KR102506042B1

KR102506042B1 - Csq-태그를 이용한 단백질의 발현 및 정제 방법

Info

Publication number: KR102506042B1
Application number: KR1020200039185A
Authority: KR
Inventors: 김성현; 방진호; 최미현
Original assignee: 한국세라믹기술원
Priority date: 2019-04-05
Filing date: 2020-03-31
Publication date: 2023-03-07
Also published as: KR20200117881A

Abstract

본 발명은 CSQ-태그 (calsequestrin-tag)를 이용한 단백질의 발현, 수용화 및 정제 방법에 관한 것으로, CSQ-태그 및 목적 단백질을 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 CSQ 태그를 이용한 목적 단백질의 발현 및 정제 방법을 제공하고자 한다. 본 발명은 의약품 및 화장품에 많이 사용되고 있는 단백질을 CSQ-태그를 이용하여 발현을 증가시키고 칼슘에 의해 쉽게 분리될 수 있도록 함으로써, 단백질 소재 및 의약품 단가를 낮출 수 있을 것으로 기대된다.

Description

CSQ-태그를 이용한 단백질의 발현 및 정제 방법{METHOD OF EXPRESSING AND PURIFYING PROTEIN USING CSQ-TAG}

본 발명은 CSQ-태그 (calsequestrin-tag)를 이용한 단백질의 발현, 수용화 그리고 정제 방법에 관한 것으로, CSQ-태그 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오디드 서열을 포함하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 세포, 및 CSQ 태그를 이용한 목적 단백질의 발현, 수용화 및 정제 방법을 제공하고자 한다. 본 발명은 의약품 및 화장품에 많이 사용되고 있는 단백질을 CSQ-태그를 이용하여 발현 및 수용화를 향상시키고 칼슘에 의해 쉽게 분리될 수 있도록 함으로써, 단백질 소재 및 의약품 단가를 낮출 수 있을 것으로 기대된다.

최근 유전공학 및 생물학의 발전으로 특정 단백질을 대량으로 생산 또는 수득하여 각종 산업 및 질병의 치료 등에 사용하고자 하는 시도가 많이 있다. 이에 따라, 원하는 단백질을 수득하기 위한 단백질 조합 기술, 대량 생산 기술 및 정제 기술 등이 중점적으로 개발되고 있다. 종종 사람들이 필요로 하는 목적 단백질은 이를 발현하는 벡터로 형질전환된 세포를 배양하여 원하는 단백질을 발현시켜 생산될 수 있다. 경우에 따라서 이러한 단백질은 진핵세포, 원핵세포 등에서 발현될 수 있으며, 특별한 경우에는 형질전환된 식물이나 형질전환된 동물에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 젖을 분비하는 형질전환된 동물에서 발현되어, 형질전환 동물의 젖을 통하여 목적 단백질을 수득하는 등의 방법 등이 시도되고 있다. 이 경우, 세포 배양물 또는 젖으로부터 원하는 단백질을 분리 정제할 수 있다.

별도의 분비를 통한 목적 단백질 수득 방법이 없는 동·식물이나 미생물에서 단백질을 발현시키는 경우에는 우선 저장기관이나 세포 내부로부터 단백질을 추출하는 과정이 필요하게 된다. 이러한 형질전환 세포로부터 목적 단백질을 수득하는 작업은 용이하지 않다. 이에 따라, 수득을 용이하기 위하여 목적 단백질을 천연형이 아닌 태그(tag)를 포함하는 형태로 재조합하는 방법이 많이 사용되고 있다. 정제를 위하여 태그(tag)를 이용하는 방법은 다양한 단백질 정제 기술 중 굉장히 높은 효율성을 나타내는 방법 중 하나로, 이때 사용되는 태그는 크게 펩타이드 태그와 단백질 태그로 나뉜다. 펩타이드 태그는 짧은 아미노산으로 이루어진 것으로 대표적으로는 히스 태그(his-tag, histidine-tag)이 있으며, 특히 헥사히스티딘 태그(hexahistidine tag, His6-tag)이 많이 사용된다. 히스티딘 펩타이드는 니켈과 특이적인 화학적 친화력을 가지고 있어, 해당 태그를 포함하는 융합 단백질은 니켈을 포함하는 컬럼에 의해 높은 순도로 정제될 수 있다. 단백질 태그는 특정 성분에 결합하는 단백질의 도메인이 가진 특징 등을 이용하기 위하여 해당 도메인 등을 포함하는 태그이다. 대표적으로는 GST-태그(Glutathione S-transferase-tag)가 있다. GST 태그는 GST의 기질인 글루타치온 고정 매개체로 하는 컬럼에 의해 높은 순도로 정제될 수 있다.

이에 본 발명자들은 목적 단백질의 수득을 용이하게 하기 위한 신규한 태그를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, CSQ(calsequestrin) 태그를 목적 단백질에 융합시키는 경우 목적 단백질이 용이하게 발현 및 수용화 그리고 정제될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

[선행문헌]

대한민국 공개특허 제10-2014-0026781호

본 발명의 목적은 CSQ-태그 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 및 상기 핵산을 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다. 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터의 모식도를 도 1에 나타내었다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CSQ 태그를 이용한 목적 단백질의 발현 및 정제 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 및 정제 방법의 일 예를 도 2에 나타내었다.

본 명세서에서 사용된 용어 "칼시퀘스트린(calsequestrin, CSQ)"은 근소포체(sarcoplasmic reticulum)의 칼슘-결합 단백질로서, 세포질보다 근소포체에서 칼슘의 농도가 더 높을 지라도 근육 수축 후에 칼슘과 결합하여 근소포체의 시스터나에 칼슘 이온을 저장할 수 있도록 한다. 하나의 칼시퀘스트린 분자가 여러 칼슘(예를 들면, 칼시퀘스트린 한 분자당 40-50개의 칼슘 결합 부위를 가짐)과 결합할 수 있기 때문에 칼슘 저장 능력이 매우 우수하다. 칼시퀘스트린은 칼슘이 적을때는 단량체로 존재하다가 칼슘의 양이 증가하면 다량체로 변해 크기가 커지는 성질을 가지고 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “목적 단백질”은 특정 목적에 의해서 높은 순도 또는 대량으로 수득할 필요가 있는 임의의 단백질을 말하며, 이에는 천연형 단백질, 변이체 단백질, 또는 신규 재조합 단백질 등이 제한 없이 포함된다. 목적 단백질은 산업적, 의료적, 학문적 이유 등으로 높은 순도로 또는 대량으로 수득이 요구되는 단백질일 수 있으며, 바람직하게는 의약용 또는 연구용 재조합 단백질일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 고분자 단백질, 당 단백질, 사이토카인, 성장인자, 혈액제제, 백신, 호르몬, 효소 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 더욱더 바람직하게는 목적 단백질은 항체의 경쇄 또는 중쇄의 전부 또는 일부분일 수 있으며, 가장 바람직하게는 항체의 경쇄 가변영역(VL) 또는 중쇄 가변영역(VH)일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "가수분해효소에 의한 분해 펩타이드 "는 CSQ 태그와 목적 단백질 사이에 포함할 수 있으며, 이는 가수분해효소에 의해 절단되어 CSQ 태그와 목적 단백질을 분리 할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "벡터"는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 핵산 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 핵산 작제물을 의미한다. 상기 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 포함하며, 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예를 들면, CMV, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "형질전환(transformation)"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 상기 형질전환 방법은 CaCl2 침전법, CaCl2 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아-매개 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어 "숙주세포"는 다른 미생물 또는 유전자를 기생시켜 영양을 공급하는 세포로, 벡터가 숙주세포에 형질전환됨으로써 숙주세포 내에서 다양한 유전적 또는 분자적 영향을 미치게 되는 세포를 의미한다. 본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예를 들면 E. coli Rosetta, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. 또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예를 들면, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.

제1구현예에 따르면,

본 발명은 CSQ 태그 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 융합 단백질에 있어서, 상기 CSQ 태그는 CSQ1 또는 CSQ2를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 융합 단백질에 있어서, 상기 CSQ1 및 CSQ2는 각각 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 아미노산으로 코딩되는 것을 특징으로 한다. 상기 서열번호 1의 아미노산은 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 암호화될 수 있고, 상기 서열번호 2의 아미노산은 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 암호화될 수 있다.

본 발명에 따른 융합 단백질에 있어서, 상기 CSQ 태그 및 목적 단백질은 서열번호 5 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 이루어진 가수분해효소에 의한 분해 펩타이드를 통해 융합된 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 융합 단백질에 있어서, 상기 목적 단백질은 고분자 단백질, 당 단백질, 사이토카인, 성장인자, 혈액제제, 백신, 호르몬, 효소 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 한다. 예를 들면, 상기 목적 단백질은 인터루킨-2(Interleukin-2), 혈액 인자 VII, 혈액 인자 VIII, 혈액 인자 IX, 면역글로불린, 호세라디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase, HRP), 사이토카인, α-인터페론, β-인터페론, γ-인터페론, 콜로니자극인자(GM-CSF), 인간 피브로넥튼 엑스트라 도메인 B(human fibronectin extra domain B, EBD), 뼈 형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF), 표피 성장 인자 (epidermal growth factor, EGF), 인슐린 성장 인자(insulinlike growth factor, IGF), 형질 전환 성장 인자(trans-forming growth factor-α and -β, TGF-α, -β), 뇌 유래 신경 영양 인자(brain-derived neutrophic factor, BDNF), 혈소판 유래 성장 인자(plateletderived growth factor, PDGF), 태반 성장 인자(placental growth factor, PlGF), 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF), 섬유아세포 성장 인자 (Fibroblast growth factor 1 and 2, FGF-1, -2), 케라틴세포 성장 인자(Keratinocyte growth factor, KGF), 글루카곤-유사 펩티드-1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1), 엑센딘, 소마토스타틴(somatostatin), LHRH(luteinizing hormone-releasing hormone), 아드레노코티코트로픽 호르몬(adrenocorticotropic hormone), 성장호르몬-방출 호르몬(growth hormone-releasing hormone), 옥시토신(oxytocin), 티모신 알파-1(thymosin alpha-1), 코티코트로핀-방출인자(corticotropin-releasing factor), 칼시토닌(calcitonin), 비발리루딘(bivalirudin), 바소프레신(vasopressin), 포스포리파제-활성화 단백질(PLAP), 인슐린, 종양 괴사 인자(TNF), 소낭-자극 호르몬, 갑상선-자극 호르몬, 항이뇨 호르몬, 색소성 호르몬, 부갑상선 호르몬, 황체분비호르몬, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(Calcitonin Gene Related Peptide, CGPR), 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리스로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드(growth hormone releasing peptide; GHPR), 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor; THF), 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데아미나제, 아데노신 데아미나제, 과산화물 디스뮤타제, 엔도톡시나제, 카탈라제, 키모트립신, 리파제, 우리카제, 아데노신 디포스파타제, 티로시나제, 빌리루빈 옥시다제, 글루코즈 옥시다제, 글루코다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, 및 글루코우로니다제로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 융합 단백질에 있어서, 상기 목적 단백질은 서열번호 9 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 코딩되는 것을 특징으로 한다.

제2구현예에 따르면,

본 발명은 CSQ 태그 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 및 상기 핵산을 포함하는 발현벡터를 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 핵산 또는 발현벡터에 있어서, 상기 CSQ 태그는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 이루어진 아미노산으로 코딩되는 것을 특징으로 한다. 상기 서열번호 1의 아미노산은 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 암호화될 수 있고, 상기 서열번호 2의 아미노산은 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 암호화될 수 있다. .

본 발명에 따른 핵산 또는 발현벡터에 있어서, 상기 CSQ 태그 및 목적 단백질은 서열번호 5 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 이루어진 가수분해효소에 의한 분해 펩타이드를 통해 융합된 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 핵산 또는 발현벡터에 있어서, 상기 목적 단백질은 고분자 단백질, 당 단백질, 사이토카인, 성장인자, 혈액제제, 백신, 호르몬, 효소 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 한다. 예를 들면, 상기 목적 단백질은 인터루킨-2(Interleukin-2), 혈액 인자 VII, 혈액 인자 VIII, 혈액 인자 IX, 면역글로불린, 호세라디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase, HRP), 사이토카인, α-인터페론, β-인터페론, γ-인터페론, 콜로니자극인자(GM-CSF), 인간 피브로넥튼 엑스트라 도메인 B(human fibronectin extra domain B, EBD), 뼈 형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF), 표피 성장 인자 (epidermal growth factor, EGF), 인슐린 성장 인자(insulinlike growth factor, IGF), 형질 전환 성장 인자(trans-forming growth factor-α and -β, TGF-α, -β), 뇌 유래 신경 영양 인자(brain-derived neutrophic factor, BDNF), 혈소판 유래 성장 인자(plateletderived growth factor, PDGF), 태반 성장 인자(placental growth factor, PlGF), 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF), 섬유아세포 성장 인자 (Fibroblast growth factor 1 and 2, FGF-1, -2), 케라틴세포 성장 인자(Keratinocyte growth factor, KGF), 글루카곤-유사 펩티드-1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1), 엑센딘, 소마토스타틴(somatostatin), LHRH(luteinizing hormone-releasing hormone), 아드레노코티코트로픽 호르몬(adrenocorticotropic hormone), 성장호르몬-방출 호르몬(growth hormone-releasing hormone), 옥시토신(oxytocin), 티모신 알파-1(thymosin alpha-1), 코티코트로핀-방출인자(corticotropin-releasing factor), 칼시토닌(calcitonin), 비발리루딘(bivalirudin), 바소프레신(vasopressin), 포스포리파제-활성화 단백질(PLAP), 인슐린, 종양 괴사 인자(TNF), 소낭-자극 호르몬, 갑상선-자극 호르몬, 항이뇨 호르몬, 색소성 호르몬, 부갑상선 호르몬, 황체분비호르몬, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(Calcitonin Gene Related Peptide, CGPR), 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리스로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드(growth hormone releasing peptide; GHPR), 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor; THF), 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데아미나제, 아데노신 데아미나제, 과산화물 디스뮤타제, 엔도톡시나제, 카탈라제, 키모트립신, 리파제, 우리카제, 아데노신 디포스파타제, 티로시나제, 빌리루빈 옥시다제, 글루코즈 옥시다제, 글루코다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, 및 글루코우로니다제로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 핵산 또는 발현벡터에 있어서, 상기 목적 단백질은 서열번호 9 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 코딩되는 것을 특징으로 한다.

제3구현예에 따르면,

본 발명은 CSQ 태그 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질 포함하는 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 형질전환된 세포에 있어서, 상기 CSQ 태그는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 이루어진 아미노산으로 코딩되는 것을 특징으로 한다. 상기 서열번호 1의 아미노산은 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 암호화될 수 있고, 상기 서열번호 2의 아미노산은 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 암호화될 수 있다.

본 발명에 따른 형질전환된 세포에 있어서, 상기 CSQ 태그 및 목적 단백질은 서열번호 5 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 이루어진 가수분해효소에 의한 분해 펩타이드를 통해 융합된 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 형질전환된 세포에 있어서, 상기 목적 단백질은 고분자 단백질, 당 단백질, 사이토카인, 성장인자, 혈액제제, 백신, 호르몬, 효소 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 한다. 예를 들면, 상기 목적 단백질은 인터루킨-2(Interleukin-2), 혈액 인자 VII, 혈액 인자 VIII, 혈액 인자 IX, 면역글로불린, 호세라디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase, HRP), 사이토카인, α-인터페론, β-인터페론, γ-인터페론, 콜로니자극인자(GM-CSF), 인간 피브로넥튼 엑스트라 도메인 B(human fibronectin extra domain B, EBD), 뼈 형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF), 표피 성장 인자 (epidermal growth factor, EGF), 인슐린 성장 인자(insulinlike growth factor, IGF), 형질 전환 성장 인자(trans-forming growth factor-α and -β, TGF-α, -β), 뇌 유래 신경 영양 인자(brain-derived neutrophic factor, BDNF), 혈소판 유래 성장 인자(plateletderived growth factor, PDGF), 태반 성장 인자(placental growth factor, PlGF), 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF), 섬유아세포 성장 인자 (Fibroblast growth factor 1 and 2, FGF-1, -2), 케라틴세포 성장 인자(Keratinocyte growth factor, KGF), 글루카곤-유사 펩티드-1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1), 엑센딘, 소마토스타틴(somatostatin), LHRH(luteinizing hormone-releasing hormone), 아드레노코티코트로픽 호르몬(adrenocorticotropic hormone), 성장호르몬-방출 호르몬(growth hormone-releasing hormone), 옥시토신(oxytocin), 티모신 알파-1(thymosin alpha-1), 코티코트로핀-방출인자(corticotropin-releasing factor), 칼시토닌(calcitonin), 비발리루딘(bivalirudin), 바소프레신(vasopressin), 포스포리파제-활성화 단백질(PLAP), 인슐린, 종양 괴사 인자(TNF), 소낭-자극 호르몬, 갑상선-자극 호르몬, 항이뇨 호르몬, 색소성 호르몬, 부갑상선 호르몬, 황체분비호르몬, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(Calcitonin Gene Related Peptide, CGPR), 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리스로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드(growth hormone releasing peptide; GHPR), 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor; THF), 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데아미나제, 아데노신 데아미나제, 과산화물 디스뮤타제, 엔도톡시나제, 카탈라제, 키모트립신, 리파제, 우리카제, 아데노신 디포스파타제, 티로시나제, 빌리루빈 옥시다제, 글루코즈 옥시다제, 글루코다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, 및 글루코우로니다제로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 형질전환된 세포에 있어서, 상기 목적 단백질은 서열번호 9 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 코딩되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 형질전환된 세포에 있어서, 상기 세포는 에스체리치아 콜리, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스, 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스, 슈도모나스 종, 효모, 곤충세포, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN, MDCK 세포주, 또는 식물세포인 것을 특징으로 한다.

제4구현예에 따르면,

본 발명은 CSQ 태그를 이용한 목적 단백질의 발현 및 정제 방법을 제공하고자 하는 것으로, 상기 방법은:

A) CSQ 태그 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;

B) 상기 발현 벡터를 숙주세포에 형질도입하여 형질전환체를 얻는 단계;

C) 상기 형질전환체로부터 CSQ 태그 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 발현시키는 단계;

D) 칼슘을 이용하여 상기 발현된 형질전환체로부터 CSQ 태그 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질를 침전시키는 단계; 및

E) 가수분해효소를 이용하여 융합 단백질로터 목적 단백질을 분리하는 단계를 포함한다.

본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 및 정제 방법에 있어서, 상기 CSQ 태그는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 이루어진 아미노산으로 코딩되는 것을 특징으로 한다. 상기 서열번호 1의 아미노산은 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 암호화될 수 있고, 상기 서열번호 2의 아미노산은 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 암호화될 수 있다.

본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 및 정제 방법에 있어서, 상기 CSQ 태그 및 목적 단백질은 서열번호 5 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 이루어진 가수분해효소에 의한 분해 펩타이드를 통해 융합된 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 및 정제 방법에 있어서, 상기 목적 단백질은 고분자 단백질, 당 단백질, 사이토카인, 성장인자, 혈액제제, 백신, 호르몬, 효소 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 한다. 예를 들면, 상기 목적 단백질은 인터루킨-2(Interleukin-2), 혈액 인자 VII, 혈액 인자 VIII, 혈액 인자 IX, 면역글로불린, 호세라디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase, HRP), 사이토카인, α-인터페론, β-인터페론, γ-인터페론, 콜로니자극인자(GM-CSF), 인간 피브로넥튼 엑스트라 도메인 B(human fibronectin extra domain B, EBD), 뼈 형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF), 표피 성장 인자 (epidermal growth factor, EGF), 인슐린 성장 인자(insulinlike growth factor, IGF), 형질 전환 성장 인자(trans-forming growth factor-α and -β, TGF-α, -β), 뇌 유래 신경 영양 인자(brain-derived neutrophic factor, BDNF), 혈소판 유래 성장 인자(plateletderived growth factor, PDGF), 태반 성장 인자(placental growth factor, PlGF), 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF), 섬유아세포 성장 인자 (Fibroblast growth factor 1 and 2, FGF-1, -2), 케라틴세포 성장 인자(Keratinocyte growth factor, KGF), 글루카곤-유사 펩티드-1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1), 엑센딘, 소마토스타틴(somatostatin), LHRH(luteinizing hormone-releasing hormone), 아드레노코티코트로픽 호르몬(adrenocorticotropic hormone), 성장호르몬-방출 호르몬(growth hormone-releasing hormone), 옥시토신(oxytocin), 티모신 알파-1(thymosin alpha-1), 코티코트로핀-방출인자(corticotropin-releasing factor), 칼시토닌(calcitonin), 비발리루딘(bivalirudin), 바소프레신(vasopressin), 포스포리파제-활성화 단백질(PLAP), 인슐린, 종양 괴사 인자(TNF), 소낭-자극 호르몬, 갑상선-자극 호르몬, 항이뇨 호르몬, 색소성 호르몬, 부갑상선 호르몬, 황체분비호르몬, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(Calcitonin Gene Related Peptide, CGPR), 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리스로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드(growth hormone releasing peptide; GHPR), 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor; THF), 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데아미나제, 아데노신 데아미나제, 과산화물 디스뮤타제, 엔도톡시나제, 카탈라제, 키모트립신, 리파제, 우리카제, 아데노신 디포스파타제, 티로시나제, 빌리루빈 옥시다제, 글루코즈 옥시다제, 글루코다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, 및 글루코우로니다제로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 및 정제 방법에 있어서, 상기 목적 단백질은 서열번호 9 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 코딩되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 CSQ 태그를 이용한 목적 단백질의 발현, 수용화 및 정제 방법에 따르면, CSQ의 고발현 및 높은 수용성으로 인해 잘 발현이 안되거나 응집이 잘 되는 단백질을 수용액 상태에서 발현이 가능하며 칼슘에 의해 침전을 하여 무컬럼으로 쉽게 분리하여 정제할 수 있어서 단백질 소재 및 의약품 단가를 낮출 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터의 모식도를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 및 정제 방법의 모식도를 나타낸다.
도 3은 실시예 1에 따라 CSQ1TEV 또는 CSQ1Thrombin 벡터에 EDB 목적단백질 유전자를 Cloning한 결과를 나타낸다.
도 4는 실시예 1에 따라 CSQ1TEV-EDB, CSQ1Thrombin-EDB 단백질의 정제 결과와 기존 상용화 되어 있는 태그인 His tag와 GST 융합단백질로 EDB를 정제한 결과를 비교한 것을 나타낸다. EDB14 단백질의 경우 His-tag이나 GST-tag을 이용해서 발현은 되지만 목적 단백질이 상층액(Supernatant)에 있지 않고 대부분 침전물(Pellet)로 응집되어 불용화되나, CSQ-tag를 이용한 EDB14, 21, 26 단백질의 경우 침전물로 일부가 응집 되지만 약 30~50% 이상 수용성 단백질로 상층액(S)에 존재해 목적 단백질이 용출 가능함이 확인되었다.
도 5은 실시예 1에 따라 CSQ1TEV-EDB 단백질을 TEV protease로 잘라낸 결과를 나타낸다. TEV protease로 CSQ-tag과 EDB 단백질을 분리 후에 칼슘처리 하여 분리된 CSQ-tag을 침전시켜 제거하여 목적단백질인 EDB를 쉽게 분리 할 수 있음이 확인되었다.
도 6은 실시예 2에 따라 CSQ1TEV와 CSQ1Thrombin 벡터에 EGF 목적단백질 유전자를 Cloning한 결과를 나타낸다.
도 7는 실시예 2에 따라 CSQ1Thrombin-EGF, CSQ1TEV-EGF 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다. 본래 박테리아에서 발현한 EGF 자체는 응집되어 100% 모두 침전물 (pellet)에 존재한다고 알려져 있는데, CSQ 태그를 이용하면 30~40%는 수용화될 수 있음을 나타낸다.
도 8은 실시예 2에 따라 CSQ1Thrombin-EGF 단백질을 Thrombin protease로 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 9는 실시예 3에 따라 CSQ1TEV-KGF1 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 10은 실시예 3에 따라 CSQ1TEV-KGF1 단백질을 TEV protease로 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 11은 실시예 3에 따라 CSQ1TEV-VEGF 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 12는 실시예 3에 따라 CSQ1TEV-VEGF 단백질을 TEV protease로 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 13은 실시예 3에 따라 CSQ1TEV-FGF2 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 14는 실시예 3에 따라 CSQ1TEV-FGF2 단백질을 TEV protease로 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 15는 실시예 4에 따라 TEVCSQ1 또는 ThrombinCSQ1 벡터에 BMP2 및 TGFβ 목적단백질 유전자를 Cloning한 결과를 나타낸다.
도 16은 실시예 4에 따라 BMP2-TEVCSQ1, BMP2-ThrombinCSQ1 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 17은 실시예 4에 따라 BMP2-TEVCSQ1 또는 BMP2-ThrombinCSQ1 단백질을 TEV protease 또는 Thrombin protease로 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 18은 실시예 4에 따라 TGFβ-TEVCSQ1, TGFβ-ThrombinCSQ1 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 19는 실시예 4에 따라 TGFβ-TEVCSQ1 또는 TGFβ-ThrombinCSQ1 단백질을 TEV protease 또는 Thrombin protease로 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 20은 실시예 4에 따라 HRP-TEVCSQ1 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 21은 실시예 4에 따라 HRP-TEVCSQ1 단백질을 TEV protease로 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 22는 실시예 4에 따라 GLP1-TEVCSQ1 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 23은 실시예 4에 따라 GLP1-TEVCSQ1단백질을 TEV protease로 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 24는 실시예 5에 따라 CSQ2TEV 또는 CSQ2Thrombin 벡터에 BMP2 및 KGF1 목적단백질 유전자를 Cloning한 결과를 나타낸다.
도 25는 실시예 5에 따라 CSQ2TEV-BMP2와 CSQ2Thrombin-BMP2 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 26은 실시예 5에 따라 CSQ2TEV-BMP2 또는 CSQ2Thrombin-BMP2 단백질을 TEV protease 또는 Thrombin protease로 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 27은 실시예 5에 따라 CSQ2TEV-KGF1, CSQ2Thrombin-KGF1 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 28은 실시예 5에 따라 CSQ2TEV-KGF1 또는 CSQ2Thrombin-KGF1 단백질을 TEV protease 또는 Thrombin protease로 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 29는 실시예 6에 따라 HRP-TEVCSQ2, HRP-ThrombinCSQ2 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 30은 실시예 6에 따라 HRP-TEVCSQ2 단백질을 TEV protease로 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 31은 실시예 6에 따라 GLP1-TEVCSQ2 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 32는 실시예 6에 따라 GLP1-TEVCSQ2 단백질을 TEV protease로 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 33은 실시예 7에 따라 CSQ1-Ssp Dna-EGF 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 34는 실시예 7에 따라 CSQ1-Ssp Dna-EGF 단백질을 Dithiothreitol(DTT)로 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 35는 실시예 7에 따라 CSQ2-Ssp Dna-KGF1 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 36은 실시예 7에 따라 CSQ2-Ssp Dna-KGF1 단백질을 Dithiothreitol(DTT)로 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 37은 실시예 8에 따라 EGF-GyrA-CSQ1 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 38은 실시예 8에 따라 EGF-GyrA-CSQ1 단백질을 20mM Na-HEPES (pH 6.5) 버퍼를 이용하여 잘라낸 결과를 나타낸다.
도 39는 실시예 8에 따라 BMP2-GyrA-CSQ2 단백질이 정제 된 결과를 나타낸다.
도 40은 실시예 8에 따라 20mM Na-HEPES (pH 6.5) 버퍼를 이용하여 잘라낸 결과를 나타낸다.

이하, 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시예를 제시한다. 하기 실시예는 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

실시예 1: CSQ-태그를 이용한 EDB의 분리

1-1. CSQ1TEV 또는 CSQ1Thrombin Vector에 EDB Cloning

CSQ1TEV 또는 CSQ1Thrombin vector에 EDB를 cloning하기 위해서, 하기의 올리고뉴클레오티드 EDB-F1 및 EDB-B1 를 합성하였다 (Bioneer, Daejeon, Korea). 한편, 비교예로서 공지 His tag 또는 GST tag와 EDB의 융합 단백질을 제조하였다.

5'-AATGGATCCGAGGTGCCCCAACTCACTGAC-3' (서열번호 20)

5'-ATTCTCGAGTTACGTTTGTTGTGTCAGTGTAGTAGG-3’ (서열번호 21)

증폭하기 위해서 EDB-F1 20pmol, EDB-B1 20pmol, PCR PreMix 4㎕ (Elpisbio, Daejeon, Korea) 및 Template 10ug를 혼합하여 총 20㎕가 되도록 증류수를 첨가한 혼합액을 만들었다. 이 혼합액을 PCR 반응(95℃에서 5분, 30 회: 95℃에서 30초, 42℃에서 30초, 72℃에서 45초 및 72℃에서 5분)을 하여 증폭 후, 정제하여 (PCR 정제 키트, GeneAll, Seoul, Korea), EDB14(서열번호 9), EDB21(서열번호 10), EDB26(서열번호 11) 유전자를 얻었다. EDB유전자를 CSQ1TEV 또는 CSQ1Thrombin 벡터에 삽입하기 위해서 CSQ1TEV 또는 CSQ1Thrombin 벡터와 인서트 DNA를 제한효소를 처리하였다. 약 1㎍의 인서트 DNA를 BamHI(New England Biolabs (NEB, Ipswich)및 XhoI (NEB, Ipswich)으로 하루 동안 반응시킨 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제 DNA를 얻었다. 또한, 약 40㎍의 CSQ1TEV 또는 CSQ1Thrombin 벡터에 CIAP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase) (NEB, Ipswich)를 넣고 3시간 동안 반응시킨 후, PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. T4 DNA 리가아제 (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 인서트 DNA를 CSQTEV 또는 CSQ1Thrombin 벡터와 상온에서 3시간 동안 연결하였다 (도 3).

그 다음, CSQ1TEV 또는 CSQ1Thrombin 벡터와 EDB 인서트를 연결 반응 시킨 DNA를 transformaion 하였다. 컴피턴트 세포인 DH5a를 얼음 위에서 녹이고, 100㎕의 컴피턴트 세포에 연결 반응 시킨 용액 2㎕와 혼합한 후, 30분 동안 반응 시켰다. 그리고 42℃에서 1분간 heat shock을 하고 SOC media를 200㎕ 넣어준 뒤 37℃에서 30분 동안 배양하여 도말하였다. 도말하여 나온 콜로니를 무작위로 6개 찍어 PCR하였고, DNA 전기영동하여 Insert를 확인 하였다. cloning이 된 콜로니를 바이오니아에 시퀀싱 의뢰하여 확인하였다.

비교예로서 His tag 또는 GST tag와 EDB의 융합 단백질은 바이오니아에서 제공하는 pBT7-N-His와 pBT7-N-GST vector에 위와 같은 방법으로 클로닝하였다.

1-2. CSQ1TEV-EDB, CSQ1Thrombin-EDB, His-EDB, GST-EDB 정제

바이오니아에서 시퀀스가 확인 된 DNA 모두를 BL21 세포에 형질 전환한 후 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 5㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 글리세롤과 1:1 비율로 혼합하여 stock 1㎖을 만들어 -80℃ deepfreezer에 보관하였다. 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 20㎖의 LB 배지에 stock 100㎕를 접종하여 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 400㎖의 LB 배지에 옮겨 OD=0.7까지 배양하였다. 이후 1mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣어주어 18℃에서 200rpm의 속도로 하루 동안 배양하였다. 4℃에서 4000rpm로 20분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼(20mM Tris(pH 8.0), 300mM NaCl 및 10mM imidazole)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 꺼내어 완전히 녹인 후, PMSF(Phenyl methane sulfonyl fluoride) 10mg을 DMSO 1㎖에 녹인 후 용해된 E. coli에 1㎖ 넣었다. 소니케이터를 이용하여 E. coli를 용해시킨 후에 4℃에서 13,000rpm의 속도로 1시간 동안 원심 분리했다. 상층액에 CaCl₂ 20mM을 넣고 4℃에서 1시간 반응하였다. 그 다음 5000rpm의 속도로 30분 동안 원심 분리 하였다. 상층액을 제거하고 침전물에 EDTA를 넣고 현탁하여 CSQ1TEV-EDB 와 CSQ1Thrombin-EDB 단백질을 얻었다 (도 4).

His-EDB는 다음과 같은 방법으로 발현 정제하였다. pBT7-N-His vector에 EDB14를 클로닝한 것을 BL21 세포에 형질 전환한 후 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 5㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 220rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 글리세롤과 1:1 비율로 혼합하여 stock 1㎖을 만들어 -80℃ deepfreezer에 보관하였다. 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 20㎖의 LB 배지에 stock 100㎕를 접종하여 37℃에서 220rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 400㎖의 LB 배지에 옮겨 OD=0.7까지 배양하였다. 이후 1mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣어주어 37℃에서 220rpm의 속도로 하루 동안 배양하였다. 4℃에서 4000xg로 10분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼(50mM sodium phosphate(pH 8.0), 300mM NaCl 및 10mM imidazole)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 꺼내어 완전히 녹인 후, PMSF(Phenyl methane sulfonyl fluoride) 10mg을 Isopropanol 1㎖에 녹인 후 용해된 E. coli에 1㎖ 넣었다.

소니케이터를 이용하여 E. coli를 용해시킨 후에 4℃에서 13,000rpm의 속도로 1시간 동안 원심 분리했다. 증류수와 라이시스 버퍼로 Ni-NTA 친화성 레진(Elposbio, Daejeon, Korea)을 세척한 후 상층액을 레진에 결합시켰다. Washing buffer(50mM sodium phosphate(pH 8.0), 300mM NaCl 및 20mM imidazole) 600㎖로 washing 후 일루션 버퍼(50mM sodium phosphate(pH 8.0), 300mM NaCl 및 250mM imidazole)을 이용하여 N-말단 His-tag EDB14 단백질을 용출시켜 획득하였다. (도 4).

GST-EDB는 다음과 같은 방법으로 발현 정제하였다. pBT7-N-GST vector에 EDB14를 클로닝한 것을 BL21 세포에 형질 전환한 후 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 5㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 220rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 글리세롤과 1:1 비율로 혼합하여 stock 1㎖을 만들어 -80℃ deepfreezer에 보관하였다. 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 20㎖의 LB 배지에 stock 100㎕를 접종하여 37℃에서 220rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 400㎖의 LB 배지에 옮겨 OD=0.7까지 배양하였다. 이후 1mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣어주어 37℃에서 220rpm의 속도로 하루 동안 배양하였다. 4℃에서 4000xg로 10분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼(50mM Tris(pH 7.5), 150mM NaCl 및 0.05% NP-40)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 꺼내어 완전히 녹인 후, PMSF(Phenyl methane sulfonyl fluoride) 10mg을 Isopropanol 1㎖에 녹인 후 용해된 E. coli에 1㎖ 넣었다.

소니케이터를 이용하여 E. coli를 용해시킨 후에 4℃에서 13,000rpm의 속도로 1시간 동안 원심 분리했다. 증류수와 라이시스 버퍼로 GST·Bind Agarose Resin(Elposbio, Daejeon, Korea)을 세척한 후 상층액을 레진에 결합시켰다. Washing buffer(50mM Tris-Cl(pH 8.0), 150mM NaCl 및 0.1mM EDTA) 600㎖로 washing 후 일루션 버퍼(50mM Tris-Cl(pH 8.0), 150mM NaCl, 0.1mM EDTA 및 10mM Reduced(Free) glutathione)을 이용하여 N-말단 GST-tag EDB14 단백질을 용출시켜 획득하였다. (도 4).

그 결과, EDB14 단백질의 경우 His-tag이나 GST-tag을 이용해서는 상등액(supernatant)으로 발현이 안되나 CSQ-tag을 이용하는 경우 수용화되어 상등액으로 발현 가능하다는 것이 확인되었다.

1-3. TEV protease를 이용한 EDB 분리

CSQ1TEV-EDB 단백질에서 EDB만 분리하기 위해서 TEV protease(Genscript. USA) 5㎕를 첨가하여 30℃에서 하루 동안 반응시킨 후 SDS-PAGE로 확인하였다 (도 5). 그 결과, CSQ-tag 및 EDB 융합 단백질은 칼슘에 의해 침전된 후, TEV protease를 이용하여 쉽게 분리될 수 있음이 확인되었다.

실시예 2: CSQ-태그를 이용한 EGF의 분리

2-1. CSQ1TEV와 CSQ1Thrombin Vector에 EGF Cloning

CSQ1TEV와 CSQ1Thrombin vector에 EGF를 cloning하기 위해서, 하기의 두 개의 올리고뉴클레오티드 EGF-F1 및 EGF-B1를 합성하였다 (Bioneer, Daejeon, Korea).

5'-AATGGATCCAACTCTGATAGCGAATGCCCG-3' (서열번호 22)

5'-ATTCTCGAGTTA ACGCAGTTCCCACCATTT-3' (서열번호 23)

증폭하기 위해서 EGF-F1 20pmol, EGF-B1 20pmol, PCR PreMix 4㎕ (Elpisbio, Daejeon, Korea) 및 Template 10ug를 혼합하여 총 20㎕가 되도록 증류수를 첨가한 혼합액을 만들었다. 이 혼합액을 PCR 반응(95℃에서 5분, 30 회: 95℃에서 30초, 42℃에서 30초, 72℃에서 45초 및 72℃에서 5분)을 하여 증폭 후, 정제하여 (PCR 정제 키트, GeneAll, Seoul, Korea), EGF 유전자 (서열번호 12)를 얻었다. EGF유전자를 CSQ1TEV와 CSQ1Thrombin 벡터에 삽입하기 위해서 벡터와 인서트 DNA를 제한효소를 처리하였다. 약 1㎍의 인서트 DNA를 BamHI(New England Biolabs (NEB, Ipswich)및 XhoI (NEB, Ipswich)으로 하루 동안 반응시킨 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제 DNA를 얻었다. 또한, 약 40㎍의 CSQ1TEV와 CSQ1Thrombin 벡터에 CIAP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase) (NEB, Ipswich)를 넣고 3시간 동안 반응시킨 후, PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. T4 DNA 리가아제 (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 인서트 DNA를 벡터와 상온에서 3시간 동안 연결하였다 (도 6).

그 다음, CSQ1TEV 또는 CSQ1Thrombin 벡터와 EGF 인서트를 연결 반응 시킨 DNA를 transformaion 하였다. 컴피턴트 세포인 DH5a를 얼음 위에서 녹이고, 100㎕의 컴피턴트 세포에 연결 반응 시킨 용액 2㎕와 혼합한 후, 30분 동안 반응 시켰다. 그리고 42℃에서 1분간 heat shock을 하고 SOC media를 200㎕ 넣어준 뒤 37℃에서 30분 동안 배양하여 도말하였다. 도말하여 나온 콜로니를 무작위로 6개 찍어 PCR하였고, DNA 전기영동하여 Insert를 확인 하였다. cloning이 된 콜로니를 바이오니아에 시퀀싱 의뢰하여 확인하였다.

2-2. CSQ1Thrombin-EGF 또는 CSQ1TEV-EGF 정제

바이오니아에서 시퀀스가 확인 된 DNA를 BL21 세포에 형질 전환한 후 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 5㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 글리세롤과 1:1 비율로 혼합하여 stock 1㎖을 만들어 -80℃ deepfreezer에 보관하였다. 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 20㎖의 LB 배지에 stock 100㎕를 접종하여 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 400㎖의 LB 배지에 옮겨 OD=0.7까지 배양하였다. 이후 1mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣어주어 18℃에서 200rpm의 속도로 하루 동안 배양하였다. 4℃에서 4000rpm로 20분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼(20mM Tris(pH 8.0), 300mM NaCl 및 10mM imidazole)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 꺼내어 완전히 녹인 후, PMSF(Phenyl methane sulfonyl fluoride) 10mg을 DMSO 1㎖에 녹인 후 용해된 E. coli에 1㎖ 넣었다. 소니케이터를 이용하여 E. coli를 용해시킨 후에 4℃에서 13,000rpm의 속도로 1시간 동안 원심 분리했다. 상층액에 CaCl₂20mM을 넣고 4℃에서 1시간 반응하였다. 그 다음 5000rpm의 속도로 30분 동안 원심 분리 하였다. 상층액을 제거하고 침전물에 EDTA를 넣고 현탁하여 CSQ1Thrombin-EGF와 CSQ1TEV-EGF 단백질을 얻었다 (도 7).

2-3. Thrombin protease를 이용한 EGF 분리

CSQ1Thrombin-EGF 단백질에서 EGF만 분리하기 위해서 Thrombin protease 5㎕를 첨가하여 22℃에서 하루 동안 반응시킨 후 SDS-PAGE로 확인하였다 (도 8). 그 결과, CSQ-tag 및 EDB 융합 단백질은 Thrombin protease를 이용하여 쉽게 분리될 수 있음이 확인되었다.

실시예 3. CSQ-태그를 이용한 KGF1, VEGF 및 FGF2의 분리

3-1. CSQ1TEV-KGF1, CSQ1TEV-VEGF 및 CSQ1TEV-FGF2 정제

KGF1(서열번호 13), VEGF(서열번호 14) 및 FGF2(서열번호 15)의 유전자를 바이오니아에서 합성한 후에 CSQ1TEV에 클로닝 한 후에 BL21 세포에 형질 전환한 후 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 5㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 글리세롤과 1:1 비율로 혼합하여 stock 1㎖을 만들어 -80℃ deepfreezer에 보관하였다. 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 30㎖의 LB 배지에 stock 100㎕를 접종하여 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 1L의 LB 배지에 옮겨 OD=0.6까지 배양하였다. 이후 1mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣어주어 17℃에서 200rpm의 속도로 하루 동안 배양하였다. 4℃에서 4000rpm로 20분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼(20mM Tris(pH 8.0), 300mM NaCl 및 10mM imidazole)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 꺼내어 완전히 녹인 후, PMSF(Phenyl methane sulfonyl fluoride) 10mg을 DMSO 1㎖에 녹인 후 용해된 E. coli에 1㎖ 넣었다. 소니케이터를 이용하여 E. coli를 용해시킨 후에 4℃에서 13,000rpm의 속도로 1시간 동안 원심 분리했다. 상층액에 CaCl₂ 20mM을 넣고 4℃에서 1시간 반응하였다. 그 다음 5000rpm의 속도로 30분 동안 원심 분리 하였다. 상층액을 제거하고 침전물에 EDTA를 넣고 현탁하여 CSQ1TEV-KGF1 와 CSQ1TEV-VEGF 및 CSQ1TEV-FGF2 단백질을 얻었다 (도 9, 도 11, 도 13).

3-2. TEV protease를 이용한 KGF1, VEGF 및 FGF2 분리

CSQ1TEV-KGF1 단백질(이하 CSQ1TEV-VEGF 및 CSQ1TEV-FGF 단백질의 경우에도 CSQ1TEV-KGF1과 동일한 실험을 수행함)에서 KGF1만 분리하기 위해서 TEV protease(Genscript. USA) 5㎕를 첨가하여 30℃에서 하루 동안 반응시킨 후 SDS-PAGE로 확인하였다 (도 10, 도 12, 도 14). 그 결과, CSQ-tag 및 KGF1 융합 단백질, CSQ-tag 및 VEGF 단백질, 및 CSQ-tag 및 FGF 단백질은 모두 TEV protease를 이용하여 쉽게 분리될 수 있음이 확인되었다.

실시예 4. CSQ-태그를 이용한 BMP2, TGFβ, HRP 및 GLP1의 분리

4-1. TEVCSQ1 또는 ThrombinCSQ1 Vector에 BMP2 및 TGFβ Cloning

TEVCSQ1 또는 ThrombinCSQ1 vector에 BMP2 및 TGFβ를 cloning하기 위해서, 하기의 올리고뉴클레오티드 Amplify-F1 및 Amplify-B1 를 합성하였다 (Bioneer, Daejeon, Korea).

5'-CAGCAAGACAGCGATGGATCC-3' (서열번호 24)

5'-CGACTTACAGGTGATCTCGAG-3’ (서열번호 25)

증폭하기 위해서 Amplify-F1 20pmol, Amplify-B1 20pmol, PCR PreMix (Bioneer, Daejeon, Korea) 및 Temp late 10ug를 혼합하여 총 20㎕가 되도록 증류수를 첨가한 혼합액을 만들었다. 이 혼합액을 PCR 반응(95℃에서 5분, 30 회: 95℃에서 30초, 47℃에서 30초, 72℃에서 45초 및 72℃에서 5분)을 하여 증폭 후, 정제하여 (PCR 정제 키트, GeneAll, Seoul, Korea), BMP2(서열번호 16) 및 TGFβ(서열번호 17) 유전자를 얻었다. BMP2유전자 (이하 TGFβ 유전자의 경우에도 BMP2와 동일한 실험을 수행함)를 TEVCSQ1 또는 ThrombinCSQ1 벡터에 삽입하기 위해서 TEVCSQ1 또는 ThrombinCSQ1 벡터와 인서트 DNA를 제한효소를 처리하였다. 약 1㎍의 인서트 DNA를 BamHI(New England Biolabs (NEB, Ipswich)으로 하루 동안 반응 시킨 뒤, XhoI(NEB, Ipswich)으로 이틀 동안 반응시켰다. 그 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제 DNA를 얻었다. 또한, 약 3㎍의 TEVCSQ 또는 ThrombinCSQ 벡터에 CIAP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase) (Takara, Japan)를 넣고 3시간 동안 반응시킨 후, PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. T4 DNA 리가아제 (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 인서트 DNA를 TEVCSQ 또는 ThrombinCSQ 벡터와 상온에서 3시간 동안 연결하였다 (도 15).

그 다음, TEVCSQ1 또는 ThrombinCSQ1 벡터와 BMP2 인서트를 연결 반응 시킨 DNA를 transformaion 하였다. 컴피턴트 세포인 DH5α를 얼음 위에서 녹이고, 100㎕의 컴피턴트 세포에 연결 반응 시킨 용액 5㎕와 혼합한 후, 30분 동안 반응 시켰다. 그리고 42℃에서 30초간 heat shock을 하고 SOC media를 200㎕ 넣어준 뒤 37℃에서 40분 동안 배양하여 도말하였다. 도말하여 나온 콜로니를 무작위로 찍어 cloning이 된 콜로니를 바이오니아에 시퀀싱 의뢰하여 확인하였다. HRP(서열번호 18)와 GLP1(서열번호 19) 유전자도 바이오니아에서 합성한 후에 위와 같은 방법으로 TEVCSQ1에 클로닝하였다.

4-2. BMP2-TEVCSQ1 또는 BMP2-ThrombinCSQ1, TGFβ-TEVCSQ1 또는 TGFβ-ThrombinCSQ1, HRP-TEVCSQ1 및 GLP1-TEVCSQ1 정제

바이오니아에서 시퀀스가 확인된 BMP2-TEVCSQ1, BMP2-ThrombinCSQ1, TGFβ-TEVCSQ1, TGFβ-ThrombinCSQ1 , HRP-TEVCSQ1, GLP-TEVCSQ1 벡터 각각을 BL21 세포에 형질 전환한 후 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 5㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 글리세롤과 1:1 비율로 혼합하여 stock 1㎖을 만들어 -80℃ deepfreezer에 보관하였다. 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 30㎖의 LB 배지에 stock 100㎕를 접종하여 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 1L의 LB 배지에 옮겨 OD=0.6까지 배양하였다. 이후 1mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣어주어 17℃에서 200rpm의 속도로 하루 동안 배양하였다. 4℃에서 4000rpm로 20분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼(20mM Tris(pH 8.0), 300mM NaCl 및 10mM imidazole)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 꺼내어 완전히 녹인 후, PMSF(Phenyl methane sulfonyl fluoride) 10mg을 DMSO 1㎖에 녹인 후 용해된 E. coli에 1㎖ 넣었다. 소니케이터를 이용하여 E. coli를 용해시킨 후에 4℃에서 13,000rpm의 속도로 1시간 동안 원심 분리했다. 상층액에 CaCl₂ 20mM을 넣고 4℃에서 1시간 반응하였다. 그 다음 5000rpm의 속도로 30분 동안 원심 분리 하였다. 상층액을 제거하고 침전물에 EDTA를 넣고 현탁하여 BMP2-TEVCSQ1 와 BMP2-ThrombinCSQ1 단백질을 얻었다 (도 16, 도 18, 도 20, 도 22).

4-3. TEV protease를 이용한 BMP2, TGFβ, HRP 및 GLP1 분리

BMP2-TEVCSQ1 단백질(이하 TGFβ-TEVCSQ1, HRP-TEVCSQ1 및 GLP1-TEVCSQ1 단백질의 경우에도 BMP2-TEVCSQ1과 동일한 실험을 수행함)에서 BMP2를 분리하기 위해서 TEV protease(Genscript. USA) 2㎕를 첨가하여 30℃에서 하루 동안 반응시킨 후 SDS-PAGE로 확인하였다(도 17, 도 19, 도 21, 도 23). 그 결과, CSQ-tag 및 BMP2 융합 단백질은 TEV protease를 이용하여 쉽게 분리될 수 있음이 확인되었다.

4-4. Thrombin protease를 이용한 BMP2 및 TGFβ 분리

BMP2-ThrombinCSQ1 단백질(이하 TGFβ-TEVCSQ1 단백질의 경우에도 BMP2-TEVCSQ1과 동일한 실험을 수행함)에서 BMP2를 분리하기 위해서 Thrombin protease 5㎕를 첨가하여 22℃에서 하루 동안 반응시킨 후 SDS-PAGE로 확인하였다 (도 17, 도 19). 그 결과, CSQ-tag 및 BMP2 융합 단백질은 Thrombin protease를 이용하여 쉽게 분리될 수 있음이 확인되었다.

실시예 5. CSQ-캐그를 이용한 BMP2 및 KGF1의 분리

5-1. CSQ2TEV 또는 CSQ2Thrombin Vector에 BMP2 및 KGF1 Cloning

CSQ2TEV 또는 CSQ2Thrombin Vector에 BMP2 및 KGF1를 cloning하기 위해서, 합성한 올리고뉴클레오티드 Amplify-F1 및 Amplify-B1 를 사용하였다. (Bioneer, Daejeon, Korea). 증폭하기 위해서 Amplify-F1 20pmol, Amplify-B1 20pmol, PCR PreMix (Bioneer, Daejeon, Korea) 및 Temp late 10ug를 혼합하여 총 20㎕가 되도록 증류수를 첨가한 혼합액을 만들었다. 이 혼합액을 PCR 반응(95℃에서 5분, 30 회: 95℃에서 30초, 47℃에서 30초, 72℃에서 45초 및 72℃에서 5분)을 하여 증폭 후, 정제하여 (PCR 정제 키트, GeneAll, Seoul, Korea), BMP2(서열번호 16) 및 KGF1(서열번호 13) 유전자를 얻었다. BMP2유전자 (이하 KGF1 유전자의 경우에도 BMP2와 동일한 실험을 수행함)를 CSQ2TEV 또는 CSQ2Thrombin 벡터에 삽입하기 위해서 CSQ2TEV 또는 CSQ2Thrombin 벡터와 인서트 DNA를 제한효소를 처리하였다. 약 1㎍의 인서트 DNA를 BamHI(New England Biolabs (NEB, Ipswich)으로 하루 동안 반응 시킨 뒤, XhoI(NEB, Ipswich)으로 이틀 동안 반응시켰다. 그 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제 DNA를 얻었다. 또한, 약 3㎍의 CSQ2TEV 또는 CSQ2Thrombin 벡터에 CIAP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase) (Takara, Japan)를 넣고 3시간 동안 반응시킨 후, PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. T4 DNA 리가아제 (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 인서트 DNA를 CSQ2TEV 또는 CSQ2Thrombin 벡터와 상온에서 3시간 동안 연결하였다 (도 24).

그 다음, CSQ2TEV 또는 CSQ2Thrombin 벡터와 BMP2 인서트를 연결 반응 시킨 DNA를 transformaion 하였다. 컴피턴트 세포인 DH5α를 얼음 위에서 녹이고, 100㎕의 컴피턴트 세포에 연결 반응 시킨 용액 5㎕와 혼합한 후, 30분 동안 반응 시켰다. 그리고 42℃에서 30초간 heat shock을 하고 SOC media를 200㎕ 넣어준 뒤 37℃에서 40분 동안 배양하여 도말하였다. 도말하여 나온 콜로니를 무작위로 찍어 cloning이 된 콜로니를 바이오니아에 시퀀싱 의뢰하여 확인하였다.

5-2. CSQ2TEV-BMP2 또는 CSQ2Thrombin-BMP2 및 CSQ2TEV-KGF1 또는 CSQ2Thrombin-KGF1 정제

바이오니아에서 시퀀스가 확인 된 DNA 모두를 BL21 세포에 형질 전환한 후 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 5㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 글리세롤과 1:1 비율로 혼합하여 stock 1㎖을 만들어 -80℃ deepfreezer에 보관하였다. 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 30㎖의 LB 배지에 stock 100㎕를 접종하여 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 1L의 LB 배지에 옮겨 OD=0.6까지 배양하였다. 이후 1mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣어주어 17℃에서 200rpm의 속도로 하루 동안 배양하였다. 4℃에서 4000rpm로 20분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼(20mM Tris(pH 8.0), 300mM NaCl 및 10mM imidazole)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 꺼내어 완전히 녹인 후, PMSF(Phenyl methane sulfonyl fluoride) 10mg을 DMSO 1㎖에 녹인 후 용해된 E. coli에 1㎖ 넣었다. 소니케이터를 이용하여 E. coli를 용해시킨 후에 4℃에서 13,000rpm의 속도로 1시간 동안 원심 분리했다. 상층액에 CaCl₂ 20mM을 넣고 4℃에서 1시간 반응하였다. 그 다음 5000rpm의 속도로 30분 동안 원심 분리 하였다. 상층액을 제거하고 침전물에 EDTA를 넣고 현탁하여 CSQ2TEV-BMP2 와 CSQ2Thrombin-BMP2 단백질을 얻었다 (도 25, 도 27).

5-3. TEV Protease를 이용한 BMP2 및 KGF 분리

CSQ2TEV-BMP2 단백질(이하 CSQ2TEV-KGF1 단백질의 경우에도 동일한 실험을 수행함)에서 BMP2를 분리하기 위해서 TEV protease(Genscript. USA) 2㎕를 첨가하여 30℃에서 하루 동안 반응시킨 후 SDS-PAGE로 확인하였다 (도 26, 도 28). 그 결과, CSQ-tag 및 BMP2 융합 단백질은 TEV protease를 이용하여 쉽게 분리될 수 있음이 확인되었다.

5-4. Thrombin Protease를 이용한 BMP2 및 KGF 분리

CSQ2Thrombin-BMP2 단백질(이하 CSQ2Thrombin-KGF1 단백질의 경우에도 동일한 실험을 수행함)에서 BMP2를 분리하기 위해서 Thrombin protease 5㎕를 첨가하여 22℃에서 하루 동안 반응시킨 후 SDS-PAGE로 확인하였다 (도 26, 도 28). 그 결과, CSQ-tag 및 BMP2 융합 단백질은 Thrombin protease를 이용하여 쉽게 분리될 수 있음이 확인되었다.

실시예 6. CSQ-태그를 이용한 HRP 및 GLP1의 분리

6-1. HRP-TEVCSQ2 또는 HRP-ThrombinCSQ2 및 GLP1-TEVCSQ2 정제

HRP(서열번호 18) 및 GLP1(서열번호 19)의 유전자를 바이오니아에서 합성한 후에 TEVCSQ2와 ThrombinCSQ2 벡터에 클로닝 한 후에 BL21 세포에 형질 전환한 후 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 5㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 글리세롤과 1:1 비율로 혼합하여 stock 1㎖을 만들어 -80℃ deepfreezer에 보관하였다. 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 30㎖의 LB 배지에 stock 100㎕를 접종하여 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 1L의 LB 배지에 옮겨 OD=0.6까지 배양하였다. 이후 1mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣어주어 17℃에서 200rpm의 속도로 하루 동안 배양하였다. 4℃에서 4000rpm로 20분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼(20mM Tris(pH 8.0), 300mM NaCl 및 10mM imidazole)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 꺼내어 완전히 녹인 후, PMSF(Phenyl methane sulfonyl fluoride) 10mg을 DMSO 1㎖에 녹인 후 용해된 E. coli에 1㎖ 넣었다. 소니케이터를 이용하여 E. coli를 용해시킨 후에 4℃에서 13,000rpm의 속도로 1시간 동안 원심 분리했다. 상층액에 CaCl₂ 20mM을 넣고 4℃에서 1시간 반응하였다. 그 다음 5000rpm의 속도로 30분 동안 원심 분리 하였다. 상층액을 제거하고 침전물에 EDTA를 넣고 현탁하여 HRP-TEVCSQ2 와 HRP-ThrombinCSQ2 및 GLP1-TEVCSQ2 단백질을 얻었다 (도 29, 도 31).

6-2. TEV Protease를 이용한 HRP 및 GLP1 분리

HRP-TEVCSQ2 단백질(이하 GLP1-TEVCSQ2 단백질의 경우에도 동일한 실험을 수행함)에서 HRP를 분리하기 위해서 TEV protease(Genscript. USA) 2㎕를 첨가하여 30℃에서 하루 동안 반응시킨 후 SDS-PAGE로 확인하였다 (도 30, 도 32). 그 결과, CSQ-tag 및 HRP 융합 단백질, 및 CSQ-tag 및 GLP1 유압 단백질은 모두 TEV protease를 이용하여 쉽게 분리될 수 있음이 확인되었다.

실시예 7. CSQ-태그를 이용한 EGF 및 KGF1의 분리

7-1. CSQ1-Ssp Dna-EGF 및 CSQ2-Ssp Dna-KGF1 정제

EGF(서열번호 12), KGF1(서열번호 13)의 유전자를 바이오니아에서 합성한 후에 CSQ1-Ssp Dna와 CSQ2-Ssp Dna 벡터에 클로닝 한 후에 BL21 세포에 형질 전환한 후 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 5㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 글리세롤과 1:1 비율로 혼합하여 stock 1㎖을 만들어 -80℃ deepfreezer에 보관하였다. 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 30㎖의 LB 배지에 stock 100㎕를 접종하여 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 1L의 LB 배지에 옮겨 OD=0.6까지 배양하였다. 이후 1mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣어주어 17℃에서 200rpm의 속도로 하루 동안 배양하였다. 4℃에서 4000rpm로 20분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼(20mM Tris(pH 8.0), 300mM NaCl 및 10mM imidazole)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 꺼내어 완전히 녹인 후, PMSF(Phenyl methane sulfonyl fluoride) 10mg을 DMSO 1㎖에 녹인 후 용해된 E. coli에 1㎖ 넣었다. 소니케이터를 이용하여 E. coli를 용해시킨 후에 4℃에서 13,000rpm의 속도로 1시간 동안 원심 분리했다. 상층액에 CaCl₂ 20mM을 넣고 4℃에서 1시간 반응하였다. 그 다음 5000rpm의 속도로 30분 동안 원심 분리 하였다. 상층액을 제거하고 침전물에 EDTA를 넣고 현탁하여 CSQ1-Ssp Dna-EGF 및 CSQ2-Ssp Dna-KGF1 단백질을 얻었다 (도 33, 도 35).

7-2. pH를 이용한 EGF 및 KGF1 분리

CSQ1-Ssp Dna-EGF 단백질(이하 CSQ2-Ssp Dna-KGF1 단백질의 경우에도 동일한 실험을 수행함)에서 EGF를 분리하기 위해서 20mM HEPES pH 6.5, 500mM NaCl 버퍼를 이용하여 상온에서 하루 동안 반응시킨 후 SDS-PAGE로 확인하였다 (도 34, 도 36). 그 결과, CSQ-tag 및 EGF 융합 단백질은 pH를 이용하여 쉽게 분리될 수 있음이 확인되었다.

실시예 8. CSQ-태그를 이용한 EGF 및 BMP2의 분리

8-1. EGF-GyrA-CSQ1 및 BMP2-GyrA-CSQ2 정제

EGF(서열번호 12), BMP2(서열번호 16)의 유전자를 바이오니아에서 합성한 후에 GyrA-CSQ1와 GyrA-CSQ2 벡터에 클로닝 한 후에 BL21 세포에 형질 전환한 후 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다.

한천 평판 배지에서 자란 군락을 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 5㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 글리세롤과 1:1 비율로 혼합하여 stock 1㎖을 만들어 -80℃ deepfreezer에 보관하였다. 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 30㎖의 LB 배지에 stock 100㎕를 접종하여 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 암피실린(50μg/㎖)이 포함된 1L의 LB 배지에 옮겨 OD=0.6까지 배양하였다. 이후 1mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣어주어 17℃에서 200rpm의 속도로 하루 동안 배양하였다. 4℃에서 4000rpm로 20분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼(20mM Tris(pH 8.0), 300mM NaCl 및 10mM imidazole)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 꺼내어 완전히 녹인 후, PMSF(Phenyl methane sulfonyl fluoride) 10mg을 DMSO 1㎖에 녹인 후 용해된 E. coli에 1㎖ 넣었다. 소니케이터를 이용하여 E. coli를 용해시킨 후에 4℃에서 13,000rpm의 속도로 1시간 동안 원심 분리했다. 상층액에 CaCl₂ 20mM을 넣고 4℃에서 1시간 반응하였다. 그 다음 5000rpm의 속도로 30분 동안 원심 분리 하였다. 상층액을 제거하고 침전물에 EDTA를 넣고 현탁하여 EGF-GyrA-CSQ1 및 BMP2-GyrA-CSQ2 단백질을 얻었다 (도 37, 도 39).

8-2. Dithiothreitol(DTT)을 이용한 EGF 및 BMP2 분리

EGF-GyrA-CSQ1 단백질(이하 BMP2-GyrA-CSQ2 단백질의 경우에도 동일한 실험을 수행함)에서 EGF를 분리하기 위해서 20mM HEPES pH 8.5, 500mM NaCl, 40mM DTT 버퍼를 이용하여 상온에서 하루 동안 반응시킨 후 SDS-PAGE로 확인하였다 (도 38, 도 40). 그 결과, CSQ-tag 및 EGF 융합 단백질은 DTT를 이용하여 쉽게 분리될 수 있음이 확인되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Institute of Ceramic Engineering and Technology <120> METHOD OF EXPRESSING AND PURIFYING PROTEIN USING CSQ-TAG <130> DP-2020-0046 <150> KR 10-2019-0040241 <151> 2019-04-05 <160> 25 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 362 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CSQ1 <400> 1 Gln Glu Gly Leu Asp Phe Pro Glu Tyr Asp Gly Val Asp Arg Val Ile 1 5 10 15 Asn Val Asn Ala Lys Asn Tyr Lys Asn Val Phe Lys Lys Tyr Glu Val 20 25 30 Leu Ala Leu Leu Tyr His Glu Pro Pro Glu Asp Asp Lys Ala Ser Gln 35 40 45 Arg Gln Phe Glu Met Glu Glu Leu Ile Leu Glu Leu Ala Ala Gln Val 50 55 60 Leu Glu Asp Lys Gly Val Gly Phe Gly Leu Val Asp Ser Glu Lys Asp 65 70 75 80 Ala Ala Val Ala Lys Lys Leu Gly Leu Thr Glu Val Asp Ser Met Tyr 85 90 95 Val Phe Lys Gly Asp Glu Val Ile Glu Tyr Asp Gly Glu Phe Ser Ala 100 105 110 Asp Thr Ile Val Glu Phe Leu Leu Asp Val Leu Glu Asp Pro Val Glu 115 120 125 Leu Ile Glu Gly Glu Arg Glu Leu Gln Ala Phe Glu Asn Ile Glu Asp 130 135 140 Glu Ile Lys Leu Ile Gly Tyr Phe Lys Ser Lys Asp Ser Glu His Tyr 145 150 155 160 Lys Ala Phe Glu Asp Ala Ala Glu Glu Phe His Pro Tyr Ile Pro Phe 165 170 175 Phe Ala Thr Phe Asp Ser Lys Val Ala Lys Lys Leu Thr Leu Lys Leu 180 185 190 Asn Glu Ile Asp Phe Tyr Glu Ala Phe Met Glu Glu Pro Val Thr Ile 195 200 205 Pro Asp Lys Pro Asn Ser Glu Glu Glu Ile Val Asn Phe Val Glu Glu 210 215 220 His Arg Arg Ser Thr Leu Arg Lys Leu Lys Pro Glu Ser Met Tyr Glu 225 230 235 240 Thr Trp Glu Asp Asp Met Asp Gly Ile His Ile Val Ala Phe Ala Glu 245 250 255 Glu Ala Asp Pro Asp Gly Phe Glu Phe Leu Glu Thr Leu Lys Ala Val 260 265 270 Ala Gln Asp Asn Thr Glu Asn Pro Asp Leu Ser Ile Ile Trp Ile Asp 275 280 285 Pro Asp Asp Phe Pro Leu Leu Val Pro Tyr Trp Glu Lys Thr Phe Asp 290 295 300 Ile Asp Leu Ser Ala Pro Gln Ile Gly Val Val Asn Val Thr Asp Ala 305 310 315 320 Asp Ser Val Trp Met Glu Met Asp Asp Glu Glu Asp Leu Pro Ser Ala 325 330 335 Glu Glu Leu Glu Asp Trp Leu Glu Asp Val Leu Glu Gly Glu Ile Asn 340 345 350 Thr Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp 355 360 <210> 2 <211> 380 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CSQ2 <400> 2 Glu Glu Gly Leu Asn Phe Pro Thr Tyr Asp Gly Lys Asp Arg Val Val 1 5 10 15 Ser Leu Ser Glu Lys Asn Phe Lys Gln Val Leu Lys Lys Tyr Asp Leu 20 25 30 Leu Cys Leu Tyr Tyr His Glu Pro Val Ser Ser Asp Lys Val Thr Pro 35 40 45 Lys Gln Phe Gln Leu Lys Glu Ile Val Leu Glu Leu Val Ala Gln Val 50 55 60 Leu Glu His Lys Ala Ile Gly Phe Val Met Val Asp Ala Lys Lys Glu 65 70 75 80 Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Gly Phe Asp Glu Glu Gly Ser Leu Tyr 85 90 95 Ile Leu Lys Gly Asp Arg Thr Ile Glu Phe Asp Gly Glu Phe Ala Ala 100 105 110 Asp Val Leu Val Glu Phe Leu Leu Asp Leu Ile Glu Asp Pro Val Glu 115 120 125 Ile Ile Ser Ser Lys Leu Glu Val Gln Ala Phe Glu Arg Ile Glu Asp 130 135 140 Tyr Ile Lys Leu Ile Gly Phe Phe Lys Ser Glu Asp Ser Glu Tyr Tyr 145 150 155 160 Lys Ala Phe Glu Glu Ala Ala Glu His Phe Gln Pro Tyr Ile Lys Phe 165 170 175 Phe Ala Thr Phe Asp Lys Gly Val Ala Lys Lys Leu Ser Leu Lys Met 180 185 190 Asn Glu Val Asp Phe Tyr Glu Pro Phe Met Asp Glu Pro Ile Ala Ile 195 200 205 Pro Asn Lys Pro Tyr Thr Glu Glu Glu Leu Val Glu Phe Val Lys Glu 210 215 220 His Gln Arg Pro Thr Leu Arg Arg Leu Arg Pro Glu Glu Met Phe Glu 225 230 235 240 Thr Trp Glu Asp Asp Leu Asn Gly Ile His Ile Val Ala Phe Ala Glu 245 250 255 Lys Ser Asp Pro Asp Gly Tyr Glu Phe Leu Glu Ile Leu Lys Gln Val 260 265 270 Ala Arg Asp Asn Thr Asp Asn Pro Asp Leu Ser Ile Leu Trp Ile Asp 275 280 285 Pro Asp Asp Phe Pro Leu Leu Val Ala Tyr Trp Glu Lys Thr Phe Lys 290 295 300 Ile Asp Leu Phe Arg Pro Gln Ile Gly Val Val Asn Val Thr Asp Ala 305 310 315 320 Asp Ser Val Trp Met Glu Ile Pro Asp Asp Asp Asp Leu Pro Thr Ala 325 330 335 Glu Glu Leu Glu Asp Trp Ile Glu Asp Val Leu Ser Gly Lys Ile Asn 340 345 350 Thr Glu Asp Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asn Ser Asp Glu 355 360 365 Glu Asp Asn Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Asp Glu 370 375 380 <210> 3 <211> 1086 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSQ1 <400> 3 caggaagggc tggacttccc tgagtacgat ggtgtggacc gtgtgatcaa tgtcaatgca 60 aagaactaca agaatgtgtt caagaagtat gaggtgctgg cactcctcta ccatgaaccc 120 cccgaggatg acaaggcctc acaaagacaa tttgagatgg aggagctgat cctggagtta 180 gcagcccaag tcctagaaga caagggtgtt ggcttcgggc tggtagactc tgagaaggat 240 gcagctgtgg ccaagaaact aggcctaact gaagtggaca gcatgtatgt attcaaggga 300 gatgaagtca ttgagtacga tggcgagttt tctgctgaca ccatcgtgga gtttctgctt 360 gatgtcctag aggaccctgt ggaattgatt gaaggtgaac gagagctgca ggcgtttgag 420 aatattgagg atgagatcaa actcattggc tacttcaaga gcaaagactc agagcattac 480 aaagccttcg aggatgcagc tgaggagttt catccctaca tccccttctt cgccaccttc 540 gacagcaagg tggcaaagaa gctgaccctg aagctgaatg agattgattt ctacgaggcc 600 ttcatggaag agcctgtgac catcccagac aagcccaata gcgaagagga gattgtcaac 660 ttcgtggagg agcacaggag atcaaccctg aggaaactga agccggagag tatgtatgag 720 acctgggagg atgatatgga tggaatccac attgtggcct tcgcagagga agctgatcct 780 gatggtttcg agttcttaga gactctcaag gctgtggccc aagataacac tgaaaaccca 840 gatcttagca tcatctggat tgaccctgat gacttccccc tgctggtccc atactgggag 900 aagacgtttg acatcgactt gtcagcccca caaataggag tcgtcaatgt tactgatgcg 960 gatagcgtat ggatggaaat ggacgatgag gaggacctgc cttctgctga ggagctggag 1020 gactggctgg aggatgtcct ggagggcgag atcaacacag aggacgatga cgatgatgat 1080 gatgac 1086 <210> 4 <211> 1143 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSQ2 <400> 4 gaagaggggc ttaatttccc cacatatgat gggaaggacc gagtggtaag tctttccgag 60 aagaacttca agcaggtttt aaagaaatat gacttgcttt gcctctacta ccatgagccg 120 gtgtcttcag ataaggtcac gccaaaacag ttccaactga aagaaatcgt gcttgagctt 180 gtggcccagg tccttgaaca taaagctata ggctttgtga tggtggatgc caagaaagaa 240 gccaagcttg ccaagaaact gggttttgat gaagaaggaa gcctgtatat tcttaagggt 300 gatcgcacaa tagagtttga tggcgagttt gcagctgatg tcttggtgga gttcctcttg 360 gatctaattg aagacccagt ggagatcatc agcagcaaac tggaagtcca agccttcgaa 420 cgcattgaag actacatcaa actcattggc tttttcaaga gtgaggactc agaatactac 480 aaggcttttg aagaagcagc tgaacacttc cagccttaca tcaaattctt tgccaccttt 540 gacaaagggg ttgcaaagaa attatctttg aagatgaatg aggttgactt ctatgagcca 600 tttatggatg agcccattgc catccccaac aaaccttaca cagaagagga gctggtggag 660 tttgtgaagg aacaccaaag acccactcta cgtcgcctgc gcccagaaga aatgtttgaa 720 acatgggaag atgatttgaa tgggatccac attgtggcct ttgcagagaa gagtgatcca 780 gatggctacg aattcctgga gatcctgaaa caggttgccc gggacaatac tgacaacccc 840 gatctgagca tcctgtggat cgacccggac gactttcctc tgctcgttgc ctactgggag 900 aagactttca agattgacct attcaggcca cagattgggg tggtgaatgt cacagatgct 960 gacagtgtct ggatggagat tccagatgat gacgatcttc caactgctga ggagctggag 1020 gactggattg aggatgtgct ttctggaaag ataaacactg aagatgatga tgaagatgat 1080 gatgatgatg ataattctga tgaagaggat aatgatgaca gtgatgacga tgatgatgaa 1140 tag 1143 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TEV <400> 5 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Thrombin <400> 6 Leu Val Pro Arg Gly Ser 1 5 <210> 7 <211> 431 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ssp Dna <400> 7 Gly Cys Ile Ser Gly Asp Ser Leu Ile Ser Leu Ala Ser Thr Gly Lys 1 5 10 15 Arg Val Ser Ile Lys Asp Leu Leu Asp Glu Lys Asp Phe Glu Ile Trp 20 25 30 Ala Ile Asn Glu Gln Thr Met Lys Leu Glu Ser Ala Lys Val Ser Arg 35 40 45 Val Phe Cys Thr Gly Lys Lys Leu Val Tyr Ile Leu Lys Thr Arg Leu 50 55 60 Gly Arg Thr Ile Lys Ala Thr Ala Asn His Arg Phe Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Gly Trp Lys Arg Leu Asp Glu Leu Ser Leu Lys Glu His Ile Ala Leu 85 90 95 Pro Arg Lys Leu Glu Ser Ser Ser Leu Gln Leu Met Ser Asp Glu Glu 100 105 110 Leu Gly Leu Leu Gly His Leu Ile Gly Asp Gly Cys Thr Leu Pro Arg 115 120 125 His Ala Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Lys Ile Glu Leu Ala Glu Lys Val 130 135 140 Val Glu Leu Ala Lys Ala Val Phe Gly Asp Gln Ile Asn Pro Arg Ile 145 150 155 160 Ser Gln Glu Arg Gln Trp Tyr Gln Val Tyr Ile Pro Ala Ser Tyr Arg 165 170 175 Leu Thr His Asn Lys Lys Asn Pro Ile Thr Lys Trp Leu Glu Asn Leu 180 185 190 Asp Val Phe Gly Leu Arg Ser Tyr Glu Lys Phe Val Pro Asn Gln Val 195 200 205 Phe Glu Gln Pro Gln Arg Ala Ile Ala Ile 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180 185 190 Asn Gly Phe Val Ser His Asn Thr 195 200 <210> 9 <211> 91 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBD14 <400> 9 Glu Val Pro Gln Leu Thr Asp Leu Ser Phe Val Asp Ile Thr Asp Ser 1 5 10 15 Ser Ile Gly Leu Arg Trp Val Gln Cys Gln Cys Ala Gly Ile Ile Gly 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Val Val Ala Ala Gly Glu Gly Ile Pro Ile Phe Glu 35 40 45 Asp Phe Val Asp Pro Ala Cys Val Tyr Tyr Thr Val Thr Gly Leu Glu 50 55 60 Pro Gly Ile Asp Tyr Asp Ile Ser Val Ile Thr Leu Ile His Arg Ile 65 70 75 80 His Pro Asn Pro Thr Thr Leu Thr Gln Gln Thr 85 90 <210> 10 <211> 91 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EBD21 <400> 10 Glu Val Pro Gln Leu Thr Asp Leu Ser Phe Val Asp Met Thr Asp Ser 1 5 10 15 Ser Ile Gly Leu Arg Trp Val Gln Val Met Arg Met Gly Ile Ile Gly 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Val Val Ala Ala Gly Glu Gly Ile Pro Ile Phe Glu 35 40 45 Asp Phe Val Asp His Pro Ile Arg Tyr Tyr Thr Val Thr Gly Leu Glu 50 55 60 Pro Gly Ile Asp Tyr Asp Ile Ser Val Ile Thr Leu Ile Pro Trp Gln 65 70 75 80 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Asn Val Asn Cys 1 5 10 15 Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly 20 25 30 Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg 35 40 45 Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn 50 55 60 Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile 65 70 75 80 Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys 85 90 95 Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu 100 105 110 Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His 115 120 125 Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val 130 135 140 Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro 145 150 155 160 Met Ala Ile Thr <210> 14 <211> 147 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF <400> 14 Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 20 25 30 Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln 35 40 45 Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu 50 55 60 Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu 65 70 75 80 Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro 85 90 95 Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His 100 105 110 Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys 115 120 125 Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Cys Asp Lys 130 135 140 Pro Arg Arg 145 <210> 15 <211> 146 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF2 <400> 15 Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His 1 5 10 15 Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu 20 25 30 Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp 35 40 45 Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser 50 55 60 Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly 65 70 75 80 Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu 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<210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 21 attctcgagt tacgtttgtt gtgtcagtgt agtagg 36 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 22 aatggatcca actctgatag cgaatgcccg 30 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 23 attctcgagt taacgcagtt cccaccattt 30 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 24 cagcaagaca gcgatggatc c 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 25 cgacttacag gtgatctcga g 21

Claims

칼시퀘스트린, 목적 단백질, 및 상기 칼시퀘스트린 및 목적 단백질 사이에 연결된 가수분해효소 분해 펩타이드로 이루어진 융합 단백질을 코딩하는 발현 벡터를 포함하는, 목적 단백질 정제용 조성물로서,
상기 목적 단백질은 발현된 융합 단백질을 칼슘으로 침전시킨 후, 가수분해효소에 의해 분리되는 것인, 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 칼시퀘스트린은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 이루어진 아미노산으로 코딩되는 것을 특징으로 하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 칼시퀘스트린은 서열번호 3 또는 서열번호 4로 이루어진 뉴클레오티드 서열로 암호화되는 것을 특징으로 하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 가수분해효소 분해 펩타이드는 서열번호 5 내지 8로 이루어진 아미노산으로 코딩되는 것을 특징으로 하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 목적 단백질은 고분자 단백질, 당 단백질, 사이토카인, 성장인자, 혈액제제, 백신, 호르몬, 효소 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 것인, 조성물.
제5항에 있어서,
상기 목적 단백질은 인터루킨-2(Interleukin-2), 혈액 인자 VII, 혈액 인자 VIII, 혈액 인자 IX, 면역글로불린, 호세라디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase, HRP), 사이토카인, α-인터페론, β-인터페론, γ-인터페론, 콜로니자극인자(GM-CSF), 인간 피브로넥튼 엑스트라 도메인 B(human fibronectin extra domain B, EBD), 뼈 형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF), 표피 성장 인자 (epidermal growth factor, EGF), 인슐린 성장 인자(insulinlike growth factor, IGF), 형질 전환 성장 인자(trans-forming growth factor-α and -β, TGF-α, -β), 뇌 유래 신경 영양 인자(brain-derived neutrophic factor, BDNF), 혈소판 유래 성장 인자(plateletderived growth factor, PDGF), 태반 성장 인자(placental growth factor, PlGF), 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF), 섬유아세포 성장 인자 (Fibroblast growth factor 1 and 2, FGF-1, -2), 케라틴세포 성장 인자(Keratinocyte growth factor, KGF), 글루카곤-유사 펩티드-1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1), 엑센딘, 소마토스타틴(somatostatin), LHRH(luteinizing hormone-releasing hormone), 아드레노코티코트로픽 호르몬(adrenocorticotropic hormone), 성장호르몬-방출 호르몬(growth hormone-releasing hormone), 옥시토신(oxytocin), 티모신 알파-1(thymosin alpha-1), 코티코트로핀-방출인자(corticotropin-releasing factor), 칼시토닌(calcitonin), 비발리루딘(bivalirudin), 바소프레신(vasopressin), 포스포리파제-활성화 단백질(PLAP), 인슐린, 종양 괴사 인자(TNF), 소낭-자극 호르몬, 갑상선-자극 호르몬, 항이뇨 호르몬, 색소성 호르몬, 부갑상선 호르몬, 황체분비호르몬, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(Calcitonin Gene Related Peptide, CGPR), 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리스로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드(growth hormone releasing peptide; GHPR), 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor; THF), 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데아미나제, 아데노신 데아미나제, 과산화물 디스뮤타제, 엔도톡시나제, 카탈라제, 키모트립신, 리파제, 우리카제, 아데노신 디포스파타제, 티로시나제, 빌리루빈 옥시다제, 글루코즈 옥시다제, 글루코다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, 및 글루코우로니다제로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 목적 단백질은 서열번호 9 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 코딩되는 것을 특징으로 하는 것인, 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 이용한 목적 단백질의 정제 방법으로,
A) 칼시퀘스트린 및 목적 단백질이 가수분해효소 분해 펩타이드를 통해 융합된 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
B) 상기 발현 벡터를 숙주세포에 형질도입하여 형질전환체를 얻는 단계;
C) 상기 형질전환체로부터 칼시퀘스트린 및 목적 단백질이 융합된 융합 단백질을 발현시키는 단계;
D) 칼슘을 이용하여 상기 발현된 형질전환체로부터 융합 단백질을 침전시키는 단계; 및
E) 가수분해효소를 이용하여 융합 단백질로부터 목적 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 칼시퀘스트린을 이용한 목적 단백질의 정제 방법.
A) 목적 단백질의 발현 및 수용화 향상을 위한 칼시퀘스트린 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
B) 상기 발현 벡터를 숙주세포에 형질도입하여 형질전환체를 얻는 단계;
C) 상기 형질전환체로부터 칼시퀘스트린 및 목적 단백질이 융합된 융합 단백질을 발현시키는 단계;
D) 칼슘을 이용하여 상기 발현된 형질전환체로부터 융합 단백질을 침전시키는 단계; 및
E) 가수분해효소를 이용하여 융합 단백질로부터 목적 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 칼시퀘스트린을 이용한 목적 단백질의 발현 및 정제 방법.
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