CN102634534A - 基于同源重组的核酸分子克隆方法及相关试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请提供基于同源重组的核酸分子克隆方法。按照本申请的方法，通过提供两端添加有分别与目标DNA两端序列或其侧翼序列同源的序列(即目标DNA特异性同源臂)的线性化载体，或者利用同时含有目标DNA特异性同源臂和载体特异性同源臂(与载体特定区域同源的序列)的连接片段，将目标DNA通过同源重组克隆到载体中。本申请的方法尤其适用于大DNA片段的克隆和单核苷酸多态性研究。本申请还提供相关的试剂盒。
Description
发明领域
本申请涉及DNA重组技术领域。更具体而言，本申请涉及基于同源重组的核酸分子克隆方法、其应用以及相关的试剂盒。
背景技术
在分子生物学研究和生物技术行业，始终需要将所需的DNA分子克隆至载体内，尤其是克隆在载体的特定位置。
将目标DNA克隆至诸如质粒之类的载体内预定位置的传统方法通常包括六大步骤：(1)利用限制性核酸内切酶对载体DNA进行酶切，纯化线性化载体；(2)用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)处理线性化载体，使连接过程中线性化载体的自环化程度最小；(3)利用PCR引物借助聚合酶链反应(PCR)扩增目标DNA，其中所述引物将在所扩增的目标DNA的5’和3’端添加使载体DNA线性化所用的限制性核酸内切酶的酶识别位点；(4)利用使载体DNA线性化所用的限制性核苷酸内切酶对所扩增目标DNA进行酶切，接着纯化经酶切的目标DNA；(5)利用DNA 连接酶将纯化的目标DNA与纯化的线性载体连接起来；以及(6)将连接产物转化到宿主细胞、例如大肠杆菌感受态细胞中，然后选择含有所要克隆产物的转化细胞，其中目标DNA于所需克隆位点插入至载体内。传统克隆方法繁琐、费时，克隆效率相对较低，也受限于载体和目标DNA上适当限制性内切酶识别位点的可用性。
利用同源重组可大大提高基因克隆的效率。目前已有各种各样的基于同源重组的克隆方法。通常的作法是，首先通过PCR对目标DNA进行扩增，利用PCR引物在所扩增的目标DNA两端添加与线性化载体DNA两端同源的序列；然后在体外通过酶的作用，通过同源重组将PCR引物克隆到载体中，或者将线性化载体和PCR产物共转化或共转染到宿主细胞中，在体内酶的作用下，通过同源重组将PCR引物克隆到载体中。
然而，现有的基于同源重组的克隆方法还存在一些问题，特别是在对来自真核生物的大片段基因组DNA进行克隆或对人基因组DNA中单核苷酸多态性(SNP)进行研究的情况下。例如，目前还难以通过PCR扩增10kb以上的大片段基因组DNA。对于体内同源重组，由于其涉及将经PCR扩增的目标DNA片段与载体DNA分子共转化或共转染到宿主细胞中，导致转化率低下。另外，在进行SNP研究时，难以区分所检测出的单个核苷酸突变是基因组中本身存在的还是因PCR扩增人为引入的。因此，还需要能够解决这些问题的新的克隆方法。
本申请通过提供一种基于同源重组的核酸分子克隆方法，解决了上述问题。
发明内容
本申请的一个方面提供基于同源重组的核酸分子克隆方法。在一个实施方案中，本申请提供将目标DNA克隆到载体中的方法，其包括：
(a) 将第一序列和第二序列分别添加到线性化载体的两端，其中第一序列与目标DNA的第一末端或其侧翼序列同源的序列，第二序列与目标DNA的第二末端或其侧翼序列同源的序列，获得两端分别具有第一序列和第二序列的延长的线性化载体，所述第一序列和第二序列各自独立地长至少12个核苷酸，优选15-50个核苷酸，更优选35-50个核苷酸；
(b) 使延长的线性化载体与含有目标DNA的样品接触，通过同源重组将目标DNA克隆到载体中。
在一个优选实施方案中，步骤(a)可以如下进行：
(i) 提供第一引物、第二引物和载体，其中第一引物包含作为5’端的所述第一序列和作为3’端的对载体第一区域特异性的序列，第二引物包含作为5’端的所述第二序列和作为3’端的对载体第二区域特异性的序列，优选对载体第一区域特异性的序列为与载体第一区域互补的序列，优选对载体第二区域特异性的序列为与载体第二区域互补的序列；和
(ii) 将第一引物、第二引物和载体接触，以载体为模板通过聚合酶链式反应，获得两端分别具有第一序列和第二序列的延长的线性化载体。
作为聚合酶链式反应模板的载体可以为线性化载体，所述第一区域和第二区域优选分别为线性化载体的第一末端和第二末端。作为聚合酶链式反应模板的载体也可以为环状载体，优选聚合酶链式反应在解旋酶存在下进行。
在另一个优选实施方案中，步骤(a)可以如下进行：
(i) 提供第一连接片段、第二连接片段和载体，其中第一连接片段具有与目标DNA第一末端或其侧翼序列同源的序列和与载体第一区域同源的序列，第二连接片段具有与目标DNA第二末端或其侧翼序列同源的序列和与载体的第二区域同源的序列；和
(ii) 将第一连接片段、第二连接片段和载体接触，通过同源重组获得两端分别具有第一序列和第二序列的延长的线性化载体。
在另一实施方案中，本申请提供将目标DNA克隆到载体中的方法，其包括：
(a) 提供第一连接片段、第二连接片段和载体，其中第一连接片段具有与载体的第一区域同源的序列和与目标DNA第一末端或其侧翼序列同源的序列，第二连接片段具有与载体的第二区域同源的序列和与目标DNA第二末端的侧翼序列同源的序列；和
(b) 将第一DNA片段和第二DNA片段与线性化载体以及含有目标DNA的样品接触，通过同源重组将目标DNA克隆到载体中。
在上述实施方案中，所述同源重组可以在核酸外切酶和单链DNA结合蛋白或退火蛋白或其功能上等同的酶存在下进行。所述核酸外切酶优选选自大肠杆菌核酸外切酶I、大肠杆菌核酸外切酶III、大肠杆菌核酸外切酶VII、λ噬菌体核酸外切酶、T7噬菌体核酸外切酶、Redα、RecE和它们的混合物。所述单链DNA结合蛋白或退火蛋白优选选自极端热稳定单链DNA结合蛋白(ET SSB)、Rec A、T4基因32蛋白、嗜热栖热菌RecA (Tth RecA)、大肠杆菌单链DNA结合单链(SSB)、Redβ、RecT和它们的混合物。
同源重组可以在核酸外切酶和单链DNA结合蛋白或退火蛋白的任意组合下进行。在一个优选实施方案中，所述同源重组在RecE和RecT存在下进行。在另一个优选实施方案中，所述同源重组在Redα和Redβ存在下进行。在进一步优选实施方案中，所述同源重组在RecE、RecT、Redα和Redβ存在下进行。
同源重组还可以在其他酶存在进行下。所述其他酶例如为解旋酶、核酸修复蛋白等。
在再一实施方案中，本申请提供用于将目标DNA克隆到载体中的试剂盒，其包含：
(a) 酶混合物，其包含核酸外切酶和单链DNA结合蛋白或退火蛋白；和 (b) 反应缓冲液。
核酸外切酶可以是原核生物核酸外切酶或病毒核酸外切酶，优选选自大肠杆菌核酸外切酶I、大肠杆菌核酸外切酶III、大肠杆菌核酸外切酶VII、λ噬菌体核酸外切酶、T7噬菌体核酸外切酶、Redα、RecE和它们的混合物。
单链DNA结合蛋白或退火蛋白可以选自极端热稳定单链DNA结合蛋白(ET SSB)、Rec A、T4基因32蛋白、嗜热栖热菌RecA (Tth RecA)、大肠杆菌单链DNA结合单链(SSB)、Redβ、RecT和它们的混合物。
所述酶混合物可以包含核酸外切酶与单链DNA结合蛋白或退火蛋白的任意组合。在一个优选实施方案中，所述酶混合物包含RecE和RecT。在另一个优选实施方案中，所述酶混合物包含Redα和Redβ。在进一步优选的实施方案中，所述酶混合物包含RecE、RecT、Redα和Redβ。
所述酶混合物还可以含有解旋酶和/或核酸修复蛋白。在一个优选实施方案中，所述酶混合物包含核酸外切酶、解旋酶、单链DNA结合蛋白或退火蛋白和核酸修复蛋白。
在本申请的试剂盒中，反应缓冲液优选包含1－10 mg/mL的Tris、1－10 mg/mL的NaCl、0.1－10 mg/mL的EDTA、0.1－10 mg/mL的MgCl2、10－200 mg/mL的甘油、10－50 mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)、0.1－10 mg/mL的ATP、1－10 mg/mL Na2HPO4、0.1－10 mg/mL KH2PO4、0.1－10 mg/mL的二硫苏糖醇(DDT)；pH值约为6.8－7.4。
附图说明
图1为本申请方法的一个实施方案的示意图，其中SM为选择标记。
图2为本申请方法的另一实施方案的示意图，其中SM为选择标记。
图3为示意图，显示DHRS4基因的片段之一、二、三和四(分别为片段2－4)在全长DHRS4基因(片段1)上的位置。
图4为阳性(氨苄青霉素抗性)克隆质粒的PCR产物的电泳图谱。1道为扩增的全长DHRS4基因(片段1)，2－4道分别为片段2－5，M道为DNA分子量标记。
图5为PstI酶切图谱。在图A中，1道为DNA分子量标记，2道为小鼠TFIIA基因的标准酶切图谱。在图B中，1道为DNA分子量标记，2－14道为以从阳性克隆(转化子)提取的质粒DNA为模板的PCR扩增产物的酶切图谱。
具体实施方式
除非另有规定，否则本申请中所用的所有科技术语的含义与具有本申请所属领域技术人员普遍理解的含义相同。
本发明人发现，在制备的DNA样品(例如提取的基因组DNA样品)中目标DNA的丰度足以允许目标DNA在体外通过同源重组克隆到载体中，而无需在将目标DNA引入载体之前对目标DNA进行扩增，从而完成了本申请。
在本申请的方法中，通过提供两端添加有分别与目标DNA两端序列或其侧翼序列同源的序列(即目标DNA特异性同源臂)的线性化载体，或者利用同时含有目标DNA特异性同源臂和载体特异性同源臂(与载体特定区域同源的序列)的连接片段，将目标DNA通过同源重组克隆到载体中。
利用本申请的方法，由于无需对目标DNA进行PCR扩增，因此不会引入人为突变，也没有PCR扩增时遇到的对目标DNA (即待扩增片段)大小的限制，可以对10kb以上(例如10－100 kb)的大DNA片段进行克隆。此外，由于本申请的方法是在体外将目标DNA引入载体，从而解决了体内重组中因共转化或共转染引起的转化率低的问题。因此，本申请通过提供这种方法解决了现有技术中存在的问题。
载体
本申请所用的术语“载体”意指这样的核酸，其能够转运所连接的另一核酸。所述载体可以为任何载体，例如质粒、粘粒、病毒等，也可以是细菌人工染色体(BAC)或酵母人工染色体(YAC)和噬菌粒。所述载体可以是自主复制型载体或整合性载体。自主复制型载体能够在所导入的宿主细胞中自主复制，例如具有细菌复制起点的细菌载体以及附加型哺乳动物载体。整合型载体在被导入宿主细胞时整合到宿主细胞的基因组中，从而随宿主基因组一起复制，例如非附加型哺乳动物载体。此外，某些载体即表达载体能够引导与其有效连接的基因表达。本申请的载体还可以是允许在不同宿主中克隆DNA或允许DNA在宿主间穿梭的特殊设计的载体，即穿梭载体。上述载体是本领域技术人员知晓的，可以根据需要，例如根据所使用的宿主细胞以及按照本申请添加第一序列和第二序列所使用的方法等来进行选择。
本申请的载体可以含有用于克隆、表达和筛选的各种元件。在一个实施方案中，所述载体含有用于在宿主细胞内复制的复制起点，例如用于在大肠杆菌宿主细胞内复制的ColE1复制起点、用于在酵母宿主细胞内复制的2μ复制起点、或病毒复制起点，例如SV40的复制起点。
在另一实施方案中，所述载体含有用于选择正确重组子的选择标记，例如药物抗性基因，所述药物例如但不限于氨苄青霉素、链霉素、卡那霉素、氯霉素、潮霉素、氨甲蝶呤等，所述选择标记也可以是报道基因，例如但不限于编码绿色荧光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、氯霉素乙酰转移酶、β-葡糖醛酸酶、新霉素磷酸转移酶等等。按照本申请，也可以使用在原始载体和重组后载体中差异表达的标记基因。含有重组后载体的转化宿主细胞可以容易地采用本领域已知的各种方法加以鉴定，例如可以通过对阳性克隆内所含载体上的目标DNA片段进行PCR扩增(PCR筛选)来鉴定。
目标DNA可以克隆在载体的任何预定位置。克隆位置可以根据需要选择。根据选定的克隆位置和方向，可以容易地确定载体的第一区域和第二区域以及本发明的引物和连接片段中与其相对应的序列。
在本申请的一个实施方案，所述载体为质粒，预定的用于插入目标DNA的位置可以位于限制性核酸内切酶酶切位点，或者位于两个限制性核酸内切酶酶切位点之间。用所述一种或一种以上限制性核酸内切酶消化所述质粒，可以获得线性化载体。
目标DNA
采用本申请的方法，可以将任何目标DNA克隆到载体中。目标DNA分子既可以来自原核生物，例如细菌基因组DNA、cDNA，也可以来自真核生物，如酵母、哺乳动物(例如人类)等的基因组DNA、cDNA；还可以是由PCR反应介导的DNA片段、由细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、粘粒等构建的原核或真核生物的基因组DNA文库中的DNA片段等。目标DNA可以是编码蛋白质的基因、携带基因突变或病变的序列等。
目标DNA可以是小片段DNA，也可以是大片段DNA。本申请的方法尤其适用于大片段DNA、例如10kb－100kb的大片段DNA的克隆。所述大片段DNA可以为10kb－100kb、例如10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100kb的大片段DNA。
延长的线性化载体的制备
按照本申请，将分别第一序列和第二序列添加在线性化载体两侧，制备延长的线性化载体，其中第一序列包含与目标DNA第一末端或其侧翼序列同源的序列，而第二序列包含与目标DNA第二末端或其侧翼序列同源的序列，使得两侧分别添加了第一序列和第二序列的线性化载体可以通过同源重组与目标DNA连接在一起。第一序列和第二序列可以是与目标DNA相应末端或其侧翼序列同源的序列。
所谓“同源”意指两个核苷酸序列之间具有一定的序列同一性(identity)或同源性(homology)，使得可以在重组酶或重组系统作用下通过同源重组连接在一起。所述“同源”包括细但不限于两个核苷酸序列之间具有至少80%的序列同一性，例如具有85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。术语“序列同一性”是本领域技术人员众所周知的，意指两个核酸序列或多肽序列在优化比对和分析时核苷酸或氨基酸残基相同的百分率。序列同一性的计算方法是本领域技术人员所熟知的。
作为同源臂的第一序列和第二序列与目标DNA相应序列的同源性没有限制，只要所得的延长的线性化载体能够与目标DNA发生同源重组即可。优选第一序列与目标DNA第一末端或其侧翼序列具有100%的序列同一性，优选第二序列与目标DNA第二末端或其侧翼序列具有100%的序列同一性。
第一序列和第二序列各自独立地长至少12个核苷酸，优选15-50个核苷酸，例如20、25、30、35、40、45、50个核苷酸，更优选长35-50个核苷酸。
第一序列和第二序列的序列和长度可以根据同源重组所使用的酶，基于目标DNA两端或其侧翼序列来设计。
第一序列和第二序列可以通过各种方法添加到线性化载体的两侧。在一个优选实施方案中，可以使用含有第一序列和载体特异性序列的第一引物和含有第二序列和载体特异性序列的第二引物，以载体为模板，经PCR将第一序列和第二序列分别添加到线性化载体的两侧。例如，第一引物含有第一序列和对载体第一区域具有特异性的序列，第二引物含有第二序列和对载体第二区域具有特异性的序列。例如，PCR引物可设计为：作为5’端的15－50 bp源自目标DNA的同源序列和紧随其后作为3’端的18－25 bp的质粒DNA模板特异性的引物序列。PCR引物中质粒DNA模板特异性的引物序列可以是与质粒DNA模板互补的序列。所谓“互补”意指100%互补。
可以使用本领域众所周知的任何方法进行PCR反应。PCR反应的条件可以通过常规实验来选择或优化。请参看例如Joseph Sambrook等, Molecular Clonning: A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; 和Carl W. Dieffenbach和Gabriela S. Dveksler, PCR primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995。
所述载体可以是线性化载体，也可以是环状载体。
在另一优选实施方案中，可以不通过PCR反应，而是利用同时含有目标DNA特异性同源臂和载体特异性同源臂的连接片段，例如第一连接片段和第二连接片段，将所述连接片段与载体接触，通过同源重组获得延长的线性化载体，即两侧分别添加有第一序列和第二序列的线性化载体。在这种情况下，所述连接片段同时含有目标特异性同源臂和载体特异性同源臂。也就是说所述连接片段既含有与目标DNA末端或其侧翼序列同源的序列，也含有载体的特定区域同源的序列。例如，第一连接片段含有与目标DNA第一末端或其侧翼序列同源的序列和与载体第一区域同源的序列，第二连接片段含有与目标DNA第二末端或其侧翼序列同源的序列和与载体第二区域同源的序列。所述载体可以是线性化载体或环状载体。当载体为环状载体时，同源重组反应可以在解旋酶的作用下进行。
同源重组技术在本领域众所周知。可以使用本领域已知的任何方法、任何合适的酶、酶混合物或酶系统实施同源重组，例如可以使用以下所述的方法，从而将第一序列和第二序列通过同源重组添加到线性化载体的两侧。
酶
同源重组可以使用任何已知用于同源重组的酶、酶混合物或酶系统来实施。
本申请方法可以使用酶混合物来实施。所述酶混合物可以包含核酸外切酶和单链DNA结合蛋白或退火蛋白、或与上述酶以基本相同方式发挥作用的酶或蛋白。核酸外切酶可以是原核生物核酸外切酶或病毒核酸外切酶，可以选自大肠杆菌核酸外切酶I、大肠杆菌核酸外切酶III、大肠杆菌核酸外切酶VII、λ噬菌体核酸外切酶、T7噬菌体核酸外切酶、Redα、RecE和它们的混合物。单链DNA结合蛋白或退火蛋白可以选自极端热稳定单链DNA结合蛋白(ET SSB)、Rec A、T4基因32蛋白、嗜热栖热菌RecA (Tth RecA)、大肠杆菌单链DNA结合单链(SSB)、Redβ、RecT和它们的混合物。所述酶混合物可以含有上述核酸外切酶和单链DNA结合蛋白或退火蛋白的任意组合。
在一个优选实施方案中，所述酶混合物包含RecE和RecT。在另一个优选实施方案中，所述酶混合物包含Redα和Redβ。在进一步优选的实施方案中，所述酶混合物RecE、RecT、Redα和Redβ。
所述酶混合物还可以含有其他酶，例如解旋酶和/或核酸修复蛋白。在一个实施方案中，所述酶混合物包含核酸外切酶、解旋酶、单链DNA结合蛋白或退火蛋白和核酸修复蛋白。
同源重组
同源重组技术在本领域众所周知。可以使用本领域已知的任何方法、任何合适的酶、酶混合物或酶系统实施同源重组。
可以使延长的线性化载体、含有目标DNA的样品与酶或酶混合物在反应混合物中接触，即在体外孵育，从而实现目标DNA与延长的线性化载体之间的同源重组。
按照本申请的另一方面，可以直接将载体、含有目标DNA的样品和以上所述的同时含有目标DNA特异性同源臂和载体特异性同源臂的连接片段，在反应混合物中与酶或酶混合物一起孵育，从而将目标DNA通过同源重组克隆或连接(例如定向或连接克隆)到载体中。
在本申请的该方面，所述载体可以是线性化载体，可以是环状载体。
反应混合物除含有目标DNA、载体和连接片段或者延长的线性化载体、酶或酶混合物和反应缓冲液。
在一个实施方案中，反应混合物含有例如1－100 mg/L的核酸外切酶和1－100 mg/L的单链DNA结合蛋白(单链DNA退火蛋白、链侵入蛋白)。反应混合物还可以含有其他酶，例如DNA解旋酶，如1－100 mg/L的DNA解旋酶；和/或核酸修复蛋白，如1－100 mg/L的核酸修复蛋白。
反应缓冲液可以根据所使用的酶或酶混合物来确定，并且可以通过常规实验进行优化。
反应缓冲液包含缓冲剂、盐和ATP，可以包含：Tris、NaCl、EDTA、MgCl2、甘油、牛血清白蛋白、ATP、磷酸盐和二硫苏糖醇。在一个优选实施方案中，反应缓冲液包含：1－10 mg/mL的Tris、1－10 mg/mL的NaCl、0.1－10 mg/mL的EDTA、0.1－10 mg/mL的MgCl2、10－200 mg/mL的甘油、10－50 mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)、0.1－10 mg/mL的ATP、1－10 mg/mL Na2HPO4、0.1－10 mg/mL KH2PO4、0.1－10 mg/mL的二硫苏糖醇(DDT)；pH值约为6.8－7.4。
本申请的另一方面提供用于将目标DNA克隆到载体中的试剂盒，所述试剂盒包含：(1)包含核酸外切酶和单链结合蛋白的酶混合物；和(2)反应缓冲液。
所述酶混合物含有其他酶。所述中核酸外切酶和单链结合蛋白以及其他酶可参看上文“酶”部分。反应缓冲液可以是上文所述的反应缓冲液。
转化
可以将目标DNA与载体的重组产物通过常规方法转化或转染到宿主细胞中。
常规转化或转染方法包括但不限于磷酸钙或氯化钙共沉淀、电穿孔、脂转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、病毒感染等。
所述宿主细胞可以是细菌细胞、真菌细胞、哺乳动物细胞等。
本领域技术人员可以根据需要选择合适的转化或转染方法和合适的宿主细胞。
转化宿主细胞经过培养后，可以根据载体中所含有的选择标记是否出现，筛选出含有目标DNA的重组子。在使用环状载体进行同源重组的情况下，也可以根据选择标记例如抗性的消失(例如目标DNA的克隆破坏了所述抗性基因)来进行筛选。
筛选出的细胞克隆或菌落可以例如通过对目标DNA进行PCR反应，确认含有正确的目标DNA。
DNA的分离与纯化、宿主细胞的选择和转化、菌落PCR反应、PCR扩增反应等操作按照本领域的标准技术，例如Joseph Sambrook等, Molecular Clonning: A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; 和Carl W. Dieffenbach和Gabriela S. Dveksler, PCR primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995等中描述的方法来实施。
采用本申请的克隆方法可以用于对目标DNA进行直接克隆的亚克隆，可以捕获基因组研究中的大片段基因(10－100kb，例如10－60kb)，可以用于构建重组质粒、对细菌染色体进行修饰、用于基因校正、快速构建一般性和条件性基因敲除动物(如鼠类动物)以及用于单核苷酸多态性(SNP)研究(替代基因芯片技术)。
本申请的方法有如下优点：
1. 不依赖传统的限制性内切酶及单一酶切位点；
2. 不受待克隆的目标DNA分子大小的限制；
3. 连接反应是在体外(in vitro)进行的，避免了在体内(in vivo)反应条件下，目标DNA未经PCR扩增时占整个基因组中的含量丰度低以及共转染所引起的转化率低的矛盾；
4. 反应精确性高；
5. 操作简便、快捷和高效。
以下通过具体的实施例更为详细地阐述如何实施本申请的方法。然而，本申请的方法并不限于这些实施例。
实施例1
人DHRS4基因簇有三个基因拷贝，分别为DHRS4 (15.569bp)、DHRS4L2 (约35kb)与DHRS4L1(又称为DHRS4X)，其中前二者同源性很高(90%-98%)，属于片段复制(segmental duplication)。DHRS4L1与DHRS4和DHRS4L2之间的同源性分别为77.8%和77.7%。三个基因之间的高同源性限制了常规分子生物学方法的应用，为DHRS4基因(全长15.569bp)的测序带来了困难，即在通过新一代基因测序技术和基因芯片捕获技术(来自Agilent和Nalgene公司)很难进行该基因的准确的测序和SNP研究。
本实施例主要是以含有RecE和RecT的酶混合物，将DHRS4基因同源重组至p15A载体(普如汀生物技术(北京)有限公司)中。简而言之，通过以DHRS4基因两侧各15-50bp的序列作为同源臂序列，以p15A载体中多克隆位点附近位点两侧20bp序列作为通常PCR扩增引物，这两段序列加在一起构成了“组合引物”(即：组合引物=源自DHRS4的同源臂序列+源自p15A载体的通常PCR扩增引物)；然后以p15A质粒载体为模板用高保真酶Prime STAR MAX DNA聚合酶(Takara公司)和 “组合引物”进行PCR扩增。将所得的PCR产物(300ng)、来自于人血液的全基因组DNA按照1:20-30 (6000ng－9000ng)和适量(0.5－2.0 U)酶混物(RecE和RecT以等比混合)在Eppendorf管中混合，在30-37℃下孵育30-60分钟后转化入到感受态大肠杆菌细胞JM109中。将转化后的大肠杆菌在37℃条件下恢复70分钟后，涂到含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，并在37℃下过夜培养。
通过PCR，以氨苄青霉素(Amp)抗性单克隆菌株中所提取的质粒上的DHRS4基因为模板，分成四段具体片段或以全长片段进行检测(参见图3)，所得到的片段为：
片段1：DHRS4全长基因(15.569bp)； 片段2：DHRS4基因片段之一(长度为7.24kb)； 片段3：DHRS4基因片段之二(长度为2.502kb)； 片段4：DHRS4基因片段之三(长度为3.618kb)； 片段5：DHRS4基因片段之四(长度为2.351 kb)； M：DNA分子量标记。
上述PCR检测反应的引物如下：
片段1：DHRS4基因(全长基因，15.569bp)的引物：
上游引物：5’-TCACCGCCCCTGGGAAGAGTGGAAC-3’ (SEQ ID NO:1)
下游引物：5’-AAGCACCCAACACTGAGAAATGAAC-3’ (SEQ ID NO:2)
片段2：DHRS4基因片段之一(7.24kb)的引物：
上游引物：5’-GACAGTAGTATGGTAGACAGAATAG-3’ (SEQ ID NO:3)
下游引物：5’-AGATGCCATGTAGGGCTTTAATAGC-3’ (SEQ ID NO:4)
片段3：DHRS4基因片段之二(2.502kb)的引物：
上游引物：5’-CATGAGGATGGGCAGTTTCTTCCCT-3’ (SEQ ID NO:5)
下游引物：5’-AAGCACCCAACACTGAGAAATGAAC-3’ (SEQ ID NO:6)
片段4：DHRS4基因片段之三(3.618kb)的引物：
上游引物：5’-GCTATTAAAGCCCTACATGGCATCT-3’ (SEQ ID NO:7)
下游引物：5’-TTACAGGCATGAGCCACCCCACCCA-3’ (SEQ ID NO:8)
片段5：DHRS4基因片段之四(2.351 kb)的引物：
上游引物：5’-TCACCGCCCCTGGGAAGAGTGGAAC-3’ (SEQ ID NO:9)
下游引物：5’-CTATTCTGTCTACCATACTACTGTC-3’ (SEQ ID NO:10)
“组合引物”的序列如下：
上游引物：
5’-
GCGCGGCTTTGAATCCAATTGACCTGTTCATTTCTCAGTGTTGGGTGCTTtataccgtctagagttaacc-3’ (SEQ ID NO:11)
下游引物5-3：
5’-
GCATGGATCAGACCAGCAAGTATGGGTTCCACTCTTCCCAGGGGCGGTGAcgtccgcgcggctcgagctt-3’ (SEQ ID NO:12)
片段3的引物和片段4的引物在设计上有重叠，即片段3的PCR产物与片段4 的PCR产物之间有重叠。
PCT检测结果示于图4。图4的结果表明，通过本申请的方法，成功地将超过15kb的大DNA片段克隆到载体中。
实施例2
按照实施例1描述的方法，设计合适的PCR引物，将长度大约为30kb的小鼠TFIIA基因(转录因子IIA, Transcription factor II A)从粘粒LAWRIST7-mTFIIA (Gene Bridges GmbH)克隆到p15A载体上。对得自阳性克隆的质粒的PCR产物经过PstI酶切图谱进行验证。图4给出了其中得自部分阳性克隆的PCR产物的酶切图谱，从图中可以看出，图B中的2－13道为正常连接，而14道为非正确连接。经过统计，按照本申请方法克隆的成功连接率(正确连接克隆数/所检测的阳性克隆数)为65-70%左右。
实施例3
使用实施例1的方法，将不同大小的目标DNA分子克隆到载体中。以下表1中每一组的正确克隆率为经酶切检测(PstI酶的酶切图谱)验证的正确克隆率(即成功连接率)。
表1
<110> 深圳市中联生物科技开发有限公司
<120> 基于同源重组的核酸分子克隆方法及相关试剂盒
<160> 12
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
TCACCGCCCC TGGGAAGAGT GGAAC 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
AAGCACCCAA CACTGAGAAA TGAAC 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
GACAGTAGTA TGGTAGACAG AATAG 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
AGATGCCATG TAGGGCTTTA ATAGC 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
CATGAGGATG GGCAGTTTCT TCCCT 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
AAGCACCCAA CACTGAGAAA TGAAC 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
GCTATTAAAG CCCTACATGG CATCT 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
TTACAGGCAT GAGCCACCCC ACCCA 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
TCACCGCCCC TGGGAAGAGT GGAAC 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
CTATTCTGTC TACCATACTA CTGTC 25
<210> 11
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
GCGCGGCTTT GAATCCAATT GACCTGTTCA TTTCTCAGTG TTGGGTGCTT tataccgtct agagttaacc 70
<210> 12
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
GCATGGATCA GACCAGCAAG TATGGGTTCC ACTCTTCCCA GGGGCGGTGA cgtccgcgcg gctcgagctt 70
Claims (10)
1.将目标DNA克隆到载体中的方法，包括：
(a) 将第一序列和第二序列分别添加到线性化载体的两端，其中第一序列与目标DNA的第一末端或其侧翼序列同源的序列，第二序列与目标DNA的第二末端或其侧翼序列同源的序列，获得两端分别具有第一序列和第二序列的延长的线性化载体，所述第一序列和第二序列各自独立地长至少12个核苷酸，优选15-50个核苷酸，更优选35-50个核苷酸；
(b) 使延长的线性化载体与含有目标DNA的样品接触，通过同源重组将目标DNA克隆到载体中。
2.权利要求1的方法，其中步骤(a)如下进行：
(i) 提供第一引物、第二引物和载体，其中第一引物包含作为5’端的所述第一序列和作为3’端的对载体第一区域特异性的序列，第二引物包含作为5’端的所述第二序列和作为3’端的对载体第二区域特异性的序列，优选对载体第一区域特异性的序列为与载体第一区域互补的序列，优选对载体第二区域特异性的序列为与载体第二区域互补的序列；和
(ii) 将第一引物、第二引物和载体接触，以载体为模板通过聚合酶链式反应，获得两端分别具有第一序列和第二序列的延长的线性化载体。
3.权利要求2的方法，其中作为聚合酶链式反应模板的载体为线性化载体，所述第一区域和第二区域优选分别为线性化载体的第一末端和第二末端。
4.权利要求2的方法，其中作为聚合酶链式反应模板的载体为环状载体。
5.权利要求1的方法，其中步骤(a)如下进行：
(i) 提供第一连接片段、第二连接片段和载体，其中第一连接片段具有与目标DNA第一末端或其侧翼序列同源的序列和与载体第一区域同源的序列，第二连接片段具有与目标DNA第二末端或其侧翼序列同源的序列和与载体的第二区域同源的序列；和
(ii) 将第一连接片段、第二连接片段和载体接触，通过同源重组获得两端分别具有第一序列和第二序列的延长的线性化载体。
6.将目标DNA克隆到载体中的方法，包括：
(a) 提供第一连接片段、第二连接片段和载体，其中第一连接片段具有与载体的第一区域同源的序列和与目标DNA第一末端或其侧翼序列同源的序列，第二连接片段具有与载体的第二区域同源的序列和与目标DNA第二末端的侧翼序列同源的序列；和
(b) 将第一DNA片段和第二DNA片段与线性化载体以及含有目标DNA的样品接触，通过同源重组将目标DNA克隆到载体中。
7.权利要求1－6中任一项的方法，其中所述同源重组在核酸外切酶和单链DNA结合蛋白或退火蛋白存在下进行，所述核酸外切酶优选选自大肠杆菌核酸外切酶I、大肠杆菌核酸外切酶III、大肠杆菌核酸外切酶VII、λ噬菌体核酸外切酶、T7噬菌体核酸外切酶、Redα、RecE和它们的混合物，所述单链DNA结合蛋白或退火蛋白优选选自极端热稳定单链DNA结合蛋白(ET SSB)、Rec A、T4基因32蛋白、嗜热栖热菌RecA (Tth RecA)、大肠杆菌单链DNA结合单链(SSB)、Redβ、RecT和它们的混合物。
8.权利要求1－6中任一项的方法，其中所述同源重组在RecE和RecT存在下或在Redα和Redβ存在下进行。
9.权利要求1－6中任一项的方法，其中所述同源重组在RecE、RecT、Redα和Redβ存在下进行。
10.用于将目标DNA克隆到载体中的试剂盒，其包含：
(a) 酶混合物，其包含核酸外切酶和单链DNA结合蛋白或退火蛋白；和
(b) 反应缓冲液。
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