CN113136374B - 一种重组突变型Tn5转座酶的制备及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种重组突变型Tn5转座酶的制备及应用，可极大提高Tn5重组蛋白的表达量、增强Tn5蛋白的活性并优化了Tn5蛋白稳定性。该转座酶能够明显提高DNA文库构建的效率，减少DNA文库构建过程中目标产物的损失，并能够适用于多种类型二代高通量测序文库的构建。

Description

一种重组突变型Tn5转座酶的制备及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组突变型Tn5转座酶的制备及应用。
背景技术
转座酶是一类具有执行转座能力的蛋白质，可以识别并结合转座子上特异性序列，将转座子通过复制或者剪切的模式随机插入到DNA序列上。由于转座酶的这种特性，许多转座酶被开发和改造为一种分子生物学研究工具，用于二代测序技术中的文库构建。与传统高通量二代测序的文库构建方法：“核酸片段化—末端修复—3’端加A—接头连接”相比较，转座酶只需要一步就可以完成，大大提高文库构建的效率并减少文库构建过程中目标产物的损耗。
Tn5转座酶是随机转座子插入形成转座体的关键酶，被广泛用于高通量二代测序文库构建，但由于野生型Tn5蛋白表达量低，酶活性极弱，稳定性差等原因，无法用于二代测序文库构建。目前市场上的Tn5蛋白，仍存在活性不足、不耐储存、结合能力弱等缺点，尚无法同时满足多种类型二代高通量测序文库的构建需求。
本发明提供了一种重组突变型Tn5转座酶的制备及应用，可极大提高Tn5重组蛋白的表达量、增强Tn5蛋白的活性并优化了Tn5蛋白稳定性，能够适用于多种类型二代高通量测序文库的构建并提高建库效率。
发明内容
本发明提供了一种重组突变型Tn5转座酶的制备及应用，增加了Tn5重组蛋白的表达量，酶活性以及稳定性，能够明显提高DNA文库构建的效率，减少DNA文库构建过程中目标产物的丢失，同时适用于多种类型二代高通量测序文库的构建。
本发明的技术方案：
本发明为一种重组突变型Tn5转座酶的制备及应用。其特征在于，将Tn5转座酶与大肠杆菌内源性蛋白EF融合形成融合蛋白，能够极大的增强Tn5蛋白的表达量以及正确折叠的效率。突变型是指通过点突变技术，在原突变型（E54K和L372P）Tn5的基础上进一步改造（突变其中两个位点，M56A与E345K）得到高酶活性、高稳定性的突变体Tn5转座酶。本发明的Tn5转座酶可应用于多种类型二代高通量测序文库的构建，对提高二代高通量测序文库构建的效率和减少文库构建过程中目标产物的损耗具有明显的作用。本发明还设计了另一种可供选择的大肠杆菌内源性蛋白TRX1，与突变型Tn5蛋白形成融合蛋白，同样可以得到高酶活性，高稳定性的突变型Tn5转座酶，可应用于多种二代高通量测序文库类型的构建，对提高二代高通量测序文库构建的效率以及减少文库构建过程中目标产物的损耗具有明显作用。本发明步骤简单、可操作性强、效果显著。上述大肠杆菌内源性蛋白EF氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；现有突变型大肠杆菌Tn5转座酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，大肠杆菌内源性蛋白TRX1氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明包含Tn5蛋白表达载体的构建、表达与分离纯化、与接头装配成Tn5转座酶、验证Tn5转座酶活性以及二代高通量文库的构建试验等多个步骤。具体步骤如下：
1. 构建含有多个有益突变位点的Tn5蛋白表达载体
利用特定的点突变引物对Tn5转座酶DNA片段进行PCR扩增，获得目标位点突变的Tn5转座酶DNA片段Tn5m，通过重组技术将大肠杆菌内源性蛋白EF或TRX1的DNA序列和Tn5m片段克隆到蛋白表达载体中。
2. 重组突变型Tn5蛋白的表达、分离纯化与浓度测定
将步骤1中所得载体转化表达菌株中，随后在含有相应浓度抗生素的液体培养基中扩大培养和分离纯化得到高纯度的重组突变型Tn5蛋白。通过BCA试剂盒（Pierce，23250）测定纯化的蛋白浓度。将得到的重组突变型Tn5蛋白与退火形成的接头按一定比例孵育，装配组成重组突变型Tn5转座酶。
3. 重组突变型Tn5转座酶的活性验证
将步骤2得到的重组突变型Tn5转座酶用于片段化λDNA，确定最佳活性比例。
4. 二代高通量文库构建试验
将上诉重组突变型Tn5转座酶用于二代高通量文库类型的构建，测定文库的片段化大小。
经过测试，本发明重组突变型Tn5转座酶具有易表达、活性高、稳定性好的特点，适用于多种二代高通量文库类型的构建。
本发明涉及一种重组突变型Tn5转座酶，构建方法包括：
（1）以原突变型Tn5转座酶基因为模板，进一步改造突变M56A与E345K两个位点，获得Tn5m核苷酸片段；
（2）将Tn5m核苷酸片段与EF或TRX1核苷酸片段通过重组反应，获得EF-Tn5m转座酶或TRX1-Tn5m转座酶的核苷酸片段；
所述EF-Tn5m转座酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；所述TRX1-Tn5m转座酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示。
步骤（1）所述改造突变M56A与E345K两个位点所需要的引物包括：
56A-F：5′-GGCAGCAAAGCCGCCCAGGAAGGCGCGTAT-3′；
56A-R：5′-ATACGCGCCTTCCTGGGCGGCTTTGCTGCC-3′；
345K-F：5′-CAGCGTATGGAAAAACCGGATAACCTG-3′；
345K-R：5′-CAGGTTATCCGGTTTTTCCATACGCTG-3′。
包含上述重组突变型Tn5转座酶的核苷酸序列的载体，制备方法为：将所述EF-Tn5m转座酶、TRX1-Tn5m转座酶的核苷酸片段利用同源重组分别克隆到表达载体pET30a中。
利用上述载体表达制备重组突变型Tn5转座酶的方法，包括以下步骤：
（1）将表达载体转入C3013（NEB）感受态细胞中，放入冰上孵育30 min，再热激60s，随后冰上孵育5 min；加入200 μL LB液体培养基，放入摇床复苏30 min后，涂布于终浓度50 μg/mL卡那霉素固体培养基上，37℃过夜培养；第二天挑取单菌落进行测序验证；
（2）将含有正确目的序列的单菌落接种于10 mL LB液体培养基，37℃培养过夜，从中取1 mL 接种于100 mL LB液体培养基，扩大培养至OD600 = 0.5，加入终浓度0.25 mM的IPTG诱导重组突变型Tn5蛋白表达；诱导6 h后，用50 mL离心管收集菌体，用于蛋白纯化；
（3）向菌体中加入10 mL 结合缓冲液 ，随后于超声波细胞破碎仪中进行菌体破碎，再加入50 μL PEI（Sigma，P3143）沉淀菌液中的DNA分子，在4℃ 12,000g条件下离心10min取上层清液；将上清液加入到已经预先平衡好的亲和柱中，待上清液流尽后，分别用结合缓冲液和漂洗缓冲液洗涤一次，然后加入10 mL洗脱液，待液体流出一个柱体积后，封闭亲和柱，放于4℃冰箱过夜，第二天释放蛋白溶液，获得重组突变型Tn5蛋白溶液；
（4）重组突变型Tn5转座酶装配：分别按摩尔比ME-A：ME-R = 1：1，ME-B：ME-R = 1：1进行混匀并退火形成Tn5 接头A和接头B，然后将接头A与接头B等体积比混合，得到Tn5接头AB；将步骤（3）所述重组突变型Tn5蛋白溶液进行超滤浓缩并用储存缓冲液置换，再按体积比1：0.5；1：1和1：2加入混合的Tn5接头AB，最后加入终浓度为50%的甘油，混合均匀，20℃孵育40 min。
所述储存缓冲液配方为：20 mM Tris-HCl pH 8.0；0.15 M NaCl；1 mM EDTA；
结合缓冲液配方为：10 mM Tris-HCl pH 8.0；1 M NaCl；1 mM EDTA； 10% 甘油；0.1% Triton X-100；
漂洗缓冲液配方为：10 mM Tris-HCl pH 8.0； 2 M NaCl；1 mM EDTA；10% 甘油；0.1% Triton X-100；
洗脱液配方为：20 mM Tris-HCl pH 8.0；0.5 M NaCl；1 mM EDTA；50 mM DTT。
本发明具有以下优点：
1、本发明所用重组突变型Tn5转座酶是一种可以人工制备，操作简单的转座酶。
2、本发明以低成本普通培养基为发酵原料，可在较短时间内获得大量稳定、高效的可溶性重组突变型Tn5转座蛋白。
3、本发明适用性广泛，可应用于多种二代高通量测序文库类型的构建，包括但不限于ChIP-seq，RNA-seq和ATAC-seq 等，具有较大的商业应用价值。
附图说明
图1为重组突变型Tn5转座酶载体示意图
图2为重组突变型Tn5转座酶装配（EF-Tn5m）；M：DNA marker；λ：200 ng λDNA；A：200 ng λDNA+1 μL重组突变型Tn5转座酶（蛋白：接头的装配比例为1：0.5）；B：200 ng λDNA+1 μL重组突变型Tn5转座酶（蛋白：接头的装配比例为1：1）；C：200 ng λDNA+1 μL重组突变型Tn5转座酶（蛋白：接头的装配比例为1：2）；
图3为原Tn5转座酶和重组突变型Tn5转座酶分别对λDNA的片段化效率；M：DNAmarker；λ：400 ng λDNA；A：400 ng λDNA+2 μL原Tn5转座酶；B：400 ng λDNA+2 μL重组突变型Tn5转座酶；
图4为重组突变型Tn5转座酶EF-Tn5m用于ChIP-seq文库构建；
图5为重组突变型Tn5转座酶EF-Tn5m用于RNA-seq文库构建；
图6为重组突变型Tn5转座酶EF-Tn5m用于ATAC-seq文库构建；
图7为重组突变型Tn5转座酶TRX1-Tn5m用于ChIP-seq文库构建；
图8为重组突变型Tn5转座酶TRX1-Tn5m用于RNA-seq文库构建；
图9为重组突变型Tn5转座酶TRX1-Tn5m用于ATAC-seq文库构建。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明并不仅限于此。
实施例1
1. 重组突变型Tn5蛋白载体的构建
以原突变型（E54K和L372P）Tn5转座酶基因为模板，通过PCR扩增技术进行点突变，扩增体系为Q5超高保真DNA聚合酶（NEB，M0491L）；Q5反应缓冲液；dNTP；上下游引物；基因模板，反应体积为50 μL，扩增条件为98℃ 45 s；98℃ 10 s；60℃ 15 s；72℃ 30 s；72℃ 5min，扩增32个循环。扩增后的产物，用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离，再通过胶回收试剂盒回收目的片段Tn5m。将回收得到的Tn5m片段连同EF或TRX1序列通过无缝克隆试剂盒（Vazyme，C113），克隆到表达载体中。引物序列如下：
56A-F：5′-GGCAGCAAAGCCGCCCAGGAAGGCGCGTAT-3′
56A-R：5′-ATACGCGCCTTCCTGGGCGGCTTTGCTGCC-3′
345K-F：5′-CAGCGTATGGAAAAACCGGATAACCTG-3′
345K-R：5′-CAGGTTATCCGGTTTTTCCATACGCTG-3′
将含有EF-Tn5m或TRX1-Tn5m目的片段的表达载体如下图1，转入C3013感受态中，放入冰上孵育30 min，再热激60 s，随后冰上孵育5 min。加入200 μL LB液体培养基，放入摇床复苏30 min后，涂布于终浓度50 μg/mL卡那霉素固体培养基上，37℃过夜培养。第二天挑取单菌落进行测序验证。
2. 重组突变型Tn5蛋白菌株培养与蛋白表达（本例为小样培养）
将含有正确目的序列的单菌落接种于10 mL LB液体培养基，37℃培养过夜，从中取1 mL 接种于100 mL LB液体培养基，扩大培养至OD600 = 0.5，加入终浓度0.25 mM的IPTG诱导重组突变型Tn5蛋白表达。诱导6 h后，用50 mL离心管收集菌体（可冻存于-80℃冰箱6个月），用于蛋白纯化。
3. 重组突变型Tn5蛋白分离纯化与浓度测定
向上述菌体中加入10 mL 结合缓冲液 （10 mM Tris-HCl pH 8.0；1 M NaCl；1 mMEDTA； 10% 甘油；0.1% Triton X-100），随后于超声波细胞破碎仪中进行菌体破碎，再加入50 μL PEI，轻柔颠倒，混合均匀，在4℃ 12,000g条件下离心10 min取上层清液。将上清液加入到已经预先平衡好的几丁质亲和柱（NEB，S6651L）中，待上清液流尽后，分别用结合缓冲液和漂洗缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0；2 M NaCl；1 mM EDTA；10% 甘油；0.1%Triton X-100）洗涤一次，然后加入10 mL 洗脱液（20 mM Tris-HCl pH 8.0；0.5 M NaCl；1mM EDTA；50 mM DTT），待液体流出一个柱体积后，封闭亲和柱，放于4℃冰箱过夜，第二天释放蛋白溶液。取部分蛋白质溶液，测定蛋白纯度，并利用BCA试剂盒测定蛋白浓度。
4. 重组突变型Tn5转座酶装配
分别按摩尔比ME-A：ME-R = 1：1，ME-B：ME-R = 1：1进行混匀并退火形成Tn5 接头A和接头B，然后将接头A与接头B等体积比混合，得到Tn5接头AB。ME-A，ME-B，ME-R序列和接头结构如下：
ME-A：5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3′
ME-B：5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3′
ME-R：5′-[phos]CTGTCTCTTATACACATCT-3′
Tn5接头A：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
;
Tn5接头B：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
;
将上述得到的重组突变型Tn5蛋白溶液进行超滤浓缩并用储存缓冲液（20 mMTris-HCl pH 8.0；0.15 M NaCl；1 mM EDTA）置换，然后按体积比1：0.5；1：1和1：2加入混合的Tn5接头AB，再加入终浓度为50%的甘油，混合均匀，20℃ 孵育40 min。
配制含有100~400 ng λDNA（BBI，B600011）的Tn5反应体系（25 uL，10 mM Tris-HCl；10 mM MgCl2；1 μL Tn5转座酶EF-Tn5m；λDNA）37℃，反应30 min后，用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定最佳装配比例如图2所示。从图中可知，当蛋白：接头的装配比例为1：0.5时，转座酶具有极强的片段化效率。
5. 原Tn5转座酶和重组突变型Tn5转座酶对λDNA的片段化效率比较
配置25 μL 的Tn5反应体系（10 mM Tris-HCl；10 mM MgCl2；400 ng λDNA），分别加入2 μL原Tn5转座酶和2 μL重组突变型Tn5转座酶，37℃条件下反应30 min后，用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定原Tn5转座酶和重组突变型Tn5转座酶片段化效率如图3所示，从图中可知，重组突变型Tn5转座酶片段化效率远优于原Tn5转座酶。
6. 重组突变型Tn5转座酶EF-Tn5m应用于多种二代高通量测序文库类型
将制备所得的重组突变型Tn5转座酶EF-Tn5m分别用于ChIP-seq，RNA-seq和ATAC-seq文库构建，构建所得文库片段大小测定如下图4~6所示，结果表明，本方案制备所得的EF-Tn5m转座酶可用于多种类型文库构建，文库插入DNA片段大小符合上机测序要求。
7. 重组突变型Tn5转座酶TRX1-Tn5m应用于多种二代高通量测序文库类型
将制备所得的重组突变型Tn5转座酶TRX1-Tn5m分别用于ChIP-seq，RNA-seq 和ATAC-seq文库构建，构建所得文库片段大小测定如下图7~9所示，结果表明，本方案制备所得的TRX1-Tn5m转座酶可用于多种类型文库构建，文库插入DNA片段大小符合上机测序要求。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一种重组突变型Tn5转座酶的制备及应用
<130> 14
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ala Glu Ile Thr Ala Ser Leu Val Lys Glu Leu Arg Glu Arg Thr
1 5 10 15
Gly Ala Gly Met Met Asp Cys Lys Lys Ala Leu Thr Glu Ala Asn Gly
20 25 30
Asp Ile Glu Leu Ala Ile Glu Asn Met Arg Lys Ser Gly Ala Ile Lys
35 40 45
Ala Ala Lys Lys Ala Gly Asn Val Ala Ala Asp Gly Val Ile Lys Thr
50 55 60
Lys Ile Asp Gly Asn Tyr Gly Ile Ile Leu Glu Val Asn Cys Gln Thr
65 70 75 80
Asp Phe Val Ala Lys Asp Ala Gly Phe Gln Ala Phe Ala Asp Lys Val
85 90 95
Leu Asp Ala Ala Val Ala Gly Lys Ile Thr Asp Val Glu Val Leu Lys
100 105 110
Ala Gln Phe Glu Glu Glu Arg Val Ala Leu Val Ala Lys Ile Gly Glu
115 120 125
Asn Ile Asn Ile Arg Arg Val Ala Ala Leu Glu Gly Asp Val Leu Gly
130 135 140
Ser Tyr Gln His Gly Ala Arg Ile Gly Val Leu Val Ala Ala Lys Gly
145 150 155 160
Ala Asp Glu Glu Leu Val Lys His Ile Ala Met His Val Ala Ala Ser
165 170 175
Lys Pro Glu Phe Ile Lys Pro Glu Asp Val Ser Ala Glu Val Val Glu
180 185 190
Lys Glu Tyr Gln Val Gln Leu Asp Ile Ala Met Gln Ser Gly Lys Pro
195 200 205
Lys Glu Ile Ala Glu Lys Met Val Glu Gly Arg Met Lys Lys Phe Thr
210 215 220
Gly Glu Val Ser Leu Thr Gly Gln Pro Phe Val Met Glu Pro Ser Lys
225 230 235 240
Thr Val Gly Gln Leu Leu Lys Glu His Asn Ala Glu Val Thr Gly Phe
245 250 255
Ile Arg Phe Glu Val Gly Glu Gly Ile Glu Lys Val Glu Thr Asp Phe
260 265 270
Ala Ala Glu Val Ala Ala Met Ser Lys Gln Ser
275 280
<210> 2
<211> 476
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Ile Thr Ser Ala Leu His Arg Ala Ala Asp Trp Ala Lys Ser Val
1 5 10 15
Phe Ser Ser Ala Ala Leu Gly Asp Pro Arg Arg Thr Ala Arg Leu Val
20 25 30
Asn Val Ala Ala Gln Leu Ala Lys Tyr Ser Gly Lys Ser Ile Thr Ile
35 40 45
Ser Ser Glu Gly Ser Lys Ala Met Gln Glu Gly Ala Tyr Arg Phe Ile
50 55 60
Arg Asn Pro Asn Val Ser Ala Glu Ala Ile Arg Lys Ala Gly Ala Met
65 70 75 80
Gln Thr Val Lys Leu Ala Gln Glu Phe Pro Glu Leu Leu Ala Ile Glu
85 90 95
Asp Thr Thr Ser Leu Ser Tyr Arg His Gln Val Ala Glu Glu Leu Gly
100 105 110
Lys Leu Gly Ser Ile Gln Asp Lys Ser Arg Gly Trp Trp Val His Ser
115 120 125
Val Leu Leu Leu Glu Ala Thr Thr Phe Arg Thr Val Gly Leu Leu His
130 135 140
Gln Glu Trp Trp Met Arg Pro Asp Asp Pro Ala Asp Ala Asp Glu Lys
145 150 155 160
Glu Ser Gly Lys Trp Leu Ala Ala Ala Ala Thr Ser Arg Leu Arg Met
165 170 175
Gly Ser Met Met Ser Asn Val Ile Ala Val Cys Asp Arg Glu Ala Asp
180 185 190
Ile His Ala Tyr Leu Gln Asp Lys Leu Ala His Asn Glu Arg Phe Val
195 200 205
Val Arg Ser Lys His Pro Arg Lys Asp Val Glu Ser Gly Leu Tyr Leu
210 215 220
Tyr Asp His Leu Lys Asn Gln Pro Glu Leu Gly Gly Tyr Gln Ile Ser
225 230 235 240
Ile Pro Gln Lys Gly Val Val Asp Lys Arg Gly Lys Arg Lys Asn Arg
245 250 255
Pro Ala Arg Lys Ala Ser Leu Ser Leu Arg Ser Gly Arg Ile Thr Leu
260 265 270
Lys Gln Gly Asn Ile Thr Leu Asn Ala Val Leu Ala Glu Glu Ile Asn
275 280 285
Pro Pro Lys Gly Glu Thr Pro Leu Lys Trp Leu Leu Leu Thr Ser Glu
290 295 300
Pro Val Glu Ser Leu Ala Gln Ala Leu Arg Val Ile Asp Ile Tyr Thr
305 310 315 320
His Arg Trp Arg Ile Glu Glu Phe His Lys Ala Trp Lys Thr Gly Ala
325 330 335
Gly Ala Glu Arg Gln Arg Met Glu Glu Pro Asp Asn Leu Glu Arg Met
340 345 350
Val Ser Ile Leu Ser Phe Val Ala Val Arg Leu Leu Gln Leu Arg Glu
355 360 365
Ser Phe Thr Pro Pro Gln Ala Leu Arg Ala Gln Gly Leu Leu Lys Glu
370 375 380
Ala Glu His Val Glu Ser Gln Ser Ala Glu Thr Val Leu Thr Pro Asp
385 390 395 400
Glu Cys Gln Leu Leu Gly Tyr Leu Asp Lys Gly Lys Arg Lys Arg Lys
405 410 415
Glu Lys Ala Gly Ser Leu Gln Trp Ala Tyr Met Ala Ile Ala Arg Leu
420 425 430
Gly Gly Phe Met Asp Ser Lys Arg Thr Gly Ile Ala Ser Trp Gly Ala
435 440 445
Leu Trp Glu Gly Trp Glu Ala Leu Gln Ser Lys Leu Asp Gly Phe Leu
450 455 460
Ala Ala Lys Asp Leu Met Ala Gln Gly Ile Lys Ile
465 470 475
<210> 3
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp
1 5 10 15
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
20 25 30
Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
35 40 45
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn
50 55 60
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu
65 70 75 80
Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
85 90 95
Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala
100 105
<210> 4
<211> 759
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Ala Glu Ile Thr Ala Ser Leu Val Lys Glu Leu Arg Glu Arg Thr
1 5 10 15
Gly Ala Gly Met Met Asp Cys Lys Lys Ala Leu Thr Glu Ala Asn Gly
20 25 30
Asp Ile Glu Leu Ala Ile Glu Asn Met Arg Lys Ser Gly Ala Ile Lys
35 40 45
Ala Ala Lys Lys Ala Gly Asn Val Ala Ala Asp Gly Val Ile Lys Thr
50 55 60
Lys Ile Asp Gly Asn Tyr Gly Ile Ile Leu Glu Val Asn Cys Gln Thr
65 70 75 80
Asp Phe Val Ala Lys Asp Ala Gly Phe Gln Ala Phe Ala Asp Lys Val
85 90 95
Leu Asp Ala Ala Val Ala Gly Lys Ile Thr Asp Val Glu Val Leu Lys
100 105 110
Ala Gln Phe Glu Glu Glu Arg Val Ala Leu Val Ala Lys Ile Gly Glu
115 120 125
Asn Ile Asn Ile Arg Arg Val Ala Ala Leu Glu Gly Asp Val Leu Gly
130 135 140
Ser Tyr Gln His Gly Ala Arg Ile Gly Val Leu Val Ala Ala Lys Gly
145 150 155 160
Ala Asp Glu Glu Leu Val Lys His Ile Ala Met His Val Ala Ala Ser
165 170 175
Lys Pro Glu Phe Ile Lys Pro Glu Asp Val Ser Ala Glu Val Val Glu
180 185 190
Lys Glu Tyr Gln Val Gln Leu Asp Ile Ala Met Gln Ser Gly Lys Pro
195 200 205
Lys Glu Ile Ala Glu Lys Met Val Glu Gly Arg Met Lys Lys Phe Thr
210 215 220
Gly Glu Val Ser Leu Thr Gly Gln Pro Phe Val Met Glu Pro Ser Lys
225 230 235 240
Thr Val Gly Gln Leu Leu Lys Glu His Asn Ala Glu Val Thr Gly Phe
245 250 255
Ile Arg Phe Glu Val Gly Glu Gly Ile Glu Lys Val Glu Thr Asp Phe
260 265 270
Ala Ala Glu Val Ala Ala Met Ser Lys Gln Ser Met Ile Thr Ser Ala
275 280 285
Leu His Arg Ala Ala Asp Trp Ala Lys Ser Val Phe Ser Ser Ala Ala
290 295 300
Leu Gly Asp Pro Arg Arg Thr Ala Arg Leu Val Asn Val Ala Ala Gln
305 310 315 320
Leu Ala Lys Tyr Ser Gly Lys Ser Ile Thr Ile Ser Ser Glu Gly Ser
325 330 335
Lys Ala Met Gln Glu Gly Ala Tyr Arg Phe Ile Arg Asn Pro Asn Val
340 345 350
Ser Ala Glu Ala Ile Arg Lys Ala Gly Ala Met Gln Thr Val Lys Leu
355 360 365
Ala Gln Glu Phe Pro Glu Leu Leu Ala Ile Glu Asp Thr Thr Ser Leu
370 375 380
Ser Tyr Arg His Gln Val Ala Glu Glu Leu Gly Lys Leu Gly Ser Ile
385 390 395 400
Gln Asp Lys Ser Arg Gly Trp Trp Val His Ser Val Leu Leu Leu Glu
405 410 415
Ala Thr Thr Phe Arg Thr Val Gly Leu Leu His Gln Glu Trp Trp Met
420 425 430
Arg Pro Asp Asp Pro Ala Asp Ala Asp Glu Lys Glu Ser Gly Lys Trp
435 440 445
Leu Ala Ala Ala Ala Thr Ser Arg Leu Arg Met Gly Ser Met Met Ser
450 455 460
Asn Val Ile Ala Val Cys Asp Arg Glu Ala Asp Ile His Ala Tyr Leu
465 470 475 480
Gln Asp Lys Leu Ala His Asn Glu Arg Phe Val Val Arg Ser Lys His
485 490 495
Pro Arg Lys Asp Val Glu Ser Gly Leu Tyr Leu Tyr Asp His Leu Lys
500 505 510
Asn Gln Pro Glu Leu Gly Gly Tyr Gln Ile Ser Ile Pro Gln Lys Gly
515 520 525
Val Val Asp Lys Arg Gly Lys Arg Lys Asn Arg Pro Ala Arg Lys Ala
530 535 540
Ser Leu Ser Leu Arg Ser Gly Arg Ile Thr Leu Lys Gln Gly Asn Ile
545 550 555 560
Thr Leu Asn Ala Val Leu Ala Glu Glu Ile Asn Pro Pro Lys Gly Glu
565 570 575
Thr Pro Leu Lys Trp Leu Leu Leu Thr Ser Glu Pro Val Glu Ser Leu
580 585 590
Ala Gln Ala Leu Arg Val Ile Asp Ile Tyr Thr His Arg Trp Arg Ile
595 600 605
Glu Glu Phe His Lys Ala Trp Lys Thr Gly Ala Gly Ala Glu Arg Gln
610 615 620
Arg Met Glu Glu Pro Asp Asn Leu Glu Arg Met Val Ser Ile Leu Ser
625 630 635 640
Phe Val Ala Val Arg Leu Leu Gln Leu Arg Glu Ser Phe Thr Pro Pro
645 650 655
Gln Ala Leu Arg Ala Gln Gly Leu Leu Lys Glu Ala Glu His Val Glu
660 665 670
Ser Gln Ser Ala Glu Thr Val Leu Thr Pro Asp Glu Cys Gln Leu Leu
675 680 685
Gly Tyr Leu Asp Lys Gly Lys Arg Lys Arg Lys Glu Lys Ala Gly Ser
690 695 700
Leu Gln Trp Ala Tyr Met Ala Ile Ala Arg Leu Gly Gly Phe Met Asp
705 710 715 720
Ser Lys Arg Thr Gly Ile Ala Ser Trp Gly Ala Leu Trp Glu Gly Trp
725 730 735
Glu Ala Leu Gln Ser Lys Leu Asp Gly Phe Leu Ala Ala Lys Asp Leu
740 745 750
Met Ala Gln Gly Ile Lys Ile
755
<210> 5
<211> 2277
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atggctgaaa ttaccgcatc cctggtaaaa gagctgcgtg agcgtactgg cgcaggcatg 60
atggattgca aaaaagcact gactgaagct aacggcgaca tcgagctggc aatcgaaaac 120
atgcgtaagt ccggtgctat taaagcagcg aaaaaagcag gcaacgttgc tgctgacggc 180
gtgatcaaaa ccaaaatcga cggcaactac ggcatcattc tggaagttaa ctgccagact 240
gacttcgttg caaaagacgc tggtttccag gcgttcgcag acaaagttct ggacgcagct 300
gttgctggca aaatcactga cgttgaagtt ctgaaagcac agttcgaaga agaacgtgtt 360
gcgctggtag cgaaaattgg tgaaaacatc aacattcgcc gcgttgctgc gctggaaggc 420
gacgttctgg gttcttatca gcacggtgcg cgtatcggcg ttctggttgc tgctaaaggc 480
gctgacgaag agctggttaa acacatcgct atgcacgttg ctgcaagcaa gccagaattc 540
atcaaaccgg aagacgtatc cgctgaagtg gtagaaaaag aataccaggt acagctggat 600
atcgcgatgc agtctggtaa gccgaaagaa atcgcagaga aaatggttga aggccgcatg 660
aagaaattca ccggcgaagt ttctctgacc ggtcagccgt tcgttatgga accaagcaaa 720
actgttggtc agctgctgaa agagcataac gctgaagtga ctggcttcat ccgcttcgaa 780
gtgggtgaag gcatcgagaa agttgagact gactttgcag cagaagttgc tgcgatgtcc 840
aagcagtcta tgattaccag tgcactgcat cgtgcggcgg attgggcgaa aagcgtgttt 900
tctagtgctg cgctgggtga tccgcgtcgt accgcgcgtc tggtgaatgt tgcggcgcaa 960
ctggccaaat atagcggcaa aagcattacc attagcagcg aaggcagcaa agccgcccag 1020
gaaggcgcgt atcgttttat tcgtaatccg aacgtgagcg cggaagcgat tcgtaaagcg 1080
ggtgccatgc agaccgtgaa actggcccag gaatttccgg aactgctggc aattgaagat 1140
accacctctc tgagctatcg tcatcaggtg gcggaagaac tgggcaaact gggtagcatt 1200
caggataaaa gccgtggttg gtgggtgcat agcgtgctgc tgctggaagc gaccaccttt 1260
cgtaccgtgg gcctgctgca tcaagaatgg tggatgcgtc cggatgatcc ggcggatgcg 1320
gatgaaaaag aaagcggcaa atggctggcc gctgctgcaa cttcgcgtct gagaatgggc 1380
agcatgatga gcaacgtgat tgcggtgtgc gatcgtgaag cggatattca tgcgtatctg 1440
caagataaac tggcccataa cgaacgtttt gtggtgcgta gcaaacatcc gcgtaaagat 1500
gtggaaagcg gcctgtatct gtatgatcac ctgaaaaacc agccggaact gggcggctat 1560
cagattagca ttccgcagaa aggcgtggtg gataaacgtg gcaaacgtaa aaaccgtccg 1620
gcgcgtaaag cgagcctgag cctgcgtagc ggccgtatta ccctgaaaca gggcaacatt 1680
accctgaacg cggtgctggc cgaagaaatt aatccgccga aaggcgaaac cccgctgaaa 1740
tggctgctgc tgaccagcga gccggtggaa agtctggccc aagcgctgcg tgtgattgat 1800
atttataccc atcgttggcg cattgaagaa tttcacaaag cgtggaaaac gggtgcgggt 1860
gcggaacgtc agcgtatgga aaaaccggat aacctggaac gtatggtgag cattctgagc 1920
tttgtggcgg tgcgtctgct gcaactgcgt gaatctttta ctccgccgca agcactgcgt 1980
gcgcagggcc tgctgaaaga agcggaacac gttgaaagcc agagcgcgga aaccgtgctg 2040
accccggatg aatgccaact gctgggctat ctggataaag gcaaacgcaa acgcaaagaa 2100
aaagcgggca gcctgcaatg ggcgtatatg gcgattgcgc gtctgggcgg ctttatggat 2160
agcaaacgta ccggcattgc gagctggggt gcgctgtggg aaggttggga agcgctgcaa 2220
agcaaactgg atggctttct ggccgcgaaa gacctgatgg cgcagggcat taaaatc 2277
<210> 6
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp
1 5 10 15
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
20 25 30
Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
35 40 45
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn
50 55 60
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu
65 70 75 80
Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
85 90 95
Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Met Ile Thr
100 105 110
Ser Ala Leu His Arg Ala Ala Asp Trp Ala Lys Ser Val Phe Ser Ser
115 120 125
Ala Ala Leu Gly Asp Pro Arg Arg Thr Ala Arg Leu Val Asn Val Ala
130 135 140
Ala Gln Leu Ala Lys Tyr Ser Gly Lys Ser Ile Thr Ile Ser Ser Glu
145 150 155 160
Gly Ser Lys Ala Met Gln Glu Gly Ala Tyr Arg Phe Ile Arg Asn Pro
165 170 175
Asn Val Ser Ala Glu Ala Ile Arg Lys Ala Gly Ala Met Gln Thr Val
180 185 190
Lys Leu Ala Gln Glu Phe Pro Glu Leu Leu Ala Ile Glu Asp Thr Thr
195 200 205
Ser Leu Ser Tyr Arg His Gln Val Ala Glu Glu Leu Gly Lys Leu Gly
210 215 220
Ser Ile Gln Asp Lys Ser Arg Gly Trp Trp Val His Ser Val Leu Leu
225 230 235 240
Leu Glu Ala Thr Thr Phe Arg Thr Val Gly Leu Leu His Gln Glu Trp
245 250 255
Trp Met Arg Pro Asp Asp Pro Ala Asp Ala Asp Glu Lys Glu Ser Gly
260 265 270
Lys Trp Leu Ala Ala Ala Ala Thr Ser Arg Leu Arg Met Gly Ser Met
275 280 285
Met Ser Asn Val Ile Ala Val Cys Asp Arg Glu Ala Asp Ile His Ala
290 295 300
Tyr Leu Gln Asp Lys Leu Ala His Asn Glu Arg Phe Val Val Arg Ser
305 310 315 320
Lys His Pro Arg Lys Asp Val Glu Ser Gly Leu Tyr Leu Tyr Asp His
325 330 335
Leu Lys Asn Gln Pro Glu Leu Gly Gly Tyr Gln Ile Ser Ile Pro Gln
340 345 350
Lys Gly Val Val Asp Lys Arg Gly Lys Arg Lys Asn Arg Pro Ala Arg
355 360 365
Lys Ala Ser Leu Ser Leu Arg Ser Gly Arg Ile Thr Leu Lys Gln Gly
370 375 380
Asn Ile Thr Leu Asn Ala Val Leu Ala Glu Glu Ile Asn Pro Pro Lys
385 390 395 400
Gly Glu Thr Pro Leu Lys Trp Leu Leu Leu Thr Ser Glu Pro Val Glu
405 410 415
Ser Leu Ala Gln Ala Leu Arg Val Ile Asp Ile Tyr Thr His Arg Trp
420 425 430
Arg Ile Glu Glu Phe His Lys Ala Trp Lys Thr Gly Ala Gly Ala Glu
435 440 445
Arg Gln Arg Met Glu Glu Pro Asp Asn Leu Glu Arg Met Val Ser Ile
450 455 460
Leu Ser Phe Val Ala Val Arg Leu Leu Gln Leu Arg Glu Ser Phe Thr
465 470 475 480
Pro Pro Gln Ala Leu Arg Ala Gln Gly Leu Leu Lys Glu Ala Glu His
485 490 495
Val Glu Ser Gln Ser Ala Glu Thr Val Leu Thr Pro Asp Glu Cys Gln
500 505 510
Leu Leu Gly Tyr Leu Asp Lys Gly Lys Arg Lys Arg Lys Glu Lys Ala
515 520 525
Gly Ser Leu Gln Trp Ala Tyr Met Ala Ile Ala Arg Leu Gly Gly Phe
530 535 540
Met Asp Ser Lys Arg Thr Gly Ile Ala Ser Trp Gly Ala Leu Trp Glu
545 550 555 560
Gly Trp Glu Ala Leu Gln Ser Lys Leu Asp Gly Phe Leu Ala Ala Lys
565 570 575
Asp Leu Met Ala Gln Gly Ile Lys Ile
580 585
<210> 7
<211> 1755
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60
gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120
ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180
atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240
ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300
aaagagttcc tcgacgctaa cctggcgatg attaccagtg cactgcatcg tgcggcggat 360
tgggcgaaaa gcgtgttttc tagtgctgcg ctgggtgatc cgcgtcgtac cgcgcgtctg 420
gtgaatgttg cggcgcaact ggccaaatat agcggcaaaa gcattaccat tagcagcgaa 480
ggcagcaaag ccgcccagga aggcgcgtat cgttttattc gtaatccgaa cgtgagcgcg 540
gaagcgattc gtaaagcggg tgccatgcag accgtgaaac tggcccagga atttccggaa 600
ctgctggcaa ttgaagatac cacctctctg agctatcgtc atcaggtggc ggaagaactg 660
ggcaaactgg gtagcattca ggataaaagc cgtggttggt gggtgcatag cgtgctgctg 720
ctggaagcga ccacctttcg taccgtgggc ctgctgcatc aagaatggtg gatgcgtccg 780
gatgatccgg cggatgcgga tgaaaaagaa agcggcaaat ggctggccgc tgctgcaact 840
tcgcgtctga gaatgggcag catgatgagc aacgtgattg cggtgtgcga tcgtgaagcg 900
gatattcatg cgtatctgca agataaactg gcccataacg aacgttttgt ggtgcgtagc 960
aaacatccgc gtaaagatgt ggaaagcggc ctgtatctgt atgatcacct gaaaaaccag 1020
ccggaactgg gcggctatca gattagcatt ccgcagaaag gcgtggtgga taaacgtggc 1080
aaacgtaaaa accgtccggc gcgtaaagcg agcctgagcc tgcgtagcgg ccgtattacc 1140
ctgaaacagg gcaacattac cctgaacgcg gtgctggccg aagaaattaa tccgccgaaa 1200
ggcgaaaccc cgctgaaatg gctgctgctg accagcgagc cggtggaaag tctggcccaa 1260
gcgctgcgtg tgattgatat ttatacccat cgttggcgca ttgaagaatt tcacaaagcg 1320
tggaaaacgg gtgcgggtgc ggaacgtcag cgtatggaaa aaccggataa cctggaacgt 1380
atggtgagca ttctgagctt tgtggcggtg cgtctgctgc aactgcgtga atcttttact 1440
ccgccgcaag cactgcgtgc gcagggcctg ctgaaagaag cggaacacgt tgaaagccag 1500
agcgcggaaa ccgtgctgac cccggatgaa tgccaactgc tgggctatct ggataaaggc 1560
aaacgcaaac gcaaagaaaa agcgggcagc ctgcaatggg cgtatatggc gattgcgcgt 1620
ctgggcggct ttatggatag caaacgtacc ggcattgcga gctggggtgc gctgtgggaa 1680
ggttgggaag cgctgcaaag caaactggat ggctttctgg ccgcgaaaga cctgatggcg 1740
cagggcatta aaatc 1755
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggcagcaaag ccgcccagga aggcgcgtat 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atacgcgcct tcctgggcgg ctttgctgcc 30
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cagcgtatgg aaaaaccgga taacctg 27
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
caggttatcc ggtttttcca tacgctg 27
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acag 34
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ctgtctctta tacacatct 19

Claims (3)

1.一种重组突变型Tn5转座酶，其特征在于，所述重组突变型Tn5转座酶构建方法包括：
（1）以原突变型Tn5转座酶基因为模板，进一步改造突变M56A与E345K两个位点，获得Tn5m核苷酸片段；
（2）将Tn5m核苷酸片段与EF或TRX1核苷酸片段通过重组反应，获得EF-Tn5m转座酶或TRX1-Tn5m转座酶的核苷酸片段；
（3）所述EF-Tn5m转座酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述TRX1-Tn5m转座酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
步骤（1）所述改造突变M56A与E345K两个位点所需要的引物包括：
56A-F：5′-GGCAGCAAAGCCGCCCAGGAAGGCGCGTAT-3′；
56A-R：5′-ATACGCGCCTTCCTGGGCGGCTTTGCTGCC-3′；
345K-F：5′-CAGCGTATGGAAAAACCGGATAACCTG-3′；
345K-R：5′-CAGGTTATCCGGTTTTTCCATACGCTG-3′。
2.一种包含权利要求1所述重组突变型Tn5转座酶的核苷酸序列的载体，其特征在于，将所述EF-Tn5m转座酶、TRX1-Tn5m转座酶的核苷酸片段利用同源重组分别克隆到表达载体pET30a中。
3.一种利用权利要求2所述载体表达制备重组突变型Tn5转座酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将表达载体转入C3013感受态细胞中，放入冰上孵育30 min，再热激60 s，随后冰上孵育5 min；加入200 μL LB液体培养基，放入摇床复苏30 min后，涂布于终浓度50 μg/mL卡那霉素固体培养基上，37℃过夜培养；第二天挑取单菌落进行测序验证；
（2）将含有正确目的序列的单菌落接种于10 mL LB液体培养基，37℃培养过夜，从中取1 mL 接种于100 mL LB液体培养基，扩大培养至OD600 = 0.5，加入终浓度0.25 mM的IPTG诱导重组突变型Tn5蛋白表达；诱导6 h后，用50 mL离心管收集菌体，用于蛋白纯化；
（3）向菌体中加入10 mL 结合缓冲液 ，随后于超声波细胞破碎仪中进行菌体破碎，再加入50 μL PEI（Sigma，P3143）沉淀菌液中的DNA分子，在4℃ 12 ,000g条件下离心10 min取上层清液；将上清液加入到已经预先平衡好的亲和柱中，待上清液流尽后，分别用结合缓冲液和漂洗缓冲液洗涤一次，然后加入10 mL 洗脱液，待液体流出一个柱体积后，封闭亲和柱，放于4℃冰箱过夜，第二天释放蛋白溶液，获得重组突变型Tn5蛋白溶液；
（4）重组突变型Tn5转座酶装配：分别按摩尔比ME-A：ME-R = 1：1，ME-B：ME-R = 1：1进行混匀并退火形成Tn5 接头A和接头B，然后将接头A与接头B等体积比混合，得到Tn5接头AB；将步骤（3）所述重组突变型Tn5蛋白溶液进行超滤浓缩并用储存缓冲液置换，再按体积比1：0.5；1：1和1：2加入混合的Tn5接头AB，最后加入终浓度为50%的甘油，混合均匀，20℃孵育40 min；
所述储存缓冲液配方为：20 mM Tris-HCl pH 8.0；0.15 M NaCl；1 mM EDTA；
结合缓冲液配方为：10 mM Tris-HCl pH 8.0；1 M NaCl；1 mM EDTA；10%甘油；0.1%Triton X-100；
漂洗缓冲液配方为：10 mM Tris-HCl pH 8.0；2 M NaCl；1 mM EDTA；10%甘油；0.1%Triton X-100；
洗脱液配方为：20 mM Tris-HCl pH 8 .0；0.5 M NaCl；1 mM EDTA；50 mM DTT。
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CN114807084B (zh) * 2022-04-26 2023-05-16 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 突变型Tn5转座酶及试剂盒
CN115948363B (zh) * 2022-08-26 2024-02-27 武汉影子基因科技有限公司 Tn5转座酶突变体及其制备方法和应用
CN116813800B (zh) * 2023-07-07 2024-03-12 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 一种双链dna结合蛋白-转座酶融合蛋白及文库构建方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5965443A (en) * 1996-09-09 1999-10-12 Wisconsin Alumni Research Foundation System for in vitro transposition
JP7402156B2 (ja) * 2017-08-30 2023-12-20 カパ バイオシステムズ， インコーポレイテッド トランスポザーゼ組成物、製造方法およびスクリーニング方法
WO2019184044A1 (zh) * 2018-03-27 2019-10-03 上海欣百诺生物科技有限公司 一种转座酶-抗体结合蛋白的融合蛋白及其制备与应用
CN111909946B (zh) * 2019-05-08 2022-11-15 上海交通大学 用于糖多孢菌的转座质粒及其应用
CN110372799B (zh) * 2019-08-01 2020-06-09 北京大学 一种用于单细胞ChIP-seq文库制备的融合蛋白及其应用

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