JP6779513B2 - インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法、インビボクローニング可能な細胞株の製造方法、細胞株、インビボクローニング方法、及びインビボクローニングを行うためのキット - Google Patents
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法、インビボクローニング可能な細胞株の製造方法、細胞株、インビボクローニング方法、及びインビボクローニングを行うためのキットに関する。
従来のＤＮＡクローニング技術では、目的のＤＮＡを制限酵素及びＤＮＡリガーゼ等を用いて発現ベクターに組み込み、目的のＤＮＡを挿入した発現ベクターを大腸菌等の宿主細胞に導入し発現させる（形質転換させる）ことで、目的のＤＮＡをクローニングすることが一般的であった。
近年、相同な配列間の組換え反応を利用して目的のＤＮＡをベクターへクローニングする方法、いわゆる、シームレスクローニングが活用されている（例えば、特許文献１参照。）。シームレスクローニングでは、まず、２０ｂｐ程度の相同な配列を付加したプライマーを合成し、目的のＤＮＡ及び発現ベクターをそれぞれＰＣＲ法により増幅させる。次いで、出芽酵母、又はＲｅｃＥＴシステムが構築された大腸菌株に相同配列を有する目的のＤＮＡ及び発現ベクターを導入し発現させることで、目的のＤＮＡをクローニングすることができる。このように、酵母や大腸菌等の細胞内で目的のＤＮＡをクローニングさせることをインビボクローニングと呼ぶ。
出芽酵母では、細胞内で相同組換えの活性が非常に高いため、容易にシームレスクローニングを行うことができる（例えば、非特許文献１参照。）。
また、ＲｅｃＥＴシステムが構築された大腸菌株では、Ｒａｃプロファージ領域のＲｅｃＥ、ＲｅｃＴレコンビナーゼが過剰発現しており、このＲｅｃＥ、ＲｅｃＴレコンビナーゼにより大腸菌細胞内で相同組換えの効率が高まり、シームレスクローニングを行うことができる（例えば、特許文献２、特許文献３、及び非特許文献２参照。）。
出芽酵母では、細胞内で相同組換えの活性が非常に高いため、容易にシームレスクローニングを行うことができる（例えば、非特許文献１参照。）。
また、ＲｅｃＥＴシステムが構築された大腸菌株では、Ｒａｃプロファージ領域のＲｅｃＥ、ＲｅｃＴレコンビナーゼが過剰発現しており、このＲｅｃＥ、ＲｅｃＴレコンビナーゼにより大腸菌細胞内で相同組換えの効率が高まり、シームレスクローニングを行うことができる（例えば、特許文献２、特許文献３、及び非特許文献２参照。）。
最近では、相同配列を有する複数の目的のＤＮＡ及び発現ベクターを大腸菌ＤＨ５α株に直接導入し発現させることで、目的のＤＮＡをクローニングできることが報告されている（例えば、非特許文献３参照。）。
Ma, H., et al., "Plasmid construction by homologous recombination in yeast", GENE, vol.58, p201-216, 1987.
Oliner, J. D., et al., "In vivo cloning of PCR products in E.coli", NUCLEIC. ACIDS. RES., vol.21, no.22, p5192-5197, 1993.
Kostylev, M., et al., "Cloning Should Be Simple: Escherichia coli DH5α-Mediated Assembly of Multiple DNA Fragments with Short End Homologies", PLOS ONE, 2015, DOI: 10.1371/journal.pone.0137466.
非特許文献１に記載の方法では、出芽酵母の細胞内において、クローニングされた目的のＤＮＡが挿入されたベクターが不安定であるため、さらに大腸菌等の細胞株に導入し、クローニングする必要がある。
また、特許文献２、特許文献３、及び非特許文献２に記載の方法では、ＲｅｃＥＴシステムを有する大腸菌株を用いる必要があり、さらに、プラスミドＤＮＡ同士で相同組換えが起こり、ダイマー、又はマルチマーを形成されるという課題を有する。
さらに、非特許文献３に記載の方法では、大腸菌ＤＨ５α株を用いて直接目的のＤＮＡをクローニングできることは報告されているが、そのメカニズムは明らかにされていない。また、非特許文献３に記載の方法では、クローニング効率が低く、よりクローニング効率の高い細胞株が求められていた。
また、特許文献２、特許文献３、及び非特許文献２に記載の方法では、ＲｅｃＥＴシステムを有する大腸菌株を用いる必要があり、さらに、プラスミドＤＮＡ同士で相同組換えが起こり、ダイマー、又はマルチマーを形成されるという課題を有する。
さらに、非特許文献３に記載の方法では、大腸菌ＤＨ５α株を用いて直接目的のＤＮＡをクローニングできることは報告されているが、そのメカニズムは明らかにされていない。また、非特許文献３に記載の方法では、クローニング効率が低く、よりクローニング効率の高い細胞株が求められていた。
本発明は上記事情を鑑みてなされたものであり、高効率でインビボクローニング可能な細胞株のスクリーニング方法を提供する。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、大腸菌等の細胞株がｈｓｄＲ遺伝子の機能が失われており、ｘｔｈＡ遺伝子を有することによって、高効率で相同組換えが起こり、高効率でインビボクローニングが可能であることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の態様を含む。
［１］インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法であって、細胞株について、ｘｔｈＡ遺伝子の有無を評価し、ｘｔｈＡ遺伝子を有する細胞株を選択する第１の選択工程を備えることを特徴とする方法。
［２］さらに、前記第１の選択工程の後に、ｈｓｄＲ遺伝子の有無を評価し、ｈｓｄＲ遺伝子の全部又は一部の機能が失われた細胞株を選択する第２の選択工程を備える［１］に記載の方法。
［３］前記細胞株が大腸菌又は哺乳動物細胞に由来するものである［１］又は［２］に記載の方法。
［４］インビボクローニング可能な細胞株の製造方法であって、ｘｔｈＡ遺伝子を細胞株の染色体に挿入し、ｘｔｈＡ遺伝子を高発現させる挿入工程を備えることを特徴とする製造方法。
［５］さらに、前記細胞株がｈｓｄＲ遺伝子を有する場合に、前記挿入工程の後、又は同時に、前記ｈｓｄＲ遺伝子の全部又は一部の機能が失わせる欠損工程を備える［４］に記載の製造方法。
［６］前記細胞株が大腸菌又は哺乳動物細胞に由来するものである［４］又は［５］に記載の製造方法。
［７］ｘｔｈＡ遺伝子を有し、ｈｓｄＲ遺伝子の全部又は一部の機能が失われたことを特徴とする細胞株。
［８］前記細胞株が、大腸菌又は哺乳動物細胞に由来するものである［７］に記載の細胞株。
［９］［１］〜［３］のいずれか一つに記載の方法、又は［４］〜［６］のいずれか一つに記載の製造方法を用いて、インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニング、又は製造した後、得られた細胞株に、発現ベクターと、５’末端領域及び３’末端領域に前記発現ベクター上の挿入を行う部位と相同な塩基配列を有する目的の二本鎖ＤＮＡとを導入する導入工程と、前記導入工程後、前記細胞株を培養し、前記目的の二本鎖ＤＮＡを相同組換えにより前記発現ベクターに挿入する挿入工程と、を備えることを特徴とするインビボクローニング方法。
［１０］インビボクローニングを行うためのキットであって、［７］又は［８］に記載の細胞株を備えることを特徴とするキット。
［１］インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法であって、細胞株について、ｘｔｈＡ遺伝子の有無を評価し、ｘｔｈＡ遺伝子を有する細胞株を選択する第１の選択工程を備えることを特徴とする方法。
［２］さらに、前記第１の選択工程の後に、ｈｓｄＲ遺伝子の有無を評価し、ｈｓｄＲ遺伝子の全部又は一部の機能が失われた細胞株を選択する第２の選択工程を備える［１］に記載の方法。
［３］前記細胞株が大腸菌又は哺乳動物細胞に由来するものである［１］又は［２］に記載の方法。
［４］インビボクローニング可能な細胞株の製造方法であって、ｘｔｈＡ遺伝子を細胞株の染色体に挿入し、ｘｔｈＡ遺伝子を高発現させる挿入工程を備えることを特徴とする製造方法。
［５］さらに、前記細胞株がｈｓｄＲ遺伝子を有する場合に、前記挿入工程の後、又は同時に、前記ｈｓｄＲ遺伝子の全部又は一部の機能が失わせる欠損工程を備える［４］に記載の製造方法。
［６］前記細胞株が大腸菌又は哺乳動物細胞に由来するものである［４］又は［５］に記載の製造方法。
［７］ｘｔｈＡ遺伝子を有し、ｈｓｄＲ遺伝子の全部又は一部の機能が失われたことを特徴とする細胞株。
［８］前記細胞株が、大腸菌又は哺乳動物細胞に由来するものである［７］に記載の細胞株。
［９］［１］〜［３］のいずれか一つに記載の方法、又は［４］〜［６］のいずれか一つに記載の製造方法を用いて、インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニング、又は製造した後、得られた細胞株に、発現ベクターと、５’末端領域及び３’末端領域に前記発現ベクター上の挿入を行う部位と相同な塩基配列を有する目的の二本鎖ＤＮＡとを導入する導入工程と、前記導入工程後、前記細胞株を培養し、前記目的の二本鎖ＤＮＡを相同組換えにより前記発現ベクターに挿入する挿入工程と、を備えることを特徴とするインビボクローニング方法。
［１０］インビボクローニングを行うためのキットであって、［７］又は［８］に記載の細胞株を備えることを特徴とするキット。
本発明によれば、高効率でインビボクローニング可能な細胞株のスクリーニング方法を提供することができる。
＜＜インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法＞＞
＜第一実施形態＞
一実施形態において、本発明は、インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法であって、細胞株について、ｘｔｈＡ遺伝子の有無を評価し、ｘｔｈＡ遺伝子を有する細胞株を選択する第１の選択工程を備える方法を提供する。
＜第一実施形態＞
一実施形態において、本発明は、インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法であって、細胞株について、ｘｔｈＡ遺伝子の有無を評価し、ｘｔｈＡ遺伝子を有する細胞株を選択する第１の選択工程を備える方法を提供する。
本実施形態のスクリーニング方法によれば、高効率でインビボクローニング可能な細胞株を得ることができる。
本実施形態におけるスクリーニング対象となる細胞株としては、通常、宿主細胞としてＤＮＡクローニング及びタンパク質発現系として用いられるものであればよく、その由来となる生物種は限定されない。細胞株の由来となる生物種としては、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞（特に、哺乳動物細胞）等が挙げられ、これらに限定されない。中でも、細胞株の由来となる生物種としては、取扱いの容易さから、大腸菌又は哺乳動物細胞であることが好ましく、大腸菌であることがより好ましい。
なお、本明細書において、「インビボクローニング」とは、細胞内で目的のＤＮＡをクローニングする技術を意味する。
本実施形態のスクリーニング方法について、以下に詳細を説明する。
なお、本明細書において、「インビボクローニング」とは、細胞内で目的のＤＮＡをクローニングする技術を意味する。
本実施形態のスクリーニング方法について、以下に詳細を説明する。
［第１の選択工程］
まず、細胞株について、ｘｔｈＡ遺伝子の有無を評価し、ｘｔｈＡ遺伝子を有する細胞株を選択する。
まず、細胞株について、ｘｔｈＡ遺伝子の有無を評価し、ｘｔｈＡ遺伝子を有する細胞株を選択する。
一般に、ｘｔｈＡ遺伝子は、二本鎖ＤＮＡの３’−ＯＨ末端から５’−モノヌクレオチドを遊離させる３’→５’エキソヌクレアーゼをコードする遺伝子であり、遺伝子産物である３’→５’エキソヌクレアーゼは、損傷を受けて、ＤＮＡグリコシラーゼの活性により除去された塩基を有するＤＮＡや、自然に塩基が欠損したＤＮＡを修復する機能を有する。
本実施形態のスクリーニング対象となる細胞株において、ｘｔｈＡ遺伝子を有することにより、３’→５’エキソヌクレアーゼを発現することができる。
図１は、ｘｔｈＡ遺伝子を有する細胞内での相同組換えのメカニズムを模式的に示す図である。図１において、相同配列を有する部位３ａ及び３ｂのうち、相同配列を有する部位３ｂにおける相同組換えのメカニズムを示している。また、相同配列を有する部位３ｂにおける相同配列を配列Ｘとした場合、目的の二本鎖ＤＮＡ１（以下、「ｄｓＤＮＡ」と称する場合がある。）及びベクターにおいて、相同配列を有する部位３ｂは、配列Ｘを有する部位３ｂ−１と、配列Ｘと相補的な配列を有する部位３ｂ−２とからなる。
まず、発現した３’→５’エキソヌクレアーゼ４は、目的のｄｓＤＮＡ１及びベクター２が導入された細胞内において、目的のｄｓＤＮＡ１の３’末端から内側へ向かって配列Ｘを有する部位３ｂ−１を分解し、配列Ｘと相補的な配列を有する部位３ｂ−２を含む末端部に１本鎖領域を生成する。また、３’→５’エキソヌクレアーゼ４は、ベクター２の３’末端から内側へ向かって配列Ｘと相補的な配列を有する部位３ｂ−２を分解し、配列Ｘを有する部位３ｂ−１を含む末端部に１本鎖領域を生成する。その結果、目的のｄｓＤＮＡ１の配列Ｘと相補的な配列を有する部位３ｂ−２を含む末端部と、ベクター２の配列Ｘを有する部位３ｂ−１を含む末端部とがアニールする。次いで、細胞内に存在するＤＮＡポリメラーゼ５によりニックが埋められ、ＤＮＡリガーゼ６により結合される。逆側の相同配列を有する部位３ａを含む末端部でも同様のメカニズムで相同組換えが行われているため、その結果、目的の二本鎖ＤＮＡがベクターに挿入される。
よって、ｘｔｈＡ遺伝子を有する細胞株を選択することで、高効率で相同組換えが行われ、目的の二本鎖ＤＮＡが挿入されたベクターを得ることができ、高効率でインビボクローニングを行うことができる。
図１は、ｘｔｈＡ遺伝子を有する細胞内での相同組換えのメカニズムを模式的に示す図である。図１において、相同配列を有する部位３ａ及び３ｂのうち、相同配列を有する部位３ｂにおける相同組換えのメカニズムを示している。また、相同配列を有する部位３ｂにおける相同配列を配列Ｘとした場合、目的の二本鎖ＤＮＡ１（以下、「ｄｓＤＮＡ」と称する場合がある。）及びベクターにおいて、相同配列を有する部位３ｂは、配列Ｘを有する部位３ｂ−１と、配列Ｘと相補的な配列を有する部位３ｂ−２とからなる。
まず、発現した３’→５’エキソヌクレアーゼ４は、目的のｄｓＤＮＡ１及びベクター２が導入された細胞内において、目的のｄｓＤＮＡ１の３’末端から内側へ向かって配列Ｘを有する部位３ｂ−１を分解し、配列Ｘと相補的な配列を有する部位３ｂ−２を含む末端部に１本鎖領域を生成する。また、３’→５’エキソヌクレアーゼ４は、ベクター２の３’末端から内側へ向かって配列Ｘと相補的な配列を有する部位３ｂ−２を分解し、配列Ｘを有する部位３ｂ−１を含む末端部に１本鎖領域を生成する。その結果、目的のｄｓＤＮＡ１の配列Ｘと相補的な配列を有する部位３ｂ−２を含む末端部と、ベクター２の配列Ｘを有する部位３ｂ−１を含む末端部とがアニールする。次いで、細胞内に存在するＤＮＡポリメラーゼ５によりニックが埋められ、ＤＮＡリガーゼ６により結合される。逆側の相同配列を有する部位３ａを含む末端部でも同様のメカニズムで相同組換えが行われているため、その結果、目的の二本鎖ＤＮＡがベクターに挿入される。
よって、ｘｔｈＡ遺伝子を有する細胞株を選択することで、高効率で相同組換えが行われ、目的の二本鎖ＤＮＡが挿入されたベクターを得ることができ、高効率でインビボクローニングを行うことができる。
ｘｔｈＡ遺伝子の有無を評価する方法としては、公知の方法を用いて行えばよく、例えば、細胞株からＤＮＡを抽出し、ｘｔｈＡ遺伝子に対するプライマーセットを用いたＰＣＲ法により、ｘｔｈＡ遺伝子を増幅し、アガロースゲルにより分離し、エチジウムブロマイド等のインターカレーターによる染色を行い、紫外線を照射して検出する方法を用いればよい。
又は、例えば、細胞株からＤＮＡを抽出し、ｘｔｈＡ遺伝子に対するプライマーセットを用いたリアルタイムＰＣＲ法により、反応液に予め蛍光プローブ又は蛍光色素を添加し、リアルタイムでｘｔｈＡ遺伝子の増幅をモニタリングしながら定量的に検出する方法を用いればよい。
又は、例えば、細胞株からＤＮＡを抽出し、ｘｔｈＡ遺伝子に対するプライマーセットを用いたリアルタイムＰＣＲ法により、反応液に予め蛍光プローブ又は蛍光色素を添加し、リアルタイムでｘｔｈＡ遺伝子の増幅をモニタリングしながら定量的に検出する方法を用いればよい。
又は、例えば、細胞株からＲＮＡを抽出し、ｘｔｈＡ遺伝子から転写されたｍＲＮＡを逆転写酵素及びｘｔｈＡ遺伝子に対するプライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲ法により、ｍＲＮＡから変換されたｃＤＮＡを増幅し、上述の検出法（アガロースゲル分離後のインターカレーターによる染色法、又は蛍光プローブ又は蛍光色素を用いたリアルタイムでの検出法）により、検出する方法を用いればよい。
［第２の選択工程］
次いで、さらに、前記第１の選択工程の後に、ｈｓｄＲ遺伝子の有無を評価し、ｈｓｄＲ遺伝子の全部又は一部の機能が失われた細胞株を選択する第２の選択工程を備えることが好ましい。
次いで、さらに、前記第１の選択工程の後に、ｈｓｄＲ遺伝子の有無を評価し、ｈｓｄＲ遺伝子の全部又は一部の機能が失われた細胞株を選択する第２の選択工程を備えることが好ましい。
一般に、ｈｓｄＲ遺伝子は、特定の塩基配列を切断する制限酵素をコードする遺伝子であって、ｈｓｄＭ遺伝子がコードするメチル化修飾酵素、及びｈｓｄＳ遺伝子がコードするメチル化認識タンパク質と共に、制限−修飾システムを担う。この制限−修飾システムでは、細胞内において、特定の塩基配列の片側のみがメチル化されている（宿主細胞中の染色体のＤＮＡ複製の間に起こるように片側だけがメチル化されている）場合、制限−修飾システムにおけるメチル化修飾酵素が働き、特定の塩基配列を切断から守る。一方、その特定の塩基配列がいずれの鎖においてもメチル化されていない場合、制限−修飾システムにおける制限酵素が働き、特定の塩基配列を切断する。
通常、外来ＤＮＡである目的の二本鎖ＤＮＡ及びベクターは、特定の塩基配列を有する場合、いずれの鎖においても該配列はメチル化されていないため、上記制限−修飾システムにより切断される。
よって、ｈｓｄＲ遺伝子の機能が破壊又は欠損している細胞株を選択することで、外来ＤＮＡである目的の二本鎖ＤＮＡ及びベクターが上記制限−修飾システムによる切断を受けないため、高効率で相同組換えが行われ、目的の二本鎖ＤＮＡが挿入されたベクターを得ることができ、高効率でインビボクローニングを行うことができる。
通常、外来ＤＮＡである目的の二本鎖ＤＮＡ及びベクターは、特定の塩基配列を有する場合、いずれの鎖においても該配列はメチル化されていないため、上記制限−修飾システムにより切断される。
よって、ｈｓｄＲ遺伝子の機能が破壊又は欠損している細胞株を選択することで、外来ＤＮＡである目的の二本鎖ＤＮＡ及びベクターが上記制限−修飾システムによる切断を受けないため、高効率で相同組換えが行われ、目的の二本鎖ＤＮＡが挿入されたベクターを得ることができ、高効率でインビボクローニングを行うことができる。
本明細書において、「機能の全部又は一部が失われた」とは、標的遺伝子（本実施形態においては、ｈｓｄＲ遺伝子）が、変更、削除、置換或いは挿入等される、又は相同組換えされることにより、本来の標的遺伝子（本実施形態においては、ｈｓｄＲ遺伝子）が欠損、欠失又は変化し、標的遺伝子（本実施形態においては、ｈｓｄＲ遺伝子）の全部又は一部が発現できず、標的遺伝子（本実施形態においては、ｈｓｄＲ遺伝子）の生理的機能の全部又は一部を果たすことができない状態を意味する。「機能の全部又は一部が失われた」状態において、相同染色体上の標的遺伝子（本実施形態においては、ｈｓｄＲ遺伝子）の片方が欠損、欠失又は変化していてもよく、両方が欠損、欠失又は変化していてもよい。
本明細書において、変更、削除、置換若しくは挿入等される、又は相同組換えされることを「遺伝子を改変する」と称する場合がある。
本明細書において、上述の用語「変更」、「削除」、「挿入」及び「置換」等の遺伝子改変手段は、限定した意味で使用されているものではない。また、いずれかの遺伝子改変手段に厳密に区別して使用する意図で用いる必要もなく、結果としていずれかの遺伝子改変手段によりｈｓｄＲ遺伝子が改変されてｈｓｄＲ遺伝子の発現が抑制され、その機能の全部又は一部が不能になっていることを意味するものとして使用される。しかしながら、上述の手段は、一般的には、後述のような意味として使用しているものと理解することができる。
本明細書において、上述の用語「変更」、「削除」、「挿入」及び「置換」等の遺伝子改変手段は、限定した意味で使用されているものではない。また、いずれかの遺伝子改変手段に厳密に区別して使用する意図で用いる必要もなく、結果としていずれかの遺伝子改変手段によりｈｓｄＲ遺伝子が改変されてｈｓｄＲ遺伝子の発現が抑制され、その機能の全部又は一部が不能になっていることを意味するものとして使用される。しかしながら、上述の手段は、一般的には、後述のような意味として使用しているものと理解することができる。
つまり、一般的には、ゲノムＤＮＡの「変更」とは、標的遺伝子のゲノムＤＮＡフラグメントの１つ又はそれ以上の塩基が変更して、標的遺伝子の発現産物の全部又は一部が機能しないようにすることを意味する。
ゲノムＤＮＡの「削除」とは、標的遺伝子のゲノムＤＮＡフラグメントの全部又は一部を欠失させることにより、標的遺伝子の発現産物の全部或いは一部が機能しない、又は存在しないようにすることを意味する。
ゲノムＤＮＡの「置換」とは、標的遺伝子のゲノムＤＮＡフラグメントの全部又は一部を標的遺伝子とは関連しない別個の配列により置換し、標的遺伝子の発現産物の全部或いは一部が機能しない、又は存在しないようにすることを意味する。
ゲノムＤＮＡの「挿入」とは、標的遺伝子中に、それ以外の配列を有するＤＮＡを挿入することにより、当該標的遺伝子以外のＤＮＡを挿入した標的遺伝子の発現産物の全部或いは一部が機能しない、又は存在しないようにすることを意味する。
また、遺伝子の変更、削除、挿入又は置換等の遺伝子改変手段は、２つ以上の方法を組み合わせて、標的遺伝子に対して同時に使用されていてもよい。
ゲノムＤＮＡの「削除」とは、標的遺伝子のゲノムＤＮＡフラグメントの全部又は一部を欠失させることにより、標的遺伝子の発現産物の全部或いは一部が機能しない、又は存在しないようにすることを意味する。
ゲノムＤＮＡの「置換」とは、標的遺伝子のゲノムＤＮＡフラグメントの全部又は一部を標的遺伝子とは関連しない別個の配列により置換し、標的遺伝子の発現産物の全部或いは一部が機能しない、又は存在しないようにすることを意味する。
ゲノムＤＮＡの「挿入」とは、標的遺伝子中に、それ以外の配列を有するＤＮＡを挿入することにより、当該標的遺伝子以外のＤＮＡを挿入した標的遺伝子の発現産物の全部或いは一部が機能しない、又は存在しないようにすることを意味する。
また、遺伝子の変更、削除、挿入又は置換等の遺伝子改変手段は、２つ以上の方法を組み合わせて、標的遺伝子に対して同時に使用されていてもよい。
ｈｓｄＲ遺伝子の有無を評価する方法としては、上述の［第１の選択工程］においてｘｔｈＡ遺伝子の有無を評価する方法として例示された方法と同様の方法が挙げられる。
＜第二実施形態＞
他の実施形態において、本発明は、インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法であって、細胞株について、ｈｓｄＲ遺伝子の有無を評価し、ｈｓｄＲ遺伝子の全部又は一部の機能が失われた細胞株を選択する第１の選択工程を備える方法を提供する。
次いで、さらに、前記第１の選択工程の後に、ｘｔｈＡ遺伝子の有無を評価し、ｘｔｈＡ遺伝子を有する細胞株を選択する第２の選択工程を備えることが好ましい。
他の実施形態において、本発明は、インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法であって、細胞株について、ｈｓｄＲ遺伝子の有無を評価し、ｈｓｄＲ遺伝子の全部又は一部の機能が失われた細胞株を選択する第１の選択工程を備える方法を提供する。
次いで、さらに、前記第１の選択工程の後に、ｘｔｈＡ遺伝子の有無を評価し、ｘｔｈＡ遺伝子を有する細胞株を選択する第２の選択工程を備えることが好ましい。
＜＜インビボクローニング可能な細胞株の製造方法＞＞
一実施形態において、本発明は、インビボクローニング可能な細胞株の製造方法であって、ｘｔｈＡ遺伝子を細胞株の染色体に挿入し、ｘｔｈＡ遺伝子を高発現させる挿入工程を備える製造方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、インビボクローニング可能な細胞株の製造方法であって、ｘｔｈＡ遺伝子を細胞株の染色体に挿入し、ｘｔｈＡ遺伝子を高発現させる挿入工程を備える製造方法を提供する。
本実施形態の製造方法によれば、高効率でインビボクローニング可能な細胞株を得ることができる。
本実施形態において用いられる細胞株としては、通常、宿主細胞としてＤＮＡクローニング及びタンパク質発現系として用いられるものであればよく、その由来となる生物種は限定されない。細胞株の由来となる生物種としては、上述の＜＜インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、細胞株の由来となる生物種としては、取扱いの容易さから、大腸菌又は哺乳動物細胞であることが好ましく、大腸菌であることがより好ましい。
本実施形態の製造方法について、以下に詳細を説明する。
本実施形態の製造方法について、以下に詳細を説明する。
［挿入工程］
まず、ｘｔｈＡ遺伝子を細胞株の染色体に挿入し、ｘｔｈＡ遺伝子を高発現させる。すでにｘｔｈＡ遺伝子を有する細胞株においても、さらにｘｔｈＡ遺伝子を挿入することにより、ｘｔｈＡ遺伝子を高発現させることができる。
まず、ｘｔｈＡ遺伝子を細胞株の染色体に挿入し、ｘｔｈＡ遺伝子を高発現させる。すでにｘｔｈＡ遺伝子を有する細胞株においても、さらにｘｔｈＡ遺伝子を挿入することにより、ｘｔｈＡ遺伝子を高発現させることができる。
ｘｔｈＡ遺伝子の染色体上の挿入する遺伝子領域としては、恒常的且つ安定的に発現が行われている遺伝子領域であり、当該領域に本来コードされている遺伝子が欠損又は改変された場合であっても、生命の維持が可能な領域であればよい。
（挿入方法）
また、ｘｔｈＡ遺伝子の染色体への挿入方法としては、相同組換え修復（ＨＤＲ）を誘発する公知のゲノム編集技術を用いた方法であればよく、例えばＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム、ＴＡＬＥＮシステム、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼシステム等が挙げられ、これに限定されない。中でも、操作が簡便であり、高い選択性で目的部位に標的遺伝子を挿入できることから、公知のゲノム編集技術としては、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを用いることが好ましい。
また、ｘｔｈＡ遺伝子の染色体への挿入方法としては、相同組換え修復（ＨＤＲ）を誘発する公知のゲノム編集技術を用いた方法であればよく、例えばＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム、ＴＡＬＥＮシステム、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼシステム等が挙げられ、これに限定されない。中でも、操作が簡便であり、高い選択性で目的部位に標的遺伝子を挿入できることから、公知のゲノム編集技術としては、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを用いることが好ましい。
ＴＡＬＥＮシステムは、Transcription activator-like effector nuclease（ＴＡＬＥＮ）を用いるシステムであり、ＴＡＬＥＮはカスタム化された結合ドメインと非特異的なＦｏｋＩヌクレアーゼドメインとを融合させたものである。ＤＮＡ結合ドメインは、キサントモナスのプロテオバクテリアが分泌し宿主植物の遺伝子転写を変えさせるタンパク質であるtranscription activator-like effectors（ＴＡＬＥ）由来の保存されたリピートからなっている。ＴＡＬＥＮシステムにより、ｘｔｈＡ遺伝子を染色体上に挿入するには、染色体上の目的部位に対するＴＡＬＥＮを作製し、挿入部位周辺に相同性を有し、ｘｔｈＡ遺伝子を含むドナーベクターを作製する。ＴＡＬＥＮをコードするＤＮＡを含むベクターとｘｔｈＡ遺伝子を含むドナーベクターとを共導入することにより、目的部位が切断され、それに引き続きドナーベクターを利用したＨＤＲにより、ｘｔｈＡ遺伝子が導入される。ｘｔｈＡ遺伝子に薬剤選択マーカーを持たせておくことにより、薬剤選択によりｘｔｈＡ遺伝子導入が起きた細胞を効率よく選択できる。
一方、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムは、細菌や古細菌が有する、外部から侵入した核酸（ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ）に対する一種の獲得免疫として機能する座位を利用したシステムである。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムにより、ｘｔｈＡ遺伝子を染色体上に挿入するには、染色体上の挿入部位を切断するためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ベクターを作製する。そのためには、目的部位にＣａｓ９を誘導するガイドＲＮＡをコードする発現ベクター及びＣａｓ９発現ベクターが必要である。
これらベクターとｘｔｈＡ遺伝子を含むドナーベクターとを共導入することにより、目的部位が切断され、それに引き続きドナーベクターを利用したＨＤＲにより、ｘｔｈＡ遺伝子が導入される。ｘｔｈＡ遺伝子に薬剤選択マーカーを持たせておくことにより、薬剤選択によりｘｔｈＡ遺伝子導入が起きた細胞を効率よく選択できる。
これらベクターとｘｔｈＡ遺伝子を含むドナーベクターとを共導入することにより、目的部位が切断され、それに引き続きドナーベクターを利用したＨＤＲにより、ｘｔｈＡ遺伝子が導入される。ｘｔｈＡ遺伝子に薬剤選択マーカーを持たせておくことにより、薬剤選択によりｘｔｈＡ遺伝子導入が起きた細胞を効率よく選択できる。
Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システムは、ＺｎフィンガードメインとＤＮＡ切断ドメインからなる人工制限酵素を用いたゲノム編集である。一つのＺｎフィンガードメインは３塩基を認識するが、３〜５つのＺｎフィンガードメインを連結させることで、特定の９〜１５塩基配列を認識するＤＮＡ結合タンパク質を設計できる。このＤＮＡ結合タンパク質に、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインを融合させることで、目的部位を切断する人工ヌクレアーゼＺＦＮを設計する。ＺＦＮシステムにより、ｘｔｈＡ遺伝子を染色体上の目的部位に挿入するには、染色体上の目的部位に対するＺＦＮを作製し、挿入部位周辺に相同性を有し、ｘｔｈＡ遺伝子を含むドナーベクターを作製する。これらベクターを共導入することにより、目的部位が切断され、それに引き続きドナーベクターを利用したＨＤＲにより、ｘｔｈＡ遺伝子が導入される。ｘｔｈＡ遺伝子に薬剤選択マーカーを持たせておくことにより、薬剤選択によりｘｔｈＡ遺伝子導入が起きた細胞を効率よく選択できる。
染色体上の挿入を行う部位と相同な配列は、ｘｔｈＡ遺伝子の上流（５’側）及び下流（３’側）に作動可能に連結されていればよく、その長さは、例えば１０ｂｐ以上３０ｂｐ以下であればよく、例えば１５ｂｐ以上２５ｂｐ以下であればよい。
ｘｔｈＡ遺伝子は、導入を行う細胞株の種類に応じたベクターに挿入したドナーベクターを作製し、上記いずれかの挿入方法で遺伝子導入を行えばよい。
前記ベクターとしては、発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターとしては特に制限されず、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ５７等の大腸菌由来のプラスミド；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のプラスミド；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来プラスミド；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス等のウイルス；及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。
前記ベクターとしては、発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターとしては特に制限されず、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ５７等の大腸菌由来のプラスミド；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のプラスミド；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来プラスミド；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス等のウイルス；及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。
ｘｔｈＡ遺伝子は、タグ配列、プロモーター配列、転写終結配列、薬剤選択マーカー遺伝子、及びそれらの組み合わせとともに導入してもよい。ここで、タグの中には、蛍光タグ（ＧＦＰなど）、アフィニティータグ、デグロンタグ、局在タグ等が挙げられる。
・薬剤選択マーカー遺伝子
薬剤選択マーカー遺伝子は、ｘｔｈＡ遺伝子の上流（５’側）又は下流（３’側）に、作動可能に連結されていればよい。薬剤選択マーカー遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ヒスティディノール耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等が挙げられ、これらに限定されない。薬剤選択マーカー遺伝子を挿入することにより、該薬物を含む培地を用いて細胞を培養することで、ｘｔｈＡ遺伝子が導入された細胞を選択することができる。
薬剤選択マーカー遺伝子は、ｘｔｈＡ遺伝子の上流（５’側）又は下流（３’側）に、作動可能に連結されていればよい。薬剤選択マーカー遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ヒスティディノール耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等が挙げられ、これらに限定されない。薬剤選択マーカー遺伝子を挿入することにより、該薬物を含む培地を用いて細胞を培養することで、ｘｔｈＡ遺伝子が導入された細胞を選択することができる。
・プロモーター
本実施形態の挿入工程において、ｘｔｈＡ遺伝子の転写を制御するプロモーター配列がｘｔｈＡ遺伝子に上流（５’側）に作動可能に連結されていることが好ましい。
なお、本明細書において、「作動可能に連結」とは、遺伝子発現制御配列（例えば、プロモーター又は一連の転写因子結合部位）と発現させたい遺伝子（本実施形態においては、ｘｔｈＡ遺伝子）との間の機能的連結を意味する。ここで、「発現制御配列」とは、その発現させたい遺伝子（本実施形態においては、ｘｔｈＡ遺伝子）の転写を指向するものを意味する。
本実施形態の挿入工程において、ｘｔｈＡ遺伝子の転写を制御するプロモーター配列がｘｔｈＡ遺伝子に上流（５’側）に作動可能に連結されていることが好ましい。
なお、本明細書において、「作動可能に連結」とは、遺伝子発現制御配列（例えば、プロモーター又は一連の転写因子結合部位）と発現させたい遺伝子（本実施形態においては、ｘｔｈＡ遺伝子）との間の機能的連結を意味する。ここで、「発現制御配列」とは、その発現させたい遺伝子（本実施形態においては、ｘｔｈＡ遺伝子）の転写を指向するものを意味する。
前記プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、細胞の種類等に応じて適宜決定できる。プロモーターの具体例としては、例えば、誘導性プロモーター、ウイルス性プロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター、組織特異的プロモーター等が挙げられる。
誘導性プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、化学的誘導性プロモーター、熱ショック誘導性プロモーター、電磁気的誘導性プロモーター、核レセプター誘導性プロモーター、ホルモン誘導性プロモーター等が挙げられる。
化学的誘導性プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、サリチル酸誘導性プロモーター（国際公開第９５／１９４３３号、参照。）、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｇａｔｚら（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２，３９７−４０４、参照。）、エタノール誘導性プロモーター、亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーター等が挙げられる。
熱ショック誘導性プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、熱誘導性プロモーター(米国特許出願第０５１８７２８７号明細書、参照。)、低温誘導性プロモーター(米国特許出願第０５８４７１０２号明細書、参照。)等が挙げられる。
電磁気的誘導性プロモーターとしては、初期増殖領域−１（ＥＧＲ−１）プロモーター（米国特許出願第米国特許５２０６１５２号明細書、参照。）、ｃ−Ｊｕｎプロモーター等が挙げられる。
核レセプター誘導性プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、オーファン核受容体ニワトリ卵白アルブミン上流プロモーター等が挙げられる。
ホルモン誘導性プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、グルココルチコイド誘導性プロモーター（Ｌｕ及びＦｅｄｅｒｏｆｆ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６，４１９−２８，１９９５．参照）、ＭＭＴＶプロモーター、成長ホルモンプロモーター等が挙げられる。
ウイルス性プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（ＣＭＶ極初期プロモーター（例えば、米国特許第５１６８０６２号明細書、参照。）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来のプロモーター（例えば、ＨＩＶ長末端リピート等）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター（例えば、ＲＳＶ長末端リピート等） 、マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＳＶプロモーター（Ｌａｐ２プロモーター又はヘルペスチミジンキナーゼプロモーターなど（Ｗａｇｎｅｒ ｅ ｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ７８， １４４−１４５，１９８１．参照） 、ＳＶ４０又はエプスタイン バール ウイルス由来のプロモーター、アデノ随伴ウイルスプロモーター（例えば、ｐ５プロモーター等）等が挙げられる。
ハウスキーピング遺伝子プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子プロモーター、β-アクチン遺伝子プロモーター、β２−マイクログロブリン遺伝子プロモーター、ＨＰＲＴ １（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）遺伝子プロモーター等が挙げられる。
組織特異的プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、黒色腫細胞又はメラニン細胞の場合は、チロシナーゼプロモーター又はＴＲＰ２プロモーター；乳房細胞又は乳癌の場合は、ＭＭＴＶプロモーター又はＷＡＰプロモーター；腸細胞又は腸癌の場合は、ビリンプロモーター又はＦＡＢＰプロモーター；膵細胞の場合は、ＰＤＸプロモーター；膵ベータ細胞の場合は、ＲＩＰプロモーター；ケラチノサイトの場合は、ケラチンプロモーター；前立腺上皮の場合は、プロバシンプロモーター；中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞又は中枢神経系の癌の場合は、ネスチンプロモーター又はＧＦＡＰプロモーター；ニューロンの場合は、チロシンヒドロキシラーゼ、Ｓ１００プロモーター又は神経フィラメントプロモーター；Edlundら、Science, 230:912-916(1985)に記載される、膵臓特異的プロモーター；肺癌の場合は、クラーラ細胞分泌タンパク質プロモーター；心細胞の場合は、αミオシンプロモーター等が挙げられる。
・その他構成
本実施形態において、ｘｔｈＡ遺伝子は、該ｘｔｈＡ遺伝子の下流（３’側）に、ｍＲＮＡの３’末端のポリアデニル化に必要なポリアデニル化シグナルが作動可能に連結されていてもよい。ポリアデニル化シグナルとしては、上記ウイルス性プロモーターで例示されたウイルス由来、各種ヒト又は非ヒト動物由来の各遺伝子に含まれるポリアデニル化シグナル、例えば、ＳＶ４０の後期遺伝子又は初期遺伝子、ウサギβグロビン遺伝子、ウシ成長ホルモン遺伝子、ヒトＡ３アデノシン受容体遺伝子等のポリアデニル化シグナル等を挙げることができる。その他ｘｔｈＡ遺伝子をさらに高発現させるために、各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、イントロンの一部をプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間或いは翻訳領域の３’下流に連結してもよい。
本実施形態において、ｘｔｈＡ遺伝子は、該ｘｔｈＡ遺伝子の下流（３’側）に、ｍＲＮＡの３’末端のポリアデニル化に必要なポリアデニル化シグナルが作動可能に連結されていてもよい。ポリアデニル化シグナルとしては、上記ウイルス性プロモーターで例示されたウイルス由来、各種ヒト又は非ヒト動物由来の各遺伝子に含まれるポリアデニル化シグナル、例えば、ＳＶ４０の後期遺伝子又は初期遺伝子、ウサギβグロビン遺伝子、ウシ成長ホルモン遺伝子、ヒトＡ３アデノシン受容体遺伝子等のポリアデニル化シグナル等を挙げることができる。その他ｘｔｈＡ遺伝子をさらに高発現させるために、各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、イントロンの一部をプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間或いは翻訳領域の３’下流に連結してもよい。
本実施形態において、ｘｔｈＡ遺伝子は、該ｘｔｈＡ遺伝子の上流（５’側）又は下流（３’側）に、１つ又は複数の核局在化配列（ＮＬＳ）が作動可能に連結されていてもよい。
ＮＬＳとしては、例えば、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１）を有する、ＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ;ヌクレオプラスミン由来のＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２）を有するヌクレオプラスミンの二分ＮＬＳ);アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３）又はＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号４）を有するｃ−ｍｙｃ ＮＬＳ;配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号５）を有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ;インポーチン−アルファ由来のＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号６）;筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号７）及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号８）;ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号９）;マウスｃ−ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１０）;インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号１１）及びＰＫＱＫＫＲ（配列番号１２）;肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号１３）;マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号１４）;ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号１５）;ステロイドホルモンレセプター（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号１６）等が挙げられ、これらに限定されない。
本実施形態において、ｘｔｈＡ遺伝子は、該ｘｔｈＡ遺伝子の上流（５’側）又は下流（３’側）に、１つ又は複数の蛍光タンパク質等のマーカー遺伝子が作動可能に連結されていてもよい。蛍光タンパク質としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（Ｂｌｕｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＦＰ）、シアン蛍光蛋白質（Ｃｙａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、赤色蛍光蛋白質（Ｒｅｄ ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ）等が挙げられる。
（遺伝子導入方法）
ｘｔｈＡ遺伝子を含むベクターの細胞株への導入方法としては、公知の遺伝子導入手法（例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等）を用いることができる。
ｘｔｈＡ遺伝子を含むベクターの細胞株への導入方法としては、公知の遺伝子導入手法（例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等）を用いることができる。
（確認方法）
ｘｔｈＡ遺伝子が挿入されたか否かの確認方法としては、公知の方法を用いればよく、例えば、薬剤選択マーカー遺伝子をｘｔｈＡ遺伝子と共に挿入することにより、薬剤を含む培地にて、細胞株を培養し、生育可能な細胞を選択する方法を用いればよい。
ｘｔｈＡ遺伝子が挿入されたか否かの確認方法としては、公知の方法を用いればよく、例えば、薬剤選択マーカー遺伝子をｘｔｈＡ遺伝子と共に挿入することにより、薬剤を含む培地にて、細胞株を培養し、生育可能な細胞を選択する方法を用いればよい。
又は、上述の［第１の選択工程］においてｘｔｈＡ遺伝子の有無を評価する方法として例示された方法と同様の方法が挙げられる。
［欠損工程］
次いで、さらに、前記細胞株がｈｓｄＲ遺伝子を有する場合に、前記挿入工程の後、又は同時に、前記ｈｓｄＲ遺伝子の全部又は一部の機能を失わせることが好ましい。
次いで、さらに、前記細胞株がｈｓｄＲ遺伝子を有する場合に、前記挿入工程の後、又は同時に、前記ｈｓｄＲ遺伝子の全部又は一部の機能を失わせることが好ましい。
ｈｓｄＲ遺伝子の全部又は一部の機能を失わせる方法としては、ｈｓｄＲ遺伝子のノックアウト、ｈｓｄＲ遺伝子へのノックイン、又はｈｓｄＲ遺伝子のノックダウンを誘発する公知のゲノム編集技術を用いた方法であればよい。
ｈｓｄＲ遺伝子のノックアウト、又はｈｓｄＲ遺伝子へのノックインを誘発する公知のゲノム編集技術としては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム、ＴＡＬＥＮシステム、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼシステム等が挙げられ、これに限定されない。
また、ｈｓｄＲ遺伝子のノックダウンを誘発する公知のゲノム編集技術としては、例えば、ＲＮＡｉ誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）を用いる方法等が挙げられ、これに限定されない。
より具体的には、例えば、ｈｓｄＲ遺伝子、又は該ｈｓｄＲ遺伝子に相補的な配列を有する遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を設計及び合成し、これを、レトロウイルスベクターやアデノウイルスベクターに組み込んで細胞株に導入することによりＲＮＡｉを引き起こすことができる。
ｈｓｄＲ遺伝子のノックアウト、又はｈｓｄＲ遺伝子へのノックインを誘発する公知のゲノム編集技術としては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム、ＴＡＬＥＮシステム、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼシステム等が挙げられ、これに限定されない。
また、ｈｓｄＲ遺伝子のノックダウンを誘発する公知のゲノム編集技術としては、例えば、ＲＮＡｉ誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）を用いる方法等が挙げられ、これに限定されない。
より具体的には、例えば、ｈｓｄＲ遺伝子、又は該ｈｓｄＲ遺伝子に相補的な配列を有する遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を設計及び合成し、これを、レトロウイルスベクターやアデノウイルスベクターに組み込んで細胞株に導入することによりＲＮＡｉを引き起こすことができる。
一般に、「ノックダウン」とは、特定の遺伝子の発現量を抑制することを意味する。遺伝子の発現量の抑制は、例えば、遺伝子の転写量を減少させること、翻訳を阻害することなどにより、達成することができる。本実施形態の製造方法において、ノックダウン細胞株とは、該細胞株のｈｓｄＲ遺伝子の発現量が、野生型と比較して低下している細胞株をいう。
一般に、「ＲＮＡｉ」とは、ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ）が標的遺伝子に特異的かつ選択的に結合し、当該標的遺伝子を切断することによりその発現を効率よく阻害する現象である。例えば、ｄｓＲＮＡを細胞株に導入すると、そのＲＮＡと相同配列の遺伝子の発現が抑制（ノックダウン）される。
本実施形態において、ＲＮＡｉ誘導性核酸を用いた場合での細胞株の製造方法を、以下に詳細に説明する。
（ｓｉＲＮＡの設計）
まず、標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡを設計する。ｓｉＲＮＡは、ｈｓｄＲ遺伝子、又は該ｈｓｄＲ遺伝子に相補的な配列を有する遺伝子であれば特に限定されるものではなく、任意の領域を全て候補にすることが可能である。また、選択した領域から、ＡＡで始まる配列であって長さが１８塩基以上３０塩基以下のもの、或いは、ＡＡを５’側に加えたときの長さが１８塩基以上３０塩基以下、好ましくは１９塩基以上２３塩基以下の配列を選択する。その配列のＧＣ含量は、例えば３０％以上７０％以下となるものを選択すればよく、５０％前後が好ましい。また、そのＧＣ分布に偏りがないものを選択するとよい。ｓｉＲＮＡは、さらに、選択した配列の３’側にｄＴ又はＵの２残基のオーバーハングを加えるとよい。また、設計したｓｉＲＮＡの塩基配列に対応するアミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴサーチをおこない、選択した配列に類似した配列を有するタンパク質が存在しないことを確認することが好ましい。
まず、標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡを設計する。ｓｉＲＮＡは、ｈｓｄＲ遺伝子、又は該ｈｓｄＲ遺伝子に相補的な配列を有する遺伝子であれば特に限定されるものではなく、任意の領域を全て候補にすることが可能である。また、選択した領域から、ＡＡで始まる配列であって長さが１８塩基以上３０塩基以下のもの、或いは、ＡＡを５’側に加えたときの長さが１８塩基以上３０塩基以下、好ましくは１９塩基以上２３塩基以下の配列を選択する。その配列のＧＣ含量は、例えば３０％以上７０％以下となるものを選択すればよく、５０％前後が好ましい。また、そのＧＣ分布に偏りがないものを選択するとよい。ｓｉＲＮＡは、さらに、選択した配列の３’側にｄＴ又はＵの２残基のオーバーハングを加えるとよい。また、設計したｓｉＲＮＡの塩基配列に対応するアミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴサーチをおこない、選択した配列に類似した配列を有するタンパク質が存在しないことを確認することが好ましい。
さらに、数種類のｓｉＲＮＡを同時に細胞株に導入することにより、遺伝子の発現をより効果的に抑制できることがある。また、数種類のｓｉＲＮＡを同時に細胞株に導入することにより、２つ以上の標的遺伝子の発現を抑制することができる。
ｓｉＲＮＡ合成法としては、例えば、Ｄｉｃｅｒ法等が挙げられる。Ｄｉｃｅｒ法によるｓｉＲＮＡ合成法は、以下の通りである。まず、ｈｓｄＲ遺伝子、又は該ｈｓｄＲ遺伝子に相補的な配列を有する遺伝子の塩基配列のスタートコドンから５００ｂｐ以上１ｋｂｐ以下の遺伝子配列をベクター等に組み込み、その遺伝子配列のセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡを転写させた後、アニーリングしてｄｓＲＮＡを作製する。次に、ＲＮａｓｅＩＩＩファミリーに属するＤｉｃｅｒ Ｅｎｚｙｍｅにより、このｄｓ−ＲＮＡを３’末端側に２塩基の突出末端をもつ２１塩基以上２３塩基以下のｓｉＲＮＡにプロセッシングさせることで、合成することができる。
また、ｓｉＲＮＡの代わりに、ｓｈＲＮＡを使用することもできる。ｓｈＲＮＡ とは、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）と呼ばれ、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有するＲＮＡ分子である。このステムループ構造を有するＲＮＡ分子は生体内のＤｉｃｅｒ等によりプロセッシングを受け、ｓｉＲＮＡが産生される。
ｓｈＲＮＡは、その一部がステムループ構造を形成するように設計することができる。例えば、ある領域の配列を「配列Ａ」とし、配列Ａに対する相補鎖を「配列Ｂ」とすると、配列Ａ、スペーサー、配列Ｂの順になるようにこれらの配列が一本のＲＮＡ鎖に存在するようにし、全体で４２塩基以上１２０塩基以下の長さとなるように設計する。配列Ａは、標的となるｈｓｄＲ遺伝子、又は該ｈｓｄＲ遺伝子に相補的な配列を有する遺伝子の一部の領域の塩基配列であり、標的領域は特に限定されるものではなく、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列Ａの長さは１８塩基以上５０塩基以下、好ましくは２１塩基以上３０塩基以下である。
また、ｓｉＲＮＡの代わりに、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を利用することもできる。ｍｉＲＮＡは小分子ＲＮＡであり、自身と相補的な配列をもつｍＲＮＡからのタンパク質への翻訳を阻害することにより、特定の遺伝子の発現を抑制することができる。
ｍｉＲＮＡは、特定の遺伝子のｍＲＮＡを認識するように設計することができる。そのように設計するｍｉＲＮＡの塩基配列の長さは、例えば、１８塩基以上２５塩基以下（例えば、約２２塩基）である。
（ｓｉＲＮＡの導入）
続いて、細胞株の細胞内に、設計したｓｉＲＮＡを導入する。導入方法としては、公知の遺伝子導入手法（例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等）等が挙げられる。
続いて、細胞株の細胞内に、設計したｓｉＲＮＡを導入する。導入方法としては、公知の遺伝子導入手法（例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等）等が挙げられる。
ｓｉＲＮＡの代わりに、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターを導入してもよい。ベクターとしては、発現ベクターが好ましい。発現ベクターとしては、上述の［挿入工程］において例示されたものと同様のものが挙げられる。
ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡは、さらに、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡの５’末端又は３’末端に、上述のプロモーター、ポリアデニル化シグナル、ＮＬＳ、蛍光タンパク質のマーカー遺伝子等が作動可能に連結されていてもよい。
ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡは、さらに、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡの５’末端又は３’末端に、上述のプロモーター、ポリアデニル化シグナル、ＮＬＳ、蛍光タンパク質のマーカー遺伝子等が作動可能に連結されていてもよい。
ｈｓｄＲ遺伝子の機能の全部又は一部の機能が失われたか否かの確認方法としては、上述の［挿入工程］において例示された方法と同様の方法が挙げられる。
＜＜細胞株＞＞
一実施形態において、本発明は、ｘｔｈＡ遺伝子を有し、ｈｓｄＲ遺伝子の全部又は一部の機能が失われた細胞株を提供する。
一実施形態において、本発明は、ｘｔｈＡ遺伝子を有し、ｈｓｄＲ遺伝子の全部又は一部の機能が失われた細胞株を提供する。
本実施形態の細胞株は、ｘｔｈＡ遺伝子を有するため、上述の＜＜インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法＞＞において説明した通り、高効率で相同組換えが行われ、目的の二本鎖ＤＮＡが挿入されたベクターを得ることができ、高効率でインビボクローニングを行うことができる。
また、本実施形態の細胞株は、ｈｓｄＲ遺伝子の全部又は一部の機能が失われているため、上述の＜＜インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法＞＞において説明した通り、外来ＤＮＡである目的の二本鎖ＤＮＡ及びベクターが、制限−修飾システムによる切断を受けず、高効率で相同組換えが行われ、目的の二本鎖ＤＮＡが挿入されたベクターを得ることができ、高効率でインビボクローニングを行うことができる。
また、本実施形態の細胞株は、ｈｓｄＲ遺伝子の全部又は一部の機能が失われているため、上述の＜＜インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法＞＞において説明した通り、外来ＤＮＡである目的の二本鎖ＤＮＡ及びベクターが、制限−修飾システムによる切断を受けず、高効率で相同組換えが行われ、目的の二本鎖ＤＮＡが挿入されたベクターを得ることができ、高効率でインビボクローニングを行うことができる。
本実施形態の細胞株としては、通常、宿主細胞としてＤＮＡクローニング系及びタンパク質発現系として用いられるものであればよく、その由来となる生物種は限定されない。細胞株の由来となる生物種としては、上述の＜＜インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、細胞株の由来となる生物種としては、取扱いの容易さから、大腸菌又は哺乳動物細胞であることが好ましく、大腸菌であることがより好ましい。
＜＜インビボクローニング方法＞＞
一実施形態において、本発明は、上述のスクリーニング方法、又は上述の製造方法を用いて、インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニング、又は製造した後、得られた細胞株に、発現ベクターと、５’末端領域及び３’末端領域に前記発現ベクター上の挿入を行う部位と相同な塩基配列を有する目的の二本鎖ＤＮＡとを導入する導入工程と、前記導入工程後、前記細胞株を培養し、前記目的の二本鎖ＤＮＡを相同組換えにより前記発現ベクターに挿入する挿入工程と、を備えるインビボクローニング方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、上述のスクリーニング方法、又は上述の製造方法を用いて、インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニング、又は製造した後、得られた細胞株に、発現ベクターと、５’末端領域及び３’末端領域に前記発現ベクター上の挿入を行う部位と相同な塩基配列を有する目的の二本鎖ＤＮＡとを導入する導入工程と、前記導入工程後、前記細胞株を培養し、前記目的の二本鎖ＤＮＡを相同組換えにより前記発現ベクターに挿入する挿入工程と、を備えるインビボクローニング方法を提供する。
本実施形態のインビボクローニング方法によれば、高効率でインビボクローニングを行うことができ、目的の二本鎖ＤＮＡ又は該ＤＮＡの遺伝子産物を高収率で得ることができる。
なお、本明細書において、「遺伝子産物」とは、目的の遺伝子から転写されるｍＲＮＡ、及び該ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質を意味する。
なお、本明細書において、「遺伝子産物」とは、目的の遺伝子から転写されるｍＲＮＡ、及び該ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質を意味する。
本実施形態のインビボクローニング方法において用いられる細胞株は、上述のスクリーニング方法、又は上述の製造方法で得られたインビボクローニング可能な細胞株であって、ｘｔｈＡ遺伝子を有する。また、前記細胞株は、ｈｓｄＲ遺伝子の全部又は一部の機能が失われていてもよい。また、前記細胞株の由来となる生物種は限定されない。細胞株の由来となる生物種としては、上述の＜＜インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、細胞株の由来となる生物種としては、取扱いの容易さから、大腸菌又は哺乳動物細胞であることが好ましく、大腸菌であることがより好ましい。
本実施形態のインビボクローニング方法において用いられる細胞株は、導入工程で用いられるのに適した細胞数となるように、予め培養しておけばよい。
本実施形態のインビボクローニング方法について、以下に詳細に説明する。
本実施形態のインビボクローニング方法において用いられる細胞株は、導入工程で用いられるのに適した細胞数となるように、予め培養しておけばよい。
本実施形態のインビボクローニング方法について、以下に詳細に説明する。
［導入工程］
まず、上述のスクリーニング方法、又は上述の製造方法で得られた細胞株に、発現ベクターと、５’末端領域及び３’末端領域に前記発現ベクター上の挿入を行う部位と相同な塩基配列を有する目的の二本鎖ＤＮＡとを導入する。
まず、上述のスクリーニング方法、又は上述の製造方法で得られた細胞株に、発現ベクターと、５’末端領域及び３’末端領域に前記発現ベクター上の挿入を行う部位と相同な塩基配列を有する目的の二本鎖ＤＮＡとを導入する。
導入工程において用いられる発現ベクターとしては、特別な限定はなく、上述の＜＜インビボクローニング可能な細胞株の製造方法＞＞の［挿入工程］において例示されたものと同様のものが挙げられる。
発現ベクターは、タグ配列、プロモーター配列、転写終結配列、薬剤選択マーカー遺伝子、及びそれらの組み合わせを含んでいてもよい。ここで、タグの中には、蛍光タグ（ＧＦＰなど）、アフィニティータグ、デグロンタグ、局在タグ等が挙げられる。
タグ配列、プロモーター配列、転写終結配列、及び薬剤選択マーカー遺伝子としては、上述の＜＜インビボクローニング可能な細胞株の製造方法＞＞の［挿入工程］において例示されたものと同様のものが挙げられる。
発現ベクターは、タグ配列、プロモーター配列、転写終結配列、薬剤選択マーカー遺伝子、及びそれらの組み合わせを含んでいてもよい。ここで、タグの中には、蛍光タグ（ＧＦＰなど）、アフィニティータグ、デグロンタグ、局在タグ等が挙げられる。
タグ配列、プロモーター配列、転写終結配列、及び薬剤選択マーカー遺伝子としては、上述の＜＜インビボクローニング可能な細胞株の製造方法＞＞の［挿入工程］において例示されたものと同様のものが挙げられる。
導入工程において用いられる目的の二本鎖ＤＮＡは、５’末端領域及び３’末端領域に発現ベクター上の挿入を行う部位と相同な塩基配列を有し、該相同な塩基配列の長さは、例えば１０ｂｐ以上３０ｂｐ以下であればよく、例えば１５ｂｐ以上２５ｂｐ以下であればよい。
また、目的の二本鎖ＤＮＡは、タグ配列、プロモーター配列、転写終結配列、及び薬剤選択マーカー遺伝子、及びそれらの組み合わせを含んでいてもよい。ここで、タグの中には、蛍光タグ（ＧＦＰなど）、アフィニティータグ、デグロンタグ、局在タグ等が挙げられる。
タグ配列、プロモーター配列、転写終結配列、及び薬剤選択マーカー遺伝子としては、上述の＜＜インビボクローニング可能な細胞株の製造方法＞＞の［挿入工程］において例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、目的の二本鎖ＤＮＡは、タグ配列、プロモーター配列、転写終結配列、及び薬剤選択マーカー遺伝子、及びそれらの組み合わせを含んでいてもよい。ここで、タグの中には、蛍光タグ（ＧＦＰなど）、アフィニティータグ、デグロンタグ、局在タグ等が挙げられる。
タグ配列、プロモーター配列、転写終結配列、及び薬剤選択マーカー遺伝子としては、上述の＜＜インビボクローニング可能な細胞株の製造方法＞＞の［挿入工程］において例示されたものと同様のものが挙げられる。
発現ベクターと、５’末端領域及び３’末端領域に前記発現ベクター上の挿入を行う部位と相同な塩基配列を有する外来ＤＮＡとの細胞株への導入方法としては、公知の遺伝子導入手法（例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等）等が挙げられる。
［挿入工程］
次いで、導入工程後の細胞株を培養し、目的の二本鎖ＤＮＡを相同組換えにより発現ベクターに挿入する。
次いで、導入工程後の細胞株を培養し、目的の二本鎖ＤＮＡを相同組換えにより発現ベクターに挿入する。
細胞株の培養条件としては、培養する細胞の種類により適宜選択することができる。
培養温度としては、例えば２５℃以上４０℃以下であってもよく、例えば３０℃以上３９℃以下であってもよく、例えば３５℃以上３９℃以下であってもよい。
また、培養環境は、例えば約５％のＣＯ２条件下であってもよい。
培養時間としては、細胞の種類、細胞数等により適宜選択することができ、例えば１日以上１５日以下であってもよく、例えば１日以上１０日以下であってもよく、例えば１日以上７日以下であってもよい。
培養温度としては、例えば２５℃以上４０℃以下であってもよく、例えば３０℃以上３９℃以下であってもよく、例えば３５℃以上３９℃以下であってもよい。
また、培養環境は、例えば約５％のＣＯ２条件下であってもよい。
培養時間としては、細胞の種類、細胞数等により適宜選択することができ、例えば１日以上１５日以下であってもよく、例えば１日以上１０日以下であってもよく、例えば１日以上７日以下であってもよい。
また、使用する細胞培養用培地としては、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）等を含む基本培地であればよく、細胞の種類により適宜選択することができる。前記細胞培養用培地としては、例えば、ＬＢ培地、大腸菌用最少培地（Ｄａｖｉｓ培地）、大腸菌用最少塩培地（ＭＳ）等の大腸菌培養用培地；枯草菌用最少培地（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ最少培地）、枯草菌用最少塩培地、枯草菌形質転換用培地Ｉ、枯草菌形質転換用培地ＩＩ等の枯草菌培養用培地；酵母用最少培地（ＹＰＤ培地）、酵母用完全培地（ＹＰＡＤ培地）等の酵母培養用培地；ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇの培地（ＭＳ培地）、Ｂ５培地、ハイポネックス培地等の植物培養用培地；グレース昆虫培地、シュナイダー昆虫培地等の昆虫細胞培養用培地；ＤＭＥＭ、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）等の動物細胞培養用培地等が挙げられ、これらに限定されない。
上述の＜＜インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法＞＞において説明した通り、図１に示したメカニズムにより、細胞内において、目的の二本鎖ＤＮＡと発現ベクターとで高効率で相同組換えが行われ、目的の二本鎖ＤＮＡが挿入されたベクターが形成される。次いで、目的の二本鎖ＤＮＡが挿入されたベクターが細胞内でクローニングされて、目的の二本鎖ＤＮＡ又は該ＤＮＡの遺伝子産物を高収率で得ることができる。
［確認工程］
さらに、挿入工程の後に、目的の二本鎖ＤＮＡが挿入されたベクターが形成されているか否かを確認する確認工程を有していてもよい。
確認工程において、目的の二本鎖ＤＮＡが挿入されたベクターが形成されているか否かを確認する方法としては、公知の方法を用いればよく、例えば、薬剤選択マーカー遺伝子を目的の二本鎖ＤＮＡと共に挿入することにより、薬剤を含む培地にて、細胞株を培養し、生育可能な細胞を選択する方法を用いればよい。
前記薬剤選択マーカー遺伝子としては、上述の＜＜インビボクローニング可能な細胞株の製造方法＞＞の［挿入工程］において例示されたものと同様のものが挙げられる。発現ベクターにおいても薬剤選択マーカー遺伝子を有する場合は、目的の二本鎖ＤＮＡと共に挿入される薬剤選択マーカー遺伝子と、発現ベクターが有する薬剤選択マーカー遺伝子とは異なる種類のものであることが好ましい。
さらに、挿入工程の後に、目的の二本鎖ＤＮＡが挿入されたベクターが形成されているか否かを確認する確認工程を有していてもよい。
確認工程において、目的の二本鎖ＤＮＡが挿入されたベクターが形成されているか否かを確認する方法としては、公知の方法を用いればよく、例えば、薬剤選択マーカー遺伝子を目的の二本鎖ＤＮＡと共に挿入することにより、薬剤を含む培地にて、細胞株を培養し、生育可能な細胞を選択する方法を用いればよい。
前記薬剤選択マーカー遺伝子としては、上述の＜＜インビボクローニング可能な細胞株の製造方法＞＞の［挿入工程］において例示されたものと同様のものが挙げられる。発現ベクターにおいても薬剤選択マーカー遺伝子を有する場合は、目的の二本鎖ＤＮＡと共に挿入される薬剤選択マーカー遺伝子と、発現ベクターが有する薬剤選択マーカー遺伝子とは異なる種類のものであることが好ましい。
又は、目的の二本鎖ＤＮＡが挿入されたベクターが形成されているか否かを確認する方法としては、例えば、上述の＜＜インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法＞＞の［第１の選択工程］においてｘｔｈＡ遺伝子の有無を評価する方法として例示された方法と同様の方法が挙げられる。
＜＜キット＞＞
一実施形態において、本発明は、インビボクローニングを行うためのキットであって、ｘｔｈＡ遺伝子を有し、ｈｓｄＲ遺伝子の全部又は一部の機能が失われた細胞株を備えるキットを提供する。
一実施形態において、本発明は、インビボクローニングを行うためのキットであって、ｘｔｈＡ遺伝子を有し、ｈｓｄＲ遺伝子の全部又は一部の機能が失われた細胞株を備えるキットを提供する。
本実施形態のキットによれば、高効率でインビボクローニングを行うことができ、目的の二本鎖ＤＮＡ又は該ＤＮＡの遺伝子産物を高収率で得ることができる。
本実施形態のキットに備えられた細胞株としては、ｘｔｈＡ遺伝子を有し、ｈｓｄＲ遺伝子の全部又は一部の機能が失われた細胞株であって、通常、宿主細胞としてＤＮＡクローニング系及びタンパク質発現系として用いられるものであればよく、その由来となる生物種は限定されない。細胞株の由来となる生物種としては、上述の＜＜インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、細胞株の由来となる生物種としては、取扱いの容易さから、大腸菌又は哺乳動物細胞であることが好ましく、大腸菌であることがより好ましい。
本実施形態のキットは、さらに、発現ベクターを備えていてもよい。
本実施形態のキットに備えられた発現ベクターとしては、特別な限定はなく、上述の＜＜インビボクローニング可能な細胞株の製造方法＞＞の［挿入工程］において例示されたものと同様のものが挙げられる。
発現ベクターは、タグ配列、プロモーター配列、転写終結配列、薬剤選択マーカー遺伝子、及びそれらの組み合わせを含んでいてもよい。ここで、タグの中には、蛍光タグ（ＧＦＰなど）、アフィニティータグ、デグロンタグ、局在タグ等が挙げられる。
タグ配列、プロモーター配列、転写終結配列、及び薬剤選択マーカー遺伝子としては、上述の＜＜インビボクローニング可能な細胞株の製造方法＞＞の［挿入工程］において例示されたものと同様のものが挙げられる。
本実施形態のキットに備えられた発現ベクターとしては、特別な限定はなく、上述の＜＜インビボクローニング可能な細胞株の製造方法＞＞の［挿入工程］において例示されたものと同様のものが挙げられる。
発現ベクターは、タグ配列、プロモーター配列、転写終結配列、薬剤選択マーカー遺伝子、及びそれらの組み合わせを含んでいてもよい。ここで、タグの中には、蛍光タグ（ＧＦＰなど）、アフィニティータグ、デグロンタグ、局在タグ等が挙げられる。
タグ配列、プロモーター配列、転写終結配列、及び薬剤選択マーカー遺伝子としては、上述の＜＜インビボクローニング可能な細胞株の製造方法＞＞の［挿入工程］において例示されたものと同様のものが挙げられる。
本実施形態のキットは、５’末端領域及び３’末端領域に前記発現ベクター上の挿入を行う部位と相同な塩基配列を有する目的の二本鎖ＤＮＡを準備することで、目的の二本鎖ＤＮＡを容易かつ高効率でインビボクローニングすることができる。
本実施形態のキットは、さらに、細胞株を培養するための細胞培養用培地を備えていてもよい。細胞培養用培地としては、キットに備えられた細胞株の種類に応じて、適宜選択することができ、上述の＜＜インビボクローニング方法＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、本実施形態のキットは、さらに、目的の二本鎖ＤＮＡ及び発現ベクターを細胞株へ導入するためのトランスフェクション試薬を備えていてもよい。トランスフェクション試薬としては、例えば、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬及びリン酸カルシウムからなる群より選択される。このようなトランスフェクション試薬としては、例えば、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ｃａｔ．ｎｏ．３０１４２５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２４３１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）、ＴｆｘＴＭ−２０ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２３９１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１３０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）、ＰｏｌｙＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１１０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（１１６６８−０１９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＣＡ）、ＪｅｔＰＥＩ（×４）ｃｏｎｃ．（１０１−３０，Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｘＧｅｎ ５００（Ｒ０５１１，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｉｎｃ．，ＭＤ）等が挙げられ、それらに限定されない。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］インビボクローニング可能な大腸菌株の探索
（１）インサートＤＮＡ及びベクターの作製
インサートＤＮＡとして、ｐＡＣＹＣ１８４由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子を有し、かつ５’末端側及び３’ 末端側それぞれにベクターに対して相同な配列（２０ｂｐ）を有するＤＮＡ（９９２ｂｐ）を用いた（インサートＤＮＡの塩基配列を配列番号１７に示した）。
また、ベクターとして、アンピシリン耐性遺伝子を有するｐＵＣ１９ベクター（２．６ｋｂ）を用いた（ｐＵＣ１９ベクターの塩基配列を配列番号１８に示した）。
まず、インサートＤＮＡ及びベクターを以下の表１に示すＰＣＲでの増幅用プライマーの塩基配列を用いて、ＰＣＲを行い、反応液を得た。
ＰＣＲ反応後のインサートＤＮＡのＰＣＲ反応液１μＬあたりのＤＮＡ量は１００ｎｇ（０．１５ｐｍｏｌ）であり、ベクターＤＮＡのＰＣＲ反応液１μＬあたりのＤＮＡ量は８０ｎｇ（０．０５ｐｍｏｌ）であった。このＰＣＲ反応液各１μＬを、精製せずにそのまま形質転換に用いた。
（１）インサートＤＮＡ及びベクターの作製
インサートＤＮＡとして、ｐＡＣＹＣ１８４由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子を有し、かつ５’末端側及び３’ 末端側それぞれにベクターに対して相同な配列（２０ｂｐ）を有するＤＮＡ（９９２ｂｐ）を用いた（インサートＤＮＡの塩基配列を配列番号１７に示した）。
また、ベクターとして、アンピシリン耐性遺伝子を有するｐＵＣ１９ベクター（２．６ｋｂ）を用いた（ｐＵＣ１９ベクターの塩基配列を配列番号１８に示した）。
まず、インサートＤＮＡ及びベクターを以下の表１に示すＰＣＲでの増幅用プライマーの塩基配列を用いて、ＰＣＲを行い、反応液を得た。
ＰＣＲ反応後のインサートＤＮＡのＰＣＲ反応液１μＬあたりのＤＮＡ量は１００ｎｇ（０．１５ｐｍｏｌ）であり、ベクターＤＮＡのＰＣＲ反応液１μＬあたりのＤＮＡ量は８０ｎｇ（０．０５ｐｍｏｌ）であった。このＰＣＲ反応液各１μＬを、精製せずにそのまま形質転換に用いた。
（２）大腸菌株の培養
次いで、ＢＷ２５１１３株、ＭＧ１６５５株、及びＷ３１１０株を、ＬＢ培地３ｍＬに植菌し、３７℃で１６時間培養し、形質転換に用いるために菌数を増やした。
次いで、ＢＷ２５１１３株、ＭＧ１６５５株、及びＷ３１１０株を、ＬＢ培地３ｍＬに植菌し、３７℃で１６時間培養し、形質転換に用いるために菌数を増やした。
（３）ｈｓｄＲ遺伝子ノックアウト大腸菌株の作製
次いで、Ｋｅｉｏ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（参考文献：Baba et al., (2006) Molecular Systems Biology, doi:10.1038/msb4100050）のΔｈｓｄＲ：：ｋａｎ株の染色体ＤＮＡを鋳型として、以下表２に示すプライマーを用いてΔｈｓｄＲ：：ｋａｎ領域を増幅した。次いで、得られたＰＣＲ産物を用いて、λＲｅｄレコンビナーゼを利用した方法（参考文献：Datsenko and Wanner, “One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products”, PNAS, vol.97, no.12, p6640-6645, 2000.）により、大腸菌ＭＧ１６５５株及びＷ３１１０株に導入し、ｈｓｄＲ遺伝子をノックアウトした。次いで、ＬＢ培地３ｍＬに各大腸菌株を植菌し、３７℃で１６時間培養し、形質転換に用いるために菌数を増やした。
次いで、Ｋｅｉｏ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（参考文献：Baba et al., (2006) Molecular Systems Biology, doi:10.1038/msb4100050）のΔｈｓｄＲ：：ｋａｎ株の染色体ＤＮＡを鋳型として、以下表２に示すプライマーを用いてΔｈｓｄＲ：：ｋａｎ領域を増幅した。次いで、得られたＰＣＲ産物を用いて、λＲｅｄレコンビナーゼを利用した方法（参考文献：Datsenko and Wanner, “One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products”, PNAS, vol.97, no.12, p6640-6645, 2000.）により、大腸菌ＭＧ１６５５株及びＷ３１１０株に導入し、ｈｓｄＲ遺伝子をノックアウトした。次いで、ＬＢ培地３ｍＬに各大腸菌株を植菌し、３７℃で１６時間培養し、形質転換に用いるために菌数を増やした。
（４）大腸菌株へのインサートＤＮＡ及びベクターの導入（大腸菌株の形質転換）
次いで、（２）で培養したＢＷ２５１１３株、ＭＧ１６５５株、及びＷ３１１０株、並びに、（３）でｈｓｄＲ遺伝子をノックアウトしたＭＧ１６５５株、及びＷ３１１０株を含む培養液をそれぞれ１ｍＬずつ、３７℃に温めておいたＬＢ培地６０ｍＬに植菌し、３７℃で９０分培養した（通常、ＯＤ６００＝０．４〜０．５程度の菌濃度であった）。
次いで、培養を止めて、培養液をそれぞれ氷中で冷やした。また、以降の操作は全て氷中の冷やした状態で行った。次いで、５，０００ｇ、４℃で５分間遠心し、上清を捨てた。次いで、各大腸菌株のペレットを氷冷したＬＢ培地２ｍＬずつに懸濁した。次いで、氷冷した以下の表２に示す組成の２×ＴＳＳ溶液を１．６ｍＬずつ加えて混ぜた。
次いで、（２）で培養したＢＷ２５１１３株、ＭＧ１６５５株、及びＷ３１１０株、並びに、（３）でｈｓｄＲ遺伝子をノックアウトしたＭＧ１６５５株、及びＷ３１１０株を含む培養液をそれぞれ１ｍＬずつ、３７℃に温めておいたＬＢ培地６０ｍＬに植菌し、３７℃で９０分培養した（通常、ＯＤ６００＝０．４〜０．５程度の菌濃度であった）。
次いで、培養を止めて、培養液をそれぞれ氷中で冷やした。また、以降の操作は全て氷中の冷やした状態で行った。次いで、５，０００ｇ、４℃で５分間遠心し、上清を捨てた。次いで、各大腸菌株のペレットを氷冷したＬＢ培地２ｍＬずつに懸濁した。次いで、氷冷した以下の表２に示す組成の２×ＴＳＳ溶液を１．６ｍＬずつ加えて混ぜた。
使用前によく混ぜた。
次いで、室温のＤＭＳＯを０．４ｍＬずつ加えて、混ぜた。次いで、各大腸菌株を含む溶液を０．１ｍＬずつ氷上で分注し、液体窒素で凍結後、−８０℃で保存した。次いで、凍結した各大腸菌株を氷上で溶かし、（１）で作製したインサートＤＮＡ及びベクターのＰＣＲ反応液各１μＬずつを、各大腸菌株を含む溶液に加え、優しくピペッティングして混ぜた。次いで、氷上で３０分間静置した。次いで、ＬＢ培地を各１ｍＬずつ加えて、３７℃で４５分間培養した。次いで、５，０００ｇ、４℃で５分間遠心し、培地の大半を捨て、培地を１００μＬ程度残した。次いで、各大腸菌株のペレットを懸濁し、クロラムフェニコール及びアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗り拡げた。次いで、大腸菌を植菌したＬＢ寒天培地を３７℃で１６時間培養し、１枚のＬＢ寒天培地プレートに出現したコロニー数を計測した。結果を図２に示す。図２において、「ＭＧ１６５５ΔｈｓｄＲ：：ｋａｎ」とは、ｈｓｄＲ遺伝子がノックアウトされたＭＧ１６５５株を示し、「Ｗ３１１０ΔｈｓｄＲ：：ｋａｎ」とは、ｈｓｄＲ遺伝子がノックアウトされたＷ３１１０株を示す。
図２から、ＢＷ２５１１３株、ＭＧ１６５５株、及びＷ３１１０株の中では、ＢＷ２５１１３株のコロニー数が多かった。ＢＷ２５１１３株では、ｈｓｄＲ遺伝子に変異が入っており、機能が失われていることが知られている。よって、ＢＷ２５１１３株では、ｈｓｄＲ遺伝子のコードする制限酵素によるインサートＤＮＡ及びベクターの切断が起こらず、インサートＤＮＡがベクターに挿入され、クロラムフェニコール耐性遺伝子及びアンピシリン耐性遺伝子が発現したため、生育することができたためであると推察された。
また、ｈｓｄＲ遺伝子がノックアウトされたＭＧ１６５５株及びＷ３１１０株は、野生型のＭＧ１６５５株及びＷ３１１０株と比較して、コロニー数が有意に増加していた。これは、ｈｓｄＲ遺伝子をノックアウトすることで、ｈｓｄＲ遺伝子のコードする制限酵素によるインサートＤＮＡ及びベクターの切断が起こらず、インサートＤＮＡがベクターに挿入され、クロラムフェニコール耐性遺伝子及びアンピシリン耐性遺伝子が発現したため、生育することができたためであると推察された。
また、ｈｓｄＲ遺伝子がノックアウトされたＭＧ１６５５株及びＷ３１１０株は、野生型のＭＧ１６５５株及びＷ３１１０株と比較して、コロニー数が有意に増加していた。これは、ｈｓｄＲ遺伝子をノックアウトすることで、ｈｓｄＲ遺伝子のコードする制限酵素によるインサートＤＮＡ及びベクターの切断が起こらず、インサートＤＮＡがベクターに挿入され、クロラムフェニコール耐性遺伝子及びアンピシリン耐性遺伝子が発現したため、生育することができたためであると推察された。
［実施例２］ＢＷ２５１１３株でのインビボクローニングのメカニズムの解明
（１）インサートＤＮＡ及びベクターの作製
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、インサートＤＮＡ及びベクターを作製し、ＰＣＲ反応液各１μＬを、精製せずにそのまま形質転換に用いた。
（１）インサートＤＮＡ及びベクターの作製
実施例１の（１）と同様の方法を用いて、インサートＤＮＡ及びベクターを作製し、ＰＣＲ反応液各１μＬを、精製せずにそのまま形質転換に用いた。
（２）大腸菌株の培養
次いで、ＢＷ２５１１３株を、ＬＢ培地３ｍＬに植菌し、３７℃で１６時間培養し、形質転換に用いるために菌数を増やした。
次いで、ＢＷ２５１１３株を、ＬＢ培地３ｍＬに植菌し、３７℃で１６時間培養し、形質転換に用いるために菌数を増やした。
（３）各種遺伝子ノックアウト大腸菌株の作製
次いで、ＢＷ２５１１３ ΔｘｔｈＡ：：ｋａｎ株、ΔｒｅｃＥ：：ｋａｎ株、ΔｒｅｃＴ：：ｋａｎ株は、Ｋｅｉｏ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（参考文献：Baba et al., (2006) Molecular Systems Biology, doi:10.1038/msb4100050）を用いた。
ＢＷ２５１１３ ΔｒｅｃＥＴ：：ｋａｎ株の作製は、まず以下表４に示すプライマーを用いて、プラスミド ｐＫＤ４（参考文献：Datsenko and Wanner, “One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products”, PNAS, vol.97, no.12, p6640-6645, 2000.）のｋａｎ遺伝子領域を増幅した。次いで、得られたＰＣＲ産物を用いて、実施例１の（３）と同様の方法を用いて、ＢＷ２５１１３株へ導入した。次いで、ＬＢ培地３ｍＬに各大腸菌株を植菌し、３７℃で１６時間培養し、形質転換に用いるために菌数を増やした。
次いで、ＢＷ２５１１３ ΔｘｔｈＡ：：ｋａｎ株、ΔｒｅｃＥ：：ｋａｎ株、ΔｒｅｃＴ：：ｋａｎ株は、Ｋｅｉｏ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（参考文献：Baba et al., (2006) Molecular Systems Biology, doi:10.1038/msb4100050）を用いた。
ＢＷ２５１１３ ΔｒｅｃＥＴ：：ｋａｎ株の作製は、まず以下表４に示すプライマーを用いて、プラスミド ｐＫＤ４（参考文献：Datsenko and Wanner, “One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products”, PNAS, vol.97, no.12, p6640-6645, 2000.）のｋａｎ遺伝子領域を増幅した。次いで、得られたＰＣＲ産物を用いて、実施例１の（３）と同様の方法を用いて、ＢＷ２５１１３株へ導入した。次いで、ＬＢ培地３ｍＬに各大腸菌株を植菌し、３７℃で１６時間培養し、形質転換に用いるために菌数を増やした。
（４）大腸菌株へのインサートＤＮＡ及びベクターの導入（大腸菌株の形質転換）
次いで、（２）で培養したＢＷ２５１１３株、ＭＧ１６５５株、及びＷ３１１０株、並びに、（３）でｈｓｄＲ遺伝子をノックアウトしたＭＧ１６５５株、及びＷ３１１０株の代わりに、（２）で培養したＢＷ２５１１３株、並びに、（３）でｒｅｃＥ遺伝子、ｒｅｃＴ遺伝子、ｒｅｃＥ遺伝子及びｒｅｃＴ遺伝子、又はｘｔｈＡ遺伝子をノックアウトしたＢＷ２５１１３株を用いた以外は実施例１の（４）と同様の方法を用いて、（１）で作製したインサートＤＮＡ及びベクターを各大腸菌株に導入し、形質転換を行い、クロラムフェニコール及びアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗り拡げた。次いで、大腸菌を植菌したＬＢ寒天培地を３７℃で１６時間培養し、１枚のＬＢ寒天培地プレートに出現したコロニー数を計測した。結果を図３及び４に示す。
図３において、「ＢＷ２５１１３ΔｒｅｃＥ：：ｋａｎ」とは、ｒｅｃＥ遺伝子がノックアウトされたＢＷ２５１１３株を示し、「ＢＷ２５１１３ΔｒｅｃＴ：：ｋａｎ」とは、ｒｅｃＴ遺伝子がノックアウトされたＢＷ２５１１３株を示し、「ＢＷ２５１１３ΔｒｅｃＥＴ：：ｋａｎ」とは、ｒｅｃＥ遺伝子及びｒｅｃＴ遺伝子がノックアウトされたＢＷ２５１１３株を示す。
また、図４において、「ＢＷ２５１１３ΔｘｔｈＡ：：ｋａｎ」とは、ｘｔｈＡ遺伝子がノックアウトされたＢＷ２５１１３株を示す。
次いで、（２）で培養したＢＷ２５１１３株、ＭＧ１６５５株、及びＷ３１１０株、並びに、（３）でｈｓｄＲ遺伝子をノックアウトしたＭＧ１６５５株、及びＷ３１１０株の代わりに、（２）で培養したＢＷ２５１１３株、並びに、（３）でｒｅｃＥ遺伝子、ｒｅｃＴ遺伝子、ｒｅｃＥ遺伝子及びｒｅｃＴ遺伝子、又はｘｔｈＡ遺伝子をノックアウトしたＢＷ２５１１３株を用いた以外は実施例１の（４）と同様の方法を用いて、（１）で作製したインサートＤＮＡ及びベクターを各大腸菌株に導入し、形質転換を行い、クロラムフェニコール及びアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗り拡げた。次いで、大腸菌を植菌したＬＢ寒天培地を３７℃で１６時間培養し、１枚のＬＢ寒天培地プレートに出現したコロニー数を計測した。結果を図３及び４に示す。
図３において、「ＢＷ２５１１３ΔｒｅｃＥ：：ｋａｎ」とは、ｒｅｃＥ遺伝子がノックアウトされたＢＷ２５１１３株を示し、「ＢＷ２５１１３ΔｒｅｃＴ：：ｋａｎ」とは、ｒｅｃＴ遺伝子がノックアウトされたＢＷ２５１１３株を示し、「ＢＷ２５１１３ΔｒｅｃＥＴ：：ｋａｎ」とは、ｒｅｃＥ遺伝子及びｒｅｃＴ遺伝子がノックアウトされたＢＷ２５１１３株を示す。
また、図４において、「ＢＷ２５１１３ΔｘｔｈＡ：：ｋａｎ」とは、ｘｔｈＡ遺伝子がノックアウトされたＢＷ２５１１３株を示す。
図３から、インサートＤＮＡ及びベクターの相同組換え及びインビボクローニングにおいて、ｒｅｃＥ遺伝子及びｒｅｃＴ遺伝子は関与していないことが明らかとなった。
また、図４から、ｘｔｈＡ遺伝子をノックアウトすることにより、インビボクローニングの活性が有意に下がることが明らかとなった。
このことから、図１に示すメカニズムにより、細胞内において、インサートＤＮＡ及びベクターの相同組換えが行われ、インビボクローニングを高効率で行うことができることが推察された。
また、図４から、ｘｔｈＡ遺伝子をノックアウトすることにより、インビボクローニングの活性が有意に下がることが明らかとなった。
このことから、図１に示すメカニズムにより、細胞内において、インサートＤＮＡ及びベクターの相同組換えが行われ、インビボクローニングを高効率で行うことができることが推察された。
以上の結果から、インビボクローニング可能な細胞株において、ｈｓｄＲ遺伝子の機能が失われており、ｘｔｈＡ遺伝子を有することが重要であることが示唆された。
本発明によれば、高効率でインビボクローニング可能な細胞株のスクリーニング方法を提供することができる。さらに、本発明のスクリーニング方法によって得られた細胞株によれば、目的の二本鎖ＤＮＡ又は該ＤＮＡの遺伝子産物を高収率で得ることができる。
１…目的の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、１ａ，１ｂ…目的の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、２…ベクター、３ａ，３ｂ…相同配列を有する部位、３ｂ−１…配列Ｘを有する部位、３ｂ−２…配列Ｘと相補的な配列を有する部位、
Claims (6)
- インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニングするための方法であって、
細胞株について、ｘｔｈＡ遺伝子の有無を評価し、ｘｔｈＡ遺伝子を有する細胞株を選択する第１の選択工程を備えることを特徴とする方法。 - さらに、前記第１の選択工程の後に、ｈｓｄＲ遺伝子の有無を評価し、ｈｓｄＲ遺伝子
の全部又は一部の機能が失われた細胞株を選択する第２の選択工程を備える請求項１に記
載の方法。 - 前記細胞株が大腸菌又は哺乳動物細胞に由来するものである請求項１又は２に記載の方法。
- インビボクローニング可能な細胞株の製造方法であって、
細胞株について、ｘｔｈＡ遺伝子の有無を評価し、ｘｔｈＡ遺伝子を有する細胞株を選択する選択工程と、前記細胞株がｈｓｄＲ遺伝子を有する場合に、前記選択工程の後、前記ｈｓｄＲ遺伝子の全部又は一部の機能を失わせる欠損工程を備えることを特徴とする製造方法。 - 前記細胞株が大腸菌又は哺乳動物細胞に由来するものである請求項４に記載の製造方法。
- 請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法、又は請求項４又は５に記載の製造方法を用いて、インビボクローニング可能な細胞株をスクリーニング、又は製造した後、得られた細胞株に、発現ベクターと、５’末端領域及び３’末端領域に前記発現ベクター上の挿入を行う部位と相同な塩基配列を有する目的の二本鎖ＤＮＡとを導入する導入工程と、
前記導入工程後、前記細胞株を培養し、前記目的の二本鎖ＤＮＡを相同組換えにより前記発現ベクターに挿入する挿入工程と、
を備えることを特徴とするインビボクローニング方法。
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