JPS61260885A - ロイシンエンケフアリン遺伝子を含有する新規組換えプラスミド - Google Patents
ロイシンエンケフアリン遺伝子を含有する新規組換えプラスミドInfo
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- JPS61260885A JPS61260885A JP10087885A JP10087885A JPS61260885A JP S61260885 A JPS61260885 A JP S61260885A JP 10087885 A JP10087885 A JP 10087885A JP 10087885 A JP10087885 A JP 10087885A JP S61260885 A JPS61260885 A JP S61260885A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
- C07K14/70—Enkephalins
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、ペプチドホルモンの一種であるロイシンエン
ケア７す７ （Ｔｙｒ−Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ −
Ｌｅｕの５個のアミノ酸よりなるペンタペプタイド）を
暗号化する遺伝子を含有する組換えプラスミドに関する
ものである。この発明の組換えプラスミドの産業上の利
用分野としては、生物化学工業、微生物工業、及び医療
分野に好適である。
ケア７す７ （Ｔｙｒ−Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ −
Ｌｅｕの５個のアミノ酸よりなるペンタペプタイド）を
暗号化する遺伝子を含有する組換えプラスミドに関する
ものである。この発明の組換えプラスミドの産業上の利
用分野としては、生物化学工業、微生物工業、及び医療
分野に好適である。
従来の技術
ロイシンエンケファリンは、あへん様ペプチドとして知
られ、習慣性のない鎮痛剤または麻酔薬としての利用が
期待される興味深いポリペプチドである。ロイシンエン
ケファリンを暗号化した遺伝子を組込んだプラスミドに
関しては、報告がな（、新規プラスミドである。
られ、習慣性のない鎮痛剤または麻酔薬としての利用が
期待される興味深いポリペプチドである。ロイシンエン
ケファリンを暗号化した遺伝子を組込んだプラスミドに
関しては、報告がな（、新規プラスミドである。
本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子操作技術
がある。最近、遺伝子操作技術の進歩に伴って、興味深
いポリペプチドを生産しようとする場合、ポリペプチド
に対応する遺伝子であるＤＮＡを２例えば、生体よりク
ローニングと呼ばれる方法で分離するなどして、これを
適当なプラスミドに組込んで２組換えたプラスミドを大
腸菌などの微生物の細胞中に導入し、プラスミド上の遺
伝子を発現させ、目的ポリペプチドを細胞から抽出する
ことができるようになった。このような状況においては
、目的ポリペプチドを暗号化した遺伝子を含むプラスミ
ドを取得することが最も重要な課題であり、また目的ポ
リペプチドが異なれば。
がある。最近、遺伝子操作技術の進歩に伴って、興味深
いポリペプチドを生産しようとする場合、ポリペプチド
に対応する遺伝子であるＤＮＡを２例えば、生体よりク
ローニングと呼ばれる方法で分離するなどして、これを
適当なプラスミドに組込んで２組換えたプラスミドを大
腸菌などの微生物の細胞中に導入し、プラスミド上の遺
伝子を発現させ、目的ポリペプチドを細胞から抽出する
ことができるようになった。このような状況においては
、目的ポリペプチドを暗号化した遺伝子を含むプラスミ
ドを取得することが最も重要な課題であり、また目的ポ
リペプチドが異なれば。
おのずからその方法論が異っており、この点が解決しな
ければならない技術課題である。
ければならない技術課題である。
発明の目的
上記のような背景に鑑み本発明者らは、ロイシンエンケ
ファリン遺伝子を安定にかつ効率的に保持する組換えプ
ラスミドの構築を目的として、鋭意研究を重ね、目的ポ
リペプチドが短かいことに注目し、ポリペプチドに対応
するＤＮＡを化学合成法により創製すること、及び導入
するためのプラスミドベクターとして、すでに本発明者
らが開発した発現効率が非常によい遺伝子を有するｐＴ
Ｐ６−１０を用いること、宿主としてＥｃｏｌｉＫ１２
Ｃ６００株を用いることを考案し、Ｃれに基づいて本発
明を完成させるに至った。
ファリン遺伝子を安定にかつ効率的に保持する組換えプ
ラスミドの構築を目的として、鋭意研究を重ね、目的ポ
リペプチドが短かいことに注目し、ポリペプチドに対応
するＤＮＡを化学合成法により創製すること、及び導入
するためのプラスミドベクターとして、すでに本発明者
らが開発した発現効率が非常によい遺伝子を有するｐＴ
Ｐ６−１０を用いること、宿主としてＥｃｏｌｉＫ１２
Ｃ６００株を用いることを考案し、Ｃれに基づいて本発
明を完成させるに至った。
発明の構成
本発明の新規組換えプラスミドｐＬＥＧ＋は、プラスミ
ドベクターの選定、ロイシンエンケファリンを暗号化す
るＤＮＡの化学合成２合成したＤＮＡのプラスミドベク
ターへの組込み９組換えプラスミドのＥ、ｃｏｌｉ Ｋ
１２Ｇ６００株への導入９組換えプラスミドを有する菌
体の分離、プラスミドの分離の過程をへることによって
作成することができる。
ドベクターの選定、ロイシンエンケファリンを暗号化す
るＤＮＡの化学合成２合成したＤＮＡのプラスミドベク
ターへの組込み９組換えプラスミドのＥ、ｃｏｌｉ Ｋ
１２Ｇ６００株への導入９組換えプラスミドを有する菌
体の分離、プラスミドの分離の過程をへることによって
作成することができる。
プラスミドベクターとしては、すでに本発明者らが開発
した高効率発現遺伝子を有するｐＴＰ６−１０を用いた
（特願 ５８−００９７３５ ’）。ｐＴＰ６−１０に
は、ＥｃｏＲＩにより切断される部位が１ケ所あるが、
これは、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲと略す。）遺
伝子中にあり、この遺伝子は高効率に発現し、菌体あた
り約１０９６に及ぶまでＤＨＦＲを生産する。
した高効率発現遺伝子を有するｐＴＰ６−１０を用いた
（特願 ５８−００９７３５ ’）。ｐＴＰ６−１０に
は、ＥｃｏＲＩにより切断される部位が１ケ所あるが、
これは、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲと略す。）遺
伝子中にあり、この遺伝子は高効率に発現し、菌体あた
り約１０９６に及ぶまでＤＨＦＲを生産する。
ロイシンエンケファリンを暗号化するＤＮＡとしては
１）５°−ａＡＡＴＴＣＡＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＴＴＴ
ＣＣＴＧＴＡＡＴＧ−３゜ ２）５°−ｄＡＡＴＴＣＡＴＴＡＣＡＧＧＡＡＡＣＣＡ
ＣＣＧＴＡＣＡＴＧ−３゜ を、ホスホアミダイト固相合成法により合成したものを
用いたが２本発明は９合成法によって制限されるもので
はない。合成によって作られた２本の２８量体のＤＮＡ
の５°末端は、ＯＨ基であるので、常法に従い、ポリヌ
クレオチドキナーゼを用いてリン酸化した。リン酸化し
た２本のＤＮＡをアニールすることにより、第２図に示
すように。
ＣＣＴＧＴＡＡＴＧ−３゜ ２）５°−ｄＡＡＴＴＣＡＴＴＡＣＡＧＧＡＡＡＣＣＡ
ＣＣＧＴＡＣＡＴＧ−３゜ を、ホスホアミダイト固相合成法により合成したものを
用いたが２本発明は９合成法によって制限されるもので
はない。合成によって作られた２本の２８量体のＤＮＡ
の５°末端は、ＯＨ基であるので、常法に従い、ポリヌ
クレオチドキナーゼを用いてリン酸化した。リン酸化し
た２本のＤＮＡをアニールすることにより、第２図に示
すように。
（５°’）ＡＡＴＴ−３°の４塩基がつきでた末端を形
成する。この末端は、制限酵素ＥｃｏＲＩによって切断
された断点と相補性を有し、ＤＮＡ！Ｊガーゼを用いる
ことにより、ＥｃｏＲＩ部位に結合することが可能であ
る。
成する。この末端は、制限酵素ＥｃｏＲＩによって切断
された断点と相補性を有し、ＤＮＡ！Ｊガーゼを用いる
ことにより、ＥｃｏＲＩ部位に結合することが可能であ
る。
５°末端をリン酸化した後アニールして得られた２８塩
基対のＤＮＡを、あらかじめＥｃｏＲＩで切断したｐＴ
Ｐ６−１０と混ぜ合わせ、これをＴ４−ＤＮＡリガーゼ
を用いて連結することにより化学合成ロイシンエンケフ
ァリン遺伝子が組込まれたプラスミドを含む連結プラス
ミド混合物を作ることができる。しかしながら、この状
態では９組込まれ方に種種の可能性があり、目的の組換
えプラスミドを得ることが困難であるので、何らかの方
法で選別を行なわなければならない。本発明においては
１本発明者がすでに開発しているプラスミドベクターｐ
ＴＰ６−１０を用いることにより、この問題を解消した
。
基対のＤＮＡを、あらかじめＥｃｏＲＩで切断したｐＴ
Ｐ６−１０と混ぜ合わせ、これをＴ４−ＤＮＡリガーゼ
を用いて連結することにより化学合成ロイシンエンケフ
ァリン遺伝子が組込まれたプラスミドを含む連結プラス
ミド混合物を作ることができる。しかしながら、この状
態では９組込まれ方に種種の可能性があり、目的の組換
えプラスミドを得ることが困難であるので、何らかの方
法で選別を行なわなければならない。本発明においては
１本発明者がすでに開発しているプラスミドベクターｐ
ＴＰ６−１０を用いることにより、この問題を解消した
。
すなわち、連結したプラスミドの混合物を、トランスホ
ーメイション法によりＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２Ｃ６００
株に導入し、菌体の薬剤耐性を調べることにより、第一
回目の選別を行なうことができた。
ーメイション法によりＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２Ｃ６００
株に導入し、菌体の薬剤耐性を調べることにより、第一
回目の選別を行なうことができた。
ｐＴＰ６−１０は、Ｅ−ｃｏＨＫ１２Ｃ６００株に導入
されると、菌体をアンピシリン耐性及びトリメトプリム
耐性に形質転換することができるが、ｐＴＰ６−１０の
ＥｃｏＲＩ部位に異種ＤＮＡが導入された場合は、ＤＨ
ＦＲ遺伝子の構造が変化するために正常なりＨＦＲタン
パクを作ることができなくなり。
されると、菌体をアンピシリン耐性及びトリメトプリム
耐性に形質転換することができるが、ｐＴＰ６−１０の
ＥｃｏＲＩ部位に異種ＤＮＡが導入された場合は、ＤＨ
ＦＲ遺伝子の構造が変化するために正常なりＨＦＲタン
パクを作ることができなくなり。
トリメトプリム耐性が失なわれる。この性質に従えば、
ｐＴＰ６−１０のＥｃｏＲＩ部位に目的ＤＮＡウ≦結合
した組換えプラスミドを保有する菌体は。
ｐＴＰ６−１０のＥｃｏＲＩ部位に目的ＤＮＡウ≦結合
した組換えプラスミドを保有する菌体は。
ｆンピシリン耐性を示すが、トリメトプリムにはもはや
耐性を示すことができなくなる。従って。
耐性を示すことができなくなる。従って。
アンピシリンに耐性で、かつ、トリメトプリムに感受性
な形質転換菌株を選択した。このような菌株のもつプラ
スミドには、目的のＤＮＡが導入されていることは確か
ではあるが、結合の仕方が目的と異っていたり、２８塩
基対のＤＮＡが何重にもつながって導入されている可能
性がある。そこで、さらに、アンピシリンに耐性で、ト
リメトプリムに感受性な形質転換株について、実際、ロ
イシンエンケファリン抗体と反応するポリペプチドを生
産するか否かについて調べ、ロイシンエンケファリン抗
体と反応するポリペプチドを産生ずる菌株を得ることが
できた。最後に、得られた菌株からにプラスミドを分離
して、実際９組込まれたＤＮＡ及びその周辺の塩基配列
を調べることにより目的のＤＮＡが目的通り組込まれた
プラスミドを選別することができたのである。
な形質転換菌株を選択した。このような菌株のもつプラ
スミドには、目的のＤＮＡが導入されていることは確か
ではあるが、結合の仕方が目的と異っていたり、２８塩
基対のＤＮＡが何重にもつながって導入されている可能
性がある。そこで、さらに、アンピシリンに耐性で、ト
リメトプリムに感受性な形質転換株について、実際、ロ
イシンエンケファリン抗体と反応するポリペプチドを生
産するか否かについて調べ、ロイシンエンケファリン抗
体と反応するポリペプチドを産生ずる菌株を得ることが
できた。最後に、得られた菌株からにプラスミドを分離
して、実際９組込まれたＤＮＡ及びその周辺の塩基配列
を調べることにより目的のＤＮＡが目的通り組込まれた
プラスミドを選別することができたのである。
このようにして得られたｐＬＥＧｌは全く新規な組換え
プラスミドである。そして、ｐＬＥＧｌはＥ、 ｃｏｌ
ｉ Ｋ１２Ｇ６００株に導入されて安定状態に保たれ、
ｐＬＥＧｌを含有するＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２Ｃ６００株
は微工研にＦＥＲＭ Ｐ−８２２５として寄託されて
いる。
プラスミドである。そして、ｐＬＥＧｌはＥ、 ｃｏｌ
ｉ Ｋ１２Ｇ６００株に導入されて安定状態に保たれ、
ｐＬＥＧｌを含有するＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２Ｃ６００株
は微工研にＦＥＲＭ Ｐ−８２２５として寄託されて
いる。
第１図は本発明のｐＬＥＧｌの全塩基配列を示す図であ
る。第２図は、化学合成したＤＮＡ由来の部分の遺伝子
配列、及び、新規組換えプラスミドｐＬＥＧ１がＥ、ｃ
ｏｌｉに組込まれて発現した場合。
る。第２図は、化学合成したＤＮＡ由来の部分の遺伝子
配列、及び、新規組換えプラスミドｐＬＥＧ１がＥ、ｃ
ｏｌｉに組込まれて発現した場合。
化学合成したＤＮＡ由来の部分から作られて（るペプチ
ドのアミノ酸配列を示した図である。新規組換えプラス
ミドｐＬＥＧ１は全長４４４３塩基対よりなり、ロイシ
ンエンケファリン遺伝子は第２図の４８３番目の”Ｔ’
から４９７番目の”Ｇ”までの１５塩基対であり、この
部分はＥ ｃｏＲＩ切断により第２図に示す２８塩基対
の断片として切り出すことができる。この２８塩基対の
ＤＮＡ断片は、高効率発現遺伝子であるＤＨＦＲ遺伝子
の途中に組込まれている。ＤＨＦＲを暗号化する遺伝子
は第１図の５９番目の１Ａ”から４７４番目の”Ｇ”ま
でと、５０３番目のＡ″から５６４番目の”Ｇ″までの
４７７塩基対より成る。４７４番目のＧ″の後にロイシ
ンエンケファリン遺伝子を含む２８塩基対のＤＮＡ断片
が結合することにより生じた融合遺伝子が発現すると、
カルボキシル末端からの５個のアミノ酸がロイシンエン
ケファリンであり、その１つ前のアミノ酸がメチオニン
である１４６個のアミノ酸より成る融合蛋白質が作られ
るはずである。従って、ロイシンエンケファリンに対す
る抗体と反応し、免疫学的にこの融合蛋白質の産生を検
出することが可能である。
ドのアミノ酸配列を示した図である。新規組換えプラス
ミドｐＬＥＧ１は全長４４４３塩基対よりなり、ロイシ
ンエンケファリン遺伝子は第２図の４８３番目の”Ｔ’
から４９７番目の”Ｇ”までの１５塩基対であり、この
部分はＥ ｃｏＲＩ切断により第２図に示す２８塩基対
の断片として切り出すことができる。この２８塩基対の
ＤＮＡ断片は、高効率発現遺伝子であるＤＨＦＲ遺伝子
の途中に組込まれている。ＤＨＦＲを暗号化する遺伝子
は第１図の５９番目の１Ａ”から４７４番目の”Ｇ”ま
でと、５０３番目のＡ″から５６４番目の”Ｇ″までの
４７７塩基対より成る。４７４番目のＧ″の後にロイシ
ンエンケファリン遺伝子を含む２８塩基対のＤＮＡ断片
が結合することにより生じた融合遺伝子が発現すると、
カルボキシル末端からの５個のアミノ酸がロイシンエン
ケファリンであり、その１つ前のアミノ酸がメチオニン
である１４６個のアミノ酸より成る融合蛋白質が作られ
るはずである。従って、ロイシンエンケファリンに対す
る抗体と反応し、免疫学的にこの融合蛋白質の産生を検
出することが可能である。
次に本発明の実施例を示す。
実施例
ｐＬＥＧｌの作製
ロイシンエンケファリンを暗号化するＤＮＡとしては。
１）５’−ａＡＡＴＴＣＡＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＴＴＴ
ＣＣＴＧＴＡＡＴＧ−３°と ２）５’−ｄＡＡＴＴＣＡＴＴＡＣＡＧＧＡＡＡＣＣＡ
ＣＣＧＴＡＣＡＴＧ−３’ の２本のＤＮＡを、ＤＮＡ自動合成機（５ｙｓｔｅｃ社
製 Ｍｊ ｃｒｏｓｙｎ １４５０型）を■いて、ホス
ホアミダイト固相合成法に従って合成し、それぞれ約１
゜５０Ｄユニツト及び４．５０ Ｄユニットの合成りＮ
Ａを得ることができた。１）の配列及び２）の配列のＤ
ＮＡを、それぞれ、Ｑ、１ｍ／及び０．３ｍ１Ｏ）反応
液Ａ （５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１−ｐＨ７，９，１
０ｍＭＭｇＣ１２，５ｍＭ ジチオトレイトール、０
．１ ｍＭＡＴＰ）に溶かし、９０’Ｃで１分間保ち、
その後３７℃で、５分間数（ｌ Ｌｔだ後＋ユニットの
Ｔ４−ポリヌクレオチドキナーゼを加え、３０分間酵素
反応を行わせた。９０°Ｃで、１０分間放置することに
より。
ＣＣＴＧＴＡＡＴＧ−３°と ２）５’−ｄＡＡＴＴＣＡＴＴＡＣＡＧＧＡＡＡＣＣＡ
ＣＣＧＴＡＣＡＴＧ−３’ の２本のＤＮＡを、ＤＮＡ自動合成機（５ｙｓｔｅｃ社
製 Ｍｊ ｃｒｏｓｙｎ １４５０型）を■いて、ホス
ホアミダイト固相合成法に従って合成し、それぞれ約１
゜５０Ｄユニツト及び４．５０ Ｄユニットの合成りＮ
Ａを得ることができた。１）の配列及び２）の配列のＤ
ＮＡを、それぞれ、Ｑ、１ｍ／及び０．３ｍ１Ｏ）反応
液Ａ （５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１−ｐＨ７，９，１
０ｍＭＭｇＣ１２，５ｍＭ ジチオトレイトール、０
．１ ｍＭＡＴＰ）に溶かし、９０’Ｃで１分間保ち、
その後３７℃で、５分間数（ｌ Ｌｔだ後＋ユニットの
Ｔ４−ポリヌクレオチドキナーゼを加え、３０分間酵素
反応を行わせた。９０°Ｃで、１０分間放置することに
より。
酵素を失活させた後、それぞれ、Ｑ、Ｑ５ｍＪずつ取り
、混ぜ合わせ、これを６０’Ｃで、３０分間放置するこ
とにより、相補的相互作用によりアニーリングを行わせ
た。この溶液を、Ａ液と呼ぶことにした。
、混ぜ合わせ、これを６０’Ｃで、３０分間放置するこ
とにより、相補的相互作用によりアニーリングを行わせ
た。この溶液を、Ａ液と呼ぶことにした。
次に２合成りＮＡを挿入するベクターＤＮＡであるｐＴ
Ｐ６−１０．約０．００１１ｎ９を０．１１＋１／の反
応液Ｂ （７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、 ｐＨ７，４，
７ｍＭ ＭｇＣｌ２．７ｍＭ ２−メルカプトエタノ
ール、６ｍＭＮａＣ１）中で、 ２：１− 二７トＥ
ｃｏＲＩを用いて、３７°Ｃで、６０分間酵素反応を行
わせた。その後、６０°Ｃで、１０分間放置することに
より、酵素を失活させた。この溶液を、Ｂ液と呼ぶこと
にした。
Ｐ６−１０．約０．００１１ｎ９を０．１１＋１／の反
応液Ｂ （７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、 ｐＨ７，４，
７ｍＭ ＭｇＣｌ２．７ｍＭ ２−メルカプトエタノ
ール、６ｍＭＮａＣ１）中で、 ２：１− 二７トＥ
ｃｏＲＩを用いて、３７°Ｃで、６０分間酵素反応を行
わせた。その後、６０°Ｃで、１０分間放置することに
より、酵素を失活させた。この溶液を、Ｂ液と呼ぶこと
にした。
Ａ液より０．００１１Ｒ１を、Ｂ液より０．０７４Ｒ１
をｉｔ）、Ｍｆ合わせ、これニ、 ０．０１５ｍｌの
ＩＭＴｒｉｓ −ＨＣＩ、 ｐＨ７，４，０，０１５ｒ
ｎｌのＩＭ ＭｇＣｌ２、 ０．０１５１１４の０．
１Ｍジチオトレイトール、及び０．０１５ｄの５ｍＭ
ＡＴＰを加え、混合後、０゜５ユニツトのＴ４−ＤＮＡ
ＩＪガーゼを添加し、冷蔵庫中（約４−１０℃）で、１
８時間、ＤＮＡの連結反応を行わせた。
をｉｔ）、Ｍｆ合わせ、これニ、 ０．０１５ｍｌの
ＩＭＴｒｉｓ −ＨＣＩ、 ｐＨ７，４，０，０１５ｒ
ｎｌのＩＭ ＭｇＣｌ２、 ０．０１５１１４の０．
１Ｍジチオトレイトール、及び０．０１５ｄの５ｍＭ
ＡＴＰを加え、混合後、０゜５ユニツトのＴ４−ＤＮＡ
ＩＪガーゼを添加し、冷蔵庫中（約４−１０℃）で、１
８時間、ＤＮＡの連結反応を行わせた。
この反応物を、 Ｎｏｒｇａｒｄらの方法（Ｍ、Ｖ。
Ｎｏｒｇａｒｄ、 Ｋ、Ｋｅｅｍ＋ Ｊ−ＪｏＭｏｎａ
ｈａｎ ； Ｇｅｎｅ、 ｖｏｌ、３゜ｐｐ、 ２９９
（１９７８） ）に従って、 Ｅ、ｃｏｌｉ Ｉ（
１２Ｇ６００株に取り込ませた。この処理をした菌体を
、５０ｍ９／４のアンピシリンナトリウムを含む栄養寒
天培地（ｌｌ中に、２ｇのグルコース、Ｉｇのに２ＨＰ
Ｏ４，５ｇのイーストエキス、５ｇのポリペプトン、及
び１５ｇの寒天を含む寒天培地）上に塗布し、３７°Ｃ
で、２４時間培養することにより。
ｈａｎ ； Ｇｅｎｅ、 ｖｏｌ、３゜ｐｐ、 ２９９
（１９７８） ）に従って、 Ｅ、ｃｏｌｉ Ｉ（
１２Ｇ６００株に取り込ませた。この処理をした菌体を
、５０ｍ９／４のアンピシリンナトリウムを含む栄養寒
天培地（ｌｌ中に、２ｇのグルコース、Ｉｇのに２ＨＰ
Ｏ４，５ｇのイーストエキス、５ｇのポリペプトン、及
び１５ｇの寒天を含む寒天培地）上に塗布し、３７°Ｃ
で、２４時間培養することにより。
５００個以上のコロニーを得ることができた。これらの
コロニーから、適当に１００ｆｆＩＡ選び、５０１１９
／ｌのアンピシリン及び２０〜／、イのトリメトプリム
を含む栄養寒天培地上に、つまようじを用いて、１個づ
つ移し、３７°Ｃで、２４時間培養したところ、１５個
がトリメトプリムを含む培地では生長できなかった。こ
の１５個の菌株から適当に８個選んで、それぞれ、５Ｑ
ｍｌの５０■／ｌのアンピシリンナトリウムを含む栄養
培地（ｌｌ中に、２ｇのグリコース、Ｉｇのに２ＨＰＯ
４，５ｇのイーストエキス、及び５ｇのポリペプトンを
含む液体培地）で、対数生長期まで培養した。それぞれ
の培養液を遠心分離し、菌体を集め、それぞれ、２１Ｒ
１の５０ ｍＭ ’）ン酸緩衝液に懸濁し、音波破砕に
より細胞を破砕し、これを、 ２００００ ｒｐｍで１
時間、遠心分離し、上清を得た。得られた上清（それぞ
れＩｔ）０倍に希釈）をミクログレートに吸着させ、こ
れに、ロイシンエンケファリンに対する抗血清（ウサギ
からの）を加え、洗浄した後、西洋わさびペルオキシダ
ーゼで標識したヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体を加え
、さらに、洗浄した。固定化された西洋わさびペルオキ
シダーゼの活性を測定したところ、８株のうち１株が。
コロニーから、適当に１００ｆｆＩＡ選び、５０１１９
／ｌのアンピシリン及び２０〜／、イのトリメトプリム
を含む栄養寒天培地上に、つまようじを用いて、１個づ
つ移し、３７°Ｃで、２４時間培養したところ、１５個
がトリメトプリムを含む培地では生長できなかった。こ
の１５個の菌株から適当に８個選んで、それぞれ、５Ｑ
ｍｌの５０■／ｌのアンピシリンナトリウムを含む栄養
培地（ｌｌ中に、２ｇのグリコース、Ｉｇのに２ＨＰＯ
４，５ｇのイーストエキス、及び５ｇのポリペプトンを
含む液体培地）で、対数生長期まで培養した。それぞれ
の培養液を遠心分離し、菌体を集め、それぞれ、２１Ｒ
１の５０ ｍＭ ’）ン酸緩衝液に懸濁し、音波破砕に
より細胞を破砕し、これを、 ２００００ ｒｐｍで１
時間、遠心分離し、上清を得た。得られた上清（それぞ
れＩｔ）０倍に希釈）をミクログレートに吸着させ、こ
れに、ロイシンエンケファリンに対する抗血清（ウサギ
からの）を加え、洗浄した後、西洋わさびペルオキシダ
ーゼで標識したヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体を加え
、さらに、洗浄した。固定化された西洋わさびペルオキ
シダーゼの活性を測定したところ、８株のうち１株が。
０．８７０という値であり、他の７株では、コントロー
ルとして用いたプラスミドを保持しないＥ。
ルとして用いたプラスミドを保持しないＥ。
ｃｏｌｉ Ｋ１２Ｇ６００株の値、０．３０３と同じ値
であった。
であった。
０、８７０の値を示した株のプラスミドをｐＬＥＧｌと
名づけ、この菌株から＊ ＴａｎａｋａとＷｅｉｓｂｌ
ｕｍの方法（Ｔ−Ｔａｎａｋａ、 Ｂ、 Ｗｅｉｂｌｕ
ｍ ；Ｊ−Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌｏｇｙ。
名づけ、この菌株から＊ ＴａｎａｋａとＷｅｉｓｂｌ
ｕｍの方法（Ｔ−Ｔａｎａｋａ、 Ｂ、 Ｗｅｉｂｌｕ
ｍ ；Ｊ−Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌｏｇｙ。
ｖａｔ、１２１．ｐｐ、３５４ （１９７５））に従っ
て、プラスミドを調製した。
て、プラスミドを調製した。
得られたｐ Ｌ Ｅ Ｇ １の全塩基配列を、 Ｍａｘ
ａｍ−ＧＮｂｅｒｔ法及びダイデオキシ法に従って決定
したところ、第１図に示す結果が得られた。
ａｍ−ＧＮｂｅｒｔ法及びダイデオキシ法に従って決定
したところ、第１図に示す結果が得られた。
第１図は、、ＬＥＧＩの全塩基配列を示した図であり、
２本鎖ＤＮＡのうち片方のＤＮＡ鎖配列配列を、５′末
端から３°末端の方向から記述している。図中符号は、
核酸塩基を表わし、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇは
グアニン、Ｔはチミンを示している。 第２図は、化学合成したＤＮＡ及びそれが暗号化するア
ミノ酸配列を示した図である。図中符号は、核酸塩基及
びアミノ酸を表わし、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇ
はグアニン、Ｔはチミン。 Ｐｈｅはフェニルアラニン＋Ｍｅｔ はメチオニン。 Ｔｙｒはチロシン、Ｇｌｙはグリシン＊ Ｌｅｕ 、は
ロイシン＊ ５ｔｏｐは停止暗号を示し、ている。
２本鎖ＤＮＡのうち片方のＤＮＡ鎖配列配列を、５′末
端から３°末端の方向から記述している。図中符号は、
核酸塩基を表わし、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇは
グアニン、Ｔはチミンを示している。 第２図は、化学合成したＤＮＡ及びそれが暗号化するア
ミノ酸配列を示した図である。図中符号は、核酸塩基及
びアミノ酸を表わし、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇ
はグアニン、Ｔはチミン。 Ｐｈｅはフェニルアラニン＋Ｍｅｔ はメチオニン。 Ｔｙｒはチロシン、Ｇｌｙはグリシン＊ Ｌｅｕ 、は
ロイシン＊ ５ｔｏｐは停止暗号を示し、ている。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、宿にアンピシリン耐性を与えることができ第１図に
おいて示されるＤＮＡ配列を含有し、制限酵素ＥｃｏＲ
I による切断によって、第２図において示される２８
塩基対よりなるロイシンエンケファリンを暗号化するＤ
ＮＡ配列を切り出すことができるという特徴を有する、
４４４３塩基対よりなる新規組換えプラスミドｐＬＥＧ
１。 ２、特許請求範囲第１項記載の新規組換プラスミドｐＬ
ＥＧ１を含有するＥｃｏｌｉＫ１２株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10087885A JPS61260885A (ja) | 1985-05-13 | 1985-05-13 | ロイシンエンケフアリン遺伝子を含有する新規組換えプラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10087885A JPS61260885A (ja) | 1985-05-13 | 1985-05-13 | ロイシンエンケフアリン遺伝子を含有する新規組換えプラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61260885A true JPS61260885A (ja) | 1986-11-19 |
| JPH0148754B2 JPH0148754B2 (ja) | 1989-10-20 |
Family
ID=14285581
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10087885A Granted JPS61260885A (ja) | 1985-05-13 | 1985-05-13 | ロイシンエンケフアリン遺伝子を含有する新規組換えプラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61260885A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7825231B2 (en) | 2005-06-01 | 2010-11-02 | Darren P. Wolfe | Method of amidated peptide biosynthesis and delivery in vivo: endomorphin-2 for pain therapy |
-
1985
- 1985-05-13 JP JP10087885A patent/JPS61260885A/ja active Granted
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7825231B2 (en) | 2005-06-01 | 2010-11-02 | Darren P. Wolfe | Method of amidated peptide biosynthesis and delivery in vivo: endomorphin-2 for pain therapy |
| US8003622B2 (en) | 2005-06-01 | 2011-08-23 | Darren Wolfe | Peptide biosynthesis and pain therapy |
| US8846889B2 (en) | 2005-06-01 | 2014-09-30 | Darren P. Wolfe | Peptide biosynthesis and pain therapy |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0148754B2 (ja) | 1989-10-20 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |