JPH11221080A - 有機溶媒耐性を有する大腸菌およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 有機溶媒耐性を有するまたはその有機溶媒耐
性が増強された大腸菌を提供すること。 【解決手段】 acrA、acrB、またはtolC遺伝子の少なく
とも１つの遺伝子で大腸菌を形質転換する。こうして得
られた大腸菌には高い極性溶媒に対する耐性が付与さ
れ、高極性の有機溶媒中においても生存および生育が可
能となる。その結果、有機溶媒中に溶解した原料の微生
物変換を、高効率で実施することができ、例えば、反応
有機溶媒が水に対する飽和溶解度以上存在する系中で、
有機溶媒可溶性物質の微生物変換を行うことが可能とな
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】発明の分野 本発明は、大腸菌に有機溶媒耐性を付与し、または大腸
菌の有機溶媒耐性を増強する方法およびその方法によっ
て得られた大腸菌並びにその利用に関する。

【０００２】背景技術 近年有機化合物の合成や修飾等の変換に、酵素や微生物
などを触媒として使用する技術が注目されている。これ
らの生体触媒は、反応生成物の立体特異性に優れている
利点を有し、医薬品原体等の製造に既に利用がなされて
いる。

【０００３】原料が有機溶媒可溶性の物質である場合、
このような原料は生体触媒を含んだ反応液（水）中に懸
濁させるかまたは反応液中に界面活性剤を併存させて、
生体触媒と反応させる。しかし、これらの方法は一般に
反応効率が低い。

【０００４】原料を有機溶媒に溶かして、酵素や微生物
を含有する反応液（水）と混合して反応させる試みもな
されている。しかしこの方法では、有機溶媒と接触によ
り酵素が失活しり、微生物が死滅してしまうことが多
い。特に生体触媒として微生物を用いる場合、微生物が
死滅してしまうと、死菌体を用いた反応のみが実施され
る。よって、この方法は補酵素系の再生が必要な反応に
は使用することができない。また、生体触媒として酵素
を用いる場合、ポリエチレングリコール等のポリマーで
修飾して、有機溶媒中においてもその活性を保持させる
ことが検討されている。しかし、修飾反応のため新たな
工程が必要となり、しかもそのために製造コストが上昇
するといった、実用化への課題が残されている。

【０００５】ここで、もし、有機溶媒に対して高度の耐
性を有する微生物が得られた場合には、例えば、微生物
の培養液に目的とする原料を溶解した有機溶媒を重層す
る方法、いわゆる溶媒重層発酵法を用いることができ
る。この方法にあっては、有機溶媒に均一に溶解した基
質溶液相と微生物の培養液相との間で、原料を分配する
ことが可能となり、培養液層に分配された原料と微生物
を接触させることができるため、反応効率が著しく高く
なる。しかも有機溶媒の存在下であっても微生物がその
有機溶媒に耐性を有していることから、死滅することな
く、よって補酵素の再生を必要とする反応も進行でき、
さらには原料により誘導される酵素系を利用することも
可能となる。その上、反応生成物が有機溶媒可溶性の場
合には、反応生成物が有機溶媒相に分配されるため、そ
の回収も容易となる。

【０００６】このように有機溶媒に高度に耐性を有する
微生物は、産業上非常に有用であるが、目的の酵素系を
有した有機溶媒耐性微生物を発見するためには多くの努
力を必要とする。

【０００７】大腸菌は、遺伝子操作を利用したタンパク
性物質の生産系として広く工業的に利用されている微生
物である。目的とする酵素系をコードした遺伝子により
形質転換することによって、目的の酵素系を有した大腸
菌を得ることができる。従って、この大腸菌の有機溶媒
耐性を増強することができれば、新規微生物をスクリー
ニングすることなく、効率的に必要とする微生物を得る
ことができる。

【０００８】大腸菌の有機溶媒耐性突然変異体の研究か
ら、大腸菌の有機溶媒を増強させる遺伝子の存在がいく
つか示唆はされているが、それらの遺伝子は現在までに
同定されておらず、その解析と利用が待ち望まれてい
る。

【０００９】

【発明の概要】本発明者らは、今般、大腸菌における有
機溶媒耐性の発現が、acrA、 acrB、またはtolC遺伝子
の高発現によることを見出した。本発明はかかる知見に
基づくものである。

【００１０】従って、本発明は、有機溶媒耐性を有する
またはその有機溶媒耐性が増強された大腸菌の製造法の
提供をその目的としている。

【００１１】さらに本発明は、有機溶媒耐性が付与され
たまたは増強された大腸菌の提供をそ目的としている。

【００１２】そして、本発明による有機溶媒耐性を有す
るまたはその有機溶媒耐性が増強された大腸菌の製造法
は、acrA、acrB、またはtolC遺伝子の少なくとも１つの
遺伝子で大腸菌を形質転換する工程を含んでなるもので
ある。

【００１３】また、本発明による有機溶媒耐性が付与さ
れたまたは増強された大腸菌は、上記の本発明による方
法によって製造された大腸菌である。

【００１４】

【発明の具体的説明】本発明において利用するacrA、 a
crB、およびtolC遺伝子は大腸菌K-12株に存在すること
が既に報告されている遺伝子である。すなわち、acrAお
よびacrB遺伝子は、sox-marレギュロンに存在する遺伝
子であり、大腸菌の薬剤耐性に関与する遺伝子として知
られている（GenBank Database Access No.M94248）。
また、tolCは外膜タンパクをコードする遺伝子として知
られている（GenBank DatabaseAccess No.X00016 J0171
1,Hackett et al., Nucleic Acids Res.11(18)6487-649
5(1983)）。

【００１５】acrA、 acrB、およびtolC遺伝子を保持す
る大腸菌K-12株は公知の大腸菌株であり、例えばＡＴＣ
Ｃ１２４３５、１５１５３、１５４８９、１５４９１、
１５６６９、１９２１５、２３２８２、２３８２０、２
５０１９、２５２４５、２５２５１、２５２５５、２５
４０４、２５９４７、２７１６１、２７０２０、２７３
２５、２７１９５、２９０７９、および３３４５４とし
て入手可能である。

【００１６】より具体的には、acrA遺伝子は配列番号１
の３１８番から１５２２番までの１２０５塩基対の配列
を意味し、さらにacrB遺伝子は同じく配列番号１の１５
３０番から４６９４番までの３１６５塩基対の配列を意
味する。配列番号１に記載の配列はアクリフラビン耐性
蛋白質（acrAB）遺伝子を表し、上記のacrA遺伝子の領
域のうち３２９番から１５２２番までが翻訳され配列番
号２のアミノ酸配列を有するアクロフラビン耐性蛋白質
を、正確には４０１番から１５２２番が翻訳されて配列
番号２の１番から３７２番までのアミノ酸配列を有する
成熟ペプチドが得られる。また、上記のacrB遺伝子の領
域のうち１５４５番から４６９５番までが翻訳されて配
列番号３のアミノ酸配列を有するアクロフラビン耐性蛋
白質を与える。

【００１７】また、tolCは外膜タンパクをコードする遺
伝子は、具体的には配列番号４に記載の１５９３塩基対
の配列を意味する。この配列の領域のうち３８番から１
５０７番までが翻訳されて配列番号５のアミノ酸配列を
有する外皮蛋白質を与える。

【００１８】従って、本発明においてacrA、 acrB、お
よびtolC遺伝子とは、配列番号１の３１８番から１５２
２番までの配列、同じく配列番号１の１５３０番から４
６９４番までの配列、そして配列番号４の配列を、第一
義的には意味するものであるが、本発明において利用可
能なacrA、 acrB、およびtolC遺伝子はこれら配列に留
まらず、配列番号２、３、および５のアミノ酸配列をコ
ードする遺伝子をも意味する。すなわち、コドンにおい
て配列番号１の３１８番から１５２２番までの配列、同
じく配列番号１の１５３０番から４６９４番までの配
列、そして配列番号４の配列と宿重関係にあるコドンを
有する遺伝子も本発明において利用可能である。

【００１９】さらに、本発明においてacrA、 acrB、お
よびtolC遺伝子とは、上記配列に留まらず、さらに配列
番号２、３、および５のアミノ酸配列において１〜数個
のアミノ酸の挿入、置換または欠失、もしくはその一方
または両末端への付加がなされたものをであって、配列
番号２、３、および５に記載の配列を有する蛋白質と同
一の機能を維持するアミノ酸配列（本明細書において、
この配列を「等価配列」ということがある）をコードす
る遺伝子をも包含するものとする。

【００２０】本発明においてこれらacrA、acrB、および
tolC遺伝子を大腸菌に導入し、大腸菌を形質転換する。
本発明において、これら遺伝子が導入された大腸菌は有
機溶媒耐性を獲得する。また、既に一定の有機溶媒耐性
を有する大腸菌にこれら遺伝子が導入されると、その大
腸菌はより増強された有機溶媒耐性を獲得する。本発明
にあっては、既にacrA、 acrB、およびtolC遺伝子を内
在性遺伝子として有する大腸菌（例えば、Ｋ１２株）に
さらにacrA、 acrB、およびtolC遺伝子を導入し、有機
溶媒耐性を増強する態様も含まれる。従って、本発明に
おいては、acrA、 acrB、およびtolC遺伝子を有さない
大腸菌に導入されたこれら遺伝子を外来性の遺伝子と呼
ぶと同時に、既にこれら遺伝子を内在性遺伝子として有
する大腸菌に導入されたacrA、 acrB、およびtolC遺伝
子をも外来性の遺伝子と呼ぶこととする。従って、本発
明によれば、有機溶媒耐性を有するまたはその有機溶媒
耐性が増強された大腸菌の製造法が提供される。また、
本発明の別の態様によれば、大腸菌に有機溶媒耐性を付
与する方法および大腸菌の有機溶媒耐性を増強する方法
が提供される。

【００２１】有機溶媒の微生物に対する毒性尺度とし
て、現在一般的にlog Pow値が用いられている。log Pow
値とは、水とn-オクタノールとの二相間における任意の
物質の分配係数Pow値の常用対数であり、物質の極性を
表す。任意の物質において、Pow値は、（n-オクタノー
ル相における濃度）／（水相における濃度）として算出
される。従って、log Pow値が低い物質は極性が高いこ
とを示している。そして、一般的にlog Pow値が低い、
すなわち極性の高い有機溶媒ほど微生物に対する毒性が
強いことが明らかにされている（Inoue et al., Natur
e, 388,264-266(1989)）。そして、ある微生物が生育で
きる最も低いlog Pow値を、その微生物の有機溶媒耐性
の程度の指標として利用することができる。本発明にお
いて、log Pow値を指標としてその有機溶媒耐性を評価
することが出来る。なお、本明細書において用いるlog
Powの数値は、各種有機溶媒の構造から算出されたもの
を使用する。算出の方法は、例えばChemical Review (L
eo, A. J., Calculating log Poct from structure. 93
; 1281-1306.) に記載の方法やlog Pow計算プログラム
C log P ver.1.0.3 (Bio-Byte corp., California) 等
を使用して行った。また、これら有機溶媒の存在量は、
水に対する飽和濃度以上とする。

【００２２】本発明の好ましい態様によれば、acrA、 a
crB、およびtolC遺伝子の導入によって大腸菌の有機溶
媒耐性をlog Pow値5.5以下、さらには3.3にすることが
可能となる。すなわち、本発明により得られた有機溶媒
耐性が増強された大腸菌は3.3以上のlog Pow値の有機溶
媒、例えばペンタン(3.3 ; log Pow値を表す。以下同
様 )、シクロヘキサン(3.35)、ｏ−ジクロロベンゼン
(3.6)、プロピルベンゼン(3.8)、ｎ−ヘキサン(3.9)、
ジフェニルエーテル(4.2)、シクロオクタン(4.5)、イソ
オクタン(4.8)、ｎ−オクタン(4.9)、ヘキシルエーテル
(5.1)、ｎ−ノナン(5.5)、ｎ−デカン(6.0)、ｎ−ドデ
カン(7.0)等の有機溶媒の、水に対する飽和濃度以上の
濃度の存在下にあっても生存および生育が可能となる。

【００２３】これら遺伝子の導入によって大腸菌に有機
溶媒耐性を付与され、または大腸菌の有機溶媒耐性が増
強される機序は明らかではないが、これら遺伝子が大腸
菌ないで発現していることが好ましいと考えられる。こ
れら遺伝子が導入され、有機溶媒耐性を獲得または増強
された大腸菌においては、これら遺伝子に対応する蛋白
質の高発現が観察されるからである。しかし、この理論
はあくまで仮定であって、本発明はこの機序に限定され
るものではない。

【００２４】これら遺伝子の大腸菌への導入の手法は特
に限定されないが、実際上は、これら遺伝子をベクタ
ー、例えばプラスミドまたはファージ、に組み込み、こ
れらベクターによって大腸菌を形質転換する。本発明に
おいて好ましく利用可能なプラスミドとしては、ブルー
スクリプト、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＭＷ１１
９等が挙げられ、またファージとしてはＰ１ファージ等
が挙げられる。

【００２５】また、上記したように、これら遺伝子は大
腸菌内で発現していることが好ましいことから、上記の
ベクターは、これら遺伝子の発現を導く制御配列、例え
ばプロモータ配列、シグナル配列、ターミネータ配列等
を含んでなるのが好ましい。本発明の好ましい態様によ
れば、プロモータ配列は、使用するベクターに応じて適
宜決定されてよいが、例えばスクリプトプラスミドを用
いる場合、その中に存在するLacプロモーターを利用出
来る。また、シグナル配列およびターミネータ配列とし
ては、配列番号１または４中に存在するacrA、acrB、ま
たはtolCのシグナル配列またはターミネーター配列を利
用することが好ましい。

【００２６】また、形質転換体の選択のために、上記の
ベクターは遺伝子マーカーを含んでなるのが好ましい。
遺伝子マーカーは、形質転換体の選択の手法に応じて適
宜選択されてよいが、例えば薬剤耐性をコードする遺伝
子（例えば、アンピシリン耐性マーカー）、栄養要求性
を相補する遺伝子等を利用することができる。

【００２７】本発明において上記ベクターによる大腸菌
の形質転換は、慣用されている手法を用いることができ
る。

【００２８】以上の遺伝子組換え等の遺伝子工学的な手
法は、一般的な総説（例えば、Maniatis et al.,1989,
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY, Current Protocols I
n Molecular Biologyなど）に従って行うことが出来
る。

【００２９】このようにして得られた大腸菌は、有機溶
媒耐性が付与されまたは増強されたものである。具体的
には、上記したような高極性の有機溶媒中においても生
存および生育が可能となる。その結果、有機溶媒中に溶
解した原料の微生物変換を、高効率で実施することがで
きる。従って、例えば、反応有機溶媒が水に対する飽和
溶解度以上存在する系中で、有機溶媒可溶性物質の微生
物変換を行うことが可能となる。

【００３０】より具体的には、微生物の培養液に目的と
する原料を溶解した有機溶媒を重層する方法、いわゆる
溶媒重層発酵法において、種々の有機溶媒と組み合わせ
て本発明による大腸菌を利用することが可能となる。本
発明による大腸菌は高い極性の有機溶媒に耐性を有する
ことから、有機溶媒の選択の範囲が広がる。このこと
は、有機溶媒に溶解できる原料物質として種々のものが
利用できることとなり、溶媒重層発酵法の利用範囲を極
めて拡大するものである。なお、ここで、溶媒重層発酵
法は公知であり、種々の総説（例えば、Aono R.et al.,
Appl.Environ.Microbiol.60,2518-2523(1994)）にその
記載がある。

【００３１】さらに、本発明による大腸菌に、さらに原
料の変換反応に必要な酵素をコードする遺伝子を導入す
ることによって、目的とする酵素系を有する大腸菌を得
ることができる。このような大腸菌は種々の用途に利用
可能であり、例えばインドールからのインジゴの生産、
コレステロール等のステロイド類の変換、あるいは流出
原油の処理や有機溶媒を含む工業廃水の浄化にも有効で
ある。

【００３２】これら酵素系の遺伝子の本発明による大腸
菌への導入は、本明細書の記載および遺伝子工学の分野
で慣用されている手法を用いれば当業者には格段の困難
性なく実施が可能であることは明らかである。

【００３３】

【実施例】実施例１ 大腸菌DK5500（acrA欠損株）またはN43（acrA欠損株）
を、それぞれLBGMg培地（１％トリプトン、0.5％酵母エ
キス、１％塩化ナトリウム、0.1％ブドウ糖、10mM硫酸
マグネシウムを含有、pH7.0）に植菌し、培地の上部に
ノナン(5.45)、オクタン(4.93)、 ジフェニルエーテル
(4.24)、 ｎ−ヘキサン(3.87)、 シクロヘキサン(3.35)
を3mmの厚さで重層し、３７℃で１６時間培養する溶媒
重層発酵を行った。ここで（ ）内の数値は各有機溶媒
のlog Pow値を表す。また、それぞれの有機溶媒量は水
に対する飽和濃度以上とした。

【００３４】その結果、 DK5500およびN43はノナン(5.4
5)重層下でのみ生育した。従って、log Pow値は5.45で
あった。

【００３５】大腸菌DK5500およびN43を、acrA遺伝子お
よびacrB遺伝子、またはacrA遺伝子で次のように形質転
換した。まず、大腸菌K-12：JA 300株から、acrAおよび
acrB遺伝子、並びにacrA遺伝子を含むフラグメントを常
法に従い得た。得られたacrAおよびacrB遺伝子を含むフ
ラグメントを、pMW119（東洋紡バイオケミカル株式会社
または日本ジーン株式会社より入手）のマルチクローニ
ングサイトに、ラクトースプロモーターに対して順向き
に挿入して、プラスミドpMacを得た。また、同様にして
pMW119のマルチクローニングサイトに、acrA遺伝子を含
むフラグメントをラクトースプロモーターに対して順向
きに挿入して、プラスミドpMacAを得た。このようにし
て得られたプラスミドpMacおよびpMacAにより、大腸菌D
K5500およびN43をそれぞれ塩化カルシウム法により形質
転換した。得られた形質転換体について、上記と同様の
溶媒重層発酵を行なった。

【００３６】その結果は次の表に示されるとおりであっ
た。

【００３７】

【表１】

【００３８】表から明らかなように、DK5500は、ノナ
ン、オクタン、ジフェニルエーテル、ｎ−ヘキサンに、
N43はノナン、オクタン、ジフェニルエーテルに耐性を
有するようになり、log Pow値はDK5500では3.87に、N43
では4.24に低下し、有機溶媒耐性が増強されていた。

【００３９】一方、対照としてpMW119で形質転換した大
腸菌は、すべての菌株でその指標log Pow値は変化しな
かった。

【００４０】実施例２ 大腸菌JA300T(tolC欠損株）およびOST3408T（tolC欠損
株）を実施例１と同様にしてLBGMg培地を用いた溶媒重
層発酵を行った。その結果、JA300TおよびOST3408TはDe
cane(5.98)重層下でのみ生育した。従って、log Pow値
は5.98であった。

【００４１】大腸菌JA300TおよびOST3408TをtolC遺伝子
で次のように形質転換した。まず、大腸菌K-12:JA300株
よりtolC遺伝子を含むフラグメントを常法に従い得た。
得られたフラグメントを、pBluescriptII(pBSII)および
pMW119のそれぞれのマルチクローニングサイトに順向き
に挿入して、プラスミドpUXおよびpMXを得た。実施例１
に記載の手法に準じてプラスミドpUXおよびpMXによって
大腸菌JA300TおよびOST3408Tを形質転換した。得られた
形質転換体について、実施例１と同様の溶媒重層発酵を
行なった。

【００４２】その結果は次の表に示されるとおりであっ
た。

【００４３】

【表２】

【００４４】表から明らかなように、JA300Tはノナン
(5.45)、オクタン(4.93)、 ジフェニルエーテル(4.2
4)、 ｎ−ヘキサン(3.87)にも、OST3408Tはノナン(5.4
5)、オクタン(4.93)、 ジフェニルエーテル(4.24)、 ｎ
−ヘキサン(3.87)、シクロヘキサン(3.35)にも耐性を有
するようになり、log Pow値はJA300Tでは3.87に、OST34
08Tでは3.35に低下し、有機溶媒耐性が増強されてい
た。

【００４５】一方、対照としてpBSIIで形質転換した大
腸菌は、すべての菌株でそのlog Pow値は変化しなかっ
た。

【００４６】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：４８７９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置 ：３２９．．１５２２ 特徴を決定した方法： 特徴を表す記号：ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置 ：３２９．．４００ 特徴を決定した方法： 特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置 ：３２９．．１５２２ 特徴を決定した方法： 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置 ：１５３０．．４６９４ 特徴を決定した方法： 配列 AGATCTCACT GAACAAATCC GACTTGTCTT TAAAATGCCA GTAGATTGCA CCGCGCGTAA 60 CGCCAGCTGC TTTTGCAATC TCGCCCAGCG AGGTGGATGA TACCCCCTGC TGTGAGAAAA 120 GACGTAGAGC CACATCGAGG ATGTGTTGGC GCGTTTCTTG CGCTTCTTGT TTGGTTTTTC 180 GTGCCATATG TTCGTGAATT TACAGGCGTT AGATTTACAT ACATTTGTGA ATGTATGTAC 240 CATAGCACGA CGATAATATA AACGCAGCAA TGGGTTTATT AACTTTTGAC CATTGACCAA 300 TTTGAAATCG GACACTCGAG GTTTACATAT GAACAAAAAC AGAGGGTTTA CGCCTCTGGC 360 GGTCGTTCTG ATGCTCTCAG GCAGCTTAGC CCTAACAGGA TGTGACGACA AACAGGCCCA 420 ACAAGGTGGC CAGCAGATGC CCGCCGTTGG CGTAGTAACA GTCAAAACTG AACCTCTGCA 480 GATCACAACC GAGCTTCCGG GTCGCACCAG TGCCTACCGG ATCGCAGAAG TTCGTCCTCA 540 AGTTAGCGGG ATTATCCTGA AGCGTAATTT CAAAGAAGGT AGCGACATCG AAGCAGGTGT 600 CTCTCTCTAT CAGATTGATC CTGCGACCTA TCAGGCGACA TACGACAGTG CGAAAGGTGA 660 TCTGGCGAAA GCCCAGGCTG CAGCCAATAT CGCGCAATTG ACGGTGAATC GTTATCAGAA 720 ACTGCTCGGT ACTCAGTACA TCAGTAAGCA AGAGTACGAT CAGGCTCTGG CTGATGCGCA 780 ACAGGCGAAT GCTGCGGTAA CTGCGGCGAA AGCTGCCGTT GAAACTGCGC GGATCAATCT 840 GGCTTACACC AAAGTCACCT CTCCGATTAG CGGTCGCATT GGTAAGTCGA ACGTGACGGA 900 AGGCGCATTG GTACAGAACG GTCAGGCGAC TGCGCTGGCA ACCGTGCAGC AACTTGATCC 960 GATCTACGTT GATGTGACCC AGTCCAGCAA CGACTTCCTG CGCCTGAAAC AGGAACTGGC 1020 GAATGGCACG CTGAAACAAG AGAACGGCAA AGCCAAAGTG TCACTGATCA CCAGTGACGG 1080 CATTAAGTTC CCGCAGGACG GTACGCTGGA ATTCTCTGAC GTTACCGTTG ATCAGACCAC 1140 TGGGTCTATC ACCCTACGCG CTATCTTCCC GAACCCGGAT CACACTCTGC TGCCGGGTAT 1200 GTTCGTGCGC GCACGTCTGG AAGAAGGGCT TAATCCAAAC GCTATTTTAG TCCCGCAACA 1260 GGGCGTAACC CGTACGCCGC GTGGCGATGC CACCGTACTG GTAGTTGGCG CGGATGACAA 1320 AGTGGAAACC CGTCCGATCG TTGCAAGCCA GGCTATTGGC GATAAGTGGC TGGTGACAGA 1380 AGGTCTGAAA GCAGGCGATC GCGTAGTAAT AAGTGGGCTG CAGAAAGTGC GTCCTGGTGT 1440 CCAGGTAAAA GCACAAGAAG TTACCGCTGA TAATAACCAG CAAGCCGCAA GCGGTGCTCA 1500 GCCTGAACAG TCCAAGTCTT AACTTAAACA GGAGCCGTTA AGACATGCCT AATTTCTTTA 1560 TCGATCGCCC GATTTTTGCG TGGGTGATCG CCATTATCAT CATGTTGGCA GGGGGGCTGG 1620 CGATCCTCAA ACTGCCGGTG GCGCAATATC CTACGATTGC ACCGCCGGCA GTAACGATCT 1680 CCGCCTCCTA CCCCGGCGCT GATGCGAAAA CAGTGCAGGA CACGGTGACA CAGGTTATCG 1740 AACAGAATAT GAACGGTATC GATAACCTGA TGTACATGTC CTCTAACAGT GACTCCACGG 1800 GTACCGTGCA GATCACCCTG ACCTTTGAGT CTGGTACTGA TGCGGATATC GCGCAGGTTC 1860 AGGTGCAGAA CAAACTGCAG CTGGCGATGC CGTTGCTGCC GCAAGAAGTT CAGCAGCAAG 1920 GGGTGAGCGT TGAGAAATCA TCCAGCAGCT TCCTGATGGT TGTCGGCGTT ATCAACACCG 1980 ATGGCACCAT GACGCAGGAG GATATCTCCG ACTACGTGGC GGCGAATATG AAAGATGCCA 2040 TCAGCCGTAC GTCGGGCGTG GGTGATGTTC AGTTGTTCGG TTCACAGTAC GCGATGCGTA 2100 TCTGGATGAA CCCGAATGAG CTGAACAAAT TCCAGCTAAC GCCGGTTGAT GTCATTACCG 2160 CCATCAAAGC GCAGAACGCC CAGGTTGCGG CGGGTCAGCT CGGTGGTACG CCGCCGGTGA 2220 AAGGCCAACA GCTTAACGCC TCTATTATTG CTCAGACGCG TCTGACCTCT ACTGAAGAGT 2280 TCGGCAAAAT CCTGCTGAAA GTGAATCAGG ATGGTTCCCG CGTGCTGCTG CGTGACGTCG 2340 CGAAGATTGA GCTGGGTGGT GAGAACTACG ACATCATCGC AGAGTTTAAC GGCCAACCGG 2400 CTTCCGGTCT GGGGATCAAG CTGGCGACCG GTGCAAACGC GCTGGATACC GCTGCGGCAA 2460 TCCGTGCTGA ACTGGCGAAG ATGGAACCGT TCTTCCCGTC GGGTCTGAAA ATTGTTTACC 2520 CATACGACAC CACGCCGTTC GTGAAAATCT CTATTCACGA AGTGGTTAAA ACGCTGGTCG 2580 AAGCGATCAT CCTCGTGTTC CTGGTTATGT ATCTGTTCCT GCAGAACTTC CGCGCGACGT 2640 TGATTCCGAC CATTGCCGTA CCGGTGGTAT TGCTCGGGAC CTTTGCCGTC CTTGCCGCCT 2700 TTGGCTTCTC GATAAACACG CTAACAATGT TCGGGATGGT GCTCGCCATC GGCCTGTTGG 2760 TGGATGACGC CATCGTTGTG GTAGAAAACG TTGAGCGTGT TATGGCGGAA GAAGGTTTGC 2820 CGCCAAAAGA AGCTACCCGT AAGTCGATGG GGCAGATTCA GGGCGCTCTG GTCGGTATCG 2880 CGATGGTACT GTCGGCGGTA TTCGTACCGA TGGCCTTCTT TGGCGGTTCT ACTGGTGCTA 2940 TCTATCGTCA GTTCTCTATT ACCATTGTTT CAGCAATGGC GCTGTCGGTA CTGGTGGCGT 3000 TGATCCTGAC TCCAGCTCTT TGTGCCACCA TGCTGAAACC GATTGCCAAA GGCGATCACG 3060 GGGAAGGTAA AAAAGGCTTC TTCGGCTGGT TTAACCGCAT GTTCGAGAAG AGCACGCACC 3120 ACTACACCGA CAGCGTAGGC GGTATTCTGC GCAGTACGGG GCGTTACCTG GTGCTGTATC 3180 TGATCATCGT GGTCGGCATG GCCTATCTGT TCGTGCGTCT GCCAAGCTCC TTCTTGCCAG 3240 ATGAGGACCA GGGCGTGTTT ATGACCATGG TTCAGCTGCC AGCAGGTGCA ACGCAGGAAC 3300 GTACACAGAA AGTGCTCAAT GAGGTAACGC ATTACTATCT GACCAAAGAA AAGAACAACG 3360 TTGAGTCGGT GTTCGCCGTT AACGGCTTCG GCTTTGCGGG ACGTGGTCAG AATACCGGTA 3420 TTGCGTTCGT TTCCTTGAAG GACTGGGCCG ATCGTCCGGG CGAAGAAAAC AAAGTTGAAG 3480 CGATTACCAT GCGTGCAACA CGCGCTTTCT CGCAAATCAA AGATGCGATG GTTTTCGCCT 3540 TTAACCTGCC CGCAATCGTG GAACTGGGTA CTGCAACCGG CTTTGACTTT GAGCTGATTG 3600 ACCAGGCTGG CCTTGGTCAC GAAAAACTGA CTCAGGCGCG TAACCAGTTG CTTGCAGAAG 3660 CAGCGAAGCA CCCTGATATG TTGACCAGCG TACGTCCAAA CGGTCTGGAA GATACCCCGC 3720 AGTTTAAGAT TGATATCGAC CAGGAAAAAG CGCAGGCGCT GGGTGTTTCT ATCAACGACA 3780 TTAACACCAC TCTGGGCGCT GCATGGGGCG GCAGCTATGT GAACGACTTT ATCGACCGCG 3840 GTCGTGTGAA GAAAGTTTAT GTCATGTCAG AAGCGAAATA CCGTATGCTG CCGGATGATA 3900 TCGGCGACTG GTATGTTCGT GCTGCTGATG GTCAGATGGT GCCATTCTCG GCGTTCTCCT 3960 CTTCTCGTTG GGAGTACGGT TCGCCGCGTC TGGAACGTTA CAACGGCCTG CCATCCATGG 4020 AAATCTTAGG CCAGGCGGCA CCGGGTAAAA GTACCGGTGA AGCAATGGAG CTGATGGAAC 4080 AACTGGCGAG CAAACTGCCT ACCGGTGTTG GCTATGACTG GACGGGGATG TCCTATCAGG 4140 AACGTCTCTC CGGCAACCAG GCACCTTCAC TGTACGCGAT TTCGTTGATT GTCGTGTTCC 4200 TGTGTCTGGC GGCGCTGTAC GAGAGCTGGT CGATTCCGTT CTCCGTTATG CTGGTCGTTC 4260 CGCTGGGGGT TATCGGTGCG TTGCTGGCTG CCACCTTCCG TGGCCTGACC AATGACGTTT 4320 ACTTCCAGGT AGGCCTGCTC ACAACCATTG GGTTGTCGGC GAAGAACGCG ATCCTTATCG 4380 TCGAATTCGC CAAAGACTTG ATGGATAAAG AAGGTAAAGG TCTGATTGAA GCGACGCTTG 4440 ATGCGGTGCG GATGCGTTTA CGTCCGATCC TGATGACCTC GCTGGCGTTT ATCCTCGGCG 4500 TTATGCCGCT GGTTATCAGT ACTGGTGCTG GTTCCGGCGC GCAGAACGCA GTAGGTACCG 4560 GTGTAATGGG CGGGATGGTG ACCGCAACGG TACTGGCAAT CTTCTTCGTT CCGGTATTCT 4620 TTGTGGTGGT TCGCCGCCGC TTTAGCCGCA AGAATGAAGA TATCGAGCAC AGCCATACTG 4680 TCGATCATCA TTGATACAAC GTGTAATCAC TAAGGCCGCG TAAGCGGCCT TTTTTATGCA 4740 TAACCTACGA ACATTAAGGA GTAATTGAAC CACCAACTCA GGATCTCATA CGAAAACCAG 4800 TATTAACCAC GGATAAAATT CATAAAAAAT ACTGATTGTT AGTTAATTTA TATTAAGTAG 4860 CGCTAATAGA TTTAATAAT 4879

【００４７】配列番号：２ 配列の長さ：３９７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：ペプチド 配列 Met Asn Lys Asn Arg Gly Phe Thr Pro Leu Ala Val Val Leu Met Leu -24 -20 -15 -10 Ser Gly Ser Leu Ala Leu Thr Gly Cys Asp Asp Lys Gln Ala Gln Gln -5 +1 5 Gly Gly Gln Gln Met Pro Ala Val Gly Val Val Thr Val Lys Thr Glu 10 15 20 Pro Leu Gln Ile Thr Thr Glu Leu Pro Gly Arg Thr Ser Ala Tyr Arg 25 30 35 40 Ile Ala Glu Val Arg Pro Gln Val Ser Gly Ile Ile Leu Lys Arg Asn 45 50 55 Phe Lys Glu Gly Ser Asp Ile Glu Ala Gly Val Ser Leu Tyr Gln Ile 60 65 70 Asp Pro Ala Thr Tyr Gln Ala Thr Tyr Asp Ser Ala Lys Gly Asp Leu 75 80 85 Ala Lys Ala Gln Ala Ala Ala Asn Ile Ala Gln Leu Thr Val Asn Arg 90 95 100 Tyr Gln Lys Leu Leu Gly Thr Gln Tyr Ile Ser Lys Gln Glu Tyr Asp 105 110 115 120 Gln Ala Leu Ala Asp Ala Gln Gln Ala Asn Ala Ala Val Thr Ala Ala 125 130 135 Lys Ala Ala Val Glu Thr Ala Arg Ile Asn Leu Ala Tyr Thr Lys Val 140 145 150 Thr Ser Pro Ile Ser Gly Arg Ile Gly Lys Ser Asn Val Thr Glu Gly 155 160 165 Ala Leu Val Gln Asn Gly Gln Ala Thr Ala Leu Ala Thr Val Gln Gln 170 175 180 Leu Asp Pro Ile Tyr Val Asp Val Thr Gln Ser Ser Asn Asp Phe Leu 185 190 195 200 Arg Leu Lys Gln Glu Leu Ala Asn Gly Thr Leu Lys Gln Glu Asn Gly 205 210 215 Lys Ala Lys Val Ser Leu Ile Thr Ser Asp Gly Ile Lys Phe Pro Gln 220 225 230 Asp Gly Thr Leu Glu Phe Ser Asp Val Thr Val Asp Gln Thr Thr Gly 235 240 245 Ser Ile Thr Leu Arg Ala Ile Phe Pro Asn Pro Asp His Thr Leu Leu 250 255 260 Pro Gly Met Phe Val Arg Ala Arg Leu Glu Glu Gly Leu Asn Pro Asn 265 270 275 280 Ala Ile Leu Val Pro Gln Gln Gly Val Thr Arg Thr Pro Arg Gly Asp 285 290 295 Ala Thr Val Leu Val Val Gly Ala Asp Asp Lys Val Glu Thr Arg Pro 300 305 310 Ile Val Ala Ser Gln Ala Ile Gly Asp Lys Trp Leu Val Thr Glu Gly 315 320 325 Leu Lys Ala Gly Asp Arg Val Val Ile Ser Gly Leu Gln Lys Val Arg 330 335 340 Pro Gly Val Gln Val Lys Ala Gln Glu Val Thr Ala Asp Asn Asn Gln 345 350 355 360 Gln Ala Ala Ser Gly Ala Gln Pro Glu Gln Ser Lys Ser 365 370

【００４８】配列番号：３ 配列の長さ：１０４９ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：アミノ酸 配列 Met Pro Asn Phe Phe Ile Asp Arg Pro Ile Phe Ala Trp Val Ile Ala 1 5 10 15 Ile Ile Ile Met Leu Ala Gly Gly Leu Ala Ile Leu Lys Leu Pro Val 20 25 30 Ala Gln Tyr Pro Thr Ile Ala Pro Pro Ala Val Thr Ile Ser Ala Ser 35 40 45 Tyr Pro Gly Ala Asp Ala Lys Thr Val Gln Asp Thr Val Thr Gln Val 50 55 60 Ile Glu Gln Asn Met Asn Gly Ile Asp Asn Leu Met Tyr Met Ser Ser 65 70 75 80 Asn Ser Asp Ser Thr Gly Thr Val Gln Ile Thr Leu Thr Phe Glu Ser 85 90 95 Gly Thr Asp Ala Asp Ile Ala Gln Val Gln Val Gln Asn Lys Leu Gln 100 105 110 Leu Ala Met Pro Leu Leu Pro Gln Glu Val Gln Gln Gln Gly Val Ser 115 120 125 Val Glu Lys Ser Ser Ser Ser Phe Leu Met Val Val Gly Val Ile Asn 130 135 140 Thr Asp Gly Thr Met Thr Gln Glu Asp Ile Ser Asp Tyr Val Ala Ala 145 150 155 160 Asn Met Lys Asp Ala Ile Ser Arg Thr Ser Gly Val Gly Asp Val Gln 165 170 175 Leu Phe Gly Ser Gln Tyr Ala Met Arg Ile Trp Met Asn Pro Asn Glu 180 185 190 Leu Asn Lys Phe Gln Leu Thr Pro Val Asp Val Ile Thr Ala Ile Lys 195 200 205 Ala Gln Asn Ala Gln Val Ala Ala Gly Gln Leu Gly Gly Thr Pro Pro 210 215 220 Val Lys Gly Gln Gln Leu Asn Ala Ser Ile Ile Ala Gln Thr Arg Leu 225 230 235 240 Thr Ser Thr Glu Glu Phe Gly Lys Ile Leu Leu Lys Val Asn Gln Asp 245 250 255 Gly Ser Arg Val Leu Leu Arg Asp Val Ala Lys Ile Glu Leu Gly Gly 260 265 270 Glu Asn Tyr Asp Ile Ile Ala Glu Phe Asn Gly Gln Pro Ala Ser Gly 275 280 285 Leu Gly Ile Lys Leu Ala Thr Gly Ala Asn Ala Leu Asp Thr Ala Ala 290 295 300 Ala Ile Arg Ala Glu Leu Ala Lys Met Glu Pro Phe Phe Pro Ser Gly 305 310 315 320 Leu Lys Ile Val Tyr Pro Tyr Asp Thr Thr Pro Phe Val Lys Ile Ser 325 330 335 Ile His Glu Val Val Lys Thr Leu Val Glu Ala Ile Ile Leu Val Phe 340 345 350 Leu Val Met Tyr Leu Phe Leu Gln Asn Phe Arg Ala Thr Leu Ile Pro 355 360 365 Thr Ile Ala Val Pro Val Val Leu Leu Gly Thr Phe Ala Val Leu Ala 370 375 380 Ala Phe Gly Phe Ser Ile Asn Thr Leu Thr Met Phe Gly Met Val Leu 385 390 395 400 Ala Ile Gly Leu Leu Val Asp Asp Ala Ile Val Val Val Glu Asn Val 405 410 415 Glu Arg Val Met Ala Glu Glu Gly Leu Pro Pro Lys Glu Ala Thr Arg 420 425 430 Lys Ser Met Gly Gln Ile Gln Gly Ala Leu Val Gly Ile Ala Met Val 435 440 445 Leu Ser Ala Val Phe Val Pro Met Ala Phe Phe Gly Gly Ser Thr Gly 450 455 460 Ala Ile Tyr Arg Gln Phe Ser Ile Thr Ile Val Ser Ala Met Ala Leu 465 470 475 480 Ser Val Leu Val Ala Leu Ile Leu Thr Pro Ala Leu Cys Ala Thr Met 485 490 495 Leu Lys Pro Ile Ala Lys Gly Asp His Gly Glu Gly Lys Lys Gly Phe 500 505 510 Phe Gly Trp Phe Asn Arg Met Phe Glu Lys Ser Thr His His Tyr Thr 515 520 525 Asp Ser Val Gly Gly Ile Leu Arg Ser Thr Gly Arg Tyr Leu Val Leu 530 535 540 Tyr Leu Ile Ile Val Val Gly Met Ala Tyr Leu Phe Val Arg Leu Pro 545 550 555 560 Ser Ser Phe Leu Pro Asp Glu Asp Gln Gly Val Phe Met Thr Met Val 565 570 575 Gln Leu Pro Ala Gly Ala Thr Gln Glu Arg Thr Gln Lys Val Leu Asn 580 585 590 Glu Val Thr His Tyr Tyr Leu Thr Lys Glu Lys Asn Asn Val Glu Ser 595 600 605 Val Phe Ala Val Asn Gly Phe Gly Phe Ala Gly Arg Gly Gln Asn Thr 610 615 620 Gly Ile Ala Phe Val Ser Leu Lys Asp Trp Ala Asp Arg Pro Gly Glu 625 630 635 640 Glu Asn Lys Val Glu Ala Ile Thr Met Arg Ala Thr Arg Ala Phe Ser 645 650 655 Gln Ile Lys Asp Ala Met Val Phe Ala Phe Asn Leu Pro Ala Ile Val 660 665 670 Glu Leu Gly Thr Ala Thr Gly Phe Asp Phe Glu Leu Ile Asp Gln Ala 675 680 685 Gly Leu Gly His Glu Lys Leu Thr Gln Ala Arg Asn Gln Leu Leu Ala 690 695 700 Glu Ala Ala Lys His Pro Asp Met Leu Thr Ser Val Arg Pro Asn Gly 705 710 715 720 Leu Glu Asp Thr Pro Gln Phe Lys Ile Asp Ile Asp Gln Glu Lys Ala 725 730 735 Gln Ala Leu Gly Val Ser Ile Asn Asp Ile Asn Thr Thr Leu Gly Ala 740 745 750 Ala Trp Gly Gly Ser Tyr Val Asn Asp Phe Ile Asp Arg Gly Arg Val 755 760 765 Lys Lys Val Tyr Val Met Ser Glu Ala Lys Tyr Arg Met Leu Pro Asp 770 775 780 Asp Ile Gly Asp Trp Tyr Val Arg Ala Ala Asp Gly Gln Met Val Pro 785 790 795 800 Phe Ser Ala Phe Ser Ser Ser Arg Trp Glu Tyr Gly Ser Pro Arg Leu 805 810 815 Glu Arg Tyr Asn Gly Leu Pro Ser Met Glu Ile Leu Gly Gln Ala Ala 820 825 830 Pro Gly Lys Ser Thr Gly Glu Ala Met Glu Leu Met Glu Gln Leu Ala 835 840 845 Ser Lys Leu Pro Thr Gly Val Gly Tyr Asp Trp Thr Gly Met Ser Tyr 850 855 860 Gln Glu Arg Leu Ser Gly Asn Gln Ala Pro Ser Leu Tyr Ala Ile Ser 865 870 875 880 Leu Ile Val Val Phe Leu Cys Leu Ala Ala Leu Tyr Glu Ser Trp Ser 885 890 895 Ile Pro Phe Ser Val Met Leu Val Val Pro Leu Gly Val Ile Gly Ala 890 895 900 Leu Leu Ala Ala Thr Phe Arg Gly Leu Thr Asn Asp Val Tyr Phe Gln 905 910 915 Val Gly Leu Leu Thr Thr Ile Gly Leu Ser Ala Lys Asn Ala Ile Leu 920 925 930 Ile Val Glu Phe Ala Lys Asp Leu Met Asp Lys Glu Gly Lys Gly Leu 935 940 945 950 Ile Glu Ala Thr Leu Asp Ala Val Arg Met Arg Leu Arg Pro Ile Leu 955 960 965 Met Thr Ser Leu Ala Phe Ile Leu Gly Val Met Pro Leu Val Ile Ser 970 985 990 Thr Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gln Asn Ala Val Gly Thr Gly Val Met 995 1000 1005 Gly Gly Met Val Thr Ala Thr Val Leu Ala Ile Phe Phe Val Pro Val 1010 1015 1020 Phe Phe Val Val Val Arg Arg Arg Phe Ser Arg Lys Asn Glu Asp Ile 1025 1030 1035 1040 Glu His Ser His Thr Val Asp His His 1045

【００４９】配列番号：４ 配列の長さ：１５９３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置 ：３８．．１５０７ 特徴を決定した方法： 配列 GATCGCGCTA AATACTGCTT CACCACAAGG AATGCAAATG AAGAAATTGC TCCCCATTCT 60 TATCGGCCTG AGCCTTTCTG GGTTCAGTTC GTTGAGCCAG GCCGAGAACC TGATGCAAGT 120 TTATCAGCAA GCACGCCTTA GTAACCCGGA ATTGCGTAAG TCTGCCGCCG ATCGTGATGC 180 TGCCTTTGAA AAAATTAATG AAGCGCGCAG TCCATTACTG CCACAGCTAG GTTTAGGTGC 240 AGATTACACC TATAGCAACG GCTACCGCGA CGCGAACGGC ATCAACTCTA ACGCGACCAG 300 TGCGTCCTTG CAGTTAACTC AATCCATTTT TGATATGTCG AAATGGCGTG CGTTAACGCT 360 GCAGGAAAAA GCAGCAGGGA TTCAGGACGT CACGTATCAG ACCGATCAGC AAACCTTGAT 420 CCTCAACACC GCGACCGCTT ATTTCAACGT GTTGAATGCT ATTGACGTTC TTTCCTATAC 480 ACAGGCACAA AAAGAAGCGA TCTACCGTCA ATTAGATCAA ACCACCCAAC GTTTTAACGT 540 GGGCCTGGTA GCGATCACCG ACGTGCAGAA AGCCCGCGCA CAGTACGATA CCGTGCTGGC 600 GAACGAAGTG ACCGCACGTA ATAACCTTGA TAACGCGGTA GAGCACGTGC GCCAGATCAC 660 CGGTAACTAC TATCCGGGAA CTGCTGCGCT GAATGTCGAA AACTTTAAAA CCGACAAACC 720 ACAGCCGGTT AACGCGCTGC TGAAAGAAGC CGAAAAACGC AACCTGTCGC TGTTACAGGC 780 ACGCTTGAGC CAGGACCTGG CGCGCGAGAA ATTCGCCAGG CGCAGGATGG TCACTTACCG 840 ACTCTGGGAT TTAACGGCTT CTACGGGATT TCTGACACCT CTTATAGCGG TTCGAAAACC 900 CTGTGCCGCT GTCCCATATG ACGATAGCAA TATGGGCCAG AACAAAGTTG GCCTGAGCTT 960 CTCGCTGCCG ATTTATCAGG GCGGAATGGT TAACTCGCAG GTGACACAGG CACAGTACAA 1020 CTTTGTCGGT GCAGCGAGCA CCTGGAAAGT GCCCATCGTA GCGTCGTGCC AACGTGCGTT 1080 CTGCTTCAGC AACATTAATG CATCTATCAG TAGCATTAAC CGCTACACAC AAGCCGCAGT 1140 TTCCGCTCAA AGCTCATTAG ACGCGATGGA AGCGGGCTAC TCGGTCGGTA CGCGTACCAT 1200 TGTTGATGTG TTGGATGCGA CCACCAGTTG TACAGCCCAA GCAAGAGCTG GCAATCCGCG 1260 TTATAACTAC CTGATTAATC AGCTGAATAT TAAGTCAGCT CTGGGTACGT TGAACGAGCA 1320 GGATCTGCTG GCACTGAACA ATGCGCTGAG CAAACCGATT TCCACTAATC CGGAAAACGT 1380 TGCACCGCAA ACGCCGGAAC AGAATGCTAT TGCTGATGGT TATGCGCCTG ATAGCCCGGC 1440 ACCAGTCGTT CAGCAAACAT CCGCACGCAC TACCACCAGT AACGGTCATA ACCCTTTCCG 1500 TAACTGATGA CGACGACGGG GCTTCGGCCC CGTCTGAACG TAAGGCGCGT ACAGATACGG 1560 GTTATTCTGC CGCATTCCCC CCCTTCTCGC TTC 1593

【００５０】配列番号：５ 配列の長さ：４８９ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：ペプチド 配列 Met Lys Lys Leu Leu Pro Ile Leu Ile Gly Leu Ser Leu Ser Gly Phe 1 5 10 15 Ser Ser Leu Ser Gln Ala Glu Asn Leu Met Gln Val Tyr Gln Gln Ala 20 25 30 Arg Leu Ser Asn Pro Glu Leu Arg Lys Ser Ala Ala Asp Arg Asp Ala 35 40 45 Ala Phe Glu Lys Ile Asn Glu Ala Arg Ser Pro Leu Leu Pro Gln Leu 50 55 60 Gly Leu Gly Ala Asp Tyr Thr Tyr Ser Asn Gly Tyr Arg Asp Ala Asn 65 70 75 80 Gly Ile Asn Ser Asn Ala Thr Ser Ala Ser Leu Gln Leu Thr Gln Ser 85 90 95 Ile Phe Asp Met Ser Lys Trp Arg Ala Leu Thr Leu Gln Glu Lys Ala 100 105 110 Ala Gly Ile Gln Asp Val Thr Tyr Gln Thr Asp Gln Gln Thr Leu Ile 115 120 125 Leu Asn Thr Ala Thr Ala Tyr Phe Asn Val Leu Asn Ala Ile Asp Val 130 135 140 Leu Ser Tyr Thr Gln Ala Gln Lys Glu Ala Ile Tyr Arg Gln Leu Asp 145 150 155 160 Gln Thr Thr Gln Arg Phe Asn Val Gly Leu Val Ala Ile Thr Asp Val 165 170 175 Gln Lys Ala Arg Ala Gln Tyr Asp Thr Val Leu Ala Asn Glu Val Thr 180 185 190 Ala Arg Asn Asn Leu Asp Asn Ala Val Glu His Val Arg Gln Ile Thr 195 200 205 Gly Asn Tyr Tyr Pro Gly Thr Ala Ala Leu Asn Val Glu Asn Phe Lys 210 215 220 Thr Asp Lys Pro Gln Pro Val Asn Ala Leu Leu Lys Glu Ala Glu Lys 225 230 235 240 Arg Asn Leu Ser Leu Leu Gln Ala Arg Leu Ser Gln Asp Leu Ala Arg 245 250 255 Glu Lys Phe Ala Arg Arg Arg Met Val Thr Tyr Arg Leu Trp Asp Leu 260 265 270 Thr Ala Ser Thr Gly Phe Leu Thr Pro Leu Ile Ala Val Arg Lys Pro 275 280 285 Cys Ala Ala Val Pro Tyr Asp Asp Ser Asn Met Gly Gln Asn Lys Val 290 295 300 Gly Leu Ser Phe Ser Leu Pro Ile Tyr Gln Gly Gly Met Val Asn Ser 305 310 315 320 Gln Val Thr Gln Ala Gln Tyr Asn Phe Val Gly Ala Ala Ser Thr Trp 325 330 335 Lys Val Pro Ile Val Ala Ser Cys Gln Arg Ala Phe Cys Phe Ser Asn 340 345 350 Ile Asn Ala Ser Ile Ser Ser Ile Asn Arg Tyr Thr Gln Ala Ala Val 355 360 365 Ser Ala Gln Ser Ser Leu Asp Ala Met Glu Ala Gly Tyr Ser Val Gly 370 375 380 Thr Arg Thr Ile Val Asp Val Leu Asp Ala Thr Thr Ser Cys Thr Ala 385 390 395 400 Gln Ala Arg Ala Gly Asn Pro Arg Tyr Asn Tyr Leu Ile Asn Gln Leu 405 410 415 Asn Ile Lys Ser Ala Leu Gly Thr Leu Asn Glu Gln Asp Leu Leu Ala 420 425 430 Leu Asn Asn Ala Leu Ser Lys Pro Ile Ser Thr Asn Pro Glu Asn Val 435 440 445 Ala Pro Gln Thr Pro Glu Gln Asn Ala Ile Ala Asp Gly Tyr Ala Pro 450 455 460 Asp Ser Pro Ala Pro Val Val Gln Gln Thr Ser Ala Arg Thr Thr Thr 465 470 475 480 Ser Asn Gly His Asn Pro Phe Arg Asn 485

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】acrA、acrB、またはtolC遺伝子の少なくと
   も１つの遺伝子で大腸菌を形質転換する工程を含んでな
   る、有機溶媒耐性を有するまたはその有機溶媒耐性が増
   強された大腸菌の製造法。
2. 【請求項２】acrA遺伝子が、配列番号１の３１８番から
   １５２２番までの１２０５塩基対の配列を含んでなるも
   のである、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】acrB遺伝子が、配列番号１の１５３０番か
   ら４６９４番までの３１６５塩基対の配列を含んでなる
   ものである、請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】tolC遺伝子が、配列番号４に記載の１５９
   ３塩基対の配列を含んでなるものである、請求項１に記
   載の方法。
5. 【請求項５】acrA遺伝子が、配列番号２のアミノ酸配列
   またはその等価配列を有する蛋白質をコードするもので
   ある、請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】acrB遺伝子が、配列番号３のアミノ酸配列
   またはその等価配列を有する蛋白質をコードするもので
   ある、請求項１に記載の方法。
7. 【請求項７】tolC遺伝子が、配列番号５のアミノ酸配列
   またはその等価配列を有する蛋白質をコードするもので
   ある、請求項１に記載の方法。
8. 【請求項８】大腸菌に、log Powが5.5以下の有機溶媒耐
   性を付与する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方
   法。
9. 【請求項９】大腸菌に、log Powが3.5以下の有機溶媒耐
   性を付与する、請求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】請求項１〜９のいずれか一項に記載の方
    法によって製造された大腸菌。
11. 【請求項１１】acrA、acrB、またはtolC遺伝子の少なく
    とも１つの遺伝子が外来性の遺伝子として導入された、
    log Powが5.5以下の有機溶媒耐性を有する、有機溶媒耐
    性大腸菌。
12. 【請求項１２】その有機溶媒耐性がlog Powが3.5以下で
    ある、請求項１１に記載の有機溶媒耐性大腸菌。
13. 【請求項１３】反応有機溶媒が水に対する飽和溶解度以
    上存在する系中で、請求項１０〜１２のいずれか一項に
    記載の大腸菌によって有機溶媒可溶性物質の微生物変換
    を行う工程を含んでなる、方法。
14. 【請求項１４】有機溶媒可溶性物質の微生物変換を、溶
    媒重層発酵法により行う、請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】acrA、acrB、またはtolC遺伝子の少なく
    とも１つの遺伝子で大腸菌を形質転換する工程を含んで
    なる、大腸菌に有機溶媒耐性を付与し、または大腸菌の
    有機溶媒耐性を増強する方法。