KR102194697B1

KR102194697B1 - 3-히드록시프로피온산 반응 전사인자를 이용한 3-하이드록시프로피온산 선택성 유전자회로 및 이를 이용한 3-히드록시프로피온산 생산 균주의 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR102194697B1
Application number: KR1020190134466A
Authority: KR
Inventors: 박성훈; 아속소마순다; 정규열; 유태현; 양진아
Original assignee: 노루 아이씨 코포레이션 엘티디
Priority date: 2019-10-28
Filing date: 2019-10-28
Publication date: 2020-12-23
Also published as: KR20190126264A

Abstract

본 발명은 3-HP 반응 전사인자와 상기 전사인자가 결합하는 프로모터를 이용한 유전자회로 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산 합성에 관여하는 효소의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 값비싼 장비나 노동집약적인 과정 없이 3-HP 생산성이 높은 균주를 선별할 수 있어, 3-HP 생산활성이 우수한 효소를 고효율로 스크리닝 할 수 있다.

Description

3-히드록시프로피온산 반응 전사인자를 이용한 3-하이드록시프로피온산 선택성 유전자회로 및 이를 이용한 3-히드록시프로피온산 생산 균주의 스크리닝 방법{Gene Circuit for Selecting 3-Hydroxypropionic Acid Using Responding 3-Hydroxypropionic Acid Transcription Factor and Method for Screening of 3-Hydroxypropionic Acid Producing Strain}

본 발명은 3-히드록시프로피온산 선택용 유전자회로 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산 합성에 관여하는 효소의 스크리닝에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 3-히드록시프로피온산 반응 전사인자와 상기 전사인자가 결합하는 프로모터를 이용한 유전자회로 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산 합성에 관여하는 효소의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

3-히드록시프로피온산(3-HP)은 아크릴산과 아크릴아마이드를 포함하는 중합체 및 여러 화학 물질의 생산을 위한 공급 원료로 사용될 수 있는 중요한 플랫폼 화학 물질이다 (Jiang et al. Appl . Microbiol . Biotechnol. 82:995, 2009; Kumar et al., Biotechnol . Adv. 31, 945-961, 2013). 3-HP는 다양한 화학적 방법으로 합성할 수 있으나, 전구체 및 공정에 필요한 비용, 환경 문제 때문에 산업적 생산에 적합하지 않다(Della Pina et al., Green Chem. 13:1624, 2011). 따라서 생물학적 합성법이 많은 관심을 끌고 있고, 지금까지 많은 시도들이 있었다(Borodina et al., 2015; Lan et al., 2015; Rathnasingh et al., 2012; Sabet-Azad et al., 2015; Song et al., 2016). 특히, 재조합 미생물에서 글리세롤을 이용해 3-HP를 합성하는 것(도 1A 참조)이 3-HP 고생산성 균주의 개발에 효율적인 것으로 입증되었다(Chu et al.,Biotechnol . Bioeng. 112, 356, 2015; Jung et al., Metab . Eng . 23, 116, 2014; Kim et al., Bioresour . Technol . 156, 170, 2014; Ko et al., Process Biochem. 47, 1135, 2012; Lim et al., ACS Synth . Biol. 5, 1247, 2016; Sankaranarayanan et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 41, 1039, 2014).

그럼에도 불구하고, 이 합성 경로에는 몇 가지 해결되어야 하는 문제들이 있다 (Kumar et al., Biotechnol . Adv. 31, 945-961, 2013; Sankaranarayanan et al., J. Ind . Microbiol . Biotechnol. 41, 1039, 2014; Zhou et al., Biotechnol Biofuels 8, 169, 2015). 중요한 쟁점 중 하나는 글리세롤로부터 3-HP를 생산하는데 관여하는 알데히드탈수소효소(특히 알파케토글루타르산 세미알데히드 탈수소효소(KGSADH))의 활성이 낮은 것이다(Chu et al., Biotechnol . Bioeng. 112, 356, 2015; Lim et al., ACS Synth . Biol. 5, 1247, 2016; Saxena et al., Biotechnol . Adv. 27, 598, 2009; Son et al., Sci . Rep. 7, 1-10, 2017). KGSADH의 활성이 낮으면 생합성 경로의 중간체이자, 독성물질인 3-히드록시프로피온알데히드(3-HPA)가 축적되어 세포 성장을 억제할 뿐만 아니라 효소 활성도 감소시켜 3-HP 생산에 악영향을 미친다(Barbirato et al., Appl . Environ. Microbiol., 62:1448,1996a; Barbirato et al. Appl . Environ. Microbiol . 62:4405, 1996b; Celiρska, 2010; Kumar et al., 2013).

효소를 개량하기 위한 방법들 중 잘 설계된 라이브러리와 효율적인 스크리닝 방법을 이용하는 직접 진화 방법(directed evolution)을 사용하는 경우, 성공적으로 개량된 효소를 얻을 수 있었다(Belsare et al., ACS Synth . Biol. 6, 416, 2017; Packer and Liu, Nat. Rev. Genet. 16, 379, 2015; Woolston et al., Annu . Rev. Chem . Biomol . Eng . 4, 259, 2013). 그러나 무작위로 생성된 라이브러리에서 양성 돌연변이가 발생할 확률이 낮으면 많은 수의 클론을 검사해야 하기 때문에 처리량이 낮고, 많은 시간이 소모되는 단점이 있다(Dietrich et al., Annu . Rev. Biochem. 79, 563, 2010). 단백질 구조 및 기능 분석의 발전에 따라 라이브러리 설계가 개선되어, 양성 클론을 분리할 가능성이 높아졌다(Di Lorenzo et al., Appl . Environ. Microbiol. 73, 7291, 2007; Jennewein et al., Biotechnol. J. 1, 537, 2006; Jeong et al., Protein Engineering, Design and Selection. 25. 725, 2012; Park et al., 2017; Yamanishi et al., 2012). 라이브러리가 표적 단백질의 구조 및 기능 정보에 의해 개선되었어도, 각 클론을 개별 분석하기에는 크기가 크기 때문에, 직접 진화 전략(directed evolution)을 적용하기 위해서는 효율적인 스크리닝 방법이 필요하다(Dietrich et al., Annu . Rev. Biochem. 79, 563, 2010; Woolston et al., Annu . Rev. Chem . Biomol . Eng. 4, 259, 2013). 또한, 생합성 경로에서 효소를 변형시키는 궁극적인 목표는 대사 산물 생산량을 향상시키는 것이기 때문에 대사 경로의 효소를 개량하기 위한 스크리닝 방법은 효소 활성을 표적 대사 산물의 생성과 연관시킬 수 있어야 한다.

이러한 이유로, 대사 산물을 인식하는 생체 분자로 구성된 유전적으로 암호화된 바이오 센서가 사용되었다(Dietrich et al.,Annu . Rev. Biochem. 79, 563, 2010; Fowler et al., Chem . Biol . 17, 756, 2010; Jang et al., Methods Enzymol . 550, 341, 2015; Liu et al., Metab . Eng. 31, 35, 2015; Michener and Smolke, Metab. Eng. 14, 306, 2012; Yang et al., Nat. Commun. 4, 1413, 2013). 이 중 하나는 분자 리간드에 반응하여 전사 결과를 조절하는 전사인자-프로모터 쌍을 사용하는 것이다(Canton et al., Nat. Biotechnol . 26, 787, 2008; Dietrich et al.,ACS Synth . Biol . 2, 47, 2013; Voigt, Curr . Opin . Biotechnol . 17, 548, 2006). 전사인자 기반의 바이오 센서는 최근의 많은 대사 공학적 접근법에 기여해왔다 (Liu et al., Metab . Eng. 31, 35, 2015; Liu et al., ACS Synth . Biol . 6, 837,2017; Mahr and Frunzke, Appl . Microbiol . Biotechnol. 100, 79, 2016). 이 경우, 리포터 유전자 또는 선별 마커 유전자를 하위(downstream)에 갖는 전사인자의 동족 프로모터는 대사 산물이 축적되는 경우, 이를 형광 또는 성장-결합 반응으로 전환시킬 수 있어, 고효율 스크리닝에 이용할 수 있다. 그러나 대다수의 대사 산물 반응성 전사인자-프로모터는 대사 산물 생산 균주와 다른 균주로부터 기인하는 경우가 많기 때문에 숙주의 생산성에 영향을 줄 수 있는 성장 억제와 같은 세포 내 대사 부담으로 인한 방해를 최소화 하기 위한 최적의 재설계가 필요하다 (Mahr and Frunzke, Appl. Microbiol. Biotechnol. 100, 79, 2016).

최근 Pseudomonas denitrificans 에 존재하는 3-HP 반응 전사인자 (LysR) 가 보고되었다 (Zhou et al., Biotechnol Biofuels 8, 169, 2015). LysR은 전사 활성제로서 특정 프로모터에 결합해 그 하위에 위치하는 유전자의 전사를 활성화시키는 전사인자이다.

이에, 본 발명자들은 3-HP 생산 효소를 개발하기 위한 라이브러리에서 3-HP 생산 균주를 고효율로 스크리닝하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 3-HP-반응 전사인자(LysR) 및 선택 마커로 항생제 내성 유전자인 tetA로 구성된 3-HP 선택용 유전자회로를 도입하는 경우, 고효율로 3-HP 생산능이 우수한 효소를 선별할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 3-하이드록시프로피온산을 인지하는 전사인자를 코딩하는 유전자를 포함하는 3-하이드록시프로피온산(3-HP) 선택용 유전자회로를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 3-하이드록시프로피온산(3-HP) 선택용 유전자회로를 이용하여 3-하이드록시프로피온산 합성에 관여하는 효소를 탐색하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 스크리닝된 알데히드 디하이드로게나아제를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (i) 3-하이드록시프로피온산을 인지하는 전사인자를 코딩하는 유전자; (ii) 상기 3-하이드록시프로피온산을 인지하는 전사인자를 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 프로모터; (iii) 선택 마커를 코딩하는 유전자; 및 (iv) 상기 3-하이드록시프로피온산을 인지하는 전사인자에 의해 활성화되고, 상기 선택마커의 발현을 조절하는 프로모터를 포함하는 3-하이드록시프로피온산(3-HP) 선택용 유전자회로를 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 3-하이드록시프로피온산 합성에 관여하는 유전자를 포함하는 유전자 라이브러리를 제공하는 단계;

(b) 상기 유전자 라이브러리와 상기 유전자회로를 숙주 미생물에 각각 도입하여 재조합 미생물을 제조하는 단계;

(c) 상기 재조합 미생물을 배양하여 3-HP를 생성하는 미생물을 선택마커 활성에 의하여 선별하는 단계; 및

(d) 선별된 미생물에서 3-하이드록시프로피온산 합성에 관여하는 효소를 확인하는 단계를 포함하는 3-하이드록시프로피온산 합성에 관여하는 효소의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 알데히드 디하이드로게나아제 및 이를 코딩하는 유전자와 상기 유전자로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 알데히드 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 미생물을 배양하여 3-하이드록시프로피온산을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 3-하이드록시프로피온산을 수득하는 단계를 포함하는 3-하이드록시프로피온산의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 값비싼 장비나 노동집약적인 과정 없이 3-HP 생산성이 높은 균주를 선별할 수 있어, 3-HP 생산활성이 우수한 효소를 고효율로 스크리닝 할 수 있다.

도 1은 3-HP 생합성 경로 및 3-HP 생산 균주 스크리닝을 위한 3-HP 선택용 유전자 회로를 나타낸 것으로, (A)는 재조합 대장균을 이용하여, 글리세롤로부터 3-HP를 생산하는 대사 경로의 개략도이다. (B)는 3-HP 선택용 유전자회로(pCDF-3HPselector)의 개략도를 나타낸 것이다.
도 2는 3-HP 선택용 유전자 회로의 성능 평가를 위한 합성 장치의 개략도를 나타낸 것이다.
도 3은 전사인자 발현 수준이 대장균에서의 장치 성능에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 것으로, (A)는 균주의 성장률을 나타낸 것으로, 검은색 막대는 C4LysR로 구성된 회로를 나타내고 회색 막대는 C3LysR로 구성된 회로를 나타낸다. 오차 막대는 세 번의 독립적인 실험으로 측정된 측정의 표준 편차를 나타낸다. (B)는 각각 다른 3-HP 농도에서 다섯 회로의 형광 히스토그램을 나타낸 것으로, 배지에 첨가한 3-HP 농도를 색깔 (녹색: 10.00g/L, 보라색: 7.50 g/L, 시안: 2.50 g/L, 적색: 1.25 g/L, 검정: 0.00 g/L) 로 표시하였다.
도 4는 (A) FACS를 이용한 단일 세포 수준 관찰에서 전사조절 인자의 종류와 발현정도가 대장균 내에서 유전자 회로의 성능에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 점선은 3-HP 10.00 g/L에 의해 유도된 세포의 형광을 나타내고, 3-HP를 첨가하지 않은 경우 세포의 형광은 실선으로 나타냈다. 각 균주는 색깔로 표시되었다 (검정: WSEN4 (J23104_C4LysR); 적색: WSEN1 (J23106_C4LysR); 보라색: WSEN3 (J23116_C4LysR); 녹색: WSEN2 (J23106_C3LysR); 시안: WSEN5 (J23116_C3LysR). (B) 3-HP 선택용 유전자회로의 동적 범위(검은색 원: pCDF-106C4sgfp; 흰색 원: pCDF-116C4sgfp; 검은색 삼각형: pCDF-106C3sgfp; 흰색 삼각형: pCDF-116C3sgfp)를 나타낸 것으로, y 축은 specific fluorescence, x 축은 배지에 첨가된 3-HP 농도 (0.00, 1.25, 2.50, 7.50 및 10.00g/L)를 나타낸 것이다.
도 5는 대장균에서 3-HP 선택용 유전자회로를 구현한 결과를 나타낸 것으로, WSEL1 균주 (W/ pCDF-3HPselector)의 세포 성장 속도를 다양한 농도의 3-HP 및 테트라사이클린을 배지에 첨가해서 측정하고, 그 결과를 heat map으로 나타내었다. 각 상자에 나타낸 값은 specific growth rate(h^-1)을 나타내었다.
도 6은 KGSADH의 알데히드 결합 사이트 라이브러리를 나타낸 것으로, (A)는 알데히드 결합 부위를 표적으로 하는 아미노산 잔기(A110, N159, K273, R281, A442, T443 및 P444)를 KGSADH (PDB : 5X5U)의 결정 구조상에 나타낸 것으로, 촉매 잔기(C287 및 E253)는 적색으로 표시하였다. (B)는 각 위치에 도입 된 아미노산을 나타낸 것이다.
도 7은 3-HP 선택용 유전자회로를 갖고 있는 모균주 WLBK1의 세포 성장 속도를 다양한 농도의 테트라사이클린에서 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 라이브러리의 균주를 24 시간 배양 후 3-HP 생산성을 확인한 결과를 나타낸 것으로, (A)는 3-HP 농도(g/L)를 나타낸 것이고, (B)는 1,3-PDO 농도(g/L)를 나타낸 것이다.
도 9는 3-HP 생산 균주를 24시간 배양 후 변형된 글리세롤 M9 최소 배지에서의 모균주(A) WLBK1 및 돌연변이 균주 (B) WLBK2 간의 3-HP 생산을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 WLBK3 균주를 변형된 글리세롤 M9최소 배지에서 24시간 배양 후 시간 경과에 따른 발효 프로파일을 나타낸 것이다.

본 발명에서는 3-HP의 생성능이 우수한 효소 변이체를 개발하기 위하여, 종래 잘 디자인된 유전자 라이브러리를 설계하고도, 스크리닝 방법에 있어서 고가 장비와 노동력이 많이 요구되었던 점을 극복하기 위하여, 유전자회로를 이용한 3-HP 생성 균주를 선별하는 방법을 개발하였으며, 본 발명의 일 양태에서는 3-HP-반응 전사인자(LysR) 및 선택 마커로 항생제 내성 유전자인 tetA로 구성된 3-HP 선택용 유전자회로를 제작하여, 3-HP 생성 효소를 코딩하는 유전자의 라이브러리와 함께 숙주세포에 도입하여 3-HP 생산능이 우수한 효소를 선별하였다.

본 발명의 고처리능 스크리닝이 가능한 3-HP 선택용 유전자회로는 두 가지 유형의 LysR 전사인자들의 유전자 발현 수준을 조절함으로써 적절한 동적 범위 및 배 변화 (fold-change) 를 갖는 검출 도구를 구축할 수 있었다. 그 후, 스크리닝에 이용될 적절한 선택 압력(항생제 내성 또는 형광세기)을 결정하고, 검출 도구를 적용해 3-HPA를 3-HP로 전환하는 효소인 K. pneumoniae의 α-케토글루타르산 세미알데히드 탈수소효소(KGSADH)의 직접 진화(directed evolution)를 수행하였다. 그 결과, 단 2회의 연속 배양 후 3-HP 생산이 25% 증가한 균주를 선별할 수 있었고, 이 균주의 돌연변이 KGSADH는 야생형 KGSADH와 비교하여 2.79배 높은 촉매 효율을 나타냈다. 따라서 본 발명에서는 잘 설계된 라이브러리와 3-HP를 스크리닝할 수 있는 장치를 사용하여 최적의 3-HP 생산을 위한 효소 개량을 효과적으로 수행할 수 있다는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일관점에서, 본 발명은 (i) 3-하이드록시프로피온산을 인지하는 전사인자를 코딩하는 유전자; (ii) 상기 3-하이드록시프로피온산을 인지하는 전사인자를 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 프로모터; (iii) 선택 마커를 코딩하는 유전자; 및 (iv) 상기 3-하이드록시프로피온산을 인지하는 전사인자에 의해 활성화되고, 상기 선택마커의 발현을 조절하는 프로모터를 포함하는 3-하이드록시프로피온산(3-HP) 선택용 유전자회로에 관한 것이다.

본 발명의 일양태의 재조합 대장균을 이용하여, 글리세롤로부터 3-HP를 생산하는 대사 경로의 개략도를 도 1에 나타내었다. 글리세롤은 K. pneumoniae에서 유래한 글리세롤 탈수 효소(GDHt)에 의해 3-HPA로 전환된다. 3-HPA는 A. brasilense 유래 kgsadh에 의해 암호화된 알데히드 탈수소효소(ALDH)에 의해 3-HP로 전환된다. 도 1B에는 3-HP 선택용 유전자회로(pCDF-3HPselector)의 개략도를 나타내었다. 본 발명의 유전자회로는 전사인자(TF) 발현 모듈과 기능 모듈로 구성된다. TF 발현 모듈은 C4-LysR TF를 암호화하는 C4- lysR 및 항상성 프로모터인 BBa_J23106 및 합성 5'-UTR을 포함하는 발현 카세트로 구성된다. 기능적 모듈은 선별 마커 tetA 및 동족 프로모터(cognate promoter, C4-LysR이 결합해 활성화시키는 프로모터) P_C4M 및 합성 5'-UTR을 포함하는 발현 카세트로 구성된다. P_C4M은 C4-LysR에 의해 3-HP가 존재할 때 활성화된다. C4-LysR 및 P_C4M은 P. denitrificans로부터 유래되었다.

*본 발명에 있어서, 제1항에 있어서, 상기 3-하이드록시프로피온산을 인지하는 전사인자는 Pseudomonas denitrificans 유래의 LysR인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 상기 3-하이드록시프로피온산을 인지하는 전사인자는 C3-LysR 또는 C4-LysR인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 3-하이드록시프로피온산을 인지하는 전사인자를 코딩하는 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유전자회로.

본 발명에 있어서, 상기 (iii)의 프로모터는 P_c3 (서열번호 4)또는 P_c4M (서열번호 5) 프로모터인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 선택 마커는 형광단백질 또는 항생제 저항성 유전자인 것을 특징으로할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서는, 3-HP를 생산하는 균주를 개량하기 위해서 P. denitrificans에서 유래 된 3-HP-반응 전사인자를 이용해 3-HP 선택용 유전자회로를 개발했고, 이 유전자 회로는 재조합 대장균에서 3-HP 생합성에 관여하는 효소 중 하나인 KGSADH의 개량에 적용되었다. 유전자 회로는 항상성 프로모터 및 5'-UTR을 사용하여 목적하는 성능을 가지도록 조작되었고, KGSADH의 기질 3-HPA에 대한 개선된 활성을 위한 개량에 적용되었다. 선택 압력 하의 2회 농축 배양 후, WLBK2 균주를 분리할 수 있었고, 이 균주는 24시간 배양 후 5.08 g/L의 3-HP를 생산했으며 수율은 수율은 0.66 g/g으로 관찰되었는데 이는 부모 균주인 WLBK1(4.07 g/L 3-HP, 0.53 g/g 수율)보다 25% 더 높은 생산성을 나타낸다. 또한 WLBK2 균주는 96-well 플레이트와 NADH의 흡광도를 사용하여 스크리닝한 결과인 108KGSADH를 포함하고 있는 WLBK3 균주보다 3-HP 생산성이 22% 더 높았다. 또한, WLBK2의 돌연변이체 KGSADH는 야생형 KGSADH에 비해 기질 3-HPA에 대한 촉매 활성도(k_cat/K_m)가 2.79 배 높고, k_cat값의 감소없이 K_m값이 감소함을 확인하였다. 추가 농축 배양은 선택 압력을 테트라사이클린 농도를 50 ㎍/mL까지 증가시킴으로써 수행되었다. 그러나 우리는 더 이상 3-HP 생산량이 증가한 균주를 확인할 수 없었으며, 대부분은 비슷한 양의 3-HP를 생산했다(unpublished data). 이것은 우리가 잘 설계된 10⁵ 사이즈의 라이브러리를 개발했기 때문에 2라운드의 농축 단계만으로 라이브러리 사이에서 가장 좋은 돌연변이를 분리할 수 있었음을 나타낸다. 이 결과는 본 발명의 스크리닝방법이 3-HP 대사 효소를 효과적으로 스크리닝할 수 있는 방법이라는 것을 명확하게 보여준다.

즉, 본 발명에서는 3-HP 선택용 유전자회로가 핵심 효소 KGSADH의 라이브러리로부터 최적화된 3-HP 생성 균주를 효과적으로 선별해 낼 수 있음을 입증했다. 대사 공학은 효소의 활성의 변형 및 전체 대사 네트워크에서의 유전자의 발현 조절을 포함하기 때문에 대사 기능에 기초한 스크리닝 방법이 필수적이다. 이러한 관점에서 우리의 selection device는 값 비싼 도구나 노동 집약적인 절차 없이 고효율 스크리닝 도구로서 3-HP 생합성 경로를 설계하는 데 광범위하게 활용될 수 있을 것이다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 본 발명은 또한, (a) 3-하이드록시프로피온산 합성에 관여하는 유전자를 포함하는 유전자 라이브러리를 제공하는 단계;

(b) 상기 유전자 라이브러리와 상기 유전자회로를 숙주 미생물에 각각 도입하여 재조합 미생물을 제조하는 단계;(c) 상기 재조합 미생물을 배양하여 3-HP를 생성하는 미생물을 선택마커 활성에 의하여 선별하는 단계; 및 (d) 선별된 미생물에서 3-하이드록시프로피온산 합성에 관여하는 효소를 확인하는 단계를 포함하는 3-하이드록시프로피온산 합성에 관여하는 효소의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 3-하이드록시프로피온산 합성에 관여하는 효소는 알데히드 디하이드로게나아제인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서는, 본 발명의 3-HP 선택용 유전자 회로를 재조합 대장균에서 3-HP 생합성에 관여하는 효소 중 하나인 KGSADH의 개량에 적용하여, 기질 3-HPA에 대한 개선된 활성을 위한 개량에 적용하고, 모균주인 WLBK1 균주보다 25% 더 높은 3-HP 생산성을 나타내는 WLBK2 균주를 선별하고, 상기 균주의 배양액으로부터 알데히드 디하이드로게나아제 효소를 정제하였으며, WLBK2의 돌연변이체 KGSADH는 야생형 KGSADH에 비해 기질 3-HPA에 대한 촉매 활성도(k_cat/K_m)가 2.79 배 높고, k_cat값의 감소없이 K_m값이 감소함을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 알데히드 디하이드로게나아제 및 이를 코딩하는 유전자와 상기 유전자가 도입되어이는 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 알데히드 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 미생물을 배양하여 3-하이드록시프로피온산을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 3-하이드록시프로피온산을 수득하는 단계를 포함하는 3-하이드록시프로피온산의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 용어 "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다. 포유동물 세포 배양물 발현을 위한 전형적인 발현 벡터는 예를 들면 pRK5 (EP 307,247호), pSV16B (WO 91/08291호) 및 pVL1392 (Pharmingen)을 기초로 한다.

"발현 조절 서열 (expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.

본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 RNA 폴리메라아제 프로모터 Φ10은 이. 콜라이에서 단백질을 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결 (operably linked)" 된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

본원 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

본 발명의 변이체를 발현현시키기 위해 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵 숙주에 적합한 발현 벡터에는, 예를 들어 SV40, 소 유두종바이러스, 아네노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열을 포함한다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pBluescript, pGEX2T, pUC벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 E. coli에서 얻는 것을 예시할 수 있는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10과 λgt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 2μ 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL 941이다.

상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.

발명의 숙주 세포는 원핵 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 또한, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 이. 콜라이, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 및 생쥐 세포같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포, 및 조직배양된 인간 세포는 사용될 수 있는 숙주 세포의 예이다. 본 발명의 단백질을 코딩하는 cDNA를 클로닝할 때에는 동물세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 어류 기원의 CHSE-214, FHM, RTG-2 및 EPC를 예시하였으나 물론 이에 제한되는 것은 아니다. COS 세포를 이용하는 경우에는 COS 세포에서 SV40 라지 T안티겐(large T antigen)이 발현하고 있으므로 SV40의 복제개시점을 갖는 플라스미드는 세포중에서 다수 카피(copy)의 에피솜(episome)으로 존재하도록 되고 통상보다 고 발현이 기대될 수 있다. 도입된 DNA 서열은 숙주 세포와 동일한 종으로부터 얻을 수 있거나, 숙주 세포와 다른 종의 것일 수 있거나, 또는 그것은 어떠한 이종 또는 상동성 DNA를 포함하는 하이브리드 DNA 서열일 수 있다.

물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 목적단백질의 cDNA를 클로닝 하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

본 발명에서 사용된 대장균 균주 및 플라스미드는 표 1에 나타내었다.

본 발명에서 사용한 균주 및 플라스미드

Name	Relevant characteristics ^a	Source
Strains
Mach1-T1^R	F^-φ80(lacZ)ΔM15 ΔlacX74 hsdR(r_K ^-m_K ⁺) ΔrecA1398 endA1 tonA	Invitrogen
DH10B	F-　mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacX74　recA1　endA1　araD139 Δ(ara leu) 7697　galU　galK　rpsL　nupG λ-	Invitrogen
E. coli W	Acid tolerant strain	KCTC1039
WSEN1	E. coli W/pCDF-106C4sgfp	본 발명
WSEN2	E. coli W/pCDF-106C3sgfp	본 발명
WSEN3	E. coli W/pCDF-116C4sgfp	본 발명
WSEN4	E. coli W/pCDF-104C4sgfp	본 발명
WSEN5	E. coli W/pCDF-116C3sgfp	본 발명
WSEL1	E. coli W/pCDF-3HPselector	본 발명
WLB1	WSEL1/ pACYC_B4	본 발명
WLBK1	WSEL1/ pACYC_B4/ pQE80L-K	본 발명
WLBK2	WSEL1/ pACYC_B4/ pQE80L-mK	본 발명
WLBK3	WSEL1/ pACYC_B4/ pQE80L-108K	본 발명

Plasmids
pQE-80L	Expression vector, Amp^R, ColE1 ori	Qiagen
pCDFDuet-1	Expression vector, Sm^R, CloDF13 ori	Novagen
pCDF-106C4sgfp	pCDF-P_{BBa_J23106}::synUTR_C4lysR-C4lysR::terminator-P_C4M::synUTR_sgfp-sgfp	본 발명
pCDF-106C3sgfp	pCDF-P_{BBa_J23106}::synUTR_C3lysR-C3lysR::terminator-P_C3::synUTR_sgfp-sgfp	본 발명
pCDF-116C4sgfp	pCDF-P_{BBa_J23116}::synUTR_C4lysR-C4lysR::terminator-P_C4M::synUTR_sgfp-sgfp	본 발명
pCDF-104C4sgfp	pCDF-P_{BBa_J23104}::synUTR_C4lysR-C4lysR::terminator-P_C4M::synUTR_sgfp-sgfp	본 발명
pCDF-116C3sgfp	pCDF-P_{BBa_J23116}::synUTR_C3lysR-C3lysR::terminator-P_C3::synUTR_sgfp-sgfp	본 발명
pCDF-3HPselector	pCDF-P_{BBa_J23106}::synUTR_C4lysR-C4lysR::terminator-P_C4M::synUTR_tetA-tetA	본 발명
pACYC-B4	pACYC-P_tac::SynUTR4_dhaB1-dhaB1-P_tac::SynUTR_dhaB2-dhaB2-dhaB3-gdrA-gdrB, Cm^R, p15A ori	(Lim et al., 2016)
pQE80L-K	pQE-80L-P_T5-kgsadh	(Watanabe et al., 2006)
pQE80L-K_Lib	pQE-80L-P_T5-kgsadh library	(Park et al., 2017)
pQE80L-mK	pQE-80L-P_T5-mkgsadh	본 발명
pQE80L-108K	pQE-80L-P_T5-108kgsadh	(Park et al., 2017)
pQE80L-K_K273E	pQE-80L-P_T5-kgsadh_K273E	(Park et al., 2017)
pQE80L-K_A442P	pQE-80L-P_T5-kgsadh_ A442P	(Park et al., 2017)
pQE80L-K_T443N	pQE-80L-P_T5-kgsadh_ T443N	본 발명
pQE80L-K_T444E	pQE-80L-P_T5-kgsadh_ T444E	(Park et al., 2017)

플라스미드 및 균주의 제조를 위한 통상적인 배양은 Luria-Bertani (LB) 배지 또는 적절한 항생제가 함유된 LB 한천 플레이트에서 수하였으며, 플라스미드 DNA 및 게놈 DNA의 분리는 AccuPrep^R Nano-Plus Plasmid Mini Extraction kit (Bioneer, 대전, 한국) 및 GeneAll^R Exgene^TM Cell SV kit (GeneAll Biotechnology, 서울, 한국)를 사용하여 수행하였다. Phusion DNA polymerase, Quick ligase 및 restriction endonuclease는 New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) 에서 구입하여 사용하였다. 클로닝을 위한 유전자 증폭에는 EmeraldAmp GT PCR Master Mix (Clontech Laboratories, Mountain View, CA, USA)를 사용하였으며, 증폭된 DNA 단편의 정제는 Geneall^R Expin^TM Gel SV Kit (GeneAll Biotechnology) 를 사용하였다. 본 발명에서 사용한 올리고 뉴클레오타이드는 표 2에 나타내었으며, Cosmogenetech(Korea) 에서 합성하였다. 세포 배양을 위한 시약은 BD Bioscience (Sparks, MD, USA) 에서 구입하고, 3-HP는 Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Japan) 에서 구입하여 사용하였다. 그 외에 다른 화학 물질은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) 에서 구입하여 사용하였다.

본 발명에서 사용한 올리고뉴클레오티드

Name	서열번호	Sequence (5'-3')^{a, b, c}
UTRsyn-C4_LysR-R	6	ACGGTACC AACCTGTAAAAAAGGAGCATCATCAATGGACTGGGACAACCTGCGG
C4_LysR-F	7	GTGGTTAACCTACATTCCCCGCCCCATCAAC
ApaI-term-F	8	AGCGGGGCCCGCGAATATGCCTGATGGTGCAAC
KpnI-J23106-term-R	9	ACATGGTACC GCTAGCACTATACCTAGGACTGAGCTAGCCGAAAA CGAAGCAGCTCTGGCTGTAC
KpnI-J23116-term-R	10	ACATGGTACC GCTAGCATAGTCCCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAA CGAAGCAGCTCTGGCTGTAC
KpnI-J23104-term-R	11	ACATGGTACC GCTAGCACAATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAA CGAAGCAGCTCTGGCTGTAC
UTRsyn-C3_LysR-R	12	ACGGTACC ACTCTCTATGAAAGGAGCATCCTGAATGTTCGACTGGAATGACCTG
C3_LysR-F	13	GTGGTTAACTTATCCGCCCGACGTTGGCGCCGCAGTTTTTCC
UTRopt-gfp-F	14	ACGGTCTCATTGCGTGAGAAAGGAGCATCGGGA
gfp-R	15	CAGCCTAGGtcacttgtacagctcgtcc
ApaI-PCM-F	16	AATGGGCCCGGGAAAGCTCGAGGAAAAACCGC
BsaI-PCM-R	17	ACGGTCTCCGCAATTGTGGCTTTTTTGTTGTCTGG
ApaI-PC3-F	18	AATGGGCCCGCAGTTCCAGGAAGTAGCGC
BsaI-PC3-R	19	ACGGTCTCCGCAATTTCTTGTTCTTTTGGGTATG
UTRVM-tetA-F	20	ACGGTCTC ATTGCGGTCTAAMGGAGCATCACAAATGAAATCTAAC
tetA-R	21	ATTCCTAGGTCAGGTCGAGGTGGCC

^a굵은 글씨체는 클로닝을 위해 사용된 제한 효소 자리를 나타낸다. ^b밑줄 친 문자는 합성 5'-UTR 서열을 나타낸다.

^c이탤릭체로 밑줄 쳐진 문자는 프로모터 서열을 나타낸다.

실시예 1: 3-HP 선택용 유전자회로 구축

최근, P. denitrificans 내에 존재하며 3-HP에 의해 유도되는 유전자 발현 시스템이 밝혀졌다(Zhou et al., Biotechnol Biofuels 8, 169, 2015). 이 시스템에서 3-HP는 LysR형 전사 조절인자를 유도하여 3-HP의 분해와 관련된 이화 유전자의 발현을 활성화시킨다. 본 실시예에서는 상기 전사인자 LysR과 3-HP 분해에 관여하는 유전자의 프로모터를 사용하여 합성 3-HP 선택 유전자 회로를 제작하였다(도 1B). 본 발명의 유전자 회로는 단일 벡터 내에 전사인자 발현 모듈 및 전사인자를 감지하여 특정 신호로 변환시키는 기능 모듈을 포함하며, 세포 내의 3-HP 존재 여부를 선택마커에 의하여 표현형으로 확인할 수 있다.

3-HP 선택용 유전자회로를 구축하기에 앞서 전사 조절 인자의 유형 및 발현 수준이 대장균에서의 유전자 회로 성능에 미치는 영향을 평가하였다 (도 2). 서로 다른 오페론에서 각각 hpdH 및 mmsA의 전사를 조절하는 C3-LysR, C4-LysR은 다른 세기를 갖는 3개의 프로모터와 조합되었다. 각 조합은 5개의 플라스미드를 얻기 위해 sgfp를 갖는 동족 프로모터(cognate promoter, 각 전사인자가 결합하는 프로모터)를 포함하고 있는 플라스미드로 클로닝하였다.

LysR 전사인자를 포함하는 유전자회로 구축을 위하여, 먼저, 합성 5'-UTR 오버행(overhang)을 갖는 프라이머 UTRsyn-C4_LysR-R 및 C4- lysR 말단에 결합하는 C4_LysR-F 프라이머를 사용하여 P. denitrificans 염색체를 주형으로, 전사인자인 C4-LysR을 암호화하는 유전자를 증폭시켰다. pCDF-C4_LysR를 구축하기 위해서, 앞서 증폭된 단편을 ApaI-term-F와 KpnI-J23106-term-R로 증폭된 전사 종결 서열을 포함하고 있는 BBa_J23106 프로모터(Standard Biological Parts (http://parts.igem.org))와 함께 pCDFDuet-1 벡터에 클로닝하였다. 이후, ApaI-term-F/KpnI-J23116-term-R 와 ApaI-term-F/KpnI-J23104-term-R 프라이머 세트를 이용하여 각각 터미네이터를 포함하고 있는 J23116 및 J23104 프로모터 서열을 증폭시켰다. 증폭된 프로모터 서열은 pCDF-C4_LysR2 및 pCDF-C4_LysR3의 제작을 위해서, 마찬가지로 앞서 증폭된 C4- lysR 서열과 함께 pCDFDuet-1 벡터에 클로닝하였다. 플라스미드 pCDF-C3_LysR도 동일한 방식으로 구축하였다. 전사인자인 C3-LysR을 암호화하는 유전자를 합성 5'-UTR 오버행을 갖는 UTRsyn-C3_LysR-R과 C3_LysR-F 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 상기 클로닝을 위해서 ApaI, KpnI 및 HpaI 제한 효소를 사용하였다.

선택마커로 사용할 형광 유전자인 sgfp의 서열은 변형된 N-말단을 갖는 sgfp를 주형으로 하고, 프라이머 세트 UTRopt-gfp-F /gfp-R을 사용하여 증폭시켰다. 정방향 프라이머는 검출 감도를 향상시키고자, 형광 단백질 유전자의 높은 수준의 발현을 위해 재설계된 합성 5'-UTR 오버행을 갖도록하였다. 프로모터 P_C4M 및 P_C3의 서열은 P. denitrificans의 염색체를 주형으로, 각각 프라이머 ApaI-PCM-F/BsaI-PCM-R 및 ApaI-PC3-F/BsaI-PC3-R 세트를 이용하여 증폭하였다. 증폭된 P_C4M 서열을 BsaI을 사용하여 변형된 N-말단을 갖는 sgfp와 연결시키고, ApaI 및 AvrII를 사용하여 pCDF-C4_LysR, pCDF-C4_LysR2 및 pCDF-C4_LysR3에 클로닝하였다. 마찬가지로, 증폭된 P_C3 서열을 BsaI을 사용하여 sgfp와 연결시키고, ApaI 및 AvrII를 사용하여 pCDF-C3_LysR에 클로닝 하였다. 결과적으로, 3-HP 검출 플라스미드인 pCDF-106C4sgfp, pCDF-116C4sgfp, pCDF-104C4sgfp 및 pCDF-106C3sgfp를 제작하였다(도 2). 프로모터 P_C3 및 P_C4M은 각각 C3-LysR 및 C4-LysR에 의해 활성화된다.

pCDF-116C3sgfp의 제작을 위해, ApaI 및 KpnI 제한 효소를 사용하여 pCDF-116C4sgfp 및 pCDF-106C3sgfp를 자르고, 얻어진 각 단편을 연결하였다. 플라스미드의 C4- lysR은 181245.75 [a.u.]의 번역 수준을 가지도록, C3- lysR은 171386.94 [a.u.]의 번역 수준을 가지도록 합성 5'-UTR을 디자인했다. sgfp의 N-말단 서열은 UTR Designer (http://sbi.postech.ac.kr/utr_designer) (Seo et al., Metab . Eng . 15, 67, 2013)를 사용하여 예측 발현 수준이 2064841.65 [a.u.]가 되도록 설계하였다.

또한, pCDF-106C4sgfp의 sgfp 유전자를 테트라사이클린/H⁺ 역수송체(antiporter)를 암호화하는 선택 마커 (selection marker) tetA로 대체하여 3-HP 선택용 유전자회로를 구축하였다(도 1B). 이 유전자 회로는 활성화 유형이므로 TetA를 사용하면 세포질에 3-HP를 축적하는 세포가 테트라사이클린의 존재 하에서 생존할 수 있다.

3-HP 선택용 유전자회로인 pCDF-3HP selector를 구축하기 위해서 pBR322(Fermentas, Glen Burnie, MD, USA)를 주형으로 UTRVM-tetA-F/tetA-R 프라이머 세트를 사용하여 선택마커로 사용할 테트라사이클린 내성 유전자인 tetA를 증폭시켰다. 증폭된 단편을 BsaI 효소를 사용하여 P_C4M 프로모터와 연결했다. 결합된 생성물을 ApaI 및 AvrII 효소를 사용하여 pCDF-C4_LysR에 클로닝하였고, 그 결과 pCDF-3HPselector를 구축할 수 있었다. 플라스미드 상의 tetA 발현을 위한 합성 5'-UTR은 308335.61 [a.u.]로 디자인하였다.

실시예 2: 3 -HP 선택용 유전자회로를 포함하는 대장균의 3-HP 농도에 따른 형광 및 성장률 측정

실시예 1에서 제작된 3-HP 선택용 유전자회로를 대장균 W(KCTC1039)로 형질전환시키고, 배지 내의 3-HP 농도를 변화시키면서 형광수치를 측정하였다. 재조합 균주는 플라스미드 유지를 위해 50 ㎍/ml 스트렙토마이신이 첨가된 글리세롤 M9 최소 배지[0.5 g/L MgSO₄· 7H₂O, 2 g/L NH₄Cl, 2 g/L NaCl, 1 g/L 효모 추출물 및 100 mM 인산 칼륨 완충액 (pH 7.0) 및 탄소원으로서 100 mM 글리세롤]에 접종하여 하룻 밤 배양 후, 세포를 수확하고 세척한 후 0.1 OD₆₀₀로 새로운 배지에 접종하였다. 그리고 10M NaOH에 의해 중화된 3-HP를 최종 농도 0g/L, 1.25g/L, 2.50g/L, 7.50g/L 및 10.00 g/L가 되도록 배지에 첨가하였다. 형광 및 OD₆₀₀을 1시간 간격으로 측정하고, 단일 세포의 형광을 접종 5시간 후에 분석하였다. 형광은 Sense425-301 마이크로 플레이트 판독기 (HIDEX, Turku, Finland)를 이용, 486nm 여기(excitation)와 535nm 방출(emission) 필터를 사용하여 측정했다. 측정된 형광수치를 OD₆₀₀으로 나누어 표준화하고, 이를 비형광(specific fluorescence)으로 나타내었다. 단일 세포 수준에서의 형광은 S3e cell sorter (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용해 관찰하였다.

WSEN1 (J23106-C4LysR), WSEN3 (J23116-C4LysR), WSEN4 (J23104-C4LysR), WSEN2 (J23106-C3LysR) 및 WSEN5 (J23116-C3LysR) 균주를 사용한 3-HP 농도에 따른 형광 수치 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다. 프로모터의 상대적 세기는 J23116:0.16, J23106:0.47, J23104:0.72이다.

BBa_J23104-C3LysR의 경우는 플라스미드를 구축할 수 없었는데, 그 이유는 아마도 도 3A에서 확인할 수 있듯이 C3-LysR의 과발현이 세포 성장을 억제하는 경향을 보이기 때문일 것이다. 강한 프로모터인 BBa_J23104 및 C4-LysR 조합을 함유하는 유전자 회로는 3-HP에 의해 유도 발현되는 형광 값의 큰 편차로 인해서 본 발명의 유전자 회로에 사용하기 적합하지 않다고 판단하였다(도 4A). 다섯 가지 유전자 회로 각각의 형광 히스토그램은 도 3B에 나타냈다. 유전자 회로의 동적 범위는 전사인자의 발현 수준에 크게 영향을 받지 않았지만 전사인자의 유형에 영향을 받는 것으로 보인다. C4-LysR로 구성된 유전자 회로의 경우 동일한 3-HP 농도에서 C3-LysR로 구성된 유전자 회로보다 높은 배 변이(fold-change)를 나타냈다. 또한, C4-LysR로 구성된 유전자 회로는 2.5 g/L 3-HP까지 선형 증가를 나타내었고, 형광 값은 3-HP 농도가 7.5 g/L에 도달 할 때까지 증가했다. 한편, C3-LysR 함유 유전자 회로의 형광은 보다 낮은 3-HP 농도에서 포화되었다 (도 4B). 이러한 결과는 C4-LysR로 구성된 합성 유전자 회로가 전사인자의 발현 수준이 너무 높지 않도록 설계될 경우에 대장균에서 3-HP를 효과적으로 검출할 수 있음을 시사한다. 표기된 3-HP 농도는 세포 외 농도이기 때문에 동일한 3-HP 생산 역가를 갖는 생산 균주에서 활성화 배수 변화(activation fold change)가 일치하지 않을 수 있다.

아울러, 선택 압력(selection pressure) 하에서 3-HP 농도에 의한 성장 속도의 변화를 측정하기 위하여, 실시예 1에서 제작된 pCDF-3HPselector를 대장균 W로 형질전환시키고 비성장 속도(specific growth rate, h^-1)를 측정하였다. BioscreenC MBR(Oy Growth Curves Ab, Helsinki, Finland)을 사용하여 각 균주의 성장률을 결정하였다. 이 때, 배양 배지는 각각 0.0g/L, 1.0g/L, 2.5g/L, 5.0g/L 및 7.5 g/L의 3-HP를 첨가하였다. 선택 압력으로 0㎍/mL, 40㎍/mL, 60㎍/mL, 80㎍/mL, 100㎍/mL, 120㎍/mL, 140㎍/mL, 160㎍/mL, 180㎍/mL 및 200 ㎍/mL의 테트라사이클린을 각 배지에 첨가하였다.

pCDF-3HPselector가 세포 내에 구현되었을 경우, 테트라사이클린을 포함하는 배지에서 세포 성장의 속도는 3-HP의 농도에 의해 영향을 받았다(도 5). 또한 3-HP 농도에 따라 유전자 회로의 선택 차단 수준(cut-off level)을 조정할 수 있는지 여부도 조사했다. 선택 조건을 조절함으로써, 3-HP 농도에 따른 세포 성장 속도의 차이가 관찰되었는데, 이는 tetA의 상이한 발현 수준에 의해 야기된다. 이는 3-HP 선택용 유전자회로가 세포 내에서 구현될 때 3-HP 농도가 tetA의 발현 수준으로 반영된다는 것을 나타낸다.

실시예 3: 3 -HP 검출 유전자 회로를 이용한 KGSADH 효소의 직접 진화(directed evolution)

본 실시예에서는 실시예 1에서 제작된 3-HP 선택용 유전자회로를 적용하여 생리학적으로 다양화된 미생물 중에서 최적의 3-HP 생산 균주를 선별하고자 하였다.

3-HP는 대장균(E. coli)에서 글리세롤로부터 연속적으로 두 차례 효소 반응을 거쳐 생산될 수 있다(도 1A). 이러한 생화학 경로는 3-HP의 생물학적 생산에 효과적이나, KGSADH의 낮은 활성은 독성 중간체인 3-HPA의 축적을 유발하여 여전히 해결되어야 할 주요한 문제로 여겨지고 있다.

따라서, 3-HP의 생산성을 높이기 위해서는 향상된 KGSADH 활성이 필요하다. 본 발명자들의 연구에서는 KGSADH 효소의 단일사이트 변이 라이브러리의 스크리닝 결과를 기반으로 알데히드 결합 사이트를 타겟으로 하여 KGSADH 라이브러리를 만들었다(도 6, 대한민국 특허출원 제2018-0001330호). 혼합 뉴클레오타이드를 사용하여 라이브러리를 만들었으며 이론적 라이브러리 크기는 27648이었다. 라이브러리를 96-well 플레이트와 NADH의 흡광도를 이용해서 스크리닝하였으며, 사용된 스크리닝 방법의 처리량(throughput)이 낮기 때문에 라이브러리의 일부(약 8000 개의 콜로니) 만을 검사하였다.

반면, 본 발명의 3-HP 선택 방법의 경우 커버할 수 있는 라이브러리 크기는 돌연변이 유전자로 형질전환된 세포의 수, 즉 라이브러리의 사이즈에 의해서만 제한된다. 따라서 보다 높은 활성을 갖는 KGSADH 변이체를 분리하기 위해서 selection 방법을 알데히드 결합 부위 라이브러리에 적용하기로 결정하였다.

돌연변이는 pQE80L-K 플라스미드 (Watanabe et al., J. Biol. Chem., 281: 28876, 2006)를 주형으로 이용하여, 어셈블리 PCR(assembly PCR)을 통해 KGSADH 유전자를 도입시켰다(대한민국 특허출원 제2018-0001330). 이 때 사용한 프라이머는 표 3에 나타냈다. PCR 결과물을 BamHI 및 PstI 를 사용하여 pQE-80L 플라스미드에 연결 하여 KGSADH 라이브러리를 만들었고, 이를 대장균 DH10B로 형질 전환시켰다. 라이브러리의 플라스미드 DNA(pQE80L-K_Lib)는 GDHt 발현 벡터 및 3-HP selection device가 들어있는 재조합된 WLB1 균주에 형질 전환되었다.

KGSADH 라이브러리 구축을 위해 사용된 올리고뉴클레오티드

Name	서열번호	Sequence (5'-3')^a,b
KGSADH library-F	22	GATTCAATTGTGAGCGGATAAC
KGSADH library-R	23	CTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCG
KGSADH A110-F	24	CGAAGTGCTGTCGKCCGCGGACATCATCG
KGSADH A110-R	25	CGATGATGTCCGCGGMCGACAGCACTTCG
KGSADH N159-F	26	GTGGAATTTCCCGGTCRHCCAGGTCGTGCGCAAG
KGSADH N159-R	27	CTTGCGCACGACCTGGDYGACCGGGAAATTCCAC
KGSADH K273-F	28	GTTGCGCTCGCGGTGDMAGCGGCCGGCGG
KGSADH K273-R	29	CCGCCGGCCGCTKHCACCGCGAGCGCAAC
KGSADH R281-F	30	GGCGGCGCGAAGTTCCRKAACGCGGGGCAGG
KGSADH R281-R	31	CCTGCCCCGCGTTMYGGAACTTCGCGCCGCC
KGSADH A442T443P444-F	32	GCTGTGGATCAACCAGCCGSCGRMWVMATGGCCGGAAATGCCGTTCG
KGSADH A442T443P444-R	33	CGAACGGCATTTCCGGCCATKBWKYCGSCGGCTGGTTGATCCACAGC

^a밑줄 쳐진 문자는 라이브러리 생성을 위한 아미노산 서열을 나타낸다. ^bK: G/T; M: A/C; R: A/G; H: A/C/T; D: A/G/T; Y: T/C; S: C/G; W: A/T; V: A/C/G; B: C/G/T.

KGSADH 라이브러리 DNA를 대장균 DH10B로 형질 전환시켜 10⁵ 개 이상의 형질 전환체를 얻었다. 이렇게 얻어진 라이브러리 플라스미드 DNA를 선별 유전자 회로가 구현되어 있는 균주 WLB1에 형질전환시켰다.

WLBK1의 성장률은 균주의 성장이 심각하게 저해되는 선별 조건(selection condition)을 확립하기 위해 선택 압력 (0-20 ㎍/mL 테트라사이클린)을 점진적으로 변화시킴으로써 분석하였다. 이 실험에서 IPTG (0.1 mM) 및 B₁₂ (2 μM)를 OD₆₀₀ 이 0.5 일 때 첨가하고, 그로부터 1시간 후에 테트라사이클린을 농도별로 첨가하였다.

3-HPA 결합 포켓 라이브러리 (pQE80L-K_Lib) 를 WLB1 균주로 형질 전환시킨 후, 세포를 25-30 ㎍/mL의 테트라사이클린을 포함하고 있는 25mL의 변형된 글리세롤 최소 배지에서 배양 하였다. OD₆₀₀ 값이 0.8-1.0에 도달했을 때, 세포를 새로운 배지에 희석시켰다. 2회의 연속 배양 (serial culture) 후, 라이브러리를 희석시키고 50 ㎍/mL 스트렙토마이신, 34 ㎍/mL의 클로람페니콜 및 100 ㎍/mL의 암피실린을 함유하는 LB 한천 플레이트 도말하고, 37 ℃ 에서 밤새 배양하여 수십 개의 단일 콜로니를 획득했다. 개별 콜로니들을 이용해 시험관에서 3-HP 생산성을 확인 한 후, 3-HP 생산성이 가장 높은 균주를 사용하여 플라스크에서 배양했다.

집적배양을 위한 선별 압력(selection pressure)인 25-30㎍/mL의 테트라사이클린 조건은 모균주인 WLBK1의 성장을 현저히 저해하는 조건이다(도 7). 균주는 3-HP가 배지에서 보충된 조건과 실제 생산 조건 사이에서 상이한 성장률을 보였다. 3-HP를 배지에 세포 외로 첨가하면, 세포 내 3-HP 농도는 초기 성장 단계에서 높은 수준으로 유지될 것이다. 그러나, 생산 조건 하에서, 세포 내 3-HP 농도는 초기 단계에서 낮을 것이며, 이것은 3-HP를 배지에 첨가한 조건에 비해 상대적으로 낮은 테트라사이클린 농도 하에서 세포 성장을 저해시킬 수 있을 것이다.

선별 압력(selection pressure)하에서 2 회의 연속 배양(serial culture) 후, 배양액으로부터 30개의 콜로니를 분리하여 시험관에서 스크리닝하였고, 그 중 생산성이 가장 높은 균주를 사용하여 플라스크 배양을 통해 3-HP 생산성을 확인하였다(도 8). 이들 균주 중 #4, #19 및 #29 균주는 3-HP를 생산하지 않고, 1,3-PDO(1,3-프로판디올)만을 생산했다. 이것은 아마도 활성이 전혀 없는 KGSADH 서열이 라이브러리에 포함되어 있어서 해당 서열을 갖는 균주는 3-HP를 생산할 수 없었고, 1,3-PDO는 원래 대장균 내에 존재하는 알데히드환원효소를 코딩하는 yqhD에 의해 3-HPA로부터 생산되었을 것이다.

실시예 4: KGSADH 변이체의 분석

실시예 3의 시험관 배양에서 가장 높은 3-HP 생산성을 나타낸 균주로부터 KGSADH 유전자를 암호화하고 있는 플라스미드를 분리, 정제하고 돌연변이 KGSADH(mKGSADH로 명명)의 뉴클레오티드 서열을 확인하였다(표 4).

KGSADH 효소들의 아미노산 서열

KGSADH	Position ^{a, b}
KGSADH	110	159	273	281	442	443	444
Wild-type	A(GCG)	N(AAC)	K(AAA)	R(CGC)	A(GCG)	T(ACG)	P(CCG)
Mutant	A(GCG)	N(AAC)	E(GAA)	R(CGC)	P(CCG)	N(AAT)	E(GAA)

^a라이브러리 구축에 이용된 일곱 개의 아미노산을 위의 표에 나타냈다. ^b야생형 KGSADH와 다른 아미노산들은 회색의 박스로 나타냈다.

KGSASDH 변이체는 96-well 플레이트에 기초한 스크리닝 방법을 사용하여 동일한 라이브러리로부터 분리된 클론(대한민국 특허출원 제2018-0001330)에서 발견되지 않는 독특한 아미노산 서열을 갖는다. 특히, T443N 돌연변이는 낮은 처리량의 스크리닝 방법을 사용하여 분리된 클론에서 관찰되지 않았다. 농축 과정 동안 염색체 및 3-HP 생산을 위한 다른 플라스미드에 일어났을 수 있는 효과를 제거하기 위해서 mKGSADH를 암호화하고 있는 플라스미드를 WLB1 균주로 형질전환하였고, 그 결과 구축된 균주(WLBK2로 명명 됨)의 3-HP 생산성을 확인하였다.

3-HP 생산을 위한 배양 실험은 100 mM 글리세롤이 포함된 변형된 M9 최소 배지 [0.5 g/L MgSO₄· 7H₂O, 2 g/L NH₄Cl, 2 g/L NaCl, 1 g/L 효모 추출물 및 100 mM 인산 칼륨 완충액 (pH 7.0)]을 사용하여 수행하였다. 플라스미드를 유지하기 위해, 50 ㎍/mL의 스트렙토마이신, 34 ㎍/mL의 클로람페니콜 및 50 ㎍/mL의 암피실린을 첨가하였다. 대장균 균주를 50mL의 배지가 들어있는 300mL 플라스크에서 배양하고, 37℃의 220 rpm 회전식진탕기(rotary shaker)에서 배양하였다. 3-HP 생산성을 확인하기 위해 단일 콜로니를 적절한 항생제가 들어있는 배지에 접종하고, 충분히 포화된 배양액을 0.1 OD₆₀₀이 되도록 새로운 배지에 접종하였다. 이것이 exponential phase에 도달하면 0.1 OD₆₀₀이 되도록 신선한 배지에 접종했다. 그 후, OD₆₀₀ 0.9-1.0이 되었을 때 0.1 mM의 IPTG를 첨가하여 유도성 유전자들의 발현을 유도하고, 동시에 GDHt 활성을 돕기 위해 조효소 B₁₂(2 μM)를 첨가했다. 배양 실험은 세 번의 생물학적 반복 실험으로 수행하였다.

그 결과, WLBK2 균주는 24시간 배양 후 5.08 g/L의 3-HP를 생산하였고, 0.66 g/g의 수율을 나타냈는데, 이는 모균주인 WLBK1 (3-HP 4.07 g/L, 0.53 g/g 수율)보다 25% 더 높은 수준이다(도 9). WLBK2 균주는 또한 대한민국 특허출원 제2018-0001330에 의해 밝혀진 KGSADH 돌연변이 균주의 3-HP 생산성과도 비교하였다. 대한민국 특허출원 제2018-0001330에서는 동일한 라이브러리로부터 야생형 KGSADH보다 촉매 활성 (k_cat/K_m)이 1.47 배 높은 활성을 보이는 KGSADH (108KGSADH로 명명됨) 돌연변이체를 분리하였다. 본 실시예에서는 108KGSADH를 코딩하는 플라스미드를 WLB1 균주로 형질전환시키고, 생성된 균주 (WLBK3로 명명됨)의 3-HP 생산성을 평가하였다. WLBK3 균주는 24시간 배양 후 4.18 g/L의 3-HP를 생산하였으며, 0.57 g/g의 수율을 보였는데, 이는 모균주 WLBK1 보다 약간 증가한 정도이다(도 10).

야생형과 mKGSADH 효소를 정제하고, k_cat과 K_m의 효소 특성을 분석하였다 (표 5).

야생형 및 돌연변이 KGSADH를 pQE-80L 플라스미드를 이용, 대장균 DH10B에서 발현시켰다. OD₆₀₀이 0.5가 될 때까지 세포를 37℃, 2xYT 배지에서 배양한 후, 효소를 암호화하고 있는 유전자의 발현을 1mM IPTG를 이용하여 유도하였다. 6시간 배양 후, 세포를 9,300g 및 4℃에서 15분 동안 원심분리하여 수확하고, 세포 펠렛은 이후에 사용할 때까지 -80℃에서 보관 하였다. N-말단 His6-태그를 갖는 효소는 제조사의 프로토콜에 따라 Ni-NTA 수지(Clontech Laboratories)를 사용하여 정제하였다. Centrifugal ultrafiltration filter(MWCO: 10,000; Merck Millipore, Billerica, MA, USA)를 사용하여 150 mM NaCl이 포함된 10 mM 인산 완충액(pH 7.4)으로 단백질 용액을 교환시키고, 정제된 단백질은 1 mM EDTA, 1 mM DTT 및 50% (v/v) 글리세롤을 함유하는 20 mM 인산 칼륨 (pH 7.5)에 저장했다. 정제된 단백질의 농도는 ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)에 의해 결정된 흡광 계수를 사용하여 280nm에서의 흡광도를 측정하여 결정하였다. 흡광도는 EON Microplate Reader (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)를 사용하여 측정하였다.

3-HPA에 대한 KGSADH 효소의 kinetic 상수는 25℃에서 기질-효소의 반응 속도를 측정하여 결정했다. 반응속도는 3-HPA에서 3-HP로의 산화가 NAD⁺에서 NADH (NADH의 λ_max = 340 nm)의 환원과 커플링되어 증가하는 A₃₄₀ (ε = 6,220 M-1 cm-1)를 관찰하여 결정하였다. 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.2% (w/v) BSA 및 2 mM NAD⁺가 첨가된 100mM 인산 완충액 (pH 8)에서 효소 농도를 20nM로 조정하고, 다양한 농도의 3-HPA를 첨가하여 반응을 개시하였다. NAD⁺에 대한 kinetic 상수를 결정하기 위하여, 효소를 3-HPA를 함유하는 완충액으로 희석하고, 다양한 농도의 NAD⁺를 첨가시켜 반응을 개시하였다. 흡광도는 EON 마이크로 플레이트 리더(BioTek Instruments, Inc.)를 사용하여 측정하였고, Origin 8.5 (Northaempton, MA, USA)를 사용하여 데이터를 분석하였다.

야생형과 돌연변이 KGSADH의 kinetic constants.^a,b,c,d

	KGSADH	k _cat (s ^-1 )	K _m (mM)	k _cat /K _m (s ^-1 mM ^-1 )
3-HPA	Wild-type	13.86 (±2.36)	1.42 (±0.20)	9.72 (±0.27)
3-HPA	Mutant	16.14 (±0.23)	0.61 (±0.11)	27.09 (±5.03)
NAD⁺	Wild-type	11.18 (±0.92)	0.21 (±0.02)	52.18 (±1.40)
NAD⁺	Mutant	20.29 (±3.85)	0.40 (±0.06)	50.77 (±4.48)

^a3-HPA 에 대한 k_cat과 K_m은2mM NAD⁺를 이용하여 측정하였다. ^bNAD⁺에 대한 k_cat과 K_m은 3mM 3-HPA를 이용하여 측정하였다.

^c각각의 값은 평균 ± 표준편차 (세번의 실험)를 나타낸다.

^dKGSADH, 알파-케토글루타르산 세미알데히드 탈수소효소; 3-HPA, 3-히드록시프로피온알데히드.

그 결과, 표 5에 나타난 바와 같이, 야생형 효소와 비교하여, mKGSADH는 K_m 값이 2배 이상 감소했으며, 유사한 k_cat 값을 보였다. 이 결과는 mKGSADH가 k_cat 값의 손실 없이 기질 3-HPA에 대한 친화성이 증가하였다는 것을 나타내고 따라서 진화된 효소의 촉매 효율 (k_cat/K_m)은 야생형과 비교하여 2.79 배까지 증가했다. 그런데 알데히드 결합 부위 외에도 예기치 않게 표적 부위인 NAD⁺에 대한 K_m의 변화가 관찰되었다. mKGSADH의 NAD⁺에 대한 K_m 값이 야생형 효소의 K_m 값보다 2배 더 높았다. 그러나, mKGSADH의 k_cat 값은 증가되었고, 따라서 mKGSADH의 k_cat/K_m은 야생형 효소와 유사했다. 또한 단일 아미노산 변이로 인한 KGSADH의 효소 활성 변화를 측정하여 mKGSADH가 갖는 4가지 아미노산 돌연변이 각각의 중요성을 확인하였다. 그 결과 각 돌연변이만으로는 3-HPA에 대한 촉매 효율 향상을 확인하기 어려웠으며, 모든 결과는 야생형과 유사했다(표 6). 이 결과는 모든 돌연변이가 조합되어야만 mKGSADH의 활성이 향상될 수 있다는 것을 나타낸다.

돌연변이 KGSADH의 단일 아미노산 돌연변이의 kinetic parameters. ^a,b,c,d

	Mutation	k _cat (s ^-1 )	K _m (mM)	k _cat /K _m (s ^-1 mM ^-1 )
3-HPA	K273E	13.61 (±4.34)	1.58 (j67)	8.85 (±2.48)
	A442P	18.26 (± 3.58)	1.83 (±0.60)	10.26 (±2.60)
	T443N	13.06 (±1.78)	1.15 (±0.03)	11.34 (±1.31)
	P444E	11.32 (±3.77)	1.13 (±0.08)	9.66 (±2.87)
NAD⁺	K273E	12.63 (±3.14)	0.24 (±0.03)	53.49 (±15.00)
	A442P	10.87 (±2.15)	0.19 (±0.00)	56.88 (±11.20)
	T443N	10.07 (±1.56)	0.17 (±0.03)	58.19 (±4.35)
	P444E	9.80 (±0.99)	0.17 (±0.01)	57.47 (±3.12)

^a3-HPA에 대한 k_cat 과 K_m은2mM NAD⁺를 이용하여 측정하였다. ^bNAD⁺에 대한k_cat 과 K_m은 3mM 3-HPA를 이용하여 측정하였다. ^c각각의 값은 평균 ± 표준편차 (세번의 실험)를 나타낸다.

^dKGSADH, 알파-케토글루타르산 세미알데히드 탈수소효소; 3-HPA, 3-히드록시프로피온알데히드

본 발명자들의 이전 발명(대한민국 특허출원 제2018-0001330)에 의해서 잘 디자인된 라이브러리가 만들어졌지만, 스크리닝 단계의 한계 때문에 더욱 활성이 증가된 돌연변이 효소가 선별되지 않았다. 스크리닝 방법의 차이는 돌연변이체 KGSADH와 높은 3-HP 생산 균주의 선별에 영향을 주었고, 본 발명의 방법을 이용한 스크리닝을 통하여, 결과적으로 108KGSADH보다 향상된 활성을 나타내는 mKGSADH를 선별할 수 있었다. 또한, mKGSADH를 포함하고 있는 WLBK2 균주는 108KGSADH를 포함하고 있는 WLBK3보다 22% 높은 3-HP 생산성을 나타냈다. 이러한 결과는 3-HP 선택용 유전자회로가 값 비싼 장비나 노동 집약적인 과정 없이 많은 수의 후보로부터 3-HP 생산량이 높은 변이 균주를 쉽게 선별할 수 있음을 보여준다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Noroo Holdings Co., Ltd <120> Gene Circuit for Selecting 3-Hydroxypropionic Acid Using Responding 3-Hydroxypropionic Acid Transcription Factor and Method for Screening of 3-Hydroxypropionic Acid Producing Strain <130> P18-B062 <160> 33 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 915 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C3-LysR <400> 1 atgttcgact ggaatgacct gcgctacttc ctggaactgc accgcagcgg taggctgctg 60 accaccgcca agcgcctgaa caccacccac gccacggtgg cgcggcacat cgagaacatc 120 gagcgcgacc tcggcaccca gctgttcgcc cagcacaccg gcggctacca gctcaccccg 180 gccggccagg cgctgctcaa gcacgccgag gcgatggaaa acaccgccct gctcgcccag 240 gaggaaatga gccaggccat ctcgccgctg gggcagatcc gcatcggcgt caccgaaggc 300 ctgggcaccc tgttcctcgc cccgcgcatg ggcgaactga tgcggcgcta cccggggctg 360 gaagtggagc tggtgtcggt gccgcgcttc gtcagcatca ccaatcgcga ggcggacatc 420 gccatcaccc tcgaacgccc cagcgccgac ctggtgatca gccgccgcct gacccgctac 480 cgcctgagcc tgttcgccag ccccgcctac ctggaaagcg ccccgcccct gcgcgaccgc 540 gaggacctgt gcaagcaccc gtggatcggc tacgtggacg acctgctgtt cagccaggaa 600 ctgatgttcc accacagctt ctgccgccac ccgcaagtgg tcttccgcag caccagcgtg 660 gtcgcccagc aacaggccgc ccaggccggc atcggcattg ccatcctgcc gcagttcatg 720 ggcctgcctg atccgctgct ggtgccggtg ctgccggaag agttcatcga gcgggagtac 780 tggatgtgca ctcgacggga attgcaccgg tcggtacgtc tgagattggt gtgggatttt 840 ctgatggagc tgtgcgggag agaacaggga atcctggtgg aaggaaaaac tgcggcgcca 900 acgtcgggcg gataa 915 <210> 2 <211> 897 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4-LysR <400> 2 atggactggg acaacctgcg gtttttcctc gagctttccc gcgccggcaa gctcaccgtt 60 gccgcccgtc gactgggcgt ggaccacacc acggtcgccc gtcgtctgca ggcgctggag 120 aagagtattg gcgcgcaact gctggtgcgc gagccgggcg gctaccggtt gaccgaagcc 180 ggccacggcc tgctgcccca ggccgaggcg atggagagtg cctgcaaggt gatcgagaag 240 cgcctggcgg gaaccgagga caatctctcc ggcaaggtgc gcatcggcgc caccgaaggc 300 tatggctcga ccctgctgac ctcgcaactg gtggagctga accggcgcca cccgcacctg 360 ggcgtggatc tgctggcggt gccgcgcgcg ttgcagctgt cgcgccatga ggcggacatc 420 gtgattacgc tggagcgccc tggccgcggg ccttacatca tcacccggct gaccgattac 480 gtgctgcgcc tgtatgcctc gaaggactat ctggccgagc gcggaccgat ccgcaatcgc 540 gacgatctgc gcgagcatgc gctggtcgga tacgtcgatg acctgttgta cagcaaggag 600 ctgcaatacc tcgacgagat cggccggccg ttgcacatgg cgctgcgctg caccagcatc 660 ctcgcccagc aacgcgcggt ggcggagggt gcggggctgg cgatcctgcc ggcattcgcc 720 gcagccgagg actcctcgtt gcagccggtg ctggcggggg agatcgagtt cgtgcggacc 780 ttctggatgc tgatgccgac cgagctcaag gacatcgcgc ggatgcgcac cacctgggat 840 ttcctgcggg agaaggcgga ggggagccag gaggcgttga tggggcgggg aatgtag 897 <210> 3 <211> 484 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> WLBK2 aldehyde dehydrogenase <400> 3 Met Ala Asn Val Thr Tyr Thr Asp Thr Gln Leu Leu Ile Asp Gly Glu 1 5 10 15 Trp Val Asp Ala Ala Ser Gly Lys Thr Ile Asp Val Val Asn Pro Ala 20 25 30 Thr Gly Lys Pro Ile Gly Arg Val Ala His Ala Gly Ile Ala Asp Leu 35 40 45 Asp Arg Ala Leu Ala Ala Ala Gln Ser Gly Phe Glu Ala Trp Arg Lys 50 55 60 Val Pro Ala His Glu Arg Ala Ala Thr Met Arg Lys Ala Ala Ala Leu 65 70 75 80 Val Arg Glu Arg Ala Asp Ala Ile Ala Gln Leu Met Thr Gln Glu Gln 85 90 95 Gly Lys Pro Leu Thr Glu Ala Arg Val Glu Val Leu Ser Ala Ala Asp 100 105 110 Ile Ile Glu Trp Phe Ala Asp Glu Gly Arg Arg Val Tyr Gly Arg Ile 115 120 125 Val Pro Pro Arg Asn Leu Gly Ala Gln Gln Thr Val Val Lys Glu Pro 130 135 140 Val Gly Pro Val Ala Ala Phe Thr Pro Trp Asn Phe Pro Val Asn Gln 145 150 155 160 Val Val Arg Lys Leu Ser Ala Ala Leu Ala Thr Gly Cys Ser Phe Leu 165 170 175 Val Lys Ala Pro Glu Glu Thr Pro Ala Ser Pro Ala Pro Ala Leu Leu 180 185 190 Arg Ala Phe Val Asp Ala Gly Val Pro Ala Gly Val Ile Gly Leu Val 195 200 205 Tyr Gly Asp Pro Ala Glu Ile Ser Ser Tyr Leu Ile Pro His Pro Val 210 215 220 Ile Arg Lys Val Thr Phe Thr Gly Ser Thr Pro Val Gly Lys Gln Leu 225 230 235 240 Ala Ser Leu Ala Gly Leu His Met Lys Arg Ala Thr Met Glu Leu Gly 245 250 255 Glu Gly His Ala Pro Val Ile Val Ala Glu Asp Ala Asp Val Ala Leu 260 265 270 Ala Val Glu Ala Ala Gly Gly Ala Lys Phe Arg Asn Ala Gly Gln Val 275 280 285 Cys Ile Ser Pro Thr Arg Phe Leu Val His Asn Ser Ile Arg Asp Glu 290 295 300 Phe Thr Arg Ala Leu Val Lys His Ala Glu Gly Leu Lys Val Gly Asn 305 310 315 320 Gly Leu Glu Glu Gly Thr Thr Leu Gly Ala Leu Ala Asn Pro Arg Arg 325 330 335 Leu Thr Ala Met Ala Ser Val Ile Asp Asn Ala Arg Lys Val Gly Ala 340 345 350 Ser Ile Glu Thr Gly Gly Glu Arg Ile Gly Ser Glu Gly Asn Phe Phe 355 360 365 Ala Pro Thr Val Ile Ala Asn Val Pro Leu Asp Ala Asp Val Phe Asn 370 375 380 Asn Glu Pro Phe Gly Pro Val Ala Ala Ile Arg Gly Phe Asp Lys Leu 385 390 395 400 Glu Glu Ala Ile Ala Glu Ala Asn Arg Leu Pro Phe Gly Leu Ala Gly 405 410 415 Tyr Ala Phe Thr Arg Ser Phe Ala Asn Val His Leu Leu Thr Ala Gln 420 425 430 Arg Leu Glu Val Gly Met Leu Trp Ile Asn Gln Pro Pro Asn Glu Trp 435 440 445 Pro Glu Met Pro Phe Gly Gly Val Lys Asp Ser Gly Tyr Gly Ser Glu 450 455 460 Gly Gly Pro Glu Ala Leu Glu Pro Tyr Leu Val Thr Lys Ser Val Thr 465 470 475 480 Val Met Ala Val <210> 4 <211> 124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter sequences of PC3 <400> 4 cgtggcgact ctcattgtta gaaaacgcac agcaggtgac tttaaacgtt cgtattttta 60 tcgcgaacga acgactaggc tccatcgtca tacccaaaag aacaagaacg acgagggact 120 ttcc 124 <210> 5 <211> 106 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter sequences of PC4M <400> 5 gcccccgcct acccgcccca gccaccccgg actcagcaag gatgctggcc cgggcctggg 60 cggagacgtc tttcgcgccc gaccatcaga acaagaggac aacccc 106 <210> 6 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 acggtaccaa cctgtaaaaa aggagcatca tcaatggact gggacaacct gcgg 54 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gtggttaacc tacattcccc gccccatcaa c 31 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 agcggggccc gcgaatatgc ctgatggtgc aac 33 <210> 9 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 acatggtacc gctagcacta tacctaggac tgagctagcc gaaaacgaag cagctctggc 60 tgtac 65 <210> 10 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 acatggtacc gctagcatag tccctaggac tgagctagct gtcaacgaag cagctctggc 60 tgtac 65 <210> 11 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 acatggtacc gctagcacaa tacctaggac tgagctagct gtcaacgaag cagctctggc 60 tgtac 65 <210> 12 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 acggtaccac tctctatgaa aggagcatcc tgaatgttcg actggaatga cctg 54 <210> 13 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gtggttaact tatccgcccg acgttggcgc cgcagttttt cc 42 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 acggtctcat tgcgtgagaa aggagcatcg gga 33 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 cagcctaggt cacttgtaca gctcgtcc 28 <210> 16 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 aatgggcccg ggaaagctcg aggaaaaacc gc 32 <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 acggtctccg caattgtggc ttttttgttg tctgg 35 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 aatgggcccg cagttccagg aagtagcgc 29 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 acggtctccg caatttcttg ttcttttggg tatg 34 <210> 20 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 acggtctcat tgcggtctaa mggagcatca caaatgaaat ctaac 45 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 attcctaggt caggtcgagg tggcc 25 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gattcaattg tgagcggata ac 22 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 cttccttagc tcctgaaaat ctcg 24 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 cgaagtgctg tcgkccgcgg acatcatcg 29 <210> 25 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 cgatgatgtc cgcggmcgac agcacttcg 29 <210> 26 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 gtggaatttc ccggtcrhcc aggtcgtgcg caag 34 <210> 27 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 cttgcgcacg acctggdyga ccgggaaatt ccac 34 <210> 28 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 gttgcgctcg cggtgdmagc ggccggcgg 29 <210> 29 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 ccgccggccg ctkhcaccgc gagcgcaac 29 <210> 30 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 ggcggcgcga agttccrkaa cgcggggcag g 31 <210> 31 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 cctgccccgc gttmyggaac ttcgcgccgc c 31 <210> 32 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 gctgtggatc aaccagccgs cgrmwvmatg gccggaaatg ccgttcg 47 <210> 33 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 cgaacggcat ttccggccat kbwkycgscg gctggttgat ccacagc 47

Claims

다음 단계를 포함하는 3-하이드록시프로피온산 합성에 관여하는 효소의 스크리닝 방법;
(a) 3-하이드록시프로피온산 합성에 관여하는 유전자를 포함하는 유전자 라이브러리를 제공하는 단계;
(b) 상기 유전자 라이브러리와 3-하이드록시프로피온산(3-HP) 선택용 유전자회로를 숙주 미생물에 각각 도입하여 재조합 미생물을 제조하는 단계;
(c) 상기 재조합 미생물을 배양하여 3-HP를 생성하는 미생물을 선택마커 활성에 의하여 선별하는 단계; 및
(d) 선별된 미생물에서 3-하이드록시프로피온산 합성에 관여하는 효소를 확인하는 단계;
여기서, 상기 3-하이드록시프로피온산(3-HP) 선택용 유전자회로는 다음을 포함함
(i) 3-하이드록시프로피온산을 인지하는 전사인자인 C3-LysR 또는 C4-LysR를 코딩하는 유전자;
(ii) 상기 3-하이드록시프로피온산을 인지하는 전사인자를 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 프로모터;
(iii) 선택 마커를 코딩하는 유전자; 및
(iv) 상기 3-하이드록시프로피온산을 인지하는 전사인자에 의해 활성화되고, 상기 선택마커의 발현을 조절하는 프로모터인 P_c3또는 P_c4M 프로모터.
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제1항에 있어서, 상기 3-하이드록시프로피온산을 인지하는 전사인자를 코딩하는 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
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제1항에 있어서, 상기 선택 마커는 형광단백질 또는 항생제 저항성 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
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제1항에 있어서, 3-하이드록시프로피온산 합성에 관여하는 효소는 알데히드 디하이드로게나아제인 것을 특징으로 하는 방법.
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