KR101587433B1 - 5′말단 코딩 영역의 코돈을 동의 코돈으로 무작위 치환하여 기능성 발현이 증진된 단백질을 코딩하는 유전자 선별 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단백질을 암호화하는 유전자의 5′말단의 코돈을 동의 코돈으로 무작위 치환하여 기능성 발현이 증대된 단백질을 선별하는 방법에 관한 것으로, 상세하게는 종래의 단백질 발현에서의 문제점인 불용성 봉입체(inclusion body)의 형성, 단백질의 낮은 발현량 또는 활성(activity)의 향상에 대한 문제점을 극복하기 위하여 개시 코돈을 제외한 초기 10개의 코돈을 동의 코돈(synonymous codon)으로 무작위 치환 후 폴딩 리포터의 융합을 통해 기능성 발현이 증가된 변이체를 선별할 수 있는 유전자 선별 방법과 상기 선별 방법으로 선별된 유전자 변이체 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

5′말단 코딩 영역의 코돈을 동의 코돈으로 무작위 치환하여 기능성 발현이 증진된 단백질을 코딩하는 유전자 선별 방법{Method of screening genes encoding a protein with enhanced functional expression using randomly substituted synonymous codon of 5′terminal coding region}
본 발명은 5′말단 코딩 영역의 코돈을 동의 코돈으로 무작위 치환하여 기능성 발현이 증진된 단백질을 코딩하는 유전자 선별 방법에 관한 것이다.
일반적으로 이종 단백질(heterologous protein)들의 발현에 있어서, 비용, 효율 및 편리성 때문에 효모 및 대장균(Escherichia coli)과 같은 대리 숙주들이 단백질 발현 시스템으로서 이용되어 왔다. 상기 숙주들의 경우 클로닝, 단백질 발현 및 정제를 위한 분자적 수단들이 잘 갖춰 있으나, 이종 단백질들이 불용성 및 비-기능 형태로 생산되는 문제가 종종 발생한다. 이를 해결하기 위해, 분자 샤페론의 공동-발현, 말토오스-결합 단백질(MBP), NusA 및 글루타티온 S-트랜스퍼라아제(GST)과 같은 가용성 파트너의 융합 및 단백질 발현 유도 조건 최적화 등의 다양한 방법들이 활용되고 있다. 그러나 이러한 전형적인 방법들은 시간 소모적이며 많은 노력을 필요로 한다.
최근 유전자 전사물의 5′비번역 영역 (5′UTR) 및 5′말단 코딩 영역의 구조적 특징이 단백질 발현량과 밀접하게 관련되어 있다는 연구결과가 보고되고 있다(Gopal and Kumar 2013, Science 342(6157):475-479). 단백질 발현은 전사 기구의 핵심 구성요소인 리보솜의 작은 서브유닛이 mRNA 5′UTR 상의 샤인-달가노(SD) 서열과의 결합에 의해 개시된다. 따라서 5′UTR의 구조는 리보솜의 결합을 조절함으로써, 전사 효율에 영향을 미친다. 또한, 리보솜이 전사 개시 동안 개시 코돈의 양 측면의 약 15 내지 25 개의 뉴클레오티드를 에워싸기 때문에, 유전자의 5′말단 코딩 영역 또한 유전자 발현에 영향을 줄 수 있다. 비록 5′말단 코딩 영역과 유전자 발현 사이의 관계에 대한 보고는 많지 않으나, N-말단 연장 및 단백질의 N-말단을 암호화하는 코돈의 추출 및 비교를 통해 수득된 증거들은 5′말단 코딩 영역의 서열의 구조적 특징이 번역 개시 및 단백질 발현에 연관되어 있음을 보여주고 있다(Goltermann et al. 2011, ProteinEng Des Sel. 24(1-2):123-129). 일본공개특허 제2006-506986호에 동의 코돈의 최적화를 이용하여 유전자 발현을 최적화하기 위한 방법에 관하여 개시되어 있고, 한국공개특허 제2005-0083691호에 코돈 번역 효율에 기초한 유전자 발현 시스템에 관한 기술에 대하여 개시되어 있다. 그러나 일본공개특허 제2006-506986호의 경우, 단백질을 암호화하는 모든 코돈을 동의 코돈으로 전환하는 것에 관한 것으로, 현존하는 어떠한 방법의 선별 방법(Ribosomal display, in vitro compartmentalization, 및 phage display 등)으로도 그 경우의 수(라이브러리 크기)를 감당할 수 없어 현실적 활용이 어려운 이론적 방법이다. 후자의 경우 단백질을 암호화하는 유전자의 코돈뿐만 아니라 동의 코돈에 대한 tRNA의 삽입이 전제되어 본 발명의 방법보다 복잡하며 활용범위가 제한적이다. 이와 더불어 본 발명의 5′말단 코딩 영역 일부를 동의 코돈으로 무작위 치환하는 유전자 선별 방법에 대해서 보고된 바 없으며, 종래의 방법의 경우, 발현량의 문제뿐만 아니라, 불용성 단백질인 봉입체(inclusion body)의 생성 또는 활성(activity)의 문제 등이 해소되지 않은 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 5′말단 코딩 영역의 코돈을 동의 코돈으로 무작위 치환하여 기능성 발현이 증진된 단백질을 코딩하는 유전자의 선별 방법에 관한 것으로, 유전자의 5′말단 코딩 영역의 코돈을 동의 코돈으로 무작위 치환 후 선별된 유전자가 암호화하는 단백질의 가용성, 활성 및 발현량이 향상될 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(1) 개시 코돈을 제외한 5′말단 코딩 영역 내의 코돈에 대하여 워블 염기(wobble base)가 축퇴된 프라이머를 합성하는 단계;
(2) 상기 축퇴된 프라이머를 이용하여 무작위로 치환된 동위 코돈을 포함하는 유전자 라이브러리를 생산하는 단계;
(3) 상기 동위 코돈을 포함하는 유전자 라이브러리를 재조합 벡터에 삽입하여 숙주 세포를 형질전환시키는 단계; 및
(4) 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 기능이 증진된 단백질을 선별하는 단계;를 포함하는 기능이 증진된 단백질을 코딩하는 유전자의 선별 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 단백질의 가용성, 활성 또는 발현량이 증진된 단백질을 코딩하는 유전자의 선별 방법으로 선별된 유전자를 재조합 벡터에 삽입하여 숙주 세포를 형질전환시킨 후, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 가용성, 활성 또는 발현량이 증진된 단백질의 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 5′말단 코딩 영역에 무작위 치환된 동의 코돈을 포함하는 유전자의 선별 방법 및 가용성, 활성 또는 발현량이 증진된 단백질의 생산 방법에 관한 것이다. 상세하게는 유전자의 5′말단 코딩 영역 내에서 동의 코돈의 치환이 가용성, 활성 또는 단백질 발현 수준을 향상시킬 수 있으며, 본 발명의 유전자의 선별 방법으로 획득한 유전자 변이체가 생물정보학적 접근법에 의한 예측 데이터를 기반으로 획득된 유전자 변이체 보다 더욱 유용할 수 있다는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 유전자의 선별 방법은 대사 공학 및 구조 생물학과 같은 다양한 생명공학 분야에서 요구하는 가용성, 활성 또는 발현량이 증진된 단백질을 획득할 수 있는 선별 수단으로 제공될 수 있다.
도 1은 벡터 pMtac 및 pSCT5를 나타낸 도면이다. 동의 코돈 변이체들의 골격 플라스미드로서, leaky Lac 오퍼레이터(operator)를 포함하는 pMal-c2x 및 pQE30을 이용하여 획득하였다. (A) High fidelity Phusion DNA 중합효소, 엠체리(mCherry) F와 R 프라이머를 이용하여 증폭하였으며, EcoRI과 HindⅢ로 절단하고, 동일한 제한효소(REase)로 절단한 pMal-c2x에 라이게이션하였다. (B) pSCT5는 엠체리 클로닝에 의해 MaltoQ30 F(단백질의 아미노 말단에 아미노산의 추가 없이 라이브러리 제작을 위해 RBS, SpeI 및 ATG 개시 코돈을 포함시켰다) 및 mCherry R 프라이머를 이용하여 증폭한 mCherry를 EcoRI과 HindⅢ로 절단한 pQE30에 라이게이션 하여 제작하였다.
도 2는 다양한 발현 시스템에서 CelEdx-SF301의 발현 양상을 분석한 도면이다. (A) 벡터 pET22b에 클로닝된 CelEdx-SF301을 0.5mM IPTG로 유도(induction) 후, 4시간 동안 30℃와 40℃의 두 온도에서 발현한 것으로, 엑소셀룰라아제 CelEdx-SF301이 불용성 응집체 형태로 발현되는 것을 확인한 것이다. (B) 엑소셀룰라아제, CelEdx-SF301의 가용성 발현의 증대를 위해 엑소셀룰라아제의 N-말단에 GST를 융합하기 위해 CelEdx - SF301을 pGEX-2T 발현 벡터에 클로닝한 것이다. (C) 벡터 pET22b에 클로닝한 CelEdx-SF301을 분자 샤페론이 삽입된 플라스미드 pGro7, pKKE7 및 pG-Tf2는 유전자 GroES-GroEL, DnaK-DnaJ-GrpE 및 GroES-GroEL-Tigf을 효과적으로 코딩하였으며, 빨간색 화살표는 타겟 단백질의 크기(kDa)를 나타내고(A와 C는 CelEdx-SF301이고, B는 GST가 융합된 CelEdx-SF301이다), T는 총(전체) 단백질이고, S는 가용성 분획이다.
도 3은 유전자 변이체의 가용성 발현을 비교하기 위해, 변이체에 융합된 mCherry 및 엑소셀룰라아제의 활성으로 생성된 MU 형광 강도를 측정한 결과이다. (A) SF301, mCherry가 융합된 SF301 및 mCherry가 융합된 scvSF301 변이체의 기능성 발현이 증진된 수준을 90㎕의 가용성 분획 및 10㎕의 1mM MUG2를 혼합한 후, 37℃에서 20분간 정치하여 엑소셀룰라아제의 활성으로 유리된 MU의 형광강도로 비교하였다. 엑소셀룰라아제에 의해 MUG2로부터 방출된 MU는 VICTORⅢ 멀티라벨 플레이트 검독기(PerkinElmer, CT)를 이용해 355nm의 파장에서 여기하고, 460nm의 발광 파장에서 검출하였다. MBP-융합된 mCherry의 적색 형광 강도가 야생형 SF301 및 scvSF301의 것에 비해 훨씬 커 형광 강도를 나타내지 않았다. 청색 및 적색 막대(bar)는 각각 MU 및 mCherry 형광 강도를 나타낸다. (B) mCherry 융합이 엑소셀룰라아제의 활성에 미치는 영향을 조사하기 위해, scvSF301-mCherry 및 scvSF301에 의해 MUG2로부터 방출되는 MU를 추정하였다. 야생형 CelEdx-SF301의 활성은 그 어느 경우에도 검출되지 않았다. 본 실험은 3회씩 독립적으로 실시하였다.
도 4는 tac 프로모터의 제어 하에 선별된 엠체리(mCherry)가 융합된 scvSF301의 발현 양상을 분석한 결과이다. MBP-융합 mCherry는 pMal-c2x에 클로닝되었고, 음성 대조군으로 사용되었다. 빨간색 화살표는 엠체리(mCherry) 융합된 scvSF301의 발현을 나타내며, 검은색 화살표는 알 수 없는 단백질이지만 mCherry가 융합된 SF301 및 scvSF301 변이체들의 강도(intensity)를 표준화하는 내부 기준으로 사용하였다. Lane SF301 및 SF301-mCherry은 야생형 유전자로부터 발현된 것으로 극단적으로 낮은 발현량을 나타내었다. T는 총(전체) 단백질이고, S는 가용성 분획을 나타낸다. 본 실험은 독립적으로 3번 반복실시하였다.
도 5는 5′말단 코딩 영역에서의 동의 코돈 치환과 단백질 발현 사이의 관계를 나타낸 도면이다. (A) 야생형 CelEdx-SF301 및 scvSF301의 처음 12개의 아미노산을 디폴트 셋팅(Edgar 2004, Nucleic Acids Res 32(5):1792-1797)을 갖춘 다중 서열 정렬 수단(MUSCLE)을 이용해 정렬시켰다. (B) 상이한 강도를 가진 프로모터로 구동되는 야생형 및 변이체 유전자로부터 발현된 SF301, scvSF301_19 및 scvSF301_20의 발현 패턴을 분석하였다. 야생형 유전자로부터 발현된 SF301 및 변이체 유전자로부터 발현된 scvSF301은 이론적으로 산출되는 분자량인 81.4kDa 의 크기를 가지는 것을 확인하였다. 공 벡터(pMtac)를 보유하고 있는 대장균 XL1-blue를 음성 대조군으로 이용하였다. 빨간색 화살표는 tac 및 T7 프로모터 하에 발현된 scvSF301를 나타낸다. T, 총(전체) 단백질; S, 가용성 분획; tac, tac 프로모터; T7, T7 프로모터이다. 본 실험은 3회씩 독립적으로 실시하였다.
도 6은 CelEdx-SF301 및 scvSF301s의 5′말단 코딩 영역에서의 코돈 사용(codon usage)을 나타낸 도면이다. 붉은색 바(bar)는 대장균에서 동일 아미노산에 대하여 10% 이하 사용되는 코돈을 나타낸다.
도 7은 FdhA 및 scvFdhA-mCherry의 발현 양상을 분석한 결과이다. (A) 야생형 유전자로부터 발현된 FdhA 및 종래 기법으로 코돈-최적화하여 획득한 유전자 변이체를 T7 프로모터의 제어 하에서 발현하여 FdhA의 발현 양상을 분석한 것으로, 42kDa의 이론적인 분자량을 갖는 FdhA가 T7 프로모터 하에 폭발적으로 발현되었다(흑색 화살표). 하지만, FdhA의 전체 발현량 중에서 약 0.5% 미만이 가용성 분획에 나타난다는 것을 확인하였다. (B) T5 프로모터의 제어 하에 발현된 mCherry가 융합된 scvFdhA_01 및 02(본 발명의 선별 방법으로 획득한 유전자 변이체로 발현한 단백질)의 약 33%가 가용성 분획에서 관찰되었다. 공 벡터 pET22b를 보유하고 있는 대장균 XL1-blue의 발현 양상을 음성 대조군으로 이용했다. 적색 화살표는 T5 프로모터 하에 발현된 mCherry가 융합된 FdhA 및 scvFdhA의 변이체를 표시한다. T, 총 단백질; S, 가용성 분획이다. 실험은 독립적으로 3 회씩 실시하였다.
도 8은 T5 프로모터 제어 하에서 mCherry가 융합된 FdhA 및 선별된 mCherry가 융합된 scvFdhAs의 발현 양상을 나타낸 도면이다. 빨간색 화살표는 mCherry가 융합된 FdhA 및 scvFdhA 변이체들을 나타낸다. T, 총(전체) 단백질; S, 가용성 분획이다. 실험은 독립적으로 3 회씩 실시하였다.
본 발명은
(1) 개시 코돈을 제외한 5′말단 코딩 영역 내의 코돈에 대하여 워블 염기(wobble base)가 축퇴된 프라이머를 합성하는 단계;
(2) 상기 축퇴된 프라이머를 이용하여 무작위로 치환된 동위 코돈을 포함하는 유전자 라이브러리를 생산하는 단계;
(3) 상기 동위 코돈을 포함하는 유전자 라이브러리를 재조합 벡터에 삽입하여 숙주 세포를 형질전환시키는 단계; 및
(4) 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 기능이 증진된 단백질을 선별하는 단계;를 포함하는 기능이 증진된 단백질을 코딩하는 유전자의 선별 방법에 관한 것이다.
상기 5′말단 코딩 영역 내의 코돈은 N-말단의 개시 코돈을 제외한, 두 번째에서 11 번째 아미노산 서열에 해당하는 코돈인 것이 바람직하지만, 11번째 이후 아미노산 서열에 대한 코돈도 동의 코돈으로 무작위 치환하는 것은 얼마든지 가능하다. 즉, 필요에 따라 무작위 동의 코돈 치환 길이는 얼마든지 조절할 수 있다. 그러나 대장균을 활용한 변이체 라이브러리의 제작 한계와 선별 효율성을 고려하여 109개 이상의 경우의 수를 넘지 않도록 설계하는 것이 보다 효율적이다.
상기 단계 (3)의 유전자 라이브러리의 3′말단의 코딩 영역에 폴딩 리포터를 코딩하는 유전자를 융합하는 것 바람직하지만, 대상이 되는 단백질의 활성 측정이 용이한 경우 별도의 폴딩 리포터를 활용할 필요가 없다. 이 경우, 선별 후, 폴딩 리포터를 제거하는 과정을 생략할 수 있다는 장점을 갖는다. 상기 폴딩 리포터는 별도의 링커 없이 직접 3′말단에 융합하는 것이 바람직하지만 이에 제한하지 않으며, 폴딩 리포터는 선별(스크리닝) 과정에서 단백질의 선택이 편리할 수 있도록 육안으로 관찰할 수 있는 형광을 띄는 서열을 융합하거나, 효소 반응 등을 수행할 수 있는 서열을 융합할 수 있다.
바람직한 폴딩 리포터로는 엠체리(mCherry), GFP(green fluoresecent protein), YFP(yellow fluoresecent protein), RFP(red fluorescent protein), CFP(cyan fluoresecent protein) 중에서 선택된 어느 하나인 것이지만, 이에 제한하지 않는다.
상기 숙주 세포는 대장균(E. coli), 효모, 바실러스 (Bacillus sp.) 슈도모나스(Pseudomonas sp.), 코리네박테리움(Corynebacterium sp.), 크렙시엘라(Klebsiella sp.), 아스퍼질러스(Aspergillus sp.), 락토바실러스(Lactobacillus sp.), 페니실리움(Penicillium sp.), 자이모모나스(Zymomonas sp.) 및 스트렙토마이세스(Stretomyces sp.) 중에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않으며, 본 발명의 선별 방법은 선택된 숙주 세포에 따른 프로모터의 종류에 맞춰 선별하는 것이 가능하다.
상기 '기능이 증진된'은 야생형 코돈으로부터 발현된 단백질과 비교하여 본 발명의 선별 방법으로 선별된 유전자 변이체로부터 발현된 단백질의 가용성(solubility), 활성(activity) 또는 발현량(expression level)이 야생형에 비해 향상됨을 의미한다.
또한, 본 발명은 단백질의 가용성, 활성 또는 발현량이 향상된 단백질을 코딩하는 유전자의 스크리닝 방법으로 선별된 유전자를 재조합 벡터에 삽입하여 숙주 세포를 형질전환시킨 후, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 가용성, 활성 또는 발현량이 증진된 단백질의 생산 방법을 제공하는 방법에 관한 것이다.
상기 유전자 선별에 의해 선별된 유전자 변이체로부터 발현된 단백질은 아미노산의 치환 또는 변형 없이 단백질의 가용성(solubility), 활성(activity) 또는 발현량(expression level)이 증진된 것이 특징이다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
[재료 및 방법]
1. 박테리아 균주 및 플라스미드
대장균(E. coli) XL1-blue를 플라스미드 증폭 및 동의 코돈 라이브러리 구축에 이용하였다. 대장균(E. coli BL21(DE3))을 T7 프로모터의 제어 하에서 동의 코돈 변이체 유전자의 발현 양상 분석에 이용하였다. pmCherry(Clontech, USA), pFOS-CSF301 (Ko et al. 2013, J Microbiol Methods 94(3):311-316) 및 pET-FdhA를 mCherry, CelEdx - SF301 및 fdhA 증폭을 위한 주형으로 이용하였고, pMal-c2x(New England Biolabs, MA) 및 pQE30(Qiagen, USA)을 동의 코돈 라이브러리의 구축에서 골격 플라스미드로 이용하였다.
2. 플라스미드 및 동의 코돈 라이브러리 구축
동의 코돈 라이브러리에 사용된 DNA 취급법은 표준 프로토콜을 기반으로 하였으며, 도 1에 나타낸 바와 같은 벡터 pMtac(tac 프로모터 포함) 및 pSCT5(T5 프로모터 포함)와; 하기 표 1에 나타낸 바와 같은 프라이머 쌍을 이용하였다.
동의 코돈을 scvSF301 F 및 R 프라이머를 이용해 SF301 유전자의 5′말단 코딩 영역에 도입하였다. scvSF301를 NdeI 및 SacI 제한효소로 자른 후, pMtac의 해당 부위에 라이게이션 하였다. 이후, 선별된 변이체 scvSF301_19 및 scvSF301_20은 Mtac F 및 Ori SF301 R 프라이머들과 Phusion DNA 중합효소(New England Biolabs, MA)를 이용해 증폭하였으며, 이후 NdeI 및 HindⅢ로 절단하였다. T7 프로모터의 제어 하의 발현을 위해, 상기 수득한 DNA 단편들을 상기와 동일한 제한효소를 이용해 자른 pET21b에 클로닝 하였다.
fdhA에 대한 동의 코돈 라이브러리는 scvFdhA F 및 R 프라이머를 이용하여 증폭함으로써 획득한 scvFdhA를 SpeI 및 KpnI로 절단하여 구축하였다. 상기 결과로서 수득한 DNA 단편들을 pSCT5에서의 해당 부위에 라이게이션 하였다.
동의 코돈 라이브러리 구축에 사용된 프라이머 쌍
프라이머 명칭
 1Primer sequence (5'→3') 제한효소 자리
mCherry F 서열번호 1 ATA GAATTC GTG AGC AAG GGC GAG GAG EcoRI
mCherry F for pSCT5 서열번호 2 ATA 2 GAA TTC ATT AAA G 3 AG GAG AA A ACT AGT ATG GGA TCC GGT ACC GTG AGC AAG GGC GAG GAG EcoRI, SpeI, BamHI, KpnI
mCherry R 서열번호 3 ATA AAG CTT CTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC HindⅢ
Mtac F 서열번호 4 GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG
Mtac R 서열번호 5 CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC
scvSF301 F 서열번호 6 ATA CAT ATG CTN TTR TGG TCN ATH GTN TTR ACN TCN TTY GCC TCC GCG CAG ACG C NdeI
scvSF301 R 서열번호 7 ATA GA GCT CCG GAG TGT CAC CTT TAC C SacI
Ori SF301 F 서열번호 8 ATA CAT ATG CTG TTG TGG TCG ATT GTC TTG NdeI
Ori SF301 R 서열번호 9 ATA AAG CTT TTA CCGGAGTGTCACCTTTACC HindⅢ
scvFdh A F 서열번호 10 ATA ACT AGT ATG TCN GGN AAY CGN GGN CTN GTN TAN CTN GGN TCG GGC AAG GTC GAA GTC C SpeI
scvFdhA R 서열번호 11 ATA GGTACC GGC CGC GCT GAA GGT CTT G KpnI
Ori FdhA F 서열번호 12 ATA ACTAGT ATG TCT GGT AAT CGT GGT GTC G SpeI
Ori FdhA R 서열번호 13 ATA AAGCTT TTA GGC CGC GCT GAA GGT CTT G HindⅢ
1Y = C + T; R = A + G; H = A + T; N = A + T + G + C
2밑줄이 있는 문자는 제한효소 자리를 나타내며; 3볼드체이며 밑줄이 있는 문자( AGGAGAA )는 벡터 pQE30의 ribosomal binding site(RBS)이다.
3. 단백질 발현 및 발현 양상의 분석
적색 형광 강도를 근거로 하여 선별된 변이체들을 적절한 항생제를 첨가한 Luria Bertani(LB) 아가 위에 도말한 후, 30℃에서 생장시켰다. 이후, LB 아가(agar) 상의 단일 콜로니를 선택하여 100㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 4㎖의 LB 액체 배지에 접종하고, 진탕(240rpm) 시키면서 30℃에서 생장시켰다. 밤새 배양하여 수득한 40㎕의 배양액을, 100㎍/㎖ 앰피실린을 함유하는 4㎖의 LB 액체 배지에 접종하고, 30℃에서 배양하였다.
이후, 600nm에서의 광학 밀도(OD600)가 약 0.5 내지 0.6에 도달했을 때, 4㎕의 2　mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG; 최종 농도, 0.2mM)를 첨가하고, 세포를 동일한 조건 하에 추가로 3시간 더 배양했다. 이어서, 배양액을 OD600를 2.0으로 보정하여, 4℃에서 8,000rpm으로 원심분리하여 수확하였다.
상기 수확한 세포를 200㎕의 50mM Tris-HCl (pH 8.0)에 재 현탁 후, 4℃에서 3초간 초음파처리하여 세포를 파쇄한 후, 불용성 응집물들을 4℃에서 20분간 14,000 rpm에서 원심분리하여 제거하였다. 초음파처리 후, 세포 해리물로부터 총(전체) 단백질을 수득하였고, 이후, 원심분리하여 얻은 상층액, 즉 가용성 단백질 분획을 수득하였다. 총(전체) 및 가용성 단백질을 SDS 시료 로딩 완충액(0.225M Tris-HCl pH 6.8; 50% 글리세롤, 5% SDS, 0.005 브로모페놀 블루 및 0.25M DTT)에 1:5 비율로 첨가하고, 15분간 끓인 후, 4 내지 12%(w/v) 구배 겔(Bio-Rad) 상의 SDS-PAGE에 전개시켰다. 전기영동 후, 겔을 쿠마씨 블루 염색 용액으로 염색하였다. 겔 중의 단백질을 제조사에서 기재한 바와 같이 Experion Automated Gel System(Bio-Rad, CA)를 이용하여 정량하였다.
실시예 1. 5′말단 코딩 영역에서의 동의 코돈이 무작위 치환된 유전자 라이브러리로부터 선별된 이종 단백질 발현 확인
본 실시예 1에서는 대장균에서 비-기능적 단백질 응집물로 생산되는 (1) 토양 시료로부터 분리한 엑소셀룰라아제 CelEdx-SF301(Ko et al. 2013, J Microbiol Methods 94(3):311-316) 및 (2) 포름알데히드 디히드로게나아제(fdhA)를 5′말단 코돈을 동의 코돈으로 무작위 치환되도록 디자인하였다.
개시 코돈을 제외하고 초기 10개의 코돈에서 동의성 변경은 임의의 아미노산의 부가 또는 치환 없이 상기 두 단백질의 기능성 발현이 증진된 결과를 제공하였다.
이종 숙주에서 단백질의 기능성 발현의 증대를 위해, 유전자의 5′말단 코딩 영역을 동의 코돈으로 무작위 치환을 실시하였다. 동의 코돈(synonymous codon)들의 치환은 종래의 대장균 코돈 이용을 기반으로 하는 선행기술(Kucharova et al. 2013, Appl Environ Microbiol 79(21): 6655-6664)과는 달리, 6개의 동의 코돈을 갖는 Leu, Arg 및 Ser의 경우를 제외하고(코돈의 세 번째 염기의 변화만으로 6개의 동의 코돈이 나타나도록 만들 수 없으므로), 아미노산이 가질 수 있는 (4개 이하의 동의 코돈을 갖는 아미노산) 모든 동의 코돈들이 나타날 수 있도록 축퇴된(degenerated) 프라이머를 제작하였다(표 1).
아미노산 10개를 초과하는 치환들의 경우, 대장균의 최대 형질전환 효율을 초과하는 변이체 수인 108 내지 109 CFU(콜로니 형성 유닛)을 제공하기 때문에, 본 발명의 발명자들은 5′말단 코딩 영역 내 처음 10개 코돈(개시 코돈인 Met는 제외)에 대해 세 번째 위치에 워블 염기(wobble base)를 가진 축퇴성(degenerated) 코돈을 채용하였고, 기능이 증진된 발현의 용이한 검출을 허용하는 폴딩 리포터로서, 돌연변이를 유도할 수 있는 UV 조사 없이도 검출되는 단량체 적색 형광 단백질인 mCherry를 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 GFP 변이체 대신 채용 하였다.
본 발명이 단백질 발현에 미치는 효과를 검증하기 위하여, 4-메틸움베릴페릴-D-셀로비오사이드(MUG2)를 기질로 이용해 메타게놈으로부터 선별하였으나 T7 프로모터의 제어 하에서 발현되는 경우 불용성 응집된 형태로 발현되며, 종래의 기술인 1) 샤페론 공동발현, 2) GST 융합 및 3) 저온 충격 발현 (cold shock expression)과 같은 통상적인 방법을 적용하였음에도 불구하고, 불용성의 응집된 형태로 발현되는 CelEdx-SF301에 적용해 보았다(도 2).
(1) CelEdx - SF301 의 기능이 증진된 발현 확인
본 실시예 1에서, 5′말단 코딩 영역 내 동의 코돈들의 치환을 통해 CelEdx-SF301의 기능성 발현이 증진된 변이체 단백질을 선별해 보았다. 우선, 엑소셀룰라아제의 동의 코돈 라이브러리의 구축을 위해, 정방향 축퇴(degenerated) 프라이머 및 정지 코돈이 없는 유전자-특이적 역방향 프라이머를 이용해 pFOS-CSF301로부터 엑소셀룰라아제로 추정되는 단일 펩티드를 코딩하는 CelEdx-SF301 유전자를 증폭하였고, 결과로서 제공된 CelEdx-SF301 동의 코돈 변이체(scvSF301s)의 PCR 생성물을 중간-강도 tac 프로모터 및 mCherry 유전자를 포함하는 pMtac에 라이게이션하였다.
형질전환 및 배양 후, 6 ×106 CFU 전체 클론을 포함하며, 1.2×105 CFU/㎖의 역가를 가진 동의 코돈 라이브러리를 수득하였다. 더욱 높은 mCherry의 적색 형광을 띄는 21개의 콜로니가 동의성 라이브러리로부터 육안으로 선별되었으며, 추가적인 분석을 위해 배양하였다.
상기 배양된 세포의 도입 및 해리 후, 불용성 응집물 제거 후, 가용성 분획의 MUG2에 대한 활성 및 mCherry의 형광 강도를 측정하였다(도 3). scvSF301의 엑소셀룰라아제 활성에 의해 MUG2로부터 방출되는 4-메틸움베르리페론(MU)의 형광 강도는 야생형 SF301에 비해 약 35 내지 530배 더 높게 나타났다. 상기 결과는 SDS-PAGE 분석에 의해 확인되었다(도 4).
21개의 mCherry 융합된 scvSF301들이 대장균 세포 용리물에서 총(전체) 단백질의 약 3%까지의 수준으로 발현되었지만, mCherry가 scvSF301의 C-말단에 링커 없는 융합 되었음에도 불구하고 발현된 전체 단백질의 95%를 초과하는 양이 가용성 분획에서 확인되었다. mCherry 형광 강도의 순위가 각 변이체의 엑소셀룰라아제 활성에 의해 MUG2로부터 방출되는 MU의 형광 강도의 순서와 일치하는 것을 확인하였다. mCherry 융합이 엑소셀룰라아제 활성에 미치는 영향을 평가하기 위해, 발현 수준이 다른 변이체들 중에서 scvSF301_02, scvSF301_03, scvSF301_04, scvSF301_11, scvSF301_19 및 scvSF301_20을 선택하여 mCherry가 없는 pMtac에 다시 클로닝하였다. mCherry의 제거 후에도 MUG2에 대한 셀룰라아제의 활성이 mCherry가 융합된 변이체에 비해 7배까지 증가한다는 것을 확인하였으나(도 3B), 동의 코돈 변이체의 엑소셀룰로오스 활성 순위는 mCherry의 융합 여부에 영향을 받지 않는 것을 확인하였다. 따라서, C-말단에 융합된 mCherry는 엑소셀룰라아제의 활성 및 발현 수준에 영향을 주기는 하지만, 동의 코돈 변이체 선별을 위한 폴딩 리포터로써 활용 가능함을 확인하였다.
이러한 결과가 기 보고된 생물정보학적 결과들과의 일치 여부를 확인하기 위해 변이체의 염기서열을 분석하였다. 서열 2 내지 11의 각 위치에서 각 아미노산에 대한 가장 빈번한 코돈, 예를 들어 서열 2 위치에서의 류신(CTT), 서열 5 위치에서의 세린(TCA) 및 서열 11 위치에서의 프롤린(TTT)이 존재 하지만, 변화된 각 위치의 동의 코돈과 변이체의 발현 수준과의 상관관계를 찾을 수 없었다(도 5A). 유전자의 5′UTR 및 5′말단 코딩 영역의 구조가 mRNA와 리보솜의 상호작용에 영향을 미친다는 보고에 근거하여(Espah Borujeni et al. 2014, Nucleic Acids Res 42(4):2646-2659), 변이체의 5′말단 염기서열과 단백질 발현 양상이 5′UTR 및 5′말단 코딩 영역의 구조적 특징에 기인하는지 여부를 확인해 보기 위해 5′UTR 및 5′말단의 33개 염기가 형성하는 구조 및 번역 속도를 비교 분석하였다. 동의코돈 변이체의 5′UTR 및 5′말단의 33개 염기가 형성한 구조의 분석은 mfold 웹 서버(http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form2.3)를 이용하였으며, 변역 속도는 RBS 라이브러리 계산기(https :// salis . psu . edu /)(Espah Borujeni et al. 2014, Nucleic Acids Res 42(4):2646-2659)를 활용하였다(표 2).
모든 변이체들의 mRNA 안정성은 야생형 mRNA의 것보다 약간 더 낮게 예측되었으나(30℃에서 -37.99kcal/mol), 변이체들의 mRNA의 5′말단이 갖는 구조의 깁스 자유에너지 및 동의 변이체들의 번역-개시 속도가 기능성 발현의 증진된 수준과 인과 관계가 없다는 것이 확인되었다. 이와 같은 결과는 전체 단백질 발현량의 증가를 기준으로 선별한 과거의 방법들과 달리 기능성 발현을 선별 기준으로 하였기 때문에 나타난 결과로 추측된다.
기능이 증진된 단백질의 발현 수준이 5′말단 코딩 영역에서의 동의 코돈의 치환에 의해 현저히 증가하였음에도, 전체 발현 수준은 여전히 낮았다. 동의 코돈 변이체들 중에서도, 여타 변이체들 보다 더 높은 발현 수준을 보여주는 scvSF301_19 및 scvSF301_20을 강력한 T7 프로모터를 갖는 원핵세포 발현 플라스미드 pET21b에 클로닝하였다. 결과물로 수득한 플라스미드를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 후, 단백질 발현을 유도하고 분석하였다(도 5B).
T7 프로모터의 제어 하에 scvSF301_19 및 scvSF301_20 유전자에 의한 전체 단백질 발현은 야생형 유전자의 것보다 약 1.5 내지 2배 더 높았으나, scvSF301 변이체 단백질이 tac 프로모터의 제어 하에서 대부분 가용성 분획에서 발현되는 이전의 결과와 달리, T7 프로모터의 제어 하에서는 scvSF301_19 및 scvSF301_20의 전체 단백질 중 약 6%만이 가용성 분획에 존재하는 것이 관찰되었다. 상기 결과는 5′말단 코딩 영역의 코돈 사용이 5′UTR과 프로모터의 세기와 관련되어 있어, 해당하는 단백질의 기능이 증진된 발현을 위해서는 전자 및 후자 인자들의 적절한 조합이 필요하다는 것을 의미한다.
DNA 서열 분석은 침묵형 돌연변이가 5′말단 코딩 영역에서 오직 33개의 뉴클레오티드에서 일어났다는 점을 확인해 주었는데, 이는 N-말단에서의 동의 코돈의 치환이 단백질 발현에 영향을 준다는 점을 시사하는 것이다.
scvSF301_05가 최고 발현 수준 및 활성을 보여줬지만, 그 변이체는 위치 5 내지 8에서 4개의 아미노산 결실로 인해 추가 분석에서 배제되었다(도 5A). 동의 코돈 및 기능이 증진된 발현 사이의 가능한 관계를 검출하기 위해, 21개의 scvSF301 변이체의 서열 정렬을 실시하였다. 대부분의 동의 코돈 변이체들은 야생형 SF301에 비해 5′말단 코딩 영역 내에 증가된 개수의 희소 코돈을 포함하였으나, 희소 코돈의 증가와 발현 수준 사이에서 상관관계는 발견하지 못하였다(도 6 및 표 2).
CelEdx-SF301 및 이들의 변이체에 대한 In silico 분석 결과
Number of rare codons1 Relative activity (%) Gibbs free energy [kcal/mol ]2 Translation
-initiation rate
CelEdx-SF301 4 0.4 -37.99 2.78
scvSF301_01 6 7.2 -33.81 85.02
scvSF301_02 5 29.1 -35.79 34.56
scvSF301_03 7 36.5 -34.90 85.02
scvSF301_04 5 41.3 -34.42 74.62
scvSF301_05 3 100.0 -32.12 -3
scvSF301_06 6 15.2 -34.68 47.57
scvSF301_07 5 18.4 -33.32 121.86
scvSF301_08 7 19.0 -32.19 182.72
scvSF301_09 6 35.1 -33.38 77.7
scvSF301_10 5 13.9 -34.67 199.93
scvSF301_11 6 34.4 -35.11 62.04
scvSF301_12 4 28.8 -34.25 159.64
scvSF301_13 6 9.6 -32.89 20.14
scvSF301_14 7 24.5 -33.08 199.93
scvSF301_15 6 28.9 -33.78 159.64
scvSF301_16 7 15.0 -34.46 64.9
scvSF301_17 6 30.5 -33.03 313.56
scvSF301_18 4 7.7 -35.97 41.38
scvSF301_19 5 65.4 -33.78 159.64
scvSF301_20 6 56.2 -35.77 47.57
scvSF301_21 3 26.7 -35.43 36.15
1대장균에서 하나의 아미노산에 대하여 10% 이하로 사용되는 코돈이 사용된 코돈의 수.
2Gibbs free energy는 5′UTR을 포함하는 지역 및 처음 11개의 아미노산 코돈의 코딩 지역에서 mRNA의 2차 구조의 안정성을 나타냄.
3TscvSF301_05의 번역-개시 속도가 예측되지 않음.
(2) 동의 코돈의 무작위 치환 방법을 활용한 포름알데히드 디히드로게나아제 유전자, fdh A 의 기능성 발현 증대
상기 결과를 바탕으로, tac 프로모터보다 강력한 프로모터인 T5 프로모터, 및 lac 오퍼레이터를 포함하는 pQE30 발현 플라스미드를 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)로부터 기원하는 포름알데히드 디하드로게나아제 유전자, fdhA에 대한 동의 코돈 라이브러리 구축에 채용했다. 야생형 fdhA 유전자가 동 플라스미드에서 발현되는 경우 숙주 대장균(E. coli)의 불용성 분획에서 주로 검출되는 것을 확인하였다(도 7A). 또한, 코돈-최적화된 fdhA 역시 유사하게 대부분이 불용성 분획에서 발현됨을 관찰하였다.
fdhA에 대한 동의 코돈 라이브러리를 제작 시, N-말단에서 불필요한 아미노산의 첨가를 피하기 위해, 순서대로 SD 서열(AGGAGAA), 아데닌(A) 뉴클레오티드, SpeI 부위, 개시 코돈 및 다중 클로닝 부위를 포함하고 있는 정방향 프라이머를 이용해 증폭된 mCherry 유전자를 클로닝하여 SD 서열 및 pQE30 벡터의 개시 코돈 사이에 SpeI 부위(ACTAGT)를 삽입하였다. mCherry가 클로닝된 pSCT5 벡터(전체 클론, 1.5×103 CFU)를 이용해 라이브러리를 제작하였을 때, 기대했던 것처럼 lac 프로모터를 갖는 pMtac을 이용하였을 때보다 빠른 시간 내에 mCherry 형광을 보이는 콜로니가 나타나는 것을 확인하였다. 상기 라이브러리에서 mCherry의 형광이 빠르게 나타나는 17 scvFdhA의 발현 양상을 분석하였다(도 8).
상기 변이체들 중, scvFdh_02는 전체 발현 수준이 약간 감소했음에도 불구하고, 발현된 단백질의 약 33%까지 가용성 단백질 분획에 존재하는 것을 확인하였다(도 7B). 상기 결과는, 가용성이 증대된 변이체 단백질을 암호화하는 유전 서열을 비교적 작은 크기의 라이브러리로부터 쉽게 선별할 수 있음을 의미한다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology <120> Method of screening genes encoding a protein with enhanced functional expression using randomly substituted synonymous codon of 5 terminal coding region <130> PN14297 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCherry F primer <400> 1 atagaattcg tgagcaaggg cgaggag 27 <210> 2 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCherry F for pSCT5 primer <400> 2 atagaattca ttaaagagga gaaaactagt atgggatccg gtaccgtgag caagggcgag 60 gag 63 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCherry R <400> 3 ataaagcttc tacttgtaca gctcgtccat gc 32 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mtac F <400> 4 gagcggataa caatttcaca cagg 24 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mtac R <400> 5 cagggttttc ccagtcacga c 21 <210> 6 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scvSF301 F <400> 6 atacatatgc tnttrtggtc nathgtnttr acntcnttyg cctccgcgca gacgc 55 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scvSF301 R <400> 7 atagagctcc ggagtgtcac ctttacc 27 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ori SF301 F <400> 8 atacatatgc tgttgtggtc gattgtcttg 30 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ori SF301 R <400> 9 ataaagcttt taccggagtg tcacctttac c 31 <210> 10 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scvFdh A F <400> 10 ataactagta tgtcnggnaa ycgnggnctn gtntanctng gntcgggcaa ggtcgaagtc 60 c 61 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scvFdhA R <400> 11 ataggtaccg gccgcgctga aggtcttg 28 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ori FdhA F <400> 12 ataactagta tgtctggtaa tcgtggtgtc g 31 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ori FdhA R <400> 13 ataaagcttt taggccgcgc tgaaggtctt g 31

Claims (8)

  1. (1) 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 개시 코돈을 제외한 5' 말단 코딩 영역 내의 코돈에 대하여 워블 염기(wobble base)가 축퇴된 프라이머를 합성하는 단계;
    (2) 상기 축퇴된 프라이머를 이용하여 무작위로 치환된 동의코돈을 포함하는 유전자 라이브러리를 생산하는 단계;
    (3) 상기 동의코돈을 포함하는 유전자 라이브러리를 재조합 벡터에 삽입하여 숙주 세포를 형질전환 시키는 단계; 및
    (4) 상기 형질전환 된 숙주 세포를 배양하여 발현량(expression level) 또는 가용성(solubility)이 증진된 목적 단백질을 선별하는 단계;를 포함하는 발현량(expression level) 또는 가용성(solubility)이 증진되며, 아미노산이 부가되지 않는 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 선별 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 5' 말단 코딩 영역 내의 코돈은 N-말단의 개시 코돈을 제외한, 두 번째에서 11 번째 아미노산 서열에 해당하는 코돈인 것을 특징으로 하는 발현량(expression level) 또는 가용성(solubility)이 증진되며, 아미노산이 부가되지 않는 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 선별 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단계 (3)의 유전자 라이브러리의 3' 말단의 코딩 영역에 폴딩 리포터를 코딩하는 유전자를 융합하는 것을 특징으로 하는 발현량(expression level) 또는 가용성(solubility)이 증진되며, 아미노산이 부가되지 않는 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 선별 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 폴딩 리포터는 엠체리(mCherry), GFP, RFP, YFP, CFP 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 발현량(expression level) 또는 가용성(solubility)이 증진되며, 아미노산이 부가되지 않는 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 선별 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 숙주 세포는 대장균(E. coli), 효모, 바실러스 (Bacillus sp.) 슈도모나스(Pseudomonas sp.), 코리네박테리움(Corynebacterium sp.), 크렙시엘라(Klebsiella sp.), 아스퍼질러스(Aspergillus sp.), 락토바실러스(Lactobacillus sp.), 페니실리움(Penicillium sp.), 자이모모나스(Zymomonas sp.) 및 스트렙토마이세스(Stretomyces sp.) 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 발현량(expression level) 또는 가용성(solubility)이 증진되며, 아미노산이 부가되지 않는 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 선별 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 유전자 선별 방법으로 선별된 유전자를 재조합 벡터에 삽입하여 숙주 세포를 형질전환 시킨 후, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현량(expression level) 또는 가용성(solubility)이 증진되며, 아미노산이 부가되지 않는 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 선별 방법.
KR1020140146163A 2014-10-27 2014-10-27 5′말단 코딩 영역의 코돈을 동의 코돈으로 무작위 치환하여 기능성 발현이 증진된 단백질을 코딩하는 유전자 선별 방법 KR101587433B1 (ko)

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