KR101922989B1

KR101922989B1 - ＣＲＩＳＰＲ／Ｒｅｔｒｏｎ 시스템을 이용한 유전체상의 치환 변이 생성과 추적 방법

Info

Publication number: KR101922989B1
Application number: KR1020170059124A
Authority: KR
Inventors: 방두희; 임현섭; 전소영
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2016-05-13
Filing date: 2017-05-12
Publication date: 2018-11-28
Also published as: KR20170128137A

Abstract

본 발명은 CRISPR/Retron 시스템을 이용한 유전체상의 치환 변이 생성과 추적 방법에 관한 것으로, 유전체 치환 변이를 위한 도너 DNA를 생산할 수 있는 레트론 시스템과 CRISPR/Cas9 시스템을 조합하여 유전체상의 치환 변이 효율을 높이고, 유전체의 여러 위치에 다양한 유전형을 표현하는 염기서열로 치환 변이를 가능케 하며 다양한 미생물 및 동물세포에서 발생할 수 있는 치환 변이들의 표현형을 빠르게 확인할 수 있다.

Description

ＣＲＩＳＰＲ／Ｒｅｔｒｏｎ 시스템을 이용한 유전체상의 치환 변이 생성과 추적 방법{Generation and tracking of substitution mutations in the genome using a CRISPR/Retron system}

본 발명은 CRISPR/Retron 시스템을 이용한 유전체상의 치환 변이 생성과 추적 방법에 관한 것이다.

유전자의 염기서열의 변화로 인해 생기는 유전자 변이는 각종 질병, 약물 반응, 유전 형질 등에 중요한 역할을 미치는 중요한 원인 중 하나이다. 특히 특정 유전자 변이들은 약물의 내성과 연관이 있다는 것들이 확인되어 다양한 유전자 변이에 대해 대응할 수 있는 약물들을 찾는 것은 중요한 과정으로 여겨지고 있다. 이를 위해서 최근 다중 유전체 엔지니어링과 약물 스크리닝 방법을 기반으로 한 번에 적은 노동력으로 다양한 변이에 대해 약물반응을 시험해보는 역유전학적 방법이 선호되고 있다.

이러한 방법들 중 최근에는 렌티바이러스 벡터와 CRISPR/Cas9 시스템을 기반으로 한 유전체 전체 대상의 기능 상실 및 기능 획득의 유전자 변이 도입 및 약물 반응 확인 기술들이 개발되었다. 예를 들어 MIT의 Feng Zhang 교수와 연구진들이 개발한 'GeCKO 시스템'이 있는데, 이 기술은 Cas9 시스템과 렌티바이러스를 기반으로 만들어진 sgRNA 라이브러리를 통해 유전체 규모로 넉-아웃 변이를 도입할 수 있었다. 하지만, GeCKO 시스템을 포함한 기존 방법들은 유전자에 치환 변이를 도입하는 것이 불가능하다는 단점이 있었다.

한편, 대장균에서는 'MAGE' 기술을 통하여 다양한 치환 변이들을 도입하는 것이 가능했지만. 유전체 규모로 치환 변이를 도입하는 경우 각 치환 변이별로 개별 위치를 증폭한 뒤 분석하여야 하는 과정을 거쳐야 하는데, 이 과정이 쉽지 않아서 치환 변이 도입 및 약물 반응 후의 결과를 확인하는 것이 어려웠다. 이를 해결하기 위해 변이들을 차세대 시퀀싱을 통하여 추적 분석할 수 있는 'TRMR' 방법이 개발되었지만, 유전자 변이별로 개별적인 표지 서열의 도입이 함께 이루어져야 해서 프로모터 영역의 치환만 가능하다는 한계가 있었다. 따라서 동물 세포에서 사용할 수 있는 다중 치환 변이 도입 시스템과 이를 추적 분석할 수 있는 시스템의 개발이 필요하였다.

본 발명자들은 단일가닥 DNA를 체내에서 생성할 수 있도록 해주는 시스템인 레트론 시스템을 통해 해당 문제의 해결이 가능하다고 예상하였으나, 레트론 시스템을 이용한 치환 변이 효율이 10^-4정도로 매우 낮다는 단점이 있어 약물 반응 등의 연구에 사용되는 것이 불가능했다.

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본 발명의 목적은 CRISPR-Retron 시스템을 이용하여 도너 DNA를 생성하는 재조합 핵산 구조체, 이를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 핵산 구조체를 이용한 CRISPR-Cas9 기반 유전체상의 치환 변이용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 CRISPR-Cas9 기반 유전체상의 치환 변이용 조성물을 이용한 유전체상의 치환 변이 추적 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 CRISPR-Cas9 기반 유전체상의 치환 변이용 조성물을 이용한 유전체상의 약물 내성 변이의 추적 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프로모터, 단일가닥 msRNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 도너 DNA 서열을 포함하는 변형된 단일가닥 msDNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 역전사효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 레트론(retron) 핵산; 및

프로모터, 가이드 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 터미네이터를 포함하는 단일가닥 가이드 RNA(sgRNA) 핵산을 포함하는 재조합 핵산 구조체를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 재조합 핵산 구조체를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 재조합 핵산 구조체를 포함하는 발현 벡터 또는 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포; 및 Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질을 발현하는 벡터를 포함하는 CRISPR-Cas9 기반 유전체상의 치환 변이용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 CRISPR-Cas9 기반 유전체상의 치환 변이용 조성물을 원핵 세포 또는 진핵 세포에 도입하여 유전체상에서 치환 변이를 유도하는 단계; 및 상기 단계에서 치환 변이가 유도된 원핵 세포 또는 진핵 세포의 유전체로부터 msd 전구체의 서열을 분석하여 유전체상의 치환 변이를 추적하는 단계를 포함하는 유전체상의 치환 변이 추적 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 CRISPR-Cas9 기반 유전체상의 치환 변이용 조성물을 원핵 세포 또는 진핵 세포에 도입하여 유전체상에서 약물과 연관된 유전자의 치환 변이를 유도하는 단계; 및 상기 단계에서 치환 변이가 유도된 원핵 세포 또는 진핵 세포에 약물을 처리하고, 상기 원핵 세포 또는 진핵 세포의 유전체로부터 msd 전구체의 서열을 분석하여 유전체상의 약물 내성 변이를 추적하는 단계를 포함하는 유전체상의 약물 내성 변이의 추적 방법을 제공한다.

본 발명은 유전체 치환 변이를 위한 도너 DNA를 생산할 수 있는 레트론 시스템과 CRISPR/Cas9 시스템을 조합하여 유전체상의 치환 변이 효율을 높이고, 유전체의 여러 위치에 다양한 유전형을 표현하는 염기서열로 치환 변이를 가능케 하며 다양한 미생물 및 동물세포에서 발생할 수 있는 치환 변이들의 표현형을 빠르게 확인할 수 있다.

도 1은 본 발명의 CRISPR/Retron 전략의 개요를 도시한 것으로, a)는 레트론(msr, msd, 및 RT) 및 sgRNA 성분으로 이루어진 CRISPR/Retron 카세트를 이용한 유전체 교정을 도시한 것이다. 도너 DNA로 작용하는 ssDNA는 역전사를 통해 msr 및 msd를 포함하는 RNA 전사체로부터 생산된다. 유전체의 절단은 sgRNA 및 직교적으로 발현된 Cas9 단백질에 의해 유도되어, 효율적인 유전체 교정을 촉진한다. b)는 msd-매개된 변이체 추적을 위한 워크플로우를 도시한 것이다.
도 2는 단일 플렉스 엔지니어링 실험에 대한 프로토콜 및 결과를 나타낸 것으로, a)는 galK 복귀 실험의 워크플로우를 도시한 것이다. b)는 T7-중합효소 및 Cas9-발현 플라스미드 하에서 CRISPR/Retron 시스템에 의해 매개된 galK 엔지니어링의 개략적인 그림이다. c)는 희석 사이클 진행을 통한 엔지니어링 효율을 나타낸 것이다. 사각형이 있는 적색 실선은 CRISPR/Retron 시스템(n=3)의 엔지니어링 효율을, X 마크가 있는 흑색 점선은 dead RT (n=2)로 불활성화된 레트론의 엔지니어링 효율을 표시한다. (d-f)는 msd 길이(d), 베타 recombinase의 여부(e) 및 sgRNA의 활성(f)에 대한 CRISPR/Retron의 조건 의존성을 나타낸 것이다. 각 값은 3반복 실험치에서 결정되었다. 모든 오차 막대는 평균의 표준오차(SEM)를 표시한다.
도 3은 본 발명에서 사용된 CRISPR/Retron 카세트의 디자인을 도시한 것으로, a)는 pRC_blank_01 플라스미드의 클로닝 사이트를 나타낸 것이다. EcoRI 사이트가 클로닝 도너 DNA의 msd 서열 내에 삽입되어 있고, AfIII 사이트는 클로닝 스페이서 서열을 위한 sgRNA 서열 내에 삽입되어 있다. b)는 베타 재조합효소를 인코딩하는 유전자가 역전사효소(RT) 유전자의 다운스트림에 삽입되어 pRC_blank_02를 형성하는 것을 나타낸다.
도 4는 변성 라이브러리의 플라스미드 분석 결과로, 플라스미드 구축 시 각 변성 염기 서열(N6)의 분포를 나타낸다.
도 5는 변성 서열 실험 결과를 나타낸 것으로, 희석 사이클이 진행될 때 각 변성 서열의 효율(a), 상관관계(b) 및 편향(c)을 도시한다. 편향은 상대표준편차로 결정되었다. 각 그래프는 2회 독립 실험에 기초하여 작성하였고, 모든 오차막대는 평균의 표준오차를 표시한다(SEM).
도 6은 멀티플렉스 엔지니어링 실험 방법 및 결과를 나타낸 것으로, a)는 대장균 유전체에서 6개의 유전자를 표적으로 하는 멀티플렉스 라이브러리 생성 과정의 개요이다. b)는 msd 및 변이체 깊이값의 상관관계를 나타낸 것이다[피어슨 상관계수(ρ)=0.96, n=3]. 사각형, 십자형 및 삼각형은 각각 n=1, n=2, 및 n=3을 표시한다.
도 7은 멀티플렉스 엔지니어링 및 화학적 선별 실험의 과정 및 결과를 나타낸 것으로, a)는 변성 라이브러리 구축 과정을 도시한 것이다. 6개의 연속 변성 염기를 포함하는 msd 인서트는 CRISPR/Retron 플라스미드에 클로닝된다. b)는 변이체 및 msd 깊이값(depth value) 간의 상관관계를 보여주는 산점도(Scatter plot)이다. 각 축은 온라인 방법에 개시된 대로 정규화된 깊이값의 로그값으로 설계되었다. 피어슨 상관계수(ρ)는 왼쪽 상단에 도시된다. c)는 화학적으로 선별된 유전자를 탐지하는 개략적인 흐름도이다. 통계 분석은 rND 값을 이용하여 수행하였다. d)는 rND에 대한 평균 차이 및 Tukey post-hoc 분석에 의해 얻은 95% 신뢰 구간을 보여주는 도식이다. rND 값은 해당 구간이 0을 포함하지 않는다는 사실에 근거하여(적색 별표로 표시됨) cat 및 다른 유전자들 간에 유의적으로 달랐다.
도 8은 클로람페니콜 처리 실험 결과를 나타낸 것이다. 유전체(a) 및 플라스미드(b)의 rND 값은 클로람페니콜 처리 실험에서 계산되었다. 모든 오차 막대는 평균의 표준오차를 표시한다(SEM).

본 발명자들은 레트론 시스템에 CRISPR/Cas9 시스템을 추가하여 작동시키면 높은 효율로 치환 변이 도입이 가능할 것으로 생각하고 이를 기반으로 유전체 규모의 치환 변이 도입 및 약물 반응 검사를 할 수 있는 새로운 기술인 CRISPR/Retron 시스템을 개발하였다(도 1a-b 참조).

따라서, 본 발명은 프로모터, 단일가닥 msRNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 도너 DNA 서열을 포함하는 변형된 단일가닥 msDNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 역전사효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 레트론(retron) 핵산; 및

본 발명의 재조합 핵산 구조체는 도너 DNA의 복제를 위한 레트론 시스템에 표적 유전자의 치환 변이를 도입할 수 있는 CRISPR/Cas9 시스템의 sgRNA를 결합시켜 제작된 것을 특징으로 한다.

즉, 본 발명의 재조합 핵산 구조체는 msr, msd 및 RT를 발현하는 부분을 포함하는 레트론 부분과 Cas9 기반의 표적 인식을 가능하게 하는 sgRNA를 발현하는 부분을 포함한다.

이 중 레트론 부분에 있는 msd 부분은 단일가닥 DNA로 최종 발현될 서열, 즉, 도너 DNA를 포함하도록 구성되는데 제한효소와 다양한 클로닝 방법들을 이용해 치환 변이를 포함하고 있는 도너 DNA를 삽입하여 클로닝한다.

또한, sgRNA를 발현하는 부분 역시 제한효소를 통해 표적 위치를 절단할 수 있는 20bp 정도의 스페이서 서열을 삽입하여 클로닝할 수 있도록 디자인된다. 이때 치환 변이 도입의 효율을 높이기 위하여 베타 재조합효소(Beta recombinase)를 포함할 수 있다. 또한, CRISPR/Retron 시스템을 발현하도록 하는 프로모터의 종류에 따라 원핵 세포(예컨대, 대장균) 및 진핵 세포(예컨대, 동물세포)의 치환 변이가 원칙적으로 가능하도록 설계하여 제작할 수 있다.

본 발명의 재조합 핵산 구조체는 도너 DNA를 포함하는 레트론 부분과 sgRNA 부분이 순차적으로 연결된 구조로, 세포 내로 전달되면, 도너 DNA는 레트론의 프로모터에 의해 RNA로 전사되고, 역전사효소를 통해 도너 DNA를 생성하게 된다. 또한, sgRNA 부분은 프로모터에 의해 가이드 RNA로 전사되고, 터미네이터를 통해 전사가 종결된다. Cas9 단백질에 의한 표적 DNA의 절단 시 상기 도너 DNA는 상동 재조합에 참여하여 표적 DNA 대신 미스매치 코돈을 포함하는 도너 DNA가 유전체 내에 포함되어 표적 DNA의 치환 돌연변이를 유도하게 된다.

상기 표적 DNA는 내재적 DNA(endogenous DNA) 또는 인위적인 DNA(artificial DNA)일 수 있으나, 바람직하게는, 내재적 DNA이다.

본 명세서에서, 용어 "절단"은 뉴클레오티드 분자의 공유결합 백본의 파손(breakage)을 의미한다.

본 명세서에서, 용어 "재조합 핵산 구조체"는 다수의 유전 요소를 갖도록 작제된 핵산을 지칭한다. 본 발명의 재조합 핵산 구조체는 msRNA, msDNA 및 역전사효소를 코딩하는 레트론 핵산; 역반복염기배열; 종결 코돈; 재조합효소 코딩 서열; 및 sgRNA 핵산을 포함한다.

야생형(예: 비-변형) 레트론은 멀티카피 단일가닥(single-stranded(ms)) DNA라 불리는 작은 엑스트라 염색체 위성 DNA의 합성에 관여하는 원핵 세포의 레트로엘리먼트의 일종이다. 야생형 msDNA는 작고 단일가닥의 RNA에 연결된 작은 단일가닥 DNA로 구성된다. 내부 염기쌍은 msDNA에서 다양한 스템-루프/헤어핀 2차 구조를 만든다. 야생형 레트론은 3개의 유전자좌, 즉, 각각 역전사를 위한 프라이머와 주형으로 제공하는 RNA 모이어티를 코딩하는 msr 및 msd와, 역전사효소를 코딩하는 ret(RT)를 포함하는 오페론의 전사를 제어하는 프로모터를 코딩하는 별개의 DNA 서열이다. 상기 레트론 내의 msr-msd 서열은 2개의 역반복염기배열에 의해 옆에 위치한다. 일단 전사되면, msr-msd RNA는 역반복염기배열 및 msr-msd 서열의 염기쌍에 의해 유도된 2차 구조로 접힌다. RT는 이 2차 구조를 인식하고, msd 서열을 역전사시키고 msDNA로 지칭되는 하이브리드 ssRNA-ssDNA 분자를 생성하기 위한 프라이밍 부위로서 msr에서 보존된 구아노신 잔기를 사용한다. 또한, msd 서열의 중간 부분은 불필요하며, 관심 있는 ssDNA(즉, 도너 DNA)를 생성하기 위한 주형으로 대체될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 도너 DNA를 중간 부분에 포함하는 msd 서열은 역전사효소에 의해 역전사되는 msRNA를 코딩하고, 도너 DNA를 포함하는 msDNA를 생성한다.

상기 도너 DNA는 표적 서열을 포함할 수 있다. 상기 표적 서열은 표적 DNA(예컨대, 유전체 서열)에 상보적이거나 부분적으로 상보적인 단일가닥 msDNA 내의 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 상기 표적 서열은 ssDNA-어닐링 재조합효소에 의해 결합될 때 그의 표적 서열에 어닐링되고, 재조합된다. 상기 표적 서열은, 표적 DNA 위치에 도입하고자 하는 유전자 변이를 포함하는 서열일 수 있다.

또한, 상기 도너 DNA는 표적 DNA에 대해 1 내지 3개의 뉴클레오티드의 미스매치를 갖는 변이 코돈을 포함하는 상동 서열로 이루어진 것일 수 있다.

또한, 상기 도너 DNA는 치환 후 같은 코돈을 갖는 PAM을 포함하도록 설계하여 염기 변이가 발생한 후 PAM 서열의 추가적인 인지가 일어나지 않도록 도너 DNA 서열 내에 PAM 서열을 포함하도록 할 수 있다.

상기 역전사효소(reverse transcriptase, RT)는 RNA 주형으로부터 상보적인 DNA를 생성하는 데 사용되는 효소이다. 즉, 역전사효소는 주형 msd RNA를 단일가닥 msDNA로 역전사시킨다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 역전사효소는 레트론 ret 유전자에 의해 코딩된다. 상기 역전사효소는 리트로바이러스 유래의 RT(예컨대, HIV RT, MuLV RT와 같은 진핵 세포 바이러스), 그룹 II 인트론 RT 및 diversity generating retroelements(DGRs)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 역반복염기배열(inverted repeat sequence)은 역 보체(reverse complement)에 의해 업스트림(5' 말단 방향) 또는 다운스트림(3'말단 방향)에 이어 연결된 뉴클레오티드 서열이다. 상기 역반복염기배열은 전형적으로 레트론에서 msr-msd 서열의 측면에 위치하며, 일단 전사되면, 2개의 서열의 결합은 전사된 분자의 2차 구조로의 폴딩을 유도한다. 반전된 반복 시퀀스는 전형적으로 각각의 레트론에 대해 특정적이다. 예를 들어, 야생형 레트론에 대한 역반복염기배열은 TGCGCACCCTTA일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 역반복염기배열의 길이는 5 내지 15개, 또는 5 내지 20개 뉴클레오타이드이다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 역반복염기배열의 길이는 20개 뉴클레오타이드보다 길다.

상기 ssDNA-어닐링 재조합효소(recombinase)는 단일가닥 msDNA에 결합하고, 그 상보적 또는 부분적으로 상보적인 단일가닥 표적 서열과 표적 서열의 어닐링 및 재조합을 매개한다. 즉, 생체 내에서 생성된 ssDNA의 재조합이 ssDNA-어닐링 재조합효소에 의해 매개될 수 있다.

상기 단일가닥 DNA 어닐링 재조합효소는 베타 재조합효소 또는 베타 재조합효소의 상동체일 수 있다. 더 구체적으로, 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis), 마이코박테리움 프메그마티스(Mycobacterium smegmatis), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 스타필로코커스 아루레우스(Staphylococcus aureus), 또는 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis) 등의 그람-양성균; 비브리오 콜레라에(Vibrio cholera), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 또는 포토합두스 루미네센스(Photorhabdus luminescens) 등의 그람-음성균의 박테리오파지 또는 프로파지 유래의 람다 베타 재조합효소 또는 박테리오파지 람다 베타 재조합효소의 상동체일 수 있다.

상기 단일가닥 DNA 어닐링 재조합효소는 역전사효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 다운스트림에 위치할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 재조합 핵산 구조체의 레트론 핵산은 5'→ 3' 방향으로, 프로모터, 역반복염기배열, 단일가닥 msRNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 단일가닥 msDNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 역반복염기배열, 역전사효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 순으로 배열된다.

본 명세서에서, "프로모터"는 핵산 서열의 잔기의 개시 및 전사 속도가 조절되는 핵산 서열의 조절 영역을 의미한다. 프로모터는 또한 RNA 폴리머라제 및 다른 전사 인자와 같은 조절 단백질 및 분자가 결합 할 수 있는 하위 영역을 포함 할 수 있다. 프로모터는 구성성, 유도성, 활성화성, 억제성, 조직 특이성 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 상기 프로모터는 조절하는 핵산 서열의 발현을 유도하거나 전사를 유도한다. 여기에서, 프로모터는 그의 전사 개시 및/또는 그 서열의 발현을 조절("구동")하기 위해 조절하는 핵산 서열과 관련하여 올바른 기능적 위치 및 배향에 있을 때 "작동 가능하게 연결된"것으로 간주된다.

상기 유도성 프로모터는 빛, pH, 온도, 방사선, 삼투압, 염분 구배, 세포 표면 결합 및 세포 내 결합의 농도와 같은 하나 이상의 생리 조건 (들)에 의해 유도되거나(또는 억제 될 수 있다), 하나 이상의 외인성 또는 내인성 유도제(들)의 투여. 외인성 유도제 신호 또는 유도제는 제한 없이 아미노산 및 아미노산 유사체, 당 및 다당류, 핵산, 단백질 전사 활성제 및 억제제, 사이토카인, 독소, 석유 계 화합물, 금속 함유 화합물, 염, 이온, 효소 기질 유사체, 호르몬 또는 이들의 조합을 포함한다.

상기 유도성 프로모터의 예는 알코올 조절된 프로모터, 테트라사이클린 조절 프로모터(예를 들어, 안하이드로 테트라사이클린(aTc)-반응 프로모터 및 테트라사이클린 억제제 단백질(tetR), 테트라사이클린 작동자 서열(tetO) 및 테트라사이클린 트랜스 활성화제 융합 단백질(tTA)를 포함하는 기타 테트라사이클린-반응 프로모터 시스템), 스테로이드-조절된 프로모터(예를 들어, 랫트 글루코 코티코이드 수용체, 인간 에스트로겐 수용체, 나방 엑딕존 수용체에 기초한 프로모터 및 쥐 및 인간에서 유래한 유전자), 병인에 의해 조절되는 프로모터(예를 들어, 스테로이드/레티노이드/갑상선 수용체 슈퍼 패밀리로부터의 프로모터), 금속 조절된 프로모터(예: 효모, 마우스 및 인간으로부터 유래된 메탈로티오네인(금속 이온을 결합 및 분리하는 단백질) 살리실산, 에틸렌 또는 벤조티아디아졸(BTH)), 온도/열 유도성 프로모터(예: 열충격 프로모터), 및 광 조절된 프로모터(예를 들어, 식물 세포로부터의 빛 반응성 프로모터)와 같은 화학적/생화학적으로 조절되고 물리적으로 조절 된 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

상기 프로모터는 세포의 종류에 따라 당업자 수준에서 적절히 채택하여 사용할 수 있어 특별히 제한하지는 않으며, 예컨대, T7 프로모터, SP6 프로모터, rpr-1 프로모터, rrk 프로모터, 또는 U6 프로모터 등 교정하고자 하는 생물의 유전체에서 작동하는 프로모터를 사용할 수 있다.

상기 레트론 프로모터와 후술하는 sgRNA 프로모터는 서로 다른 유도성 프로모터일 수 있다.

상기 sgRNA 핵산은 CRISPR-Cas9 시스템에서 표적 유전자를 인식하는 가이드 RNA를 발현할 수 있는 구조물로서, 가이드 RNA를 발현하기 위한 프로모터; 가이드 RNA를 코딩하는 DNA; 및 터미네이터를 포함할 수 있다.

상기 가이드 RNA는 표적 DNA에 특이적인 RNA로, 세포 내로 전달된 재조합 핵산 구조체의 전사를 통해 발현되어 표적 유전자를 인식하고 Cas9 단백질과 복합체를 형성할 수 있고 Cas9 단백질을 표적 DNA에 가져오는 RNA이다. 따라서, 상기 가이드 RNA는 표적 DNA를 인식할 수 있는 스페이서; 및 표적과 무관한 불변 서열(non-variable sequence)로 이루어진 가이드 RNA 스캐폴드를 포함한다.

상기 스페이서는 가이드 RNA가 표적 DNA를 인식할 수 있게 하는 서열을 의미하며, 표적 DNA 위치의 근처에 있는 PAMs 서열의 일부 또는 전체를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 PAMs에 인접한 서열을 사용할 수 있다. 또한, 상기 스페이서는 표적 세포의 종류에 따라 적당한 변형이 가해질 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 동물 세포에 도입하기 위해 PAM에 인접한 서열에 엑스트라 5'G를 결합시켜 스페이서를 제조할 수 있다.

상기 가이드 RNA 스캐폴드는 두 개의 RNA, 즉, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스활성화 crRNA(transactivating crRNA, tracrRNA)로 이루어져 있거나, crRNA 및 tracrRNA의 필수적 부분의 융합에 의해 생성된 단일 사슬 RNA(single-chain guide RNA, sgRNA)일 수 있다. 상기 가이드 RNA는 crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 이중 RNA(dual RNA)일 수 있다. 만약 상기 가이드 RNA 스캐폴드가 crRNA 및 tracrRNA의 필수적인 부분 및 표적과 상보적인 부분을 포함한다면, 어떠한 가이드 RNA 스캐폴드라도 본 발명에 사용될 수 있다. 상기 crRNA는 표적 DNA와 혼성화될 수 있다.

바람직하게는, 단일-사슬 가이드 RNA일 수 있다.

상기 터미네이터는 가이드 RNA를 코딩하는 DNA의 전사를 종결하기 위해 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 말단에 연결되는 것으로, 프로모터에 맞게 당업자의 적정 선택 수준에서 채택하여 사용할 수 있어 특별히 제한하지는 않으며, 예컨대, T7 terminator 등의 파지 터미네이터, RNA Polymerase III terminator 또는 -TTTTTT- 서열일 수 있다.

본 발명의 재조합 핵산 구조체는 표준 분자 생물학 방법(예를 들어, Green and Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2012, Cold Spring Harbor Press 참조)을 사용하여 제조될 수 있다.

본 발명의 재조합 핵산 구조체는 예를 들어 세포에 전달하기 위해 벡터 내에 포함될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 재조합 핵산 구조체를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에서 "발현 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 또는 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택마커를 포함하고, 복제가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

본 발명의 발현 벡터는 바람직하게는 일반적인 대장균 균주 발현용 벡터에 상술한 효소 코딩 핵산을 각각 또는 함께 삽입함으로써 제조될 수 있다. 상기 대장균 균주 발현용 벡터는 일반적으로 사용할 수 있는 모든 대장균주 발현용 벡터가 제한 없이 사용될 수 있다.

상기 발현 벡터는 형질전환을 통해 숙주세포에 도입될 수 있다.

상기 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 미세주입법(microinjection), 전기천공법(electroporation), DEAE-덱스트란 처리(DEAE-dextran treatment), 리포펙션(lipofection), 나노파티클-매개 형질주입, 단백질 전달 도메인 매개 도입, 바이러스-매개 유전자 전달, 및 원생동물에서 PEG-매개 형질주입 등과 같은 당업계의 다양한 방법에 의해 세포로 전달될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다.

숙주세포로는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵생물이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 진균(예를 들어, 아스퍼질러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa))등의 진핵생물이 사용될 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다. 상기 형질전환체는 상기 발현 벡터를 임의의 숙주세포에 도입시킴으로써 용이하게 제조될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 재조합 핵산 구조체를 포함하는 발현 벡터 또는 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포; 및 Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질을 발현하는 벡터를 포함하는 CRISPR-Cas9 기반 유전체상의 치환 변이용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 CRISPR-Cas9 기반 유전체상의 치환 변이용 조성물은 레트론 시스템에 CRISPR/Cas9 시스템을 추가한 CRISPR/Retron 시스템을 포함하며, 레트론 시스템을 통해 생성된 도너 DNA가 표적 유전자의 위치로 재조합되는 메커니즘과, 이를 촉진시킬 수 있도록 Cas9을 통해 표적 위치를 절단하는 메커니즘을 통해서 표적 유전자의 치환 변이를 도입할 수 있는 것을 특징으로 한다.

또한, Cas9의 표적 위치 절단 과정을 통해서 치환 변이가 도입되지 않은 세포들의 사멸을 유도할 수도 있어 기존 레트론 기반의 치환 변이 도입 과정과 비교하여 높은 효율로 치환 변이 도입이 가능하도록 되어있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 CRISPR/Retron 시스템을 이용한 치환 변이는 약 46.8 퍼센트의 효율로, 기존의 레트론 시스템을 이용한 치환 변이 효율인 약 0.1 퍼센트에 비해 현저히 우수하였다.

상기 Cas9 단백질은 CRISPR/Cas9 시스템에서 필수적인 단백질 요소를 의미하고, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(trans-activating crRNA, tracrRNA)로 불리는 두 RNA와 복합체를 형성할 때, 활성 엔도뉴클레아제를 형성한다. Cas9 유전자 및 단백질의 정보는 국립생명공학정보센터(national center for biotechnology information, NCBI)의 GenBank에서 구할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 Cas9 단백질이 세포 내로 전달될 경우, 단백질 전달 도메인(protein transduction domain)과 연결될 수 있다. 상기 단백질 전달 도메인은 폴리-아르기닌(poly-arginine) 도메인 또는 HIV로부터 유래한 TAT 단백질일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 Cas9 단백질은 Cas9 단백질을 발현하는 벡터, 즉, Cas9 단백질 코딩 핵산을 포함하는 벡터의 형태로 형질주입을 통해 전달될 수 있다. 상기 Cas9 단백질 코딩 핵산은 CMV 또는 CAG와 같은 프로모터 하에서 Cas9 코딩 서열을 포함하는 플라스미드 같은 벡터의 형태일 수 있다.

상기 재조합 핵산 구조체를 포함하는 발현 벡터 및 Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질을 발현하는 벡터의 전달은 당업계에 공지된 다양한 형질전환 기술을 통해 세포로 전달될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 원핵 세포 또는 진핵 세포에서 단일 위치 또는 다중 위치 유전자의 표적화된 돌연변이를 유도하는 것일 수 있다.

상기 원핵 세포 또는 진핵 세포는 대장균, 효모, 곰팡이, 식물, 곤충, 양서류, 포유동물 등의 세포일 수 있고, 예를 들어, 당업계에서 일반적으로 사용되는 인 비트로에서 배양된 세포, 이식된 세포, 일차 세포 배양, 인 비보 세포, 인간을 포함하는 포유동물의 세포일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명은 또한 상기 CRISPR-Cas9 기반 유전체상의 치환 변이용 조성물을 원핵 세포 또는 진핵 세포에 도입하여 유전체상에서 치환 변이를 유도하는 단계; 및 상기 단계에서 치환 변이가 유도된 원핵 세포 또는 진핵 세포의 유전체로부터 msd 전구체의 서열을 분석하여 유전체상의 치환 변이를 추적하는 단계를 포함하는 유전체상의 치환 변이 추적 방법에 관한 것이다.

본 발명은 레트론 시스템을 이용하여 세포 내에서 도너 DNA를 생성하므로 치환 변이가 예상되는 유전체의 개별 위치의 증폭 없이도 도너 DNA를 포함하는 msd 전구체의 서열을 분석(시퀀싱)하여 유전자 치환 변이 비율을 추적 분석함으로써 유전체상의 치환 변이를 추적할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 피어슨 상관관계 분석법을 통해 확인한 결과, 시간이 지날수록 상관계수와 치환 변이들의 비율의 편차가 커지고, 15번의 접종이 진행되었을 때, 최종적으로 상관계수가 0.79로 높은 양의 상관관계를 나타내었다.

본 발명은 또한 상기 CRISPR-Cas9 기반 유전체상의 치환 변이용 조성물을 원핵 세포 또는 진핵 세포에 도입하여 유전체상에서 약물과 연관된 유전자의 치환 변이를 유도하는 단계; 및 상기 단계에서 치환 변이가 유도된 원핵 세포 또는 진핵 세포에 약물을 처리하고, 상기 원핵 세포 또는 진핵 세포의 유전체로부터 msd 전구체의 서열을 분석하여 유전체상의 약물 내성 변이를 추적하는 단계를 포함하는 유전체상의 약물 내성 변이의 추적 방법에 관한 것이다.

본 발명은 레트론 시스템을 이용하여 세포 내에서 도너 DNA를 생성하므로 약물과 연관된 유전자의 치환 변이를 유도한 후 msd 전구체의 서열을 분석(시퀀싱)하고, ANOVA & Tukey 분석법을 통해 유전체 상의 약물 내성 변이를 추적할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 클로람페니콜과 연관이 있는 유전자, apt, cadA, cat, galK, kefB, malK, rpoB에 대해 치환 변이를 유도하고, 클로람페니콜 약물을 투입하여 각 변이 별 약물 저항성을 측정한 결과, cat 유전자의 변이가 클로람페니콜에 대해 저항성을 갖게 하는 것을 확인함으로써 유전체상의 약물 내성 변이를 알 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

<실시예>

(세균 균주, 항생제 및 유도)

E. coli EcNR2(ΔmutS::cat 및 Δ(ybhB-bioAB)::[λcl857 N(cro-ea59)::tetR-bla]를 갖는 균주 MG1655)), EcHB3(표 1에 나열된 올리고뉴클레오티드를 표적으로 하고, 불활성화된 cat, bla, galK, 및 malK를 갖는 균주 EcNR2), E. coli C2566, 및 그들의 유도체를 30℃(E.coli C2566인 경우 37℃)에서 적당한 항생제(앰피실린, 50 ㎍/mL; 가나마이신, 30 ㎍/mL; 및 스펙티노마이신, 100 ㎍/mL)가 첨가된 Luria-Bertani(LB) 브로스 또는 LB 아가에서 배양하였다. IPTG는 최종 농도가 1mM가 되도록 첨가하였다.

Oligos for construction of msd insert for singleplex engineering (template oligos )
galK_donor_template	GCCGGGTTAAGTTCTTCCGCTTCACTGGAAGTCGCGGTCGGAACCGTATTGCAGCAGCTTTA TCATCTGCCGCTCGACGGCGCACAAATCGCGCTTAACGGTCAGGAAGCAGAAAACCAGTTT
(forward primers)
galk_55_fwd galk_75_fwd galk_95_fwd galk_115_fwd	TCTGAGTTACTGTCTGTTTTCCTGAAATTTGTGCGCCGTCGA TCTGAGTTACTGTCTGTTTTCCTGAAGTTAAGCGCGATTTGTGCGC TCTGAGTTACTGTCTGTTTTCCTGAACTTCCTGACCGTTAAGCG TCTGAGTTACTGTCTGTTTTCCTGAATGGTTTTCTGCTTCCTGACC
(reverse primers)
galk_55_rev galk_75_rev galk_95_rev galk_115_rev galk_55_rev galk_75_rev galk_95_rev galk_115_rev	GTCAGAAAAAACGGGTTTCCTGAACGGTCGGAACCGTATTG GTCAGAAAAAACGGGTTTCCTGAACTGGAAGTCGCGGTCG GTCAGAAAAAACGGGTTTCCTGAATTCCGCTTCACTGGAAGT GTCAGAAAAAACGGGTTTCCTGAAGGTTAAGTTCTTCCGCTTCA GTCAGAAAAAACGGGTTTCCTGAACGGTCGGAACCGTATTG GTCAGAAAAAACGGGTTTCCTGAACTGGAAGTCGCGGTCG GTCAGAAAAAACGGGTTTCCTGAATTCCGCTTCACTGGAAGT GTCAGAAAAAACGGGTTTCCTGAAGGTTAAGTTCTTCCGCTTCA
for multiplex engineering(template oligos )
apt_template_1 apt_template_2 apt_template_3 apt_template_4 cadA_template_1 cadA_template_2 cadA_template_3 cadA_template_4 cadA_template_5 cat_template_1 cat_template_2 cat_template_3 kefB_template_1 kefB_template_2 kefB_template_3 kefB_template_4 kefB_template_5 malK_template_1 malK_template_2 malK_template_3 malK_template_4 malK_template_5 rpoB_template_1 rpoB_template_2 rpoB_template_3 rpoB_template_4 tolC_template_1 tolC_template_2 tolC_template_3 tolC_template_4 tolC_template_5	CATTGAATCTGAGTTACTGTCTGTTTTCCTGAATGTTCGATCTCGGCGGCGAACAGCGTC GAACGGGACGATGCTGTAGCTCGTAATGCCCTGTTTTTCGAGACGCTGTTCGCCGC CTACAGCATCGTCCCGTTCCCGGGCCATTAATTATCGCCAGTCTTGTGCTGCCCAC CACCCTTACGTCAGAAAAAACGGGTTTCCTGAATGTCCGTAGCGTGGGCAGCACAAGACT CATTGAATCTGAGTTACTGTCTGTTTTCCTGAAGGGAAGTGGCAAGCCA CAAAAAATAATTAGCTCGTACAAGGGAAGTGGCTTGCCACTTCCC CTTGTACGAGCTAATTATTTTTTGCTTTCTTCTTTGATTACCTTAACCGTATAGC TGATTACCTTAACCGTATAGCGGCCATCAGCCTGACGGTATGCACCGTGAATATCGGTTT CACCCTTACGTCAGAAAAAACGGGTTTCCTGAAAAACCGATATTCACGGTGCA TCTGAGTTACTGTCTGTTTTCCTGAATTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTG CAGCTGAACGGTCTGGTTATACGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTC TCAGAAAAAACGGGTTTCCTGAACCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAG CATTGAATCTGAGTTACTGTCTGTTTTCCTGAACCCGACGCGAACTGG CGATCTGACGTCGTTCTTGTTGCATTTCACGCTGGAAAATCTCTTCCAGTTCGCGTCGGG CAAGAACGACGTCAGATCGACGGCTGGGATGAATTTGAGTAGAGGGTAAAG GACGGCTGGGATGAATTTGAGTAGAGGGTAAAGATGGCAATCCGAAAACGTTTTAT CACCCTTACGTCAGAAAAAACGGGTTTCCTGAAATAAAACGTTTTCGGATTGCCAT CATTGAATCTGAGTTACTGTCTGTTTTCCTGAATGTTGGTAGAAGAAGGTGCC AGATATGACAACGCTCTGGCGGCAGGCCGATAGCGAATGTGGCACCTTCTTCTACCAACA GCCAGAGCGTTGTCATATCTTCCGTGAGGATGGCACT TCCGTGAGGATGGCACTGCATGTCGTCGACTGCATAAGGAGCCGGGCGTTTAAGC CACCCTTACGTCAGAAAAAACGGGTTTCCTGAAGCTTAAACGCCCGGCT CATTGAATCTGAGTTACTGTCTGTTTTCCTGAAACATCGTGGACGGCAACCATCAGATGG ATCTCTTTCAAGATTACGTTGAACGATTCTGGCATGCCCGGCTCCATCTGATGGTTGCCG TTCAACGTAATCTTGAAAGAGATTCGTTCGCTGGGTATCAACATCGAACTGGAAGACGA CACCCTTACGTCAGAAAAAACGGGTTTCCTGAAGAGAATTACTCGTCTTCCAGTTCGATG CATTGAATCTGAGTTACTGTCTGTTTTCCTGAATTCTGTTCCGGCGTTTG GATCAGCAAACCCGTTTCCACTAATCCGGAAAACGTTGCACCGCAAACGCCGGAACAGAA GGAAACGGGTTTGCTGATCGCATTGTTCAGTGCCAGC GCATTGTTCAGTGCCAGCAGATCCTGCTCGTTCAACGTACCCAGAGCTGACTTAA CACCCTTACGTCAGAAAAAACGGGTTTCCTGAATTAAGTCAGCTCTGGGTACG
(forward primers)
apt_fwd cadA_fwd cat_fwd kefB_fwd malK_fwd rpoB_fwd tolC_fwd	GAGTTACTGTCTGTTTTCCTGAACGGCGGCGAACAGCG GAGTTACTGTCTGTTTTCCTGAAAAGCCACTTCCCTTGTA GAGTTACTGTCTGTTTTCCTGAATTA GAGTTACTGTCTGTTTTCCTGAAACTGGAAGAGATTTTCC GAGTTACTGTCTGTTTTCCTGAAAGAAGGTGCCACATTCG GAGTTACTGTCTGTTTTCCTGAACGGCAACCATCAGATGG GAGTTACTGTCTGTTTTCCTGAAGCGTTTGCGGTGCAAC
(reverse primers)
apt_rev cadA_rev cat_rev kefB_rev malK_rev rpoB_rev tolC_rev	TCAGAAAAAACGGGTTTCCTGAAGTGGGCAGCACAAGACT TCAGAAAAAACGGGTTTCCTGAATCACGGTGCATACCGTC TCAGAAAAAACGGGTTTCCTG TCAGAAAAAACGGGTTTCCTGAATTCGGATTGCCATCTTT TCAGAAAAAACGGGTTTCCTGAACCGGCTCCTTATGCAGT TCAGAAAAAACGGGTTTCCTGAACGTCTTCCAGTTCGATG TCAGAAAAAACGGGTTTCCTGAATCTGGGTACGTTGAACG
for degenerate engineering(template oligos )
galK_N6_oligo	TGGTTTTCTGCTTCCTGACCGTTAAGCGCGATTTGTGCGCCGTCGANNNNNNGATGAT AAAGCTGCTGCAATACGGTTCCGACCGCGACTTCCAGTGAAGCGGAAGAACTTAACC
(forward primers)
N6_fwd N6+homology_fwd	CTTCCTGACCGTTAAGCG galk_95_fwd
(reverse primers)
N6_rev N6+homology_rev	CCAATTGTGTTTCCAGCCATCACGGC galk_95_rev
Oligos for construction of sgRNA insert forward primers for singleplex & degenerate engineering
Gg18_fwd Standard_fwd mis1(mid)_fwd mis1(left)_fwd mis1(right)_fwd mis2_fwd	CTATATTGCAGGAAGGGCTAATACGACTCACTATAGGAGCTTTAACATCTGCCGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTC CTATATTGCAGGAAGGGCTAATACGACTCACTATAGGGGCAGCTTTAACATCTGCCGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTC CTATATTGCAGGAAGGGCTAATACGACTCACTATAGGGGCAGCTTTATCATCTGCCGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTC CTATATTGCAGGAAGGGCTAATACGACTCACTATAGGGGCAGGTTTAACATCTGCCGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTC CTATATTGCAGGAAGGGCTAATACGACTCACTATAGGGGCAGCTTTAACATCTCCCGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTC CTATATTGCAGGAAGGGCTAATACGACTCACTATAGGGGCAGCTTTATCATCTCCCGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTC
forward primers for multiplex engineering
apt_sgRNA_fwd cadA_sgRNA_fwd cat_sgRNA_fwd kefB_sgRNA_fwd malK_sgRNA_fwd rpoB_sgRNA_fwd tolC_sgRNA_fwd	CTATATTGCAGGAAGGGCTAATACGACTCACTATAGGGGAACGGGACTAGGCTGTAGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG CTATATTGCAGGAAGGGCTAATACGACTCACTATAGGGTTCTTCTTTGAATACCTTAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG CTATATTGCAGGAAGGGCTAATACGACTCACTATAGGGCAGCTGAACCGTCTGGTTATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG CTATATTGCAGGAAGGGCTAATACGACTCACTATAGGGATTCATCCCTGCCGTCCAGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG CTATATTGCAGGAAGGGCTAATACGACTCACTATAGGGTGCCATCCTGACGGAACAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG CTATATTGCAGGAAGGGCTAATACGACTCACTATAGGGCTCTTTCAAGAATACGTTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG CTATATTGCAGGAAGGGCTAATACGACTCACTATAGGGGAACAATGCCCTGAGCAAACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
common reverse primer
sgRNA_scaffold_rev	GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC
MAGE oligos for construction of EcHB3 strain
cat_mut_oligo bla_mut_oligo galK_mut45_oligo malK_mut45_oligo	GCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTTAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAA GCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTATTAGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAG GCTTCACTGGAAGTCGCGGTCGGAACCGTATTGCAGCAGCTTTAACATCTGCCGCTGGACGGCGCACAAATCGCGCTTAACGGTCAGGAA CCAAATGACATGTTTTCTGCTACTGACAGGTGGGGATAGAGCGCTTAAGACTGAAACACCATACCAACGCCGCGTTCTGCTGGCGGAGTG
Oligos for target region amplification for singleplex & degenerate engineering
NGS_galk_fwd_1 NGS_galk_fwd_2 NGS_galk_fwd_3 NGS_galk_fwd_4 NGS_galk_fwd_5 NGS_galk_fwd_6 NGS_galk_fwd_7 NGS_galk_fwd_8 NGS_galk_fwd_9 NGS_galk_fwd_10 NGS_galk_fwd_11 NGS_galk_fwd_12 NGS_galk_fwd_13 NGS_galk_fwd_14 NGS_galk_fwd_15 NGS_galk_rev	AACTATCCATGATCCCGCAGTTAC ACGAATCCATGATCCCGCAGTTAC ACTTATCCATGATCCCGCAGTTAC AGTCATCCATGATCCCGCAGTTAC ATGTATCCATGATCCCGCAGTTAC CTGCATCCATGATCCCGCAGTTAC GATTATCCATGATCCCGCAGTTAC GCTGATCCATGATCCCGCAGTTAC GTCCATCCATGATCCCGCAGTTAC TAGCATCCATGATCCCGCAGTTAC TCGAATCCATGATCCCGCAGTTAC TTGCATCCATGATCCCGCAGTTAC CGGTATCCATGATCCCGCAGTTAC CGTTATCCATGATCCCGCAGTTAC NGSCTTAATCCATGATCCCGCAGTTAC NG GGACATGGTGATCAGCGG
for multiplex engineering
apt_fwd apt_rev cadA_fwd cadA_rev cat_fwd cat_rev kefB_fwd kefB_rev malK_fwd malK_rev rpoB_fwd rpoB_rev tolC_fwd tolC_rev	CCGTTAAACTGATCCGTCGT CTAACACAGCCCCGTCAGA GGAGTTCCTGCAGATGCTGT GGGTGTTTTCATGTGTTCTCC TCGAGATTTTCAGGAGCTAAGG GCCGGATAAAACTTGTGCTT CGAGAGCTCATCCCAATGC ACATCGCCATTGAATCCTG TCCCTTCCATTCGTCAAAAC TGACAGGCTTTGTGTGTTTTG TGAACGGTCGTACCAAGATG CCGTCGGAGTTAGCACAATC TGTACAACGCCAAGCAAGAG TATCAGGCGCATAACCATCA
for amplifying msd region
plasmid_fwd plasmid_rev	TGGTTTTCTGCTTCCTGACC TAAGTTCTTCCGCTTCACTGG

(CRISPR/Retron 플라스미드 구축)

재조합 세포의 제한효소에 의한 절단을 막기 위해 프로토스페이서 근접 모티프 서열에서 바라는 돌연변이 서열 및 한 개의 동등한 돌연변이를 포함하여 msd 및 스페이서 인서트 구축을 위한 올리고뉴클레오티드를 설계하고 합성하였다(표 1). 각 인서트를 다음과 같이 PCR에 의해 제조하였다: 0.1 pmol의 각 주형을 2차 증류수로 8㎕이 되도록 희석하고, 1㎕의 정방향 프라이머(10 μM), 1㎕의 역방향 프라이머(10 μM) 및 10㎕의 2X KAPA HiFi HotStart ReadyMix (KAPA Biosystems, Wilmington, MA, USA)과 혼합하였다. 다음의 열 사이클링 조건을 사용하였다: 95℃에서 3분; 95℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 30초로 25 사이클; 및 72℃에서 1분간 최종 연장. 2 ng의 각 msd 및 스페이서 인서트를 깁슨 조립에 따라 EcoRI 및 AflII에 의해 절단된 pRC_blank_01 또는 pRC_blank_02에 클로닝하였다. 재조합 플라스미드는 형질전환되고, 생거 시퀀싱(Macrogen, Korea)으로 평가한 다음 GeneAll Exprep plasmid SV kit (GeneAll, Korea)를 사용하여 분리하였다. 구축된 플라스미드 및 올리고머 서열에 관한 정보는 표 1, 표 2 및 표 3을 참고할 수 있다.

(변성 라이브러리의 제조)

6개의 변성 염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드(galK_N6_oligo)를 합성하였다(표 1). msd 인서트를 구축하기 위해 PCR 증폭을 수행하였다: 1㎕의 0.1 μM galK_N6_oligo, 1㎕의 정방향 프라이머(10 μM), 1㎕의 역방향 프라이머(10 μM), 7㎕의 2차 증류수 및 2X KAPA HiFi HotStart ReadyMix를 혼합하고, 다음과 같이 반응을 수행하였다: 95℃에서 3분; 95℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 30초로 25 사이클; 72℃에서 1분간 최종 연장. Ampure XP beads (Beckman Coulter, Brea, CA, USA)로 산물을 정제하고, 2차로, 8사이클 동안 30-mer Gibson homology-flanked primers를 사용하여 증폭한 다음 다시 Ampure XP beads로 정제하였다. 13ng의 산물을 320ng의 EcoRI에 의해 절단된 pRC_galK_sg_only 벡터에 클로닝 하였다. Ampure XP beads를 사용하여 플라스미드를 정제하고, 이어서 다음과 같이 전기천공을 통해 E. coli C2566(New England BioLabs, Ipswich, MA, USA)에 형질전환되었다: C2566 세포를 37℃에서 배양하여 OD₆₀₀=0.7이 되도록 하였다. 15,000rpm에서 1분 동안 원심분리 하여 세포를 회수하고, 차가운 2차 증류수로 2회 세척하고, 50㎕의 정제된 깁슨-조립된 산물에서 재현탁하였다. 세포 현탁액을 a 1-mm gap cuvette (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에서 1.8kV로 펄스 처리하고, 37℃에서 밤새도록 3mL의 LB 브로스에서 회복시켰다. 회복된 세포에 50㎍/mL의 앰피실린을 포함하는 7mL의 LB 배지를 첨가하고 37℃에서 밤새도록 인큐베이션 하였다. 플라스미드 DNA는 GeneAll Exprep plasmid SV kit를 사용하여 형질전환체로부터 분리하였다.

(CRISPR/Retron system에 의한 유전체 교정)

E. coli EcHB3 세포를 순차적으로 pN249 및 pCas9_T7로 전기천공하여 T7 폴리머라제 및 Cas9를 각각 발현하는 EN7 세포를 생성하였다. 그리고 나서, CRISPR/Retron 플라스미드를 다음과 같이 ENC 세포에 전기천공하였다: 세포를 OD₆₀₀=0.7이 되도록 30℃에서 배양하고, 15,000rpm에서 1분간 원심분리하여 회수하였다. 세포 펠렛을 1mL의 차가운 2차 증류수로 2회 세척하고, 50㎕의 적당한 플라스미드에서 재현탁하였다. 세포 현탁액을 1-mm gap cuvettes에서 1.8kV로 전기천공하고, 항생제가 없는 LB 브로스에 옮겨 6시간 동안 회복시켰다. 그리고 나서, 형질전환체를 적당한 선별 항생제가 첨가된 LB 브로스에 옮기고, 30℃에서 인큐베이션 하고, 10mL의 신선한 LB 브로스에서 1:100으로 12시간 마다 희석되었다.

(유전체에 대한 딥 시퀀싱 및 msd 분석)

유전체 및 플라스미드 DNA는 각각 DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen, Germany) 및 GeneAll Exprep plasmid SV kit를 사용하여 형질전환체로부터 추출하였다. 표적 유전자좌 및 msd 부위는 200 ng의 주형, 10 pmol의 각 바코드 프라이머 쌍(표 1) 및 10㎕의 KAPA HiFi HotStart ReadyMix으로부터 증폭되었다. 반응은 다음과 같이 수행되었다: 95℃에서 3분; 95℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 30초로 25 사이클(msd 경우 20사이클); 72℃에서 1분간 최종 연장. 샘플을 모으고, 제조사의 프로토콜에 따라 SPARK DNA 샘플 준비 키트(Enzymatics, Beverly, MA, USA)를 사용하여 말단 수리, A-테일링 및 어댑터-라이게이션 반응을 수행하였다. Illumina HiSeq 4000 platform를 사용하여 시퀀싱을 수행하였다. 로우 데이터를 측면 바코드로 역 다중화하고, msd 및 표적 유전자좌 서열을 조회하여 나열하고, 서열 깊이를 Python 스크립트를 사용하여 측정하였다. 변성 라이브러리를 또한 같은 방법으로 분석하여 변성 염기의 변화(다양성)을 평가하였다.

(상관관계 분석)

msd 및 변이 깊이의 상관관계를 조사하기 위해, 피어슨 상관계수를 다음과 같이 계산하였다. 데이터 양에서의 차이를 정규화하기 위해, 총 깊이는 10⁴로 정규화하여 깊이값에 대해 바로잡고, 최소 깊이값을 정규화된 깊이(ND)에 더하여 <1의 ND가 되지 않도록 하였다. 이러한 접근은 또한 GeCKO 법에서 사용되며, 다음 식 1로 나타낸다:

[식 1]

깊이 인자는 데이터의 정량에 의해 결정되었다. 클로람페니콜의 반응을 시험할 때, 데이터의 최대 양을 기록하기 위해 10⁶를 사용하였다. 그리고 나서, 정규화된 msd 깊이를 X로, 정규화된 변이 깊이를 Y로 정하고, 피어슨 상관계수(ρ)는 다음 식 2에 따라 계산하였다:

[식 2]

Cov (X, Y)는 X 및 Y의 공분산을 의미하고, σ는 표준편차를 의미한다.

(화학물질-내성 분석)

화학물질-내성 유전자를 상대 ND 값(rND)을 이용하여 one-way ANOVA & Tukey post-hoc analysis에 따라 결정하였다. rND 값은 대조 샘플에 대한 화학물질-처리된 샘플에서의 폴드 변화를 의미하고, 하기 식 3으로 나타낸다:

[식 3]

One-way ANOVA는 임의의 특정 종이 선별되는지를 결정하기 위해 수행되며, p-값은 마이크로소프트 엑셀 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. 이 실험에서, ANOVA test가 p<0.05를 보여주는 유전자에 대해 시험을 진행하였다. 이어서, Tukey honest significant difference (HSD) 값은 모든 가능한 조합(HSD _i,j )에 대해 계산되었고, 유전자는 다음과 같이 선별되는 것으로 간주되었다:

1. 다음이 만족되는 경우 유전자(i)는 긍정적으로 선별된다:

2. 다음이 만족되는 경우 유전자(ii)는 부정적으로 선별된다:

하위 및 상위 신뢰 한계 값은 하기 식 4에 의해 계산되었다:

[식 4]

는 유전자(i)의 rND의 평균 값을 의미한다.

<실시예 1> 대장균의 galK 위치에 대한 치환 교정

CRISPR/Rteron 시스템의 작동을 확인하기 위해 대장균의 유전자를 변화시킬 수 있는 시스템을 제작하였다. 갈락토오즈 인산화 효소를 발현시키는 유전자인 galK 위치를 표적으로 하여 하나의 아미노산이 변화할 수 있도록 CRISPR/Retron 시스템을 제작하였다(도 2a).

이를 위해 먼저 대장균용 CRISPR/Retron 시스템의 기본 벡터인 pRC_blank_01(도 3)을 제작하였고 여기에 galK 유전자를 인식할 수 있는 75bp의 도너 DNA와 sgRNA 서열을 삽입하여 pRC_galK_on 벡터를 제작하였다. 해당 벡터는 대장균 균주의 하나인 EcHB3에 pN249, pCas9_T7 벡터를 삽입한 균주인 ENC(도 2b, 표 4)에 전기천공법을 통하여 삽입하였고 액체 배지에서 균주를 배양하여 치환 교정이 일어나도록 하였다. 지속적인 치환 교정이 일어나도록 12시간 마다 새로운 액체 배지에 이전까지 배양되었던 균주를 접종하였으며 15회 정도의 접종이 끝난 후에는 6번의 시간간격으로 나눠 치환 교정 효율을 관찰하였다(도 2b).

그 결과 15회 접종을 진행하였을 때 5.5%의 효율로 치환 변이가 도입된 것을 확인하였으며 시간에 따라 점점 치환 교정의 효율이 상승하는 것을 확인하였다(도 2c).

<실시예 2> 대장균에서의 CRISPR/Retron 시스템 최적화

다음으로는 galK 유전자의 치환을 목적으로 제작되었던 pRC_galK_on에 대하여 도너 DNA의 길이, sgRNA 서열의 변화, Beta 재조합효소의 첨가와 같은 다양한 변화를 준 벡터들을 새로 제작하였고(표 2) 이에 따른 치환 교정의 효율을 확인하였다.

그 결과 도너 DNA는 95 bp의 길이에서, sgRNA는 서열의 중간에 의도적으로 염기 오류를 넣어 sgRNA의 활성정도를 떨어트렸을 때, Beta 재조합효소가 같이 작동할 때가 치환변이의 도입 효율이 높은 것을 확인하였다(도 2d, 2e, 2f). 이를 바탕으로 pRC_blank_01 벡터를 최적화한 벡터인 pRC_blank_02 벡터를 디자인하였고 도너 DNA나 sgRNA의 서열 역시 최적화하여 디자인하도록 하였다.

<실시예 3> CRISPR/Retron 시스템을 통한 유전 변이 라이브러리의 추적 분석

다음으로는 치환변이의 비율을 도너 DNA의 발현 전구체인 msd 서열 분석을 통해서 추적 분석이 가능한지 알아보기 위해 CRISPR/Retron을 통해 도입된 치환 변이들과 도너 DNA의 발현 전구체인 msd 서열간의 상관관계를 확인해보았다. 이를 위해 시스템을 통해서 6bp의 무작위 서열인 치환 변이를 도입할 수 있는 벡터 라이브러리를 만들었고, 총 4,095개의 msd 서열로 이루어진 것을 차세대 시퀀싱을 통해서 확인한 뒤(도 4), 이를 ENC 세포에 전기천공법을 이용해서 삽입하여 치환변이 도입을 진행하였다. 벡터 라이브러리는 실시예 1과 같이 15번의 접종기간 동안 치환 교정 도입이 진행되었다.

그 결과 실시예 1과 마찬가지로 시간이 지날수록 치환 효율이 높아지는 것을 확인하였으며(도 5a), 총 1,651개의 치환 변이가 생긴 것이 확인되었고, 각 msd 전구체에 있는 서열과 해당 변이들의 비율을 각각 차세대 시퀀싱으로 분석하고 피어슨 상관관계 분석법을 통해 확인해본 결과 시간이 지날수록 상관계수와 치환 변이들의 비율의 편차가 커지는 것을 확인하였고(도 5b, 5c), 15번의 접종이 진행되었을 때 최종적으로 상관계수가 0.79로 높은 양의 상관관계를 갖는 것을 확인할 수 있었다(도 7b).

<실시예 4> CRISPR/Retron 시스템을 통한 다중 위치의 엔지니어링

다음으로는 다중 위치의 치환 교정이 가능한지 알아보기 위해 apt, cadA, kefB, malK, rpoB, tolC 유전자를 대상으로 하여 CRISPR/Retron 시스템을 제작하였다(표 5, 도 6a).

제작된 벡터는 ENC 세포에 전기천공법으로 삽입되어 치환 변이가 도입되었으며, 합이 46.8%의 효율로 치환변이의 도입이 이루어진 것을 확인하였다. 또한, 추적 분석을 진행하였을 때도 실제 유전체의 치환 비율과 msd 전구체의 비율이 높은 상관관계가 있음을 확인하였다(도 6b).

<실시예 5> 클로람페니콜 약물에 대한 유전자 변이들의 내성 확인

최종적으로는 다중 위치의 치환 교정 및 추적 분석을 이용하여 약물에 대한 내성을 확인할 수 있는지 알아보았다. 최종적으로 7개의 유전자인 apt, cadA, cat, galK, kefB, malK, rpoB에 대해 치환 교정이 이루어졌으며(표 5, 도 7c), 이 치환 변이들에 대해 클로람페니콜 약물을 투입하여 각 변이 별 약물 저항성을 측정하였다.

그 결과 원래 클로람페니콜과 연관이 있는 것으로 알려진 cat 유전자의 변이가 클로람페니콜에 대하여 저항성을 갖게 해주는 것을(표 1 및 표 4) Sanger 시퀀싱 및 ANOVA & Tukey 분석법을 통해 확인하였다(도 8, 도 7d, 표 6, 표 7).

Claims

프로모터, 단일가닥 msRNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 도너 DNA 서열을 포함하는 변형된 단일가닥 msDNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 역전사효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 레트론(retron) 핵산; 및
프로모터, 가이드 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 터미네이터를 포함하는 단일가닥 가이드 RNA(sgRNA) 핵산을 순차적으로 포함하는 재조합 핵산 구조체.
제1항에 있어서,
레트론 핵산과 가이드 RNA 핵산의 프로모터는 서로 다른 유도성 프로모터인, 재조합 핵산 구조체.
제2항에 있어서,
유도성 프로모터는 T7 프로모터, SP6 프로모터, rpr-1 프로모터, rrk 프로모터 또는 U6 프로모터 중 어느 하나인, 재조합 핵산 구조체.
제1항에 있어서,
재조합 핵산 구조체는 단일가닥 DNA 어닐링 재조합효소(recombinase)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하는, 재조합 핵산 구조체.
제4항에 있어서,
단일가닥 DNA 어닐링 재조합효소는 베타 재조합효소 또는 베타 재조합효소의 상동체인, 재조합 핵산 구조체.
제5항에 있어서,
단일가닥 DNA 어닐링 재조합효소는 박테리오파지 람다 베타 재조합효소 또는 박테리오파지 람다 베타 재조합효소의 상동체인, 재조합 핵산 구조체.
제4항에 있어서,
단일가닥 DNA 어닐링 재조합효소는 역전사효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 다운스트림에 위치하는, 재조합 핵산 구조체.
제1항에 있어서,
도너 DNA는 PAM 서열을 포함하고, 표적 DNA에 대해 1 내지 3개의 뉴클레오티드의 미스매치를 갖는 변이 코돈을 포함하는 상동 서열로 이루어진 것인, 재조합 핵산 구조체.
제1항에 있어서,
가이드 RNA는 표적 DNA를 인식하는 스페이서; 및 crRNA 및 tracrRNA로 이루어진 단일가닥 RNA 스캐폴드를 포함하는, 재조합 핵산 구조체.
제9항에 있어서,
스페이서는 protospacer adjacent motifs(PAMs) 서열의 일부 또는 전체를 포함하는, 재조합 핵산 구조체.
제1항에 있어서,
터미네이터는 T7 terminator, RNA Polymerase III terminator 또는 -TTTTTT- 서열 중 어느 하나인, 재조합 핵산 구조체.
제1항의 재조합 핵산 구조체를 포함하는 발현 벡터.
제12항의 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포.
제13항에 있어서,
숙주세포는 대장균(E.coli)를 포함하는, 숙주세포.
제1항의 재조합 핵산 구조체를 포함하는 발현 벡터 또는 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포; 및
Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질을 발현하는 벡터를 포함하는 CRISPR-Cas9 기반 유전체상의 치환 변이용 조성물.
제15항에 있어서,
조성물은 원핵 세포 또는 진핵 세포에서 단일 위치 또는 다중 위치 유전자의 표적화된 돌연변이를 유도하는 것인, CRISPR-Cas9 기반 유전체상의 치환 변이용 조성물.
제15항의 CRISPR-Cas9 기반 유전체상의 치환 변이용 조성물을 원핵 세포 또는 인간을 제외한 진핵 세포에 도입하거나, 인 비트로에서 인간 세포에 도입하여 유전체상에서 치환 변이를 유도하는 단계; 및
상기 단계에서 치환 변이가 유도된 원핵 세포 또는 인간을 제외한 진핵 세포의 유전체, 또는 인 비트로에서 치환 변이가 유도된 인간 세포의 유전체로부터 msd 전구체의 서열을 분석하여 유전체상의 치환 변이를 추적하는 단계를 포함하는 유전체상의 치환 변이 추적 방법.
제15항의 CRISPR-Cas9 기반 유전체상의 치환 변이용 조성물을 원핵 세포 또는 인간을 제외한 진핵 세포에 도입하거나, 인 비트로에서 인간 세포에 도입하여 유전체상에서 약물과 연관된 유전자의 치환 변이를 유도하는 단계; 및
상기 단계에서 치환 변이가 유도된 원핵 세포 또는 인간을 제외한 진핵 세포에 약물을 처리하거나, 상기 단계에서 치환 변이가 유도된 인간 세포에 대해 인 비트로에서 약물을 처리하고,
상기 원핵 세포 또는 인간을 제외한 진핵 세포의 유전체, 또는 인 비트로에서 치환 변이가 유도된 인간 세포의 유전체로부터 msd 전구체의 서열을 분석하여 유전체상의 약물 내성 변이를 추적하는 단계를 포함하는 유전체상의 약물 내성 변이의 추적 방법.