接触， 通过同 源重组将目标 DNA克隆到载体中。
在一个优选实施方案中， 步骤 (a)可以如下进行：
(i)提供第一引物、 第二引物和载体， 其中第一引物包含作为 5' 端的所述第一序列和作为 3，端的对载体第一区域特异性的序列， 第 二引物包含作为 5，端的所述第二序列和作为 3，端的对载体第二区域 特异性的序列， 优选对载体第一区域特异性的序列为与载体第一区 域互补的序列， 优选对载体第二区域特异性的序列为与载体第二区 i或互 卜的序列； 和
(ii) 将第一引物、 第二引物和载体接触， 以载体为模板通过聚合 酶链式反应， 获得两端分别具有第一序列和第二序列的延长的线性 化载体。
作为聚合酶链式反应模板的载体可以为线性化载体， 所述第一 区域和第二区域优选分别为线性化载体的第一末端和第二末端。 作 为聚合酶链式反应模板的载体也可以为环状载体， 优选聚合酶链式 反应在解旋酶存在下进行。
在另一个优选实施方案中， 步骤 (a)可以如下进行：
(i) 提供第一连接片段、 第二连接片段和载体， 其中第一连接片 段具有与目标 DNA第一末端或其侧翼序列同源的序列和与载体第一 区域同源的序列， 第二连接片段具有与目标 DNA第二末端或其侧翼 序列同源的序列和与载体的第二区域同源的序列； 和
(ii) 将第一连接片段、 第二连接片段和载体接触， 通过同源重组 获得两端分别具有第一序列和第二序列的延长的线性化载体。
在另一实施方案中， 本申请提供将目标 DNA克隆到载体中的方 法， 其包括：
(a)提供第一连接片段、 第二连接片段和载体， 其中第一连接片 段具有与载体的第一区域同源的序列和与目标 DNA第一末端或其侧 翼序列同源的序列， 第二连接片段具有与载体的第二区域同源的序 列和与目标 DNA第二末端的侧翼序列同源的序列； 和
(b) 将第一 DNA 片段和第二 DNA 片段与线性化载体以及含有 目标 DNA的样品接触， 通过同源重组将目标 DNA克隆到载体中。
在上述实施方案中， 所述同源重组可以在核酸外切酶和单链 DNA 结合蛋白或退火蛋白或其功能上等同的酶存在下进行。 所述核 酸外切酶优选选自大肠杆菌核酸外切酶 I、 大肠杆菌核酸外切酶 III、 大肠杆菌核酸外切酶 VII、 λ噬菌体核酸外切酶、 Τ7噬菌体核酸外切 酶、 Red o、 RecE和它们的混合物。 所述单链 DNA结合蛋白或退火 蛋白优选选自极端热稳定单链 DNA结合蛋白（ET SSB)、 Rec A、 T4 基因 32蛋白、 嗜热栖热菌 RecA (Tth RecA), 大肠杆菌单链 DNA结 合单链 (SSB)、 Red β 、 RecT和它们的混合物。
同源重组可以在核酸外切酶和单链 DNA结合蛋白或退火蛋白的 任意组合下进行。 在一个优选实施方案中， 所述同源重组在 RecE和 RecT存在下进行。 在另一个优选实施方案中， 所述同源重组在 Red α和 Red P存在下进行。 在进一步优选实施方案中， 所述同源重组在 RecE, RecT, Red α和 Red β存在下进行。
同源重组还可以在其他酶存在进行下。 所述其他酶例如为解旋 酶、 核酸修复蛋白等。
在再一实施方案中， 本申请提供用于将目标 DNA克隆到载体中 的试剂盒， 其包含：
(a) 酶混合物， 其包含核酸外切酶和单链 DNA 结合蛋白或退火 蛋白。
(b)反应緩沖液。
核酸外切酶可以是原核生物核酸外切酶或病毒核酸外切酶， 优 选选自大肠杆菌核酸外切酶 I、 大肠杆菌核酸外切酶 III、 大肠杆菌核 酸外切酶 VII、 λ噬菌体核酸外切酶、 Τ7 噬菌体核酸外切酶、 Red α、 RecE和它们的混合物。
单链 DNA 结合蛋白或退火蛋白可以选自极端热稳定单链 DNA 结合蛋白（ET SSB)、 Rec A、 T4基因 32蛋白、 嗜热栖热菌 RecA (Tth RecA), 大肠杆菌单链 DNA结合单链 (SSB)、 Red β , RecT和它们的 混合物。
所述酶混合物可以包含核酸外切酶与单链 DNA结合蛋白或退火 蛋白的任意组合。 在一个优选实施方案中， 所述酶混合物包含 RecE 和 RecT。 在另一个优选实施方案中， 所述酶混合物包含 Red o和 Red P。 在进一步优选的实施方案中， 所述酶混合物包含 RecE、 RecT, Red o和 Red β 。
所述酶混合物还可以含有解旋酶和 /或核酸修复蛋白。 在一个优 选实施方案中， 所述酶混合物包含核酸外切酶、 解旋酶、 单链 DNA 结合蛋白或退火蛋白和核酸修复蛋白。
在本申请的试剂盒中， 反应緩沖液优选包含 1 - 10 mg/mL 的 Tris、 1 - 10 mg/mL 的 NaCl、 0.1 - 10 mg/mL 的 EDTA、 0.1 - 10 mg/mL的 MgCl2、 10 - 200 mg/mL的甘油、 10 - 50 mg/mL的牛血清 白蛋白（BSA)、 0.1— 10 mg/mL的 ATP、 1— 10 mg/mL Na2HP04、 0.1 - 10 mg/mL KH2P04、 0.1 - 10 mg/mL的二硫苏糖醇 (DDT); pH值约 为 6.8 _ 7.4。 附图说明
图 1 为本申请方法的一个实施方案的示意图， 其中 SM 为选择 标记。
图 2 为本申请方法的另一实施方案的示意图， 其中 SM为选择 标记。
图 3 为示意图， 显示 DHRS4基因的片段之一、 二、 三和四 (分 别为片段 2 _ 4)在全长 DHRS4基因（片段 1)上的位置。
图 4 为阳性 (氨苄青霉素抗性)克隆质粒的 PCR产物的电泳图 谱。 1道为扩增的全长 DHRS4基因（片段 1), 2 - 4道分别为片段 2 - 5, M道为 DNA分子量标记。
图 5为 Pstl酶切图谱。 在图 A中， 1道为 DNA分子量标记， 2 道为小鼠 TFIIA基因的标准酶切图谱。 在图 B中， 1道为 DNA分子 量标记， 2 - 14 道为以从阳性克隆 (转化子)提取的质粒 DNA 为模板 的 PCR扩增产物的酶切图谱。 具体实施方式
除非另有规定， 否则本申请中所用的所有科技术语的含义与具 有本申请所属领域技术人员普遍理解的含义相同。
本发明人发现， 在制备的 DNA样品 (例如提取的基因组 DNA样 品）中目标 DNA的丰度足以允许目标 DNA在体外通过同源重组克隆 到载体中， 而无需在将目标 DNA引入载体之前对目标 DNA进行扩 增， 从而完成了本申请。
在本申请的方法中， 通过提供两端添加有分别与目标 DNA两端 序列或其侧翼序列同源的序列（即目标 DNA特异性同源臂)的线性化 载体， 或者利用同时含有目标 DNA特异性同源臂和载体特异性同源 臂 (与载体特定区域同源的序列）的连接片段， 将目标 DNA通过同源 重组克隆到载体中。
利用本申请的方法， 由于无需对目标 DNA进行 PCR扩增， 因 此不会引入人为突变， 也没有 PCR扩增时遇到的对目标 DNA (即待 扩增片段)大小的限制， 可以对 10kb以上 (例如 10 - 100 kb)的大 DNA 片段进行克隆。 此外， 由于本申请的方法是在体外将目标 DNA引入 载体， 从而解决了体内重组中因共转化或共转染引起的转化率低的 问题。 因此， 本申请通过提供这种方法解决了现有技术中存在的问 题。 载体
本申请所用的术语 "载体" 意指这样的核酸， 其能够转运所连 接的另一核酸。 所述载体可以为任何载体， 例如质粒、 粘粒、 病毒 等， 也可以是细菌人工染色体 (BAC)或酵母人工染色体 (YAC)和噬菌 粒。 所述载体可以是自主复制型载体或整合性载体。 自主复制型载 体能够在所导入的宿主细胞中自主复制， 例如具有细菌复制起点的 细菌载体以及附加型哺乳动物载体。 整合型载体在被导入宿主细胞 时整合到宿主细胞的基因组中， 从而随宿主基因组一起复制， 例如 非附加型哺乳动物载体。 此外， 某些载体即表达载体能够引导与其 有效连接的基因表达。 本申请的载体还可以是允许在不同宿主中克 隆 DNA 或允许 DNA 在宿主间穿梭的特殊设计的载体， 即穿梭载 体。 上述载体是本领域技术人员知晓的， 可以根据需要， 例如根据 所使用的宿主细胞以及按照本申请添加第一序列和第二序列所使用 的方法等来进行选择。
本申请的载体可以含有用于克隆、 表达和筛选的各种元件。 在 一个实施方案中， 所述载体含有用于在宿主细胞内复制的复制起 点， 例如用于在大肠杆菌宿主细胞内复制的 ColEl 复制起点、 用于 在酵母宿主细胞内复制的 2 μ复制起点、 或病毒复制起点， 例如 SV40的复制起点。
在另一实施方案中， 所述载体含有用于选择正确重组子的选择 标记， 例如药物抗性基因， 所述药物例如但不限于氨苄青霉素、 链 霉素、 卡那霉素、 氯霉素、 潮霉素、 氨曱蝶呤等， 所述选择标记也 可以是报道基因， 例如但不限于编码绿色荧光蛋白（GFP)、 β-半乳糖 苷酶、 荧光素酶、 氯霉素乙酰转移酶、 β-葡糖醛酸酶、 新霉素磷酸转 移酶等等。 按照本申请， 也可以使用在原始载体和重组后载体中差 异表达的标记基因。 含有重组后载体的转化宿主细胞可以容易地采 用本领域已知的各种方法加以鉴定， 例如可以通过对阳性克隆内所 含载体上的目标 DNA片段进行 PCR扩增 (PCR筛选)来鉴定。
目标 DNA可以克隆在载体的任何预定位置。 克隆位置可以根据 需要选择。 根据选定的克隆位置和方向， 可以容易地确定载体的第 一区域和第二区域以及本发明的引物和连接片段中与其相对应的序 列。
在本申请的一个实施方案， 所述载体为质粒， 预定的用于插入 目标 DNA的位置可以位于限制性核酸内切酶酶切位点， 或者位于两 个限制性核酸内切酶酶切位点之间。 用所述一种或一种以上限制性 核酸内切酶消化所述质粒， 可以获得线性化载体。 目标 DNA
采用本申请的方法， 可以将任何目标 DNA克隆到载体中。 目标 DNA分子既可以来自原核生物， 例如细菌基因组 DNA、 cDNA, 也 可以来自真核生物， 如酵母、 哺乳动物（例如人类）等的基因组 DNA、 cDNA; 还可以是由 PCR反应介导的 DNA片段、 由细菌人工 染色体 (BAC)、 酵母人工染色体 (YAC)、 粘粒等构建的原核或真核生 物的基因组 DNA文库中的 DNA片段等。 目标 DNA可以是编码蛋 白质的基因、 携带基因突变或病变的序列等。
目标 DNA可以是小片段 DNA, 也可以是大片段 DNA。 本申请 的方法尤其适用于大片段 DNA、 例如 10kb - lOOkb 的大片段 DNA 的克隆。 所述大片段 DNA可以为 10kb - 100kb、 例如 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 50、 55、 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95、 100kb的大片段 DNA。 延长的线性化载体的制备
按照本申请， 将分别第一序列和第二序列添加在线性化载体两 侧， 制备延长的线性化载体， 其中第一序列包含与目标 DNA第一末 端或其侧翼序列同源的序列， 而第二序列包含与目标 DNA第二末端 或其侧翼序列同源的序列， 使得两侧分别添加了第一序列和第二序 列的线性化载体可以通过同源重组与目标 DNA连接在一起。 第一序 列和第二序列可以是与目标 DNA相应末端或其侧翼序列同源的序 列。
所谓 "同源" 意指两个核苷酸序列之间具有一定的序列同一性 (identity)或同源性 (homology), 使得可以在重组酶或重组系统作用下 通过同源重组连接在一起。 所述 "同源" 包括细但不限于两个核苷 酸序列之间具有至少 80%的序列同一性， 例如具有 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%的 同一性。 术语 "序列同一性" 是本领域技术人员众所周知的， 意指 两个核酸序列或多肽序列在优化比对和分析时核苷酸或氨基酸残基 相同的百分率。 序列同一性的计算方法是本领域技术人员所熟知 的。
作为同源臂的第一序列和第二序列与目标 DNA相应序列的同源 性没有限制， 只要所得的延长的线性化载体能够与目标 DNA发生同 源重组即可。 优选第一序列与目标 DNA第一末端或其侧翼序列具有 100%的序列同一性， 优选第二序列与目标 DNA 第二末端或其侧翼 序列具有 100%的序列同一性。 第一序列和第二序列各自独立地长至少 12 个核苷酸， 优选 15- 50个核苷酸， 例如 20、 25、 30、 35、 40、 45、 50个核苷酸， 更优选 长 35-50个核苷酸。
第一序列和第二序列的序列和长度可以根据同源重组所使用的 酶， 基于目标 DNA两端或其侧翼序列来设计。
第一序列和第二序列可以通过各种方法添加到线性化载体的两 侧。 在一个优选实施方案中， 可以使用含有第一序列和载体特异性 序列的第一引物和含有第二序列和载体特异性序列的第二引物， 以 载体为模板， 经 PCR将第一序列和第二序列分别添加到线性化载体 的两侧。 例如， 第一引物含有第一序列和对载体第一区域具有特异 性的序列， 第二引物含有第二序列和对载体第二区域具有特异性的 序列。 例如， PCR 引物可设计为： 作为 5，端的 15 - 50 bp 源自目标 DNA的同源序列和紧随其后作为 3'端的 18 - 25 bp的质粒 DNA模板 特异性的引物序列。 PCR引物中质粒 DNA模板特异性的引物序列可 以是与质粒 DNA模板互补的序列。 所谓 "互补" 意指 100%互补。
可以使用本领域众所周知的任何方法进行 PCR反应。 PCR反应 的条件可以通过常规实验来选择或优化。 请参看例如 Joseph Sambrook等, Molecular Clonning: A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; 和 Carl W. Dieffenbach 和 Gabriela S. Dveksler, PCR primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995。
所述载体可以是线性化载体， 也可以是环状载体。
在另一优选实施方案中， 可以不通过 PCR反应， 而是利用同时 含有目标 DNA特异性同源臂和载体特异性同源臂的连接片段， 例如 第一连接片段和第二连接片段， 将所述连接片段与载体接触， 通过 同源重组获得延长的线性化载体， 即两侧分别添加有第一序列和第 二序列的线性化载体。 在这种情况下， 所述连接片段同时含有目标 特异性同源臂和载体特异性同源臂。 也就是说所述连接片段既含有 与目标 DNA末端或其侧翼序列同源的序列， 也含有载体的特定区域 同源的序列。 例如， 第一连接片段含有与目标 DNA第一末端或其侧 翼序列同源的序列和与载体第一区域同源的序列， 第二连接片段含 有与目标 DNA第二末端或其侧翼序列同源的序列和与载体第二区域 同源的序列。 所述载体可以是线性化载体或环状载体。 当载体为环 状载体时， 同源重组反应可以在解旋酶的作用下进行。
同源重组技术在本领域众所周知。 可以使用本领域已知的任何 方法、 任何合适的酶、 酶混合物或酶系统实施同源重组， 例如可以 使用以下所述的方法， 从而将第一序列和第二序列通过同源重组添 加到线性化载体的两侧。
同源重组可以使用任何已知用于同源重组的酶、 酶混合物或酶 系统来实施。
本申请方法可以使用酶混合物来实施。 所述酶混合物可以包含 核酸外切酶和单链 DNA结合蛋白或退火蛋白、 或与上述酶以基本相 同方式发挥作用的酶或蛋白。 核酸外切酶可以是原核生物核酸外切 酶或病毒核酸外切酶， 可以选自大肠杆菌核酸外切酶 I、 大肠杆菌核 酸外切酶 III、 大肠杆菌核酸外切酶 VII、 λ噬菌体核酸外切酶、 Τ7 噬菌体核酸外切酶、 Red o、 RecE和它们的混合物。 单链 DNA结合 蛋白或退火蛋白可以选自极端热稳定单链 DNA结合蛋白（ET SSB)、 Rec A、 T4基因 32蛋白、 嗜热栖热菌 RecA (Tth RecA)、 大肠杆菌单 链 DNA 结合单链 (SSB)、 Red p , RecT 和它们的混合物。 所述酶混 合物可以含有上述核酸外切酶和单链 DNA结合蛋白或退火蛋白的任 意组合。
在一个优选实施方案中， 所述酶混合物包含 RecE和 RecT。 在 另一个优选实施方案中， 所述酶混合物包含 Red α和 Red β。 在进一 步优选的实施方案中， 所述酶混合物 RecE、 RecT, Red α和 Red β。
所述酶混合物还可以含有其他酶， 例如解旋酶和 /或核酸修复蛋 白。 在一个实施方案中， 所述酶混合物包含核酸外切酶、 解旋酶、 单链 DNA结合蛋白或退火蛋白和核酸修复蛋白。 同源重组
同源重组技术在本领域众所周知。 可以使用本领域已知的任何 方法、 任何合适的酶、 酶混合物或酶系统实施同源重组。
可以使延长的线性化载体、 含有目标 DNA的样品与酶或酶混合 物在反应混合物中接触， 即在体外孵育， 从而实现目标 DNA与延长 的线性化载体之间的同源重组。
按照本申请的另一方面， 可以直接将载体、 含有目标 DNA的样 品和以上所述的同时含有目标 DNA特异性同源臂和载体特异性同源 臂的连接片段， 在反应混合物中与酶或酶混合物一起孵育， 从而将 目标 DNA 通过同源重组克隆或连接 (；例如定向或连接克隆)到载体 中。
在本申请的该方面， 所述载体可以是线性化载体， 可以是环状 载体。
反应混合物除含有目标 DNA、 载体和连接片段或者延长的线性 化载体、 酶或酶混合物和反应緩沖液。
在一个实施方案中， 反应混合物含有例如 1 - 100 mg/L 的核酸 外切酶和 1 - 100 mg/L的单链 DNA结合蛋白（单链 DNA退火蛋白、 链侵入蛋白）。 反应混合物还可以含有其他酶， 例如 DNA解旋酶， 如 1 - 100 mg/L 的 DNA 解旋酶； 和 /或核酸修复蛋白， 如 1 - 100 mg/L的核酸修复蛋白。
反应緩沖液可以根据所使用的酶或酶混合物来确定， 并且可以 通过常规实验进行优化。
反应緩沖液包含緩沖剂、 盐和 ATP, 可以包含： Tris、 NaCl、 EDTA、 MgCl2、 甘油、 牛血清白蛋白、 ATP、 磷酸盐和二硫苏糖 醇。 在一个优选实施方案中， 反应緩沖液包含： 1 - 10 mg/mL 的 Tris、 1 - 10 mg/mL 的 NaCl、 0.1 - 10 mg/mL 的 EDTA、 0.1 - 10 mg/mL的 MgCl2、 10 - 200 mg/mL的甘油、 10 - 50 mg/mL的牛血清 白蛋白（BSA)、 0.1— 10 mg/mL的 ATP、 1— 10 mg/mL Na2HP04、 0.1 - 10 mg/mL KH2P04、 0.1 - 10 mg/mL的二硫苏糖醇 (DDT); pH值约 为 6.8 _ 7.4。
本申请的另一方面提供用于将目标 DNA 克隆到载体中的试剂 盒， 所述试剂盒包含： （1)包含核酸外切酶和单链结合蛋白的酶混合 物； 和 (2)反应緩沖液。
所述酶混合物含有其他酶。 所述中核酸外切酶和单链结合蛋白 以及其他酶可参看上文 "酶" 部分。 反应緩沖液可以是上文所述的 反应緩沖液。 转化
可以将目标 DNA与载体的重组产物通过常规方法转化或转染到 宿主细胞中。
常规转化或转染方法包括但不限于磷酸钙或氯化钙共沉淀、 电 穿孔、 脂转染、 DEAE-葡聚糖介导的转染、 病毒感染等。
所述宿主细胞可以是细菌细胞、 真菌细胞、 哺乳动物细胞等。 本领域技术人员可以根据需要选择合适的转化或转染方法和合 适的宿主细胞。
转化宿主细胞经过培养后， 可以根据载体中所含有的选择标记 是否出现， 筛选出含有目标 DNA的重组子。 在使用环状载体进行同 源重组的情况下， 也可以根据选择标记例如抗性的消失（例如目标 DNA的克隆破坏了所述抗性基因）来进行筛选。
筛选出的细胞克隆或菌落可以例如通过对目标 DNA 进行 PCR 反应， 确认含有正确的目标 DNA。
DNA的分离与纯化、 宿主细胞的选择和转化、 菌落 PCR反应、
PCR扩增反应等操作按照本领域的标准技术， 例如 Joseph Sambrook 等, Molecular Clonning: A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 2001 ; 和 Carl W. Dieffenbach和 Gabriela S.
Dveksler, PCR primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995等中描述的方法来实施。
采用本申请的克隆方法可以用于对目标 DNA进行直接克隆的亚 克隆， 可以捕获基因组研究中的大片段基因（10 - lOOkb, 例如 10 - 60kb), 可以用于构建重组质粒、 对细菌染色体进行修饰、 用于基因 校正、 快速构建一般性和条件性基因敲除动物 (如鼠类动物)以及用于 单核苷酸多态性 (SNP)研究 (替代基因芯片技术)。
本申请的方法有如下优点：
1. 不依赖传统的限制性内切酶及单一酶切位点；
2. 不受待克隆的目标 DNA分子大小的限制；
3. 连接反应是在体夕卜 O W ro)进行的， 避免了在体内 O W )反 应条件下， 目标 DNA 未经 PCR扩增时占整个基因组中的含量丰度 低以及共转染所引起的转化率低的矛盾；
4. 反应精确性高；
5. 操作筒便、 快捷和高效。 以下通过具体的实施例更为详细地阐述如何实施本申请的方 法。 然而， 本申请的方法并不限于这些实施例。 实施例 1
人 DHRS4基因簇有三个基因拷贝， 分别为 DHRS4 (15.569bp)、 DHRS4L2 (约 35kb)与 DHRS4L1 (又称为 DHRS4X), 其中前二者同源 性很高（90%-98%), 属于片段复制（segmental duplication)。 DHRS4L1 与 DHRS4和 DHRS4L2之间的同源性分别为 77.8%和 77.7%。 三个 基因之间的高同源性限制了常规分子生物学方法的应用， 为 DHRS4 基因（全长 15.569bp)的测序带来了困难， 即在通过新一代基因测序技 术和基因芯片捕获技术 (来自 Agilent和 Nalgene公司）很难进行该基 因的准确的测序和 SNP研究。
本实施例主要是以含有 RecE和 RecT 的酶混合物， 将 DHRS4 基因同源重组至 pl5A 载体 (普如汀生物技术（北京）有限公司）中。 筒 而言之， 通过以 DHRS4基因两侧各 15-50bp 的序列作为同源臂序 列， 以 pl5A 载体中多克隆位点附近位点两侧 20bp 序列作为通常 PCR扩增引物， 这两段序列加在一起构成了 "组合引物" （即： 组合 引物 =源自 DHRS4的同源臂序列+源自 pl5A载体的通常 PCR扩增引 物）； 然后以 pl5A质粒载体为模板用高保真酶 Prime STAR MAX DNA 聚合酶 (Takara公司）和 "组合引物" 进行 PCR扩增。 将所得 的 PCR产物 (300ng)、 来自于人血液的全基因组 DNA按照 1:20-30 (6000ng - 9000ng)和适量 (0.5 - 2.0 U)酶混物 (RecE和 RecT以等比混 合)在 Eppendorf管中混合， 在 30-37°C下孵育 30-60分钟后转化入到 感受态大肠杆菌细胞 JM109 中。 将转化后的大肠杆菌在 37°C条件下 恢复 70分钟后， 涂到含有 lOO g/ml氨苄青霉素的 LB平板上， 并 在 37°C下过夜培养。
通过 PCR, 以氨苄青霉素 (Amp)抗性单克隆菌株中所提取的质粒 上的 DHRS4基因为模板， 分成四段具体片段或以全长片段进行检测 (参见图 3), 所得到的片段为：
片段 1 : DHRS4全长基因（15.569bp); 片段 2: DHRS4基因片 段之一 (；长度为 7.24kb); 片段 3 : DHRS4 基因片段之二 (；长度为 2.502kb); 片段 4: DHRS4基因片段之三 (长度为 3.618kb); 片段 5: DHRS4基因片段之四（长度为 2.351 kb); M: DNA 分子量标 记。
上述 PCR检测反应的引物如下：
片段 1 : DHRS4基因（全长基因， 15.569bp)的引物：
上游引物： 5， -TCACCGCCCCTGGGAAGAGTGGAAC-3， (SEQ ID ΝΟ:1)
下游引物： 5， -AAGCACCCAACACTGAGAAATGAAC-3 ' (SEQ ID NO:2)
片段 2: DHRS4基因片段之一 (7.24kb)的引物：
上游引物： 5 '-GACAGTAGTATGGTAGACAGAATAG-3 ' (SEQ ID NO:3)
下游引物： 5，-AGATGCCATGTAGGGCTTTAATAGC-3， (SEQ ID NO:4) 片段 3: DHRS4基因片段之二 (2.502kb)的引物： 上游引物： 5，-CATGAGGATGGGCAGTTTCTTCCCT-3， (SEQ ID NO:5)
下游引物： 5， -AAGCACCCAACACTGAGAAATGAAC-3 ' (SEQ ID NO:6)
片段 4: DHRS4基因片段之三 (3.618kb)的引物：
上游引物： 5，-GCTATTAAAGCCCTACATGGCATCT-3， (SEQ ID NO:7)
下游引物： 5，-TTACAGGCATGAGCCACCCCACCCA-3， (SEQ ID NO: 8)
片段 5: DHRS4基因片段之四 (2.351 kb)的引物：
上游引物： 5， -TCACCGCCCCTGGGAAGAGTGGAAC-3， (SEQ ID NO:9)
下游引物： 5， -CTATTCTGTCTACCATACTACTGTC-3 ' (SEQ ID NO: 10)
"组合引物" 的序列如下：
上游引物：
GTGCTTtataccgtctagagttaacc-3 ' (SEQ ID NO: 11)
下游引物 5-3:
GCGGTGAcgtccgcgcggctcgagctt-3 ' (SEQ ID NO: 12)
片段 3的引物和片段 4的引物在设计上有重叠， 即片段 3的 PCR产 物与片段 4 的 PCR产物之间有重叠。
PCT 检测结果示于图 4。 图 4 的结果表明， 通过本申请的方 法， 成功地将超过 15kb的大 DNA片段克隆到载体中。 实施例 2 按照实施例 1描述的方法， 设计合适的 PCR引物， 将长度大约 为 30kb的小鼠 TFIIA基因（转录因子 ΠΑ, Transcription factor II A)从 粘粒 LAWRIST7-mTFIIA (Gene Bridges GmbH)克隆到 pl5A载体上。 对得自阳性克隆的质粒的 PCR产物经过 Pstl酶切图谱进行验证。 图 4给出了其中得自部分阳性克隆的 PCR产物的酶切图谱， 从图中可 以看出， 图 B中的 2 - 13道为正常连接， 而 14道为非正确连接。 经 过统计， 按照本申请方法克隆的成功连接率 (正确连接克隆数 /所检测 的阳性克隆数)为 65-70%左右。 实施例 3
使用实施例 1的方法， 将不同大小的目标 DNA分子克隆到载体 中。 以下表 1 中每一组的正确克隆率为经酶切检测 (Pstl 酶的酶切图 谱)验证的正确克隆率 (即成功连接率)。
表 1
Figure imgf000017_0001

Claims

权利要求书
1. 将目标 DNA克隆到载体中的方法， 包括：
(a) 将第一序列和第二序列分别添加到线性化载体的两端， 其中 第一序列与目标 DNA的第一末端或其侧翼序列同源的序列， 第二序 列与目标 DNA的第二末端或其侧翼序列同源的序列， 获得两端分别 具有第一序列和第二序列的延长的线性化载体， 所述第一序列和第 二序列各自独立地长至少 12个核苷酸， 优选 15-50个核苷酸， 更优 选 35-50个核苷酸；
(b)使延长的线性化载体与含有目标 DNA 的样品接触， 通过同 源重组将目标 DNA克隆到载体中。
2. 权利要求 1的方法， 其中步骤 (a)如下进行：
(i)提供第一引物、 第二引物和载体， 其中第一引物包含作为 5' 端的所述第一序列和作为 3，端的对载体第一区域特异性的序列， 第 二引物包含作为 5，端的所述第二序列和作为 3，端的对载体第二区域 特异性的序列， 优选对载体第一区域特异性的序列为与载体第一区 域互补的序列， 优选对载体第二区域特异性的序列为与载体第二区 i或互 卜的序列； 和
(ii) 将第一引物、 第二引物和载体接触， 以载体为模板通过聚合 酶链式反应， 获得两端分别具有第一序列和第二序列的延长的线性 化载体。
3. 权利要求 2 的方法， 其中作为聚合酶链式反应模板的载体为 线性化载体， 所述第一区域和第二区域优选分别为线性化载体的第 一末端和第二末端。
4. 权利要求 2 的方法， 其中作为聚合酶链式反应模板的载体为 环状载体。
5. 权利要求 1的方法， 其中步骤 (a)如下进行：
(i) 提供第一连接片段、 第二连接片段和载体， 其中第一连接片 段具有与目标 DNA第一末端或其侧翼序列同源的序列和与载体第一 区域同源的序列， 第二连接片段具有与目标 DNA第二末端或其侧翼 序列同源的序列和与载体的第二区域同源的序列； 和
(ii) 将第一连接片段、 第二连接片段和载体接触， 通过同源重组 获得两端分别具有第一序列和第二序列的延长的线性化载体。
6. 将目标 DNA克隆到载体中的方法， 包括：
(a)提供第一连接片段、 第二连接片段和载体， 其中第一连接片 段具有与载体的第一区域同源的序列和与目标 DNA第一末端或其侧 翼序列同源的序列， 第二连接片段具有与载体的第二区域同源的序 列和与目标 DNA第二末端的侧翼序列同源的序列； 和
(b) 将第一 DNA 片段和第二 DNA 片段与线性化载体以及含有 目标 DNA的样品接触， 通过同源重组将目标 DNA克隆到载体中。
7. 权利要求 1 - 6中任一项的方法， 其中所述同源重组在核酸外 切酶和单链 DNA结合蛋白或退火蛋白存在下进行， 所述核酸外切酶 优选选自大肠杆菌核酸外切酶 I、 大肠杆菌核酸外切酶 III、 大肠杆菌 核酸外切酶 VII、 λ噬菌体核酸外切酶、 Τ7噬菌体核酸外切酶、 Red α、 RecE 和它们的混合物， 所述单链 DNA 结合蛋白或退火蛋白优 选选自极端热稳定单链 DNA结合蛋白（ET SSB)、 Rec A、 T4基因 32 蛋白、 嗜热栖热菌 RecA (Tth RecA)、 大肠杆菌单链 DNA结合单链 (SSB)、 Red β 、 RecT和它们的混合物。
8. 权利要求 1 - 6 中任一项的方法， 其中所述同源重组在 RecE 和 RecT存在下或在 Red on Red β存在下进行。
9. 权利要求 1 - 6 中任一项的方法， 其中所述同源重组在 RecE, RecT, Red α和 Red β存在下进行。
10. 用于将目标 DNA克隆到载体中的试剂盒， 其包含：
(a) 酶混合物， 其包含核酸外切酶和单链 DNA 结合蛋白或退火 蛋白； 和
(b)反应緩沖液。
11. 权利要求 10 的试剂盒， 其中核酸外切酶选自原核生物核酸 外切酶或病毒核酸外切酶， 优选选自大肠杆菌核酸外切酶 I、 大肠杆 菌核酸外切酶 III、 大肠杆菌核酸外切酶 VII、 λ噬菌体核酸外切酶、 Τ7噬菌体核酸外切酶、 Red α、 RecE和它们的混合物。
12. 权利要求 10或 11的试剂盒， 其中单链 DNA结合蛋白或退 火蛋白选自极端热稳定单链 DNA结合蛋白（ET SSB)、 Rec A、 T4基 因 32蛋白、 嗜热栖热菌 RecA (Tth RecA)、 大肠杆菌单链 DNA结合 单链 (SSB)、 Red β 、 RecT和它们的混合物。
13. 权利要求 10 - 12 中任一项的试剂盒， 其中所述酶混合物包 含 RecE和 RecT、 或 Red α和 Red β 。
14. 权利要求 10 - 12 中任一项的试剂盒， 其中所述酶混合物包 含 RecE, RecT, Red α和 Red β 。
15. 权利要求 10 - 14 中任一项的试剂盒， 所述酶混合物还含有 解旋酶和 /或核酸修复蛋白。
16. 权利要求 15 的试剂盒， 其中所述酶混合物包含核酸外切 酶、 解旋酶、 单链 DNA结合蛋白或退火蛋白和核酸修复蛋白。
17. 权利要求 10 - 16 中任一项的试剂盒， 其中反应緩沖液包含 1— 10 mg/mL 的 Tris、 1— 10 mg/mL 的 NaCl、 0.1— 10 mg/mL 的 EDTA、 0.1 - 10 mg/mL的 MgCl2、 10 - 200 mg/mL的甘油、 10 - 50 mg/mL 的牛血清白蛋白（BSA)、 0.1 - 10 mg/mL 的 ATP、 1 - 10 mg/mL Na2HP04、 0.1— 10 mg/mL KH2P04、 0.1— 10 mg/mL的二石克苏 糖醇 (DDT); pH值约为 6.8 - 7.4。
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102634534A (zh) * 2012-03-30 2012-08-15 深圳市中联生物科技开发有限公司 基于同源重组的核酸分子克隆方法及相关试剂盒
CN104372016A (zh) * 2013-10-19 2015-02-25 刘立新 在受体细胞的目的基因组序列引入变异的系统和方法
CN104152482A (zh) * 2014-07-14 2014-11-19 四川大学 运动发酵单胞菌RecET重组系统表达质粒及其构建方法与应用
CN104498451A (zh) * 2015-01-06 2015-04-08 苏州泓迅生物科技有限公司 兼具核酸外切和单链dna交换活性的重组酶及其应用
CN106119222A (zh) * 2016-07-04 2016-11-16 翌圣生物科技（上海）有限公司 一种用于体外同源重组的蛋白酶组合物、试剂盒及方法
JP6779513B2 (ja) * 2016-07-11 2020-11-04 大学共同利用機関法人情報・システム研究機構 インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法、インビボクローニング可能な細胞株の製造方法、細胞株、インビボクローニング方法、及びインビボクローニングを行うためのキット
CN106701607B (zh) * 2017-01-11 2020-05-08 浙江科技学院 在酵母菌中实现高准确率定点基因敲除的方法
CN106834335B (zh) * 2017-01-11 2020-05-08 浙江科技学院 在酵母菌中实现高准确率基因同源克隆的方法
CN106995813B (zh) * 2017-03-23 2020-06-16 山东大学 基因组大片段直接克隆和dna多分子组装新技术
US11952613B2 (en) * 2019-03-11 2024-04-09 Phillip N. Gray Methods and reagents for enhanced next generation sequencing library conversion and incorporation of molecular barcodes into targeted and random nucleic acid sequences
CN110951759A (zh) * 2019-12-27 2020-04-03 苏州泓迅生物科技股份有限公司 一种超大质粒的体外组装方法及其应用
CN111850022A (zh) * 2020-07-02 2020-10-30 南京农业大学 一种快速添加或替换目的基因的蛋白标签的方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1331748A (zh) * 1998-10-30 2002-01-16 默多克研究所 重组方法及其所用试剂
CN1844401A (zh) * 2006-01-17 2006-10-11 南京大学 一种快速构建基因打靶重组用载体的方法
US20070148775A1 (en) * 2005-12-02 2007-06-28 Seung-Goo Lee Method for cloning and expressing target gene by homologous recombination
CN101492694A (zh) * 1999-07-09 2009-07-29 欧洲分子生物学实验室 应用同源重组定向克隆和亚克隆的方法和组合物
CN102007212A (zh) * 2008-03-07 2011-04-06 国立大学法人富山大学 同源重组方法和克隆方法以及试剂盒
CN102124112A (zh) * 2008-09-10 2011-07-13 金斯瑞公司 基于同源重组dna的克隆方法及组合物
CN102321612A (zh) * 2011-08-29 2012-01-18 苏州金唯智生物科技有限公司 工业化的基因合成方法
CN102634534A (zh) * 2012-03-30 2012-08-15 深圳市中联生物科技开发有限公司 基于同源重组的核酸分子克隆方法及相关试剂盒

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4139561B2 (ja) * 1997-12-05 2008-08-27 ユーロペーイシェ ラボラトリウム フュール モレキュラーバイオロジー（イーエムビーエル） 新規ｄｎａクローニング方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1331748A (zh) * 1998-10-30 2002-01-16 默多克研究所 重组方法及其所用试剂
CN101492694A (zh) * 1999-07-09 2009-07-29 欧洲分子生物学实验室 应用同源重组定向克隆和亚克隆的方法和组合物
US20070148775A1 (en) * 2005-12-02 2007-06-28 Seung-Goo Lee Method for cloning and expressing target gene by homologous recombination
CN1844401A (zh) * 2006-01-17 2006-10-11 南京大学 一种快速构建基因打靶重组用载体的方法
CN102007212A (zh) * 2008-03-07 2011-04-06 国立大学法人富山大学 同源重组方法和克隆方法以及试剂盒
CN102124112A (zh) * 2008-09-10 2011-07-13 金斯瑞公司 基于同源重组dna的克隆方法及组合物
CN102321612A (zh) * 2011-08-29 2012-01-18 苏州金唯智生物科技有限公司 工业化的基因合成方法
CN102634534A (zh) * 2012-03-30 2012-08-15 深圳市中联生物科技开发有限公司 基于同源重组的核酸分子克隆方法及相关试剂盒

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