KR102000490B1

KR102000490B1 - 가용성이 개선된 살모넬라균 편모 유래 플라젤린 단백질 발현 형질전환체, 그 제조방법 및 용도

Info

Publication number: KR102000490B1
Application number: KR1020180004354A
Authority: KR
Inventors: 김근중; 정대은
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2018-01-12
Filing date: 2018-01-12
Publication date: 2019-10-01

Abstract

본 발명은 가용성이 개선된 살모넬라균 편모 유래 플라젤린 단백질 발현 형질전환체, 그 제조방법 및 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아미노산 말단 코돈을 동의 코돈으로 무작위 치환함으로써, 형질전환 후 가용성이 개선된 살모넬라 유래 편모 단백질의 일부인 플라젤린 단백질 변이체를 선별하는 방법, 선별된 플라젤린 단백질을 코딩하는 유전자의 염기서열 및 면역 치료 보조제로서의 용도에 관한 것으로, 본 발명을 통해 가용성이 개선된 살모넬라 편모 유래 플라젤린 단백질의 선별 및 정제가 동시에 가능하도록 함으로써 종래의 방법에 비해 간단하고 경제적일 뿐만 아니라, 아미노산의 변형 또는 부가가 없어 의료용 단백질 생산을 위한 방법으로 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

가용성이 개선된 살모넬라균 편모 유래 플라젤린 단백질 발현 형질전환체, 그 제조방법 및 용도{Transformants for expressing flagellin protein derived from Salmonella sp. with improved solubility, preparation method and use thereof}

본 발명은 가용성이 개선된 살모넬라균 편모 유래 플라젤린 단백질 발현 형질전환체, 그 제조방법 및 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아미노산 말단 코돈을 동의 코돈으로 무작위 치환함으로써, 형질전환 후 가용성이 개선된 살모넬라 유래 편모 단백질의 일부인 플라젤린 단백질 변이체를 선별하는 방법, 선별된 플라젤린 단백질을 코딩하는 유전자의 염기서열 및 면역 치료 보조제로서의 용도에 관한 것이다.

편모(flagella)는 미생물에게 주화성, 접착 및 침투 능력을 부여하며, 병원성 미생물에서는 숙주에 대한 독성을 증대시키는 주요한 인자들 중 하나이다. 편모는 양성자 구동력을 주는 기저 소체(basal body), 필라멘트와 상기 두 구조를 연결하는 후크(hook)로 구분된다. 이 중 필라멘트는 수많은 플라젤린(flagellin) 단량체들의 다량화로 형성되는데, 일예로 살모넬라의 경우, 약 2 만 개의 플라젤린 단량체가 모여 필라멘트를 형성한다. 플라젤린은 아미노산 서열에 있어서, 미생물 간 보존성이 높은 양쪽 아미노/카르복실 말단과, 보존성이 매우 낮은 중앙 부분으로 구분된다. 플라젤린의 3차 구조에서 보존성이 높은 부분은 알파 나선(alpha helix) 형태, 보존성이 낮은 부분은 베타 시트(beta sheet) 형태를 갖는다. 숙주 내에서 플라젤린은 단량체로 분리되어 염증 반응 및 선천성 면역에서 중요한 역할을 수행하는 톨 유사 수용체-5(Toll-like receptor-5; TLR5)와 선택적 결합을 한다. 톨 유사 수용체-5와의 결합은 세포질에서 MyD88 (Myeloid differentiation primary response gene 88), IKK (IkB kinase)및 NF-kB 를 경유하는 신호 전달을 통해 TNF-α (tumor necrosis factor-alpha) 또는 IL-18 (interleukin-18)등의 사이토카인 발현 및 분비를 유도한다.

플라젤린 단량체가 면역 자극 활성을 갖는 것으로부터 병원성 미생물의 플라젤린을 다른 미생물에 대한 백신, 암 치료용 면역 치료제, 방사선 보호제 등으로의 활용이 고려되고 있다. 그러나, 플라젤린에서 미생물 간 보존성이 높고 약물로서 작용하는 양 말단은 수용액 상에서 무정형의 구조를 갖는다. 이러한 구조적 특성은 일예로, 대장균에서 플라젤린 단량체를 과생산할 때 불용성 응집체를 형성하는 원인이 된다 (Burdelya and Krivokrysenko 2008, Science 320(5873):226-30). 불용성 응집체 형태의 단백질은 재접힘 과정을 통해 본래의 구조로 복원할 필요가 있으나, 재접힘은 단백질의 종류에 따라 적합한 조건이 상이하며, 복원이 불가능한 경우도 존재할 뿐만 아니라, 복원 후 본래의 구조와 동일함을 보장할 수 없다는 문제가 있다. 플라젤린과 같이 고유 3차원 구조가 단백질의 기능에 중요한 인자인 경우, 재접힘보다는 가용성 발현이 보다 적합하다.

단백질의 가용성 증대를 위해 배양 및 발현 조건, 프로모터 세기 조절, 분자 샤페론(molecular chaperone) 동시 발현, 말토오스 결합 단백질(maltose binding protein), NusA 또는 글루타치온 S 트랜스퍼라제(glutathion S transferase) 등의 가용성 파트너 융합과 같은 전략이 활용되고 있다. 그러나, 이와 같은 개별 유전자의 가용성 발현을 위한 조건 최적화는 많은 시간과 노력이 필요한 자원 소모적인 방법이며, 인공 진화 방법은 아미노산의 변화를 수반하여, 의약용 단백질 생산에 적합하지 않다. 또한 코돈 최적화 방법은 아미노산 변화는 수반하지 않으나, 기술적 적용 범위가 제한적인 한계가 있다.

최근에는 전체 유전자 대신 개별 유전자 전사체의 5'비번역 영역(5'UTR) 및 5'말단을 코딩하는 염기 서열의 변화만으로 단백질 발현에 영향을 줄 수 있다는 결과들이 보고되었다(Goltermann et al. 2011, ProteinEng Des Sel. 24(1-2):123-129; Gopal and Kumar 2013, Science 342(6157):475-479). 목적 단백질의 가용성 개선을 위해 접힘 리포터(folding reporter)를 목적 단백질에 융합하는 전략이 시도되고 있으나, 이와 같은 접힘 리포터 또한 가용성 개선 및 정제를 위해 제거될 필요가 있다. 이를 위해 진핵 RNA에서 발견되는 인트론(intron)과 같이 단백질에서도 3차원 접힘 후 특정 신호에 의해 스스로 분리되는 인테인(intein)을 이용하는 단백질 스플라이싱(protein splicing) 등의 방법이 사용되고 있으나, 이 경우에도 단백질 스플라이싱을 위해 인테인의 기능성 발현이 유도되어야 하는 점과 절단 효율이 낮은 문제점이 있으며, 분리 후 단백질 스플라이싱을 위해 필요한 보존적 아미노산이 목적 단백질에 추가되어 의약용 단백질로서의 활용에 문제점으로 남아 이에 대한 해결 방안의 개발이 절실한 상황이다.

대한민국 등록특허공보 제1587433호(2016.01.21.). 대한민국 공개특허공보 제2017-0060952호(2017.06.02.).

Goltermann et al. 2011, ProteinEng Des Sel. 24(1-2):123-129. Gopal and Kumar 2013, Science 342(6157):475-479.

상기와 같은 문제점의 해결을 위해 본 발명에서는 5'말단 코딩 영역의 코돈을 동의 코돈(synonym codon)으로 무작위 치환하여 아미노산이 변형되지 않고 가용성이 개선된 살모넬라 플라젤린 단백질의 선별 및 정제를 동시에 수행할 수 있는 신규한 접합 리포터(folding reporter)를 제공하고자 하였다.

본 발명은 가용성이 개선된 살모넬라 편모 유래 단백질을 코딩하는, 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 염기서열로 이루어진 살모넬라 플라젤린 유전자에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 살모넬라 플라젤린 유전자가 도입된 벡터에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된, 인간을 제외한 형질전환체에 관한 것이다.

또한 본 발명은,

a) 개시코돈을 제외한 5′말단 코딩영역 내의 코돈에 대해, 동요염기(動搖鹽基; wobble base)가 도입된 프라이머를 이용하여, 살모넬라 플라젤린 유전자 라이브러리를 제작하는 단계;

b) 상기 살모넬라 플라젤린 유전자 라이브러리로부터, 살모넬라 플라젤린 유전자가 포함된 재조합 벡터를 제작하는 단계;

c) 상기 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계; 및

d) 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 가용성이 개선된 플라젤린 단백질을 선별 및 정제하는 단계;

를 포함하는, 가용성이 개선되고 아미노산이 부가되지 않는 살모넬라 편모 유래 플라젤린 단백질을 코딩하는, 살모넬라 플라젤린 유전자의 선별방법에 관한 것이다.

본 발명을 통해 가용성이 개선된 살모넬라 편모 유래 플라젤린 단백질의 선별 및 정제가 동시에 가능하도록 함으로써 종래의 방법에 비해 간단하고 경제적일 뿐만 아니라, 아미노산의 변형 또는 부가가 없어 의료용 단백질 생산을 위한 방법으로 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 벡터 pSCT5-ImCherry를 나타낸 것이다.
도 2는 벡터 pTac-Ssp_C를 나타낸 것이다.
도 3은 T5 프로모터 제어 하에서 선별된 ImCherry가 융합된 편모 단백질의 형광 세기를 나타낸 것이다.
도 4는 T5 프로모터 제어 하에서 선별된 ImCherry가 융합된 편모 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 5는 ImCherry가 융합된 동의 코돈 치환체 #5, #6, #7 및 #9와 야생형 편모 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다(T: 전체 단백질, S: 가용성 분획).
도 6은 scvFliC를 인테인의 단백질 스플라이싱을 통해 수득하는 절차를 묘사한 그림이다.
도 7은 ImCherry가 융합된 동의 코돈 치환체 #5를 정제한 결과이다(S: 가용성 분획; E24, E27, E30, E33, E36: DTT 첨가 분획).
도 8은 동의 코돈 치환체 #5의 면역 자극 활성 측정 결과이다.

이하 첨부한 표 또는 도면들을 참조하여 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

도면이 기재되어 있을 경우, 이는 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위한 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 상기 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

또한 본 발명은 상기 살모넬라 플라젤린 유전자가 도입된 벡터에 관한 것으로, 상기 유전자를 도입하여 발현을 유도함으로써 본 발명의 목적에 저해가 되지 않는 한 그 종류는 제한되지는 않지만, 일예로 도 1의 개열지도를 갖는 재조합 벡터 pSCT-ImCherry일 수 있으며, 상기와 같이 제작할 경우, 형질전환 후 살모넬라 플라젤린 유전자의 발현이 증가하며, 가용성이 개선된 단백질의 선별 및 정제가 보다 용이하게 이루어질 수 있어 바람직하다.

또한 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된, 인간을 제외한 형질전환체에 관한 것으로, 상기 형질전환체의 제작을 위한 숙주 세포는 도입된 상기 벡터로부터 살모넬라 플라젤린 유전자의 발현을 통해 가용성이 개선된 살모넬라 편모 유래 단백질을 얻을 수 있어, 본 발명의 목적에 저해가 되지 않는 한 그 종류는 원핵생물, 고세균, 진핵생물 등 제한되지는 않지만, 구체적인 일예로 대장균(E. coli), 효모, 바실러스 (Bacillus sp.), 슈도모나스(Pseudomonas sp.), 코리네박테리움(Corynebacterium sp.), 크렙시엘라(Klebsiella sp.), 아스퍼질러스(Aspergillus sp.), 락토바실러스(Lactobacillus sp.), 페니실리움(Penicillium sp.), 자이모모나스(Zymomonas sp.) 및 스트렙토마이세스(Stretomyces sp.) 중에서 선택될 수 있으며, 좋게는 대장균(E. coli), 더욱 좋게는 대장균(E. coli) XL-1 blue일 수 있다. 상기 숙주 세포를 이용할 경우, 살모넬라 편모 유래 단백질의 발현이 우수하고 선별 및 정제를 보다 간단한 과정으로 수행할 수 있어 바람직하다.

본 발명의 다른 양태로, 본 발명은

c) 상기 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계; 및

이하, 상기 가용성이 개선된 살모넬라 플라젤린 유전자로부터 살모넬라 편모 유래 단백질의 발현과 선별 및 정제 과정에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명에서, 상기 유전자 라이브러리의 5'말단의 코딩 영역에 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 무작위로 치환된 동의 코돈(synonym codon)을 포함할 수 있으며, 상기 5′말단 코딩영역 내의 코돈은 N-말단의 개시코돈을 제외한, 두 번째 코돈으로부터 숙주 세포에서 통상적인 방법으로 제작할 수 있는 라이브러리 개수 를 넘지 않는 범위에 해당되도록 할 수 있는 코돈까지인 것이 바람직하며, 일예로 대장균의 경우 1×10⁹ CFU를 넘지 않는 범위로 두 번째 코돈으로부터 11번째 코돈까지 아미노산 서열을 동의코돈으로 무작위 치환을 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 범위에서 변이체 라이브러리의 제작이 원활히 이루어질 수 있으며, 선별 과정의 효율성이 향상될 수 있어 바람직하다.

본 발명에서, 상기 b)에서, 유전자 라이브러리의 3' 말단의 코딩 영역에 폴딩 리포터(folding reporter)를 코딩하는 유전자를 융합할 수 있다. 상기 폴딩 리포터는 별도의 링커 없이 직접 3'말단에 융합하는 것이 바람직하지만, 이에 제한되지 않으며, 폴딩 리포터는 선별 과정에서 단백질의 선별이 용이하도록 육안으로의 관찰이 가능하도록 형광을 나타내는 서열을 융합하거나 효소 반응 등을 수행하는 서열을 융합할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 살모넬라 플라젤린 유전자 라이브러리가 도입된 재조합 벡터를 이용함으로써, 발현된 살모넬라 편모 유래 단백질의 선별 및 정제가 동시에 가능하게 되어 바람직하다.

본 발명에서 상기 폴딩 리포터는 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 일예로, 엠체리(mCherry), GFP(green fluoresecent protein), YFP(yellow fluoresecent protein), RFP(red fluorescent protein) 및 CFP(cyan fluoresecent protein)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 좋게는 엠체리(mCherry)를 이용할 수 있다.

본 발명에서 상기 엠체리는 Synechocystis sp. 유래 DnaB 유전자로부터 발현되는 인테인과 융합되어 사용될 수 있고, 상기 GFP(green fluoresecent protein), YFP(yellow fluoresecent protein), RFP(red fluorescent protein) 또는 CFP(cyan fluoresecent protein)는 Nostoc punctiforme PCC73102 유래 DnaE 유전자로부터 발현되는 인테인과 융합되어 사용될 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니며, 이를 통해 3차원 접힘 후 특정 신호에 의해 스스로 분리되도록 할 수 있어 바람직하다.

본 발명에서 상기 숙주 세포는 도입된 상기 벡터로부터 살모넬라 플라젤린 유전자의 발현을 통해 가용성이 개선된 살모넬라 편모 유래 단백질을 얻을 수 있어, 본 발명의 목적에 저해가 되지 않는 한 그 종류는 원핵생물, 고세균, 진핵생물 등 제한되지는 않지만, 구체적인 일예로 대장균(E. coli), 효모, 바실러스 (Bacillus sp.), 슈도모나스(Pseudomonas sp.), 코리네박테리움(Corynebacterium sp.), 크렙시엘라(Klebsiella sp.), 아스퍼질러스(Aspergillus sp.), 락토바실러스(Lactobacillus sp.), 페니실리움(Penicillium sp.), 자이모모나스(Zymomonas sp.) 및 스트렙토마이세스(Stretomyces sp.) 중에서 선택될 수 있으며, 좋게는 대장균(E. coli), 더욱 좋게는 대장균(E. coli) XL-1 blue일 수 있다. 상기 숙주 세포를 이용할 경우, 살모넬라 편모 유래 단백질의 발현이 우수하고 선별 및 정제를 보다 간단한 과정으로 수행할 수 있어 바람직하다.

본 발명에서 상기 살모넬라 플라젤린 유전자는 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 염기서열로 이루어질 수 있다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

[시약, 재료 및 프로토콜]

대장균(E. coli) XL1-blue를 플라스미드 증폭 및 동의코돈 라이브러리 구축에 이용하였다.

플라젤린의 아미노/카르복실 말단을 암호화하는 유전자 및 가용성 살모넬라 플라젤린 유전자와 가용성 살모넬라 플라젤린 유전자 선별 및 단백질 정제를 위한 재조합 벡터 제작을 위한 Synechocystis sp. (이하 Ssp) Ssp DnaB 유전자를 코돈 최적화하여 IDT(Integrated DNA Technologies, 한국지사)에 의뢰해 합성하였다. 유전자를 합성하는 과정에서 인테인의 아미노 말단 부와 카르복실 말단 부의 상호작용으로 아미노 말단만 절단되도록, 카르복실 말단에 스플라이싱 활성 아미노산인 아스파라진을 알라닌으로 치환해 합성하였다(서열번호 5).

플라스미드 pSCT-mCherry (Cheong et al., Biotechnol. Bioeng. 112(4):822-826, 2015) 및 pMal-c2x (New England Biolabs, MA)는 골격 플라스미드로서, 아미노산 변화 및 추가 없이 정제 가능한 접힘 리포터 제작 및 단백질 스플라이싱을 통한 정제를 위해 친화성 표지가 융합된 인테인의 카르복실 영역을 얻기 위해 사용하였다.

[실시예 1] 플라스미드 및 동의 코돈 라이브러리 구축

플라젤린 동의코돈 라이브러리의 제작 및 정제를 위한 접힘 리포터(ImCherry) 제작에 사용된 DNA 취급법은 표준 프로토콜을 기반으로 하였다. 또한, 하기 표 1의 프라이머 쌍을 이용하여, 도 1의 개열 지도를 갖는 pSCT5-ImCherry, 도 2의 개열 지도를 갖는 pTac-Ssp_C 및 플라젤린 동의 코돈 라이브러리를 제작하였다.

현재까지 판매 혹은 보고된 인테인의 스플라이싱을 이용한 단백질 정제 방법의 경우, 두 조각으로 분리 가능한 스플릿 인테인(split intein)의 카르복실 말단 부를 목적 단백질의 아미노 말단에 융합한 단백질과 정제를 위한 친화성 표지의 카르복실 말단에 스플릿 인테인의 아미노 말단부를 융합한 단백질을 이용한다. 그러나 이와 같은 구조로 스플릿 인테인을 목적 단백질에 융합하는 경우, 목적 단백질 아미노 말단에 intein 에 단백질 스플라이싱을 위한 보존 아미노산 서열인 시스테인 또는 아스파라진 등의 아미노산이 추가되는 단점이 있다. 본 발명에서는 스플릿 인테인의 아미노 말단부와 리포터를 융합한 단백질을 목적 단백질의 카르복실 말단에 융합함으로써 목적 단백질에 아미노산 추가 없이 발현 양상이 개선된 동의 코돈 치환체의 선별 및 정제가 가능하도록 설계하였다.

동의 코돈 라이브러리 및 접힘 리포터 제작을 위한 프라이머 쌍

서열번호	프라이머 명칭	¹ Primer sequence (5'→3')	제한효소 자리
6	ImCherry F	ATA ² ACTAGT ATG GGA TGC ATT AGC GGC GAC TCA CTG ATT TCA CTT GCT GTG AGC AAG GGC GAG GAG G	SpeI F
7	ImCherry R	ATA AAG CTT CTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC	HindIII R
8	Ssp C F	ATA CAT ATG TCT ACT GGC AAA CGT GAG	NdeI
9	Ssp C R	ATA AAG CTT TTA ³ RTG RTG RTG RTG RTG RTG TGA NGC GTG TAC AAT AAT ATC GTT TG	HindIII
10	scvFliC F	ATA ACT AGT ATG CGN GGN TCN CAY CAY CAY CAY CAY CAY GGN	SpeI
11	scvFliC R	ATA ATG CAT CGC AGC AGG CTT AAC ACA TTC	NsiI
비고 ¹Y = C + T; R = A + G; H = A + T; N = A + T + G + C ²각 프라이머의 밑줄 부분은 제한효소 자리를 나타냄 ^3" RTG RTG RTG RTG RTG RTG"는 Hisㅧ6을 나타냄

pSCT5-mCherry 플라스미드를 주형으로 스플릿 인테인인 Ssp DnaB 인테인의 아미노 말단 13개 아미노산을 암호화하는 서열을 포함한 ImCherry F 및 ImCherry R 프라이머 쌍을 이용하여 mCherry의 아미노 말단에 Ssp DnaB intein 의 카르복실 말단이 융합된 ImCherry 를 PCR 을 통해 증폭한 후 SpeI 및 HindIII 제한 효소로 처리하여, 동일한 제한 효소로 처리를 통해 mCherry가 제거된 pSCT5-mCherry에 클로닝하여 pSCT5-ImCherry를 제작하였다.

상기 Ssp DnaB 유전자의 카르복실 말단을 표 1의 Ssp C F 와 6 x His tag을 포함한 Ssp C R 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 증폭 후, NdeI 및 HindIII 제한 효소로 처리하였다. 상기 과정을 통해 수득한 DNA 단편들을 상기와 동일한 제한 효소로 처리해 pMal-c2X 플라스미드에서 MBP(maltose binding protein)를 제거한 후, Ssp C를 클로닝하여 pTac-Ssp_C 를 제작하였다.

살모넬라 플라젤린 유전자(FliC)에 대한 동의 코돈 라이브러리(pSCT5-scvFliC_ImCherry)는 scvFliC F 및 R 프라이머를 이용하여 증폭하여, 동의 코돈이 무작위로 도입된 scvFliC를 SpeI 및 NsiI 제한 효소로 처리하고, 상기와 같이 제작한 DNA 단편을 상기와 동일한 제한 효소로 처리한 pSCT5-ImCherry에 라이게이션(ligation)하여 구축하였다.

[실시예 2] 단백질 발현 및 발현 패턴 분석

100 ㎍/㎖ 앰피실린을 함유하는 LB(Luria-Bertani, Sigma-Aldrich) 고체 배지에서 ImCherry 형광이 빠르게 나타나는 순서를 기준으로 15개 변이체를 선별하였다.

상기와 같이 ImCherry의 적색형광 강도를 근거로 하여 선별된 변이체들을 100 ㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 4 ㎖ LB(Luria-Bertani, Sigma-Aldrich) 액체 배지에 접종하고, 30 ℃에서 240 rpm으로 진탕 배양 하였다. 12시간 배양 후, 동일한 조성을 갖는 4 ㎖ LB 액체 배지에 1 % (v/v) 접종 후 동일한 조건에서 본배양하였다. 배양액의 600 nm에서의 광학 밀도(OD₆₀₀)가 0.5 부근에 도달하였을 때, 최종 농도가 0.2 mM이 되도록 4 ㎕ 200 mM IPTG(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가 한 후 3시간 추가 배양하였다. 배양이 끝나는 시점에서 OD₆₀₀를 2.0으로 보정하여, 4℃에서 8,000 rpm으로 원심분리하여 세포를 수확하였다.

수확한 세포를 200 ㎕의 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)에 재현탁 후, 4 ℃에서 2초간 초음파 처리하여 세포를 파쇄한 후, 불용성 응집물을 4 ℃에서 20 분간 14,000 rpm에서 원심분리하여 제거하였다. 초음파 처리 후, 세포 파쇄물로부터 총(전체) 단백질을 수득하였고, 이후 원심분리하여 얻은 상층액을 가용성 단백질 분획물로 이용하였다. 총(전체) 및 가용성 단백질을 SDS 시료 로딩 완충액(0.225M Tris-HCl pH 6.8; 50 % 글리세롤, 5 % SDS, 0.005 브로모페놀 블루 및 0.25 M 디티오트레이톨(DTT))에 1:5 비율로 첨가하고, 15분간 끓인 후, 12% (w/v) SDS-PAGE에 전개시켰다. 전기영동 후, 겔을 쿠마씨 블루 염색 용액으로 염색하였다.

상기 과정을 통해 ImCherry 형광과 SDS-PAGE로 발현양상을 비교하였다(도 3, 도 4). SDS-PAGE 결과 8번 변이체는 전체 플라젤린 유전자가 삽입된 것과 비교해서 크기가 작게 나타나 이 후 실험에서 제외하였다. 또한, 야생형 플라젤린과 ImCherry 융합체는 형광이 매우 낮아 육안이 아닌 기계적으로는 측정이 가능하였으나, SDS-PAGE에서는 발현을 관찰할 수 없었다. 반면 8번 변이체를 제외한, 나머지 14개의 선별된 변이체들의 과발현 양상을 SDS-PAGE에서 관찰하였다. 이로부터 5, 6, 7 및 9번 변이체의 형광이 다른 변이체에 비해 높게 나타나는 것을 확인하였다.

형광이 증가한 변이체의 염기서열 검증

상기 5, 6, 7 및 9번 변이체에 대하여 통상적인 염기서열 분석을 수행하였다. 그 결과, 5'말단의 코돈이 동의코돈으로 치환되었으며 아미노산에는 변화가 없음을 확인하였다(서열번호 1 내지 4).

형광이 증가한 변이체의 가용성

상기 변이체의 가용성 발현 검증을 위해 플라스미드를 정제하고 상기와 같은 방법으로 대장균 XL1-Blue에 재도입하여 야생형과의 발현을 비교하였다(도 5). 상기 결과로부터, 야생형과 ImCherry를 융합한 플라젤린 단백질은 SDS-PAGE 관찰 결과 육안으로 발현을 관찰할 수 없었던 반면, 선별된 변이체에서는 플라젤린 단백질의 전체 발현양의 90%이상이 가용성인 것을 확인하였다.

이는 mRNA의 번역속도가 단백질 발현 과정에서 중요한 단계인 번역 개시 단계와 밀접한 관련이 있는 아미노 말단 영역을 암호화하는 코돈을 무작위 변형함으로써 mRNA의 2차 구조 및 가용 tRNA pool 변화를 유도하여 가용성 단백질의 생산 비율을 증가시키기 때문인 것으로 유추할 수 있다.

[실시예 3] 플라젤린 단백질의 정제

상기 실시예를 통해 선별한 변이체 중 실험간 발현 편차가 가장 적어 안정적으로 과발현이 유도된 7번 변이체인 scvFliC #7을 하기와 같은 방법으로 정제하였다.

pTac-Ssp_C

상기와 같이 제작한 pTac-Ssp_C를 E. coli XL1-Blue에 형질전환 후, 100 ㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 10 ㎖ LB 액체 배지에 접종하고, 30 ℃에서 240 rpm으로 진탕 배양 하였다. 밤새 배양 후, 동일한 조성을 갖는 500 ㎖ LB 액체 배지에 1% (v/v) 접종 후 동일한 조건에서 본배양하였다. OD₆₀₀이 0.5 부근에 도달하였을 때, 최종 농도가 0.2 mM이 되도록 4 ㎕ 200 mM IPTG를 첨가한 후 동일 조건에서 3시간 추가 배양하였다. 배양이 끝나는 시점에서 6000 rpm으로 원심분리하여 세포를 수확하고, 50 ㎖의 DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, Thermo Fisher Scientific)에 재현탁 후 초음파 처리하여 세포를 파쇄하였다.

이후 4 ℃, 14,000 rpm에서 15 분간 원심분리하여 불용성 응집체를 제거하고, 1 ㎖ Histrap FF 컬럼(GE Healthcare Life Sciences)에 고속 단백질 액체 크로마토그래피(Fast Protein Liquid Chromatography, FPLC)을 이용하여 1 ㎖/min 속도로 로딩하였다. 이후 20 mM 이미다졸(imidazole)을 포함한 DPBS 처리를 통해 비특적 결합한 단백질을 제거하였다.

pSCT5-scvFliC_ImCherry

상기와 같이 제작한 pSCT5-scvFliC_ImCherry를 E. coli XL1-Blue에 형질전환 후, 상기 Ssp_C가 결합된 1 ㎖ Histrap FF 컬럼에 FPLC를 이용하여 1 ㎖/min 속도로 로딩하였다.

인테인(intein)의 단백질 스플라이싱(protein splicing)을 이용하여 접힘 리포터(folding reporter)인 ImCherry 가 제거된 scvFliC를 얻기 위해, 도 6에 묘사한 절차에 따라 하기와 같이 진행하였다.

친화성 표지가 융합된 스플릿 인테인의 카르복실 말단 부위를 Histrap FF 에 로딩 한다. 이후 동일 컬럼에 스플릿 인테인의 아미노 말단 부위와 mCherry 가 카르복실 말단에 융합된 scvFliC를 로딩하면, 스플릿 인테인에 카르복실 말단 부와 아미노 말단 부의 상호 작용으로 컬럼 내부에 잔류한다. 이후 단백질 스플라이싱 유도를 위해 두 단백질이 결합하고 있는 상기 컬럼에 50 mM 디티오트레이톨(DTT)을 포함한 DPBS를 주입하고, 37 ℃에서 2 시간동안 처리하여 scvFliC 만을 수득하였다. 야생형 인테인의 경우, DTT 를 처리하면 아미노 말단과 카르복실 말단 모두 절단되어 scvFliC 이외에 인테인도 용출되나, Ssp DnaB 인테인의 합성 과정에서 카르복실 말단의 활성(active site) 아미노산인 아스파라진을 알라닌으로 치환해 카르복실 말단이 절단되지 못하도록 함으로써, scvFliC 와 아미노 말단 부 인테인 사이의 펩타이드 결합만 절단되어 용출되도록 설계하였다.

그 결과, 도 7에서 확인할 수 있듯이 400 ㎖ 배양액으로부터 약 90 %이상 순도를 갖는 1.63 ㎎의 플라젤린 단백질을 정제하였다. 이로부터 인테인을 사용한 단순한 공정을 통하여, 아미노산을 플라젤린 단백질에 남기지 않으면서도, 단일 공정을 통해 고발현된 단백질인 폴딩 리포터 등의 특정 목적의 융합파트너를 지닌 단백질을 용이하게 회수 가능한 현저한 효과가 있음을 확인하였다.

[실시예 4] 플라젤린 단백질의 활성 측정

대장균 내독소 전처리

정제한 플라젤린이 갖는 면역활성을 측정하기 위해, 먼저 톨-유사 수용체4 를 통해 면역을 자극하는 대장균 내독소(endotoxin)를 Pierce에서 판매하는 High Capacity Endotoxin Removal Spin Column을 사용하여 단백질 정제 용액에서 완전히 제거하고, 내독소 잔류 농도는 Limulus Amebocyte Lysate QCL-1000 (Cambrex, Walkersille, MD, USA)에서 제공하는 방법을 이용해 측정하여, 내독소가 완전히 제거된 것을 확인하여 불순물에 의한 부반응 유발 가능성을 원천적으로 차단하였다.

플라젤린 단백질 활성 측정

정제한 플라젤린 단백질의 톨-유사 수용체5 자극 유무 확인을 위해, 톨-유사 수용체 5 (Toll-like receptor 5;TLR5)를 갖는 HEK293 세포주(ATCC CRL-11268G-1)를 pOZ-mTLR5(Addgene, 미국지사)로 형질주입(transfection)하였다. 플라젤린 단백질의 면역 반응을 확인하기 위해, 형질주입된 HEK293-mTLR5에 NF-kB 프로모터를 갖는 pNiFty-SEAP(InvivoGen, San Diego, CA, USA)로 형질주입하였다.

pNiFty-SEAP가 형질주입된 HEK293-mTLR5를 96 웰-플레이트(well-plate)에 5×10⁴ 세포/웰로 첨가하고 5 % CO₂환경의 37℃ 배양기에서 하루 동안 배양하였다. 배양한 세포를 PBS(Phosphate Buffered Saline)으로 2회 세척한 후 정제한 플라젤린 단백질을 0.1 ng/㎖, 1 ng/㎖, 10 ng/㎖, 100 ng/㎖ 및 1㎍/㎖의 농도별로 처리하였다. 각 실험 군에 대해 multiwell plate reader(TECAN)를 이용해 SEAP (secreted alkaline phosphatase)의 신호를 측정하여 활성을 측정하였다.

이 때, 대조군으로는 플라젤린 단백질을 트립신 처리하여 분해한 것, 트립신 및 PBS의 3개군을 선정하여 동일한 측정 방법으로 활성을 비교하였다.

그 결과 도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 플라젤린 단백질을 1 ng/㎖ 처리했을 때 트립신으로 분해한 플라젤린 또는 PBS를 처리한 것 대비 2배 가까이 높은 신호가 나타나는 것을 확인하였다. 이를 통해 플라젤린 단백질의 구조적 특징이 NF-kB에 의해 발현되는 단백질에 따른 면역 자극 반응과 밀접한 관계가 있음을 유추할 수 있으며, 이로부터 본 발명을 통해 선별한 가용성이 증가한 살모넬라 플라젤린 단백질이 고유의 3차원 구조를 유지하여 본래의 기능성을 유지하고 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

<110> University Industry Liaison Office Of Chonnam National University <120> Transformants for expressing flagellin protein derived from Salmonella sp. with improved solubility, preparation method and use thereof <130> P17120771475 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ssp flagellin gene 1 <400> 1 atgcgaggtt ctcatcacca ccaccaccac ggaatggcct cgatgacggg gggtcagcag 60 atgggtcgcg atctctatga tgacgatgac aaagatccaa tggcacaggt gattaacacc 120 aactctttaa gcctgcttac acagaataac cttaataaga gccagagctc cctttccagt 180 gcaattgaaa ggctgagtag cggtttacgt ataaactctg caaaagatga tgctgccggg 240 caggcgatcg cgaatagatt tacaagcaat ataaaagggt taacacaggc tagccgcaat 300 gcaaacgatg gtatatctat cgcgcagact acggaaggtg cactgaatga aataaacaat 360 aatctccaaa gagtgcgtga actgtcggtt caagcaacca atggtacgaa ttcagatagc 420 gacctgaaaa gcatccaaga cgaaattcag caacgtctgg aggaaatcga ccgcgtaagt 480 aaccaaaccc aatttaatgg agttaaagtt ctgagccagg ataatcagat gaaaattcaa 540 gttggtgcta atgatggaga gactattaca atcgacttgc aaaagatcga tgttaaaagt 600 ctgggtctgg atggtttcaa cgtcaactct cctggtattt ccggtggcgg tggtggcata 660 ctcgactcta tgggaaccct aattaatgag gatgcagcgg cagctaagaa aagcactgct 720 aatccgctgg catccatcga tagcgcattg agcaaagtag atgcggtgcg gagttccctt 780 ggcgcaattc agaatcggtt tgattctgcc atcactaatc tgggaaacac agtcaccaac 840 ttaaattcag cacgctcacg tattgaggac gcggactacg cgaccgaagt ctcgaacatg 900 agcaaggcac agattctgca gcaagcgggc acgagtgttc ttgcccaggc aaaccaggta 960 ccgcagaatg tgttaagcct gctgcgttag 990 <210> 2 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ssp flagellin gene 2 <400> 2 atgcgagggt ctcaccacca ccaccaccac ggaatggcct cgatgacggg gggtcagcag 60 atgggtcgcg atctctatga tgacgatgac aaagatccaa tggcacaggt gattaacacc 120 aactctttaa gcctgcttac acagaataac cttaataaga gccagagctc cctttccagt 180 gcaattgaaa ggctgagtag cggtttacgt ataaactctg caaaagatga tgctgccggg 240 caggcgatcg cgaatagatt tacaagcaat ataaaagggt taacacaggc tagccgcaat 300 gcaaacgatg gtatatctat cgcgcagact acggaaggtg cactgaatga aataaacaat 360 aatctccaaa gagtgcgtga actgtcggtt caagcaacca atggtacgaa ttcagatagc 420 gacctgaaaa gcatccaaga cgaaattcag caacgtctgg aggaaatcga ccgcgtaagt 480 aaccaaaccc aatttaatgg agttaaagtt ctgagccagg ataatcagat gaaaattcaa 540 gttggtgcta atgatggaga gactattaca atcgacttgc aaaagatcga tgttaaaagt 600 ctgggtctgg atggtttcaa cgtcaactct cctggtattt ccggtggcgg tggtggcata 660 ctcgactcta tgggaaccct aattaatgag gatgcagcgg cagctaagaa aagcactgct 720 aatccgctgg catccatcga tagcgcattg agcaaagtag atgcggtgcg gagttccctt 780 ggcgcaattc agaatcggtt tgattctgcc atcactaatc tgggaaacac agtcaccaac 840 ttaaattcag cacgctcacg tattgaggac gcggactacg cgaccgaagt ctcgaacatg 900 agcaaggcac agattctgca gcaagcgggc acgagtgttc ttgcccaggc aaaccaggta 960 ccgcagaatg tgttaagcct gctgcgttag 990 <210> 3 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ssp flagellin gene 3 <400> 3 atgcgaggat cacatcacca ccatcaccac ggtatggcct cgatgacggg gggtcagcag 60 atgggtcgcg atctctatga tgacgatgac aaagatccaa tggcacaggt gattaacacc 120 aactctttaa gcctgcttac acagaataac cttaataaga gccagagctc cctttccagt 180 gcaattgaaa ggctgagtag cggtttacgt ataaactctg caaaagatga tgctgccggg 240 caggcgatcg cgaatagatt tacaagcaat ataaaagggt taacacaggc tagccgcaat 300 gcaaacgatg gtatatctat cgcgcagact acggaaggtg cactgaatga aataaacaat 360 aatctccaaa gagtgcgtga actgtcggtt caagcaacca atggtacgaa ttcagatagc 420 gacctgaaaa gcatccaaga cgaaattcag caacgtctgg aggaaatcga ccgcgtaagt 480 aaccaaaccc aatttaatgg agttaaagtt ctgagccagg ataatcagat gaaaattcaa 540 gttggtgcta atgatggaga gactattaca atcgacttgc aaaagatcga tgttaaaagt 600 ctgggtctgg atggtttcaa cgtcaactct cctggtattt ccggtggcgg tggtggcata 660 ctcgactcta tgggaaccct aattaatgag gatgcagcgg cagctaagaa aagcactgct 720 aatccgctgg catccatcga tagcgcattg agcaaagtag atgcggtgcg gagttccctt 780 ggcgcaattc agaatcggtt tgattctgcc atcactaatc tgggaaacac agtcaccaac 840 ttaaattcag cacgctcacg tattgaggac gcggactacg cgaccgaagt ctcgaacatg 900 agcaaggcac agattctgca gcaagcgggc acgagtgttc ttgcccaggc aaaccaggta 960 ccgcagaatg tgttaagcct gctgcgttag 990 <210> 4 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ssp flagellin gene 4 <400> 4 atgcgaggat cacatcacca ccatcaccac ggtatggcct cgatgacggg gggtcagcag 60 atgggtcgcg atctctatga tgacgatgac aaagatccaa tggcacaggt gattaacacc 120 aactctttaa gcctgcttac acagaataac cttaataaga gccagagctc cctttccagt 180 gcaattgaaa ggctgagtag cggtttacgt ataaactctg caaaagatga tgctgccggg 240 caggcgatcg cgaatagatt tacaagcaat ataaaagggt taacacaggc tagccgcaat 300 gcaaacgatg gtatatctat cgcgcagact acggaaggtg cactgaatga aataaacaat 360 aatctccaaa gagtgcgtga actgtcggtt caagcaacca atggtacgaa ttcagatagc 420 gacctgaaaa gcatccaaga cgaaattcag caacgtctgg aggaaatcga ccgcgtaagt 480 aaccaaaccc aatttaatgg agttaaagtt ctgagccagg ataatcagat gaaaattcaa 540 gttggtgcta atgatggaga gactattaca atcgacttgc aaaagatcga tgttaaaagt 600 ctgggtctgg atggtttcaa cgtcaactct cctggtattt ccggtggcgg tggtggcata 660 ctcgactcta tgggaaccct aattaatgag gatgcagcgg cagctaagaa aagcactgct 720 aatccgctgg catccatcga tagcgcattg agcaaagtag atgcggtgcg gagttccctt 780 ggcgcaattc agaatcggtt tgattctgcc atcactaatc tgggaaacac agtcaccaac 840 ttaaattcag cacgctcacg tattgaggac gcggactacg cgaccgaagt ctcgaacatg 900 agcaaggcac agattctgca gcaagcgggc acgagtgttc ttgcccaggc aaaccaggta 960 ccgcagaatg tgttaagcct gctgcgttag 990 <210> 5 <211> 471 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ssp DnaB gene <400> 5 atgggatgca ttagcggcga ctcactgatt tcacttgctt ctactggcaa acgtgtgagc 60 attaaggacc ttctggatga gaaagatttt gagatttggg caatcaacga acagaccatg 120 aagttagagt cagcgaaagt gtctcgcgta ttctgtacag gtaaaaagtt agtgtatatt 180 ctcaaaaccc gtctggggcg cacgatcaaa gctaccgcaa atcatcgttt cttgaccatt 240 gatggttgga aacgcttaga tgaattgagc ttgaaagaac acattgcgct gccccgtaaa 300 ttggagtcaa gctccttgca gctttccccc gagattgaaa agctgtcaca gagtgatatt 360 tactgggatt caatcgtgtc gattacggag actggggtgg aagaagtctt cgatctgacg 420 gttccaggtc ctcataattt tgtggcaaac gatattattg tacacgcatc a 471 <210> 6 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ImCherry F <400> 6 ataactagta tgggatgcat tagcggcgac tcactgattt cacttgctgt gagcaagggc 60 gaggagg 67 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ImCherry R <400> 7 ataaagcttc tacttgtaca gctcgtccat gc 32 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ssp C F <400> 8 atacatatgt ctactggcaa acgtgag 27 <210> 9 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ssp C R <400> 9 ataaagcttt tartgrtgrt grtgrtgrtg tgangcgtgt acaataatat cgtttg 56 <210> 10 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scvFliC F <400> 10 ataactagta tgcgnggntc ncaycaycay caycaycayg gn 42 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scvFliC R <400> 11 ataatgcatc gcagcaggct taacacattc 30

Claims

가용성이 개선된 살모넬라 편모 유래 단백질을 코딩하는,
서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 염기서열로 이루어진 살모넬라 플라젤린 유전자.
제 1항의 살모넬라 플라젤린 유전자가 도입된 벡터.
제 2항의 벡터로 형질전환된, 인간을 제외한 형질전환체.
제 3항에 있어서,
상기 형질전환체는 대장균(E. coli), 효모, 바실러스 (Bacillus sp.) 슈도모나스(Pseudomonas sp.), 코리네박테리움(Corynebacterium sp.), 크렙시엘라(Klebsiella sp.), 아스퍼질러스(Aspergillus sp.), 락토바실러스(Lactobacillus sp.), 페니실리움(Penicillium sp.), 자이모모나스(Zymomonas sp.) 및 스트렙토마이세스(Stretomyces sp.) 중에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
a) 개시코돈을 제외한 5′말단 코딩영역 내의 코돈에 대해, 동요염기(動搖鹽基; wobble base)가 도입된 프라이머를 이용하여, 살모넬라 플라젤린 유전자 라이브러리를 제작하는 단계;
b) 상기 살모넬라 플라젤린 유전자 라이브러리로부터, 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 염기서열로 이루어진 살모넬라 플라젤린 유전자가 포함된 재조합 벡터를 제작하는 단계;
c) 상기 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계; 및
d) 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 가용성이 개선된 플라젤린 단백질을 선별 및 정제하는 단계;
를 포함하는, 가용성이 개선되고 아미노산이 부가되지 않는 살모넬라 편모 유래 플라젤린 단백질을 코딩하는, 제 1항의 살모넬라 플라젤린 유전자의 선별방법.
제 5항에 있어서,
상기 유전자 라이브러리의 5'말단의 코딩 영역에 무작위로 치환된 동의 코돈(synonym codon)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 살모넬라 플라젤린 유전자의 선별방법.
제 5항에 있어서,
상기 b)에서, 유전자 라이브러리의 3' 말단의 코딩 영역에 폴딩 리포터(folding reporter)를 코딩하는 유전자를 융합하는 것을 특징으로 하는, 살모넬라 플라젤린 유전자의 선별방법.
제 5항에 있어서,
상기 재조합 벡터는
발현된 살모넬라 편모 유래 단백질의 선별 및 정제가 동시에 가능하도록 하는 것을 특징으로 하는, 살모넬라 플라젤린 유전자의 선별방법.
제 7항에 있어서,
상기 폴딩 리포터는 엠체리(mCherry), GFP(green fluoresecent protein), YFP(yellow fluoresecent protein), RFP(red fluorescent protein) 및 CFP(cyan fluoresecent protein)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 살모넬라 플라젤린 유전자의 선별방법.
제 9항에 있어서,
상기 엠체리는 Synechocystis sp. 유래 DnaB 유전자로부터 발현되는 인테인과 융합되어 사용되는 것을 특징으로 하는, 살모넬라 플라젤린 유전자의 선별방법.
제 9항에 있어서,
상기 GFP(green fluoresecent protein), YFP(yellow fluoresecent protein), RFP(red fluorescent protein) 또는 CFP(cyan fluoresecent protein)는 Nostoc punctiforme PCC73102 유래 DnaE 유전자로부터 발현되는 인테인과 융합되는 것을 특징으로 하는, 살모넬라 플라젤린 유전자의 선별방법.
삭제
제 2항에 있어서,
상기 벡터는 도 1의 개열지도를 갖는 재조합 벡터 pSCT-ImCherry인 것을 특징으로 하는 벡터.