CN102007212A - 同源重组方法和克隆方法以及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供可以选择性地同源重组目标基因的方法、以及利用该方法得到的重组DNA分子。同源重组方法，该方法使用PCR产物和线性化载体，所述PCR产物包含两末端具有扩增用引物序列P1和P2的靶基因序列；所述线性化载体具有包含与该PCR产物的扩增用引物序列P1和P2同源的核苷酸序列的同源重组区VP1和VP2，在VP1的末端侧具有包含与P1内侧的部分序列T1同源的核苷酸序列的同源重组区VT1、和/或在VP2的末端侧具有包含与P2内侧的部分序列T2同源的核苷酸序列的同源重组区VT2(T1和T2的至少一方具有靶基因所特有的核苷酸序列)，该方法包括：使上述PCR产物参与同源重组反应，以将其插入上述载体中，由此得到在载体中特异性地插入有目标PCR产物的重组DNA分子。克隆方法，该方法利用上述同源重组方法，制备在载体中特异性地插入有目标PCR产物的重组DNA分子，之后扩增所得的重组DNA分子。

Description

同源重组方法和克隆方法以及试剂盒

相关申请

本申请主张2008年3月7日申请的日本特愿2008-57995号的优先权，其全部内容以公开的形式特别引用于此。

技术领域

本发明涉及基因的同源重组方法和靶基因的克隆方法以及用于上述方法的试剂盒。

背景技术

所谓DNA克隆，是指使目的基因与质粒、噬菌体、黏粒等具有自身复制能力的载体结合，之后导入大肠杆菌等宿主中使其增殖，从而大量制作相同基因集团的技术。大肠杆菌中的克隆和亚克隆按照下述方法进行：使用DNA连接酶，使利用聚合酶链反应(PCR)的方法等扩增的目的基因与具有复制起点和抗生素选择标记的载体结合，再将其导入大肠杆菌细胞中，之后研究抗生素耐性，从而筛选出被克隆的细胞。

所述常规克隆技术成为现代生命科学的基础，被广泛用于在人基因组计划完成以后得到了飞跃发展的、基于基因信息的大量基因的克隆和高速的蛋白表达等中。但在现有基因操作方法中，存在以下局限：要求用相同识别位点的限制酶切断插入DNA和载体、以及在选择限制酶时还选择不切断插入DNA或载体的内部的酶等。另外，在处理限制酶和连接酶的过程中需要高端技术，而且使用高价的酶所导致的高成本也不容忽视。

1990年代以后，人们对使用识别特定的核苷酸序列以促进DNA片段间的重组的序列特异性基因重组酶的基因操作技术的关注逐渐提高。特别开发了使用识别attL、attR、attB、attP等的特异性DNA序列的基因整合酶来克隆基因的Gateway体系(Invitrogen(株)制)，将其广泛用于大量基因的快速克隆和蛋白表达。虽然该方法与常规限制酶-连接反应一样，通过细胞外的基因操作来进行，但却是一种使用以持有attL或attR的线性DNA片段介导的LR Clonase(クロナ一ゼ)和识别attP与attB之间的BP Clonase的新型克隆方法。在该方法中，首先，利用常规的基因操作将目的基因克隆到插入载体中，通过利用存在于该插入载体中的attL、attR、attB、attP等特异性重组序列和识别该序列的称作Clonase的酶的同源重组反应，可以将基因移入具有同样的特异性重组序列的各种表达载体中。该方法对大量基因的快速亚克隆和表达的检测有效，但最初必须首先将目标DNA片段通过常规的克隆方法克隆到插入载体中，不适于克隆不具有特异性重组序列的任意的DNA片段。

另一方面，在大肠杆菌细胞中，参与双链切断的修复的蛋白RecA、RecBCD催化同源重组反应。在该重组反应中，当存在数百个以上的核苷酸显示出相同序列的DNA片段时，有时会发生同源重组。但是，当同源DNA的长度为40-50个以下时，极难发生大肠杆菌自身的基因重组，只限于导入了来自噬菌体的重组酶Red(Redα/β)或RecE/T体系的情况下，才有可能发生同源基因间的重组。使用这种含有短同源区的DNA片段的基因重组，被用于控制微生物的遗传体的技术或不受限制酶/连接酶影响的细胞内克隆等(非专利文献1、专利文献1)。

非专利文献1：Zhang等人，1998，Nature Genetics，20，123-128，Zhang等人，2000，Nature Biotechnology 18，1314-1317

专利文献1：日本特表2002-503448号公报(对应的WO99/29837)

上述专利文献1和非专利文献1的全部内容均以公开的形式特别引用于此。

发明内容

发明所要解决的课题

利用线性化质粒载体与PCR产物间的同源重组反应进行细胞内克隆时，采用以下方法：首先，使长度为50个核苷酸的序列同源区位于插入DNA的两端，即使在载体中也利用限制酶进行切断使序列同源区位于两端，之后导入具有同源重组酶的大肠杆菌中。

例如，以PCR产物的形式制备插入DNA时，在PCR时的引物与模板的结合特异性低的情况下、或模板中存在多个与引物序列类似的序列的情况下等，非特异性扩增反应的结果，有时会出现下述情形：夹在两端的序列同源区中的区并不是作为克隆对象的靶区。

当夹在序列同源区中的区不是作为克隆对象的靶区时，也使用存在于引物中的序列同源区，与目标基因一样被克隆化。

于是，本发明的目的在于：提供采用同源重组的基因克隆方法中使用的同源重组方法，该方法可以选择性地同源重组目标基因。

本发明的目的还在于：提供靶基因的克隆方法，该方法包括扩增利用上述可以选择性地同源重组目标基因的方法得到的重组DNA分子。

解决课题的方法

常规的同源重组中，存在于线性化载体两端的同源重组区与存在于扩增用引物序列中的同源区相同。相对于此，本发明中的线性化载体所具有的同源重组区具有以下特征：在载体侧除了添加扩增用引物序列，还添加仅存在于靶基因中的扩增用引物序列的内侧序列，从而从使用扩增用引物得到的扩增产物中选择性地同源重组靶DNA片段。

本发明如下所述。

[1]同源重组方法，该方法使用PCR产物和线性化载体，所述PCR产物包含两末端具有扩增用引物序列P1和P2的靶基因序列；所述线性化载体具有包含与该PCR产物的扩增用引物序列P1和P2同源的核苷酸序列的同源重组区VP1和VP2，并且，在VP1的末端侧具有包含与P1内侧的部分序列T1同源的核苷酸序列的同源重组区VT1、和/或在VP2的末端侧具有包含与P2内侧的部分序列T2同源的核苷酸序列的同源重组区VT2(其中，T1和T2的至少一方具有靶基因所特有的核苷酸序列)，

该方法包括：使上述PCR产物参与同源重组反应，以将其插入上述载体中，从而得到在载体中特异性地插入有目标PCR产物的重组DNA分子。

[2][1]所述的方法，其中T1和T2的两方具有靶基因所特有的核苷酸序列。

[3][1]或[2]所述的方法，其中扩增用引物序列P1和P2的一方或两方具有靶基因所特有的核苷酸序列。

[4][1]～[3]中任一项所述的方法，其中PCR产物通过2次PCR制备而成，在第1次PCR中，使用包含T1序列的扩增用引物和包含P3序列的扩增用引物来实施(其中，P3序列与上述载体所具有的同源重组区VT1、VP1、VT2和VP2不具有同源性)；在第2次PCR中，使用包含P1序列的扩增用引物和包含P2序列的扩增用引物来实施。

[5][4]所述的方法，其中包含P1序列的扩增用引物的3’端侧区和包含T1序列的扩增用引物的5’端侧区具有部分重复的序列，而包含P2序列的扩增用引物和包含P3序列的扩增用引物具有或不具有部分重复的序列。

[6][1]～[5]中任一项所述的方法，其中扩增用引物序列P1和P2分别为10个核苷酸以上。

[7][1]～[6]中任一项所述的方法，其中载体的同源重组区VP1+VT1和VP2+VT2分别为11个核苷酸以上。

[8][1]～[7]中任一项所述的方法，其中一方或两方的扩增用引物序列P1和P2来自核酸酶耐性寡引物(ヌクレア一ゼ耐性オリゴプライ一マ一)。

[9][1]～[8]中任一项所述的方法，其中上述靶基因为抗体基因或T细胞受体基因，包含来自上述抗体基因或T细胞受体基因的恒定区的序列和来自可变区的序列，上述载体的同源重组区VP1+VT1和VP2+VT2的一方为来自抗体基因或T细胞受体基因的恒定区的序列。

[10][9]所述的方法，其中上述载体的同源重组区VP1+VT1和VP2+VT2的另一方具有不是来自抗体基因和T细胞受体基因的核苷酸序列。

[11][1]～[10]中任一项所述的方法，其中上述同源重组反应是使用Red(Redα/β)或RecE/T体系在细胞内进行。

[12][1]～[10]中任一项所述的方法，其中上述同源重组反应通过In-Fusion法来进行。

[13]靶基因的克隆方法，该方法包括：利用[1]～[12]中任一项所述的同源重组方法，制备在载体中特异性地插入有目标PCR产物的重组DNA分子，之后扩增具有所得的重组DNA分子的重组体。

[14]试剂盒，其中含有线性化载体，该线性化载体用于同源重组方法，所述同源重组方法包括：得到在载体中特异性地插入有PCR产物的重组DNA分子，所述PCR产物含有在两末端具有扩增用引物序列P1和P2的靶基因序列，

上述线性化载体具有包含与PCR产物的扩增用引物序列P1和P2同源的核苷酸序列的同源区VP1和VP2，并且在VP1的末端侧具有包含与P1内侧的部分序列T1同源的核苷酸序列的同源重组区VT1、和/或在VP2的末端侧具有包含与P2内侧的部分序列T2同源的核苷酸序列的同源重组区VT2。

[15][14]所述的试剂盒，其中上述同源重组方法为[1]～[12]中任一项所述的方法。

[16][14]或[15]所述的试剂盒，其中上述重组DNA分子用于靶基因的克隆方法，所述靶基因的克隆方法包括：扩增具有该重组DNA分子的重组体。

发明效果

根据本发明的方法(利用内部序列依赖性同源重组反应的方法)，即使在靶DNA片段与非靶DNA片段混在一起的情况下，无需纯化靶DNA片段(除去非靶DNA片段)，也可以高效率地将靶DNA片段导入载体中，通过使用导入了该靶DNA片段的载体，可以高效率地克隆靶DNA片段。

根据本发明的方法(利用使用核酸酶耐性寡引物扩增的PCR产物和内部序列依赖性同源重组反应的方法)，即使在靶DNA片段与非靶DNA片段混在一起的情况下，也无需纯化靶DNA片段(除去非靶DNA片段)，与上述利用内部序列依赖性同源重组反应的方法相比，可以以更高的概率(选择性)将靶DNA片段插入载体中，通过使用导入有该靶DNA片段的载体，可以以更高的效率克隆靶DNA片段。

具体实施方式

[同源重组方法]

本发明的同源重组方法，使用PCR产物和线性化载体，所述PCR产物包含两末端具有扩增用引物序列P1和P2的靶基因序列；所述线性化载体具有包含与该PCR产物的扩增用引物序列P1和P2同源的核苷酸序列的同源重组区VP1和VP2，并且在VP1的末端侧具有包含与P1内侧的部分序列T1同源的核苷酸序列的同源重组区VT1、和/或在VP2的末端侧具有包含与P2内侧的部分序列T2同源的核苷酸序列的同源重组区VT2(其中，T1和T2的至少一方具有靶基因所特有的核苷酸序列)，

该同源重组方法包括：使上述PCR产物参与同源重组反应，以将其插入上述载体中，从而得到在载体中特异性地插入有目标PCR产物的重组DNA分子。

[常规的同源重组方法、图1]

如图1所示，常规的同源重组方法(ET重组反应)是指，使用PCR产物[靶DNA片段(1)和非靶DNA片段(2)]和载体(II)，通过同源重组将上述PCR产物插入上述载体中，所述PCR产物的两末端具有扩增用引物序列P1和P2；所述载体(II)位于该PCR产物的末端或末端附近，具有包含一部分或全部扩增用引物序列的同源重组区VP1和VP2。

此时，在DNA片段的引物序列P1和P2与线性化载体的引物同源序列VP1和VP2之间发生重组。因此，当靶DNA片段(1)与非靶DNA片段(2)混在一起时，只要不具备DNA片段的长度极不相同等特别条件，两者就以相同的概率插入载体中。如图1所示，靶DNA片段(1)与非靶DNA片段(2)以相同的概率插入载体(II)中。

因此，在常规的同源重组方法的情况下，当靶DNA片段(1)与非靶DNA片段(2)混在一起时，应预先纯化靶DNA片段(1)(除去非靶DNA片段(2))，之后再参与同源重组反应。

[内部序列依赖性同源重组反应、图2]

相对于此，在本发明中，线性化载体的同源重组区包含扩增用引物序列(位于PCR产物的至少一方的末端或末端附近)P1(和P2)、以及与存在于靶DNA片段的扩增用引物序列内侧的序列T1(和T2)同源的核苷酸序列VP1+VT1(和VP2+VT2)。而且，位于PCR产物的一方末端的扩增用引物序列的内侧序列T1(和T2)为来自模板的序列。载体的同源重组区中，有一部分来自扩增用引物序列P1(和P2)，剩余部分来自靶基因序列的一部分T1(和T2)。由此，虽然两端具有扩增用引物序列但其内侧包含靶基因以外的序列的PCR产物，其扩增用引物序列部分是共通的，但靶基因的序列部分不同，所以不能作为同源重组区识别，不发生同源重组。因此，可以将包含目标靶基因序列的PCR产物特异性地同源重组到载体中。本发明的方法还可称作内部序列依赖性同源重组反应方法。

如图2所示，靶DNA片段(1)在两方的末端具有一部分来自扩增用引物序列、剩余部分来自靶基因序列的一部分的同源重组区P1+T1和P2+T2。线性化载体(I)所具有的同源重组区VP1+VT1和VP2+VT2，也是其中一部分相当于来自扩增用引物序列的序列、剩余部分相当于来自靶基因序列的一部分的序列。这种情况下(利用ET重组反应的内部序列依赖性同源重组反应)，发生来自DNA片段的引物互补链的序列的重组和载体的内部序列(来自靶基因序列的一部分的序列)的重组。基于利用内部序列的载体的重组反应仅发生同源重组区中具有内部序列的、靶DNA片段(1)的特异性重组(途径B)，不发生同源重组区中不具有内部序列T1和T2的、非靶DNA片段(2)的重组(途径D，与内部序列不具有同源性)。但在发生基于DNA片段的引物序列P1和P2的互补链的重组时(途径A和C)，靶DNA片段(1)和非靶DNA片段(2)被一同插入载体中。其结果，当靶DNA片段(1)和非靶DNA片段(2)混在一起时，靶DNA片段(1)的情形存在途径A和B；相对于此，非靶DNA片段(2)的情形仅存在途径C，前者被优先导入载体中。

但是，当位于PCR产物末端的扩增用引物序列的内侧序列(内部序列)T1和T2的至少一方为来自模板的序列、即模板特有(固有)的序列时，得到提高上述靶DNA片段的同源重组的选择性(特异性)的效果，包含靶基因序列的PCR产物同源重组到载体中的特异性大幅提高。剩余一方的内部序列可以不是模板特有(固有)的序列。但是，当T1和T2两方均为模板特有(固有)的序列时，提高靶DNA片段的同源重组选择性的效果好，因此优选。

[基于S化-寡引物的内部序列依赖性同源重组反应、图3]

若将以普通的寡DNA作为引物扩增的DNA片段和线性化载体一同导入大肠杆菌中进行ET重组反应，则该DNA片段在菌体内接受5’→3’核酸外切酶的消化。其结果，形成DNA片段的3’端突出的结构。该3’突出端来自PCR中使用的引物序列。同样，线性化载体也接受5’→3’核酸外切酶的消化，其结果，形成载体的3’端突出的结构(图2中左起第2种状态)。载体的3’突出端来自内部序列。

线性化载体的3’突出端与DNA片段的同源区进行重组反应时(途径B和D)，利用的是内部序列，所以只有靶DNA被插入载体中(图2的途径B)。不具有内部序列的非靶DNA在该途径中未发生同源重组，没有被插入载体中(图2的途径D)。DNA片段的3’突出端与载体的同源区进行重组反应时(途径A和C)，由于利用的是引物序列，所以有时不仅靶DNA片段(图2的途径A)、就连非靶DNA片段(图2的途径C)也被插入载体中，这种情形如上所述。

构成DNA的核苷酸分子以经由磷酸的磷酸二酯键连接，细胞内的DNA分解酶具有切断磷酸二酯键的活性。但磷酸二酯被S化(硫代磷酸酯化)的DNA或2’4’-BNA化(桥联核酸(Bridged Nucleic Acid)化)的DNA对DNA分解酶显示出耐性。在本发明中，将这些对DNA分解酶显示出耐性的寡引物称作核酸酶耐性寡引物。核酸酶耐性寡引物的代表例有S化(硫代磷酸酯化)寡引物，但核酸酶耐性寡引物并不限于S化寡引物。以S化寡DNA(SP1、SP2)为引物，通过PCR反应扩增的S化DNA片段在其5’侧具有S化的序列，所以特别不易接受5’→3’核酸外切酶的消化。因此，若将该DNA片段与载体一同导入大肠杆菌中进行ET重组反应，则S化DNA片段的5’侧被S化，所以不会接受5’→3’核酸外切酶的消化(图3中左起第2种状态)。其结果，无法形成来自引物的互补序列的3’突出端，不会发生S化DNA片段与载体的同源重组(途径A、C，未发生重组)。另一方面，线性化载体接受5’→3’核酸外切酶的消化，所以形成载体的3’端突出的结构。该3’突出端来自内部序列，所以只有与本区具有同源性的靶S化DNA片段成为同源重组反应的底物(途径B)。

这样，由于DNA片段的5’侧来自S化-寡DNA，所以对5’→3’核酸外切酶消化具有耐性。因此，DNA片段与载体侧的同源重组反应被抑制。另一方面，线性化载体的5’端被5’→3’核酸外切酶消化，形成单链的3’端的内部序列可以只与靶DNA片段进行同源重组反应。其结果，即使靶DNA为非靶DNA的五分之一的量，也可以只将靶DNA片段选择性地导入载体中。

通过使用以S化-寡DNA(SP1、SP2)为引物得到的PCR产物作为同源重组用的DNA片段，仅图3的B成为同源重组反应途径。相对于此，将使用通常的引物得到的PCR产物用作同源重组用的DNA片段时，图2的A、B、C成为同源重组反应途径。其中，途径C是插入有非靶DNA片段的反应途径。本反应中使用的寡引物，只要其5’侧为至少一个核苷酸以上、且对DNA分解酶具有耐性即可，对其种类没有特别限定。还可以是5’侧被2’4’-BNA化的寡引物。

[同源重组反应]

本发明的同源重组反应，除采用ET重组法[Red(Redα/β)或RecE/T体系]以外，还可以采用In-Fusion法。

ET重组法是在菌体内进行的同源重组反应，其利用由RecE或Redα的5’→3’核酸外切酶消化形成的3’突出端(参照非专利文献1、专利文献1)。利用RecE或Redα均可实施本发明。同源重组反应本身可以利用常规方法来实施。

In-Fusion法是在试管内进行的同源重组反应，其利用通过痘苗病毒DNA聚合酶的3’→5’核酸外切酶消化形成的5’突出端。该反应中，在DNA片段端与直链状载体端之间必需存在约15bp左右的同源区。痘苗病毒DNA聚合酶的3’→5’核酸外切酶消化进行到消化内部序列的阶段时，靶DNA片段被插入载体中。

In-Fusion法的原理在以下论文中加以说明，实施时可以直接使用タカラバイオ/Clontech社出售的同源重组试剂。

Nucleic Acids Research，2007，第35卷，No.1143-151

Michael等人

Duplex strand joining reactions catalyzed by vaccinia virus DNA polymerase

使用In-Fusion法的常规的同源重组反应如图4的B图所示。痘苗病毒DNA聚合酶消化DNA片段和载体的3’端。由此，在DNA片段与线性化载体之间出现互补区。该互补链区相互退火，从而将DNA片段插入载体中。

相对于此，本发明的同源重组反应如图4的A图所示。当痘苗病毒DNA聚合酶的3’→5’核酸外切酶消化进行到消化内部序列的阶段时，在靶DNA片段(1)与线性化载体(I)之间出现互补链区。其结果，发生重组反应。相对于此，在非靶DNA片段(2)中，经由引物序列与载体形成互补链区，由于存在与非靶DNA片段(2)不具有同源性的载体的内部序列，所以没有发生重组反应。

[靶基因]

对本发明的方法中使用的靶基因没有特别限定。靶基因例如可以是抗体基因，而位于包含抗体基因的PCR产物的一方末端的扩增用引物序列的内侧序列可以是来自抗体基因的恒定区的序列。靶基因中，除抗体基因以外，T细胞受体基因、剪接变体等引物区和与其相邻的内侧序列是一定的，但也可以是内部具有可变部位的DNA。

PCR产物通过2次PCR来制备，在第1次PCR中，可以使用包含T1序列的扩增用引物和包含P3序列的扩增用引物来实施(其中，P3序列与上述载体所具有的同源重组区VT1、VP1、VT2和VP2不具有同源性)；在第2次PCR中，可以使用包含P1序列的扩增用引物和包含P2序列的扩增用引物来实施。各序列的位置关系如图5所示。上述P3序列不直接参与同源重组，其被用作进行嵌套式PCR时的第1次使用的引物。包含P1序列的扩增用引物的3’端侧区与包含T1序列的扩增用引物的5’端侧区具有部分重复的序列；包含P2序列的扩增用引物与包含P3序列的扩增用引物可以具有、也可以不具有部分重复的序列。

以下，以免疫球蛋白基因恒定区作为靶基因序列的情形为例，根据图6进行以下说明。图6所示的引物B(的一部分)相当于图2和图5的引物T1，引物D和C相当于图2和图5的序列P1和P2。图6所示的引物A相当于引物P3。

(1)PCR产物

参照使用磁珠的cDNA合成法的图6(免疫球蛋白可变区扩增法)。

模板中使用3’端添加有poly dG的免疫球蛋白cDNA(在磁珠上合成)、引物A(免疫球蛋白基因恒定区)和B(用于与poly dG结合)，进行第1次PCR。

第1次PCR结束后，将其例如稀释至100倍左右，以所得稀释物作为第2次PCR的模板。使用的引物为D和C。D设计成3’侧的序列与第1次PCR中使用的引物B的5’侧重叠，使D的3’端侧区与该区结合。引物C位子恒定区，设计成位于第1次PCR中使用的引物A的内侧。其中，引物C可以具有一部分与引物A重叠的序列，也可以具有与引物A不重叠的序列。在第1次PCR中，当包含免疫球蛋白的恒定区的DNA片段被扩增时，通过使用引物C和D，可以进一步扩增包含免疫球蛋白的恒定区的DNA片段。这是被称作5’RACE-PCR(rapid amplification of cDNAend，cDNAend的快速扩增)的PCR法之一。

引物D+B序列是通过2次PCR反应由引物B和D合成的人工序列，不具有模板的序列所特有(固有)的序列。该部位成为载体的同源重组用序列之一。

通过第2次基因扩增反应，引物D特异性地与通过第1次PCR扩增的DNA片段的3’端侧区结合(由于具有引物B的序列)、引物C与引物A的更内侧的免疫球蛋白恒定区结合。其结果，进行特异性扩增。这种情况下，在PCR产物的单侧必定存在D+B的序列。但实际上，有时所用的引物与具有与其类似的核苷酸序列的非靶DNA结合，结果合成了非特异性PCR产物。例如，引物D非特异性地与其他DNA片段结合时，在所合成的DNA片段中，引物D的序列存在于其末端，但在其内侧不存在引物B的序列。由于具有这样的序列的DNA片段不具有引物D+B序列，所以不能成为内部序列依赖性同源重组的对象(图7、参照使用免疫球蛋白可变区的同源重组的载体导入法)。因此，亦如图5所示，引物B的不与引物D重叠的序列发挥内部序列的作用，使靶DNA片段的同源重组的选择性提高。

另外，如果引物C与具有与其类似的核苷酸序列的非靶DNA结合，进行DNA扩增时，该DNA片段中不存在相当于图7所示的+α的恒定区的序列。相当于+α的序列是作为靶DNA的免疫球蛋白链特有(固有)的序列。因此，不具有+α作为同源区的DNA片段不能成为同源重组的对象，不能插入载体中(图7、参照使用免疫球蛋白可变区的同源重组的载体导入法)。只有当引物C特异性地与作为靶基因的免疫球蛋白基因的恒定区结合来扩增DNA时，引物C+α的序列才出现在DNA片段的末端。该序列成为与载体同源重组的对象(图7)。

本发明的方法为：非特异性扩增的PCR产物不能被导入载体中，而只有特异性扩增的PCR产物被自动地导入载体中的方法。在现有方法中，为了将目标特异性扩增产物导入载体中，在PCR反应后，必需采用凝胶电泳法或离心柱法等进行特异性扩增产物的分离纯化操作。而且，还必需进行所得质粒的基因序列分析，花费时间和成本。

如上所述，PCR产物通过2次PCR来制备，在第1次PCR中，可以使用包含T1和P3序列的扩增用引物来实施；在第2次PCR中，可以使用包含P1和P2序列的扩增用引物来实施。包含P1序列的扩增用引物和包含T1序列的扩增用引物在5’RACE-PCR中具有部分重复的序列。另外，包含P2序列的扩增用引物和包含P3序列的扩增用引物可以具有、也可以不具有部分重复的序列。

关于各扩增用引物序列，考虑到PCR的引发性能，例如可以是10个核苷酸以上，优选为14～35个核苷酸的范围。

来自引物序列P1和P2的同源重组区例如可以是10个核苷酸以上，优选为14～35个核苷酸的范围。

作为与同源重组区的部分序列同源的核苷酸序列的扩增用引物序列的内侧的内部序列T1和T2为1个核苷酸以上的范围，优选为5～1000个核苷酸的范围。并且，与扩增用引物序列的总计P1+T1和P2+T2各自独立可以为11个核苷酸以上的范围，优选为25～1000个核苷酸的范围。

[克隆方法]

本发明包含靶基因的克隆方法，该方法包括：利用上述本发明的方法，扩增在载体中特异性地插入有目标PCR产物的重组DNA分子(重组载体)。重组DNA分子的扩增可以采用常规方法。插入到表达载体中并扩增的重组DNA分子(重组载体)在细胞等中表达，得到蛋白，可以进一步用于所得蛋白的功能分析。当目标基因为抗体基因时，可以研究分离的抗体(蛋白)是否与目标抗原结合。

另外，被扩增的重组DNA分子(重组载体)中所含的靶基因例如通过限制酶处理从载体中切出，根据需要进行纯化。靶基因的分离和纯化可以利用常规方法来进行。作为靶基因的分离和纯化，例如可以采用凝胶提取或柱纯化等。分离和纯化的靶基因例如可以用于核苷酸序列的确定、插入表达载体中、靶基因的功能分析等。

[试剂盒]

本发明还涉及含有线性化载体的试剂盒，该线性化载体用于同源重组方法，所述同源重组方法包括：得到在载体中特异性地插入有PCR产物的重组DNA分子，所述PCR产物包含两末端具有扩增用引物序列P1和P2的靶基因序列。该试剂盒中所含的线性化载体，具有包含与PCR产物的扩增用引物序列P1和P2同源的核苷酸序列的同源区VP1和VP2，并且，在VP1的末端侧具有包含与P1内侧的部分序列T1同源的核苷酸序列的同源重组区VT1、和/或在VP2的末端侧具有包含与P2内侧的部分序列T2同源的核苷酸序列的同源重组区VT2。该线性化载体与上述同源重组方法中说明的线性化载体相同。

上述试剂盒中，除了包含线性化载体以外，例如还可以包含试剂盒的使用说明书和用于同源重组反应的试剂等。作为用于同源重组反应的试剂等，例如有：Red(Redα/β)或RecE/T体系用的试剂等、In-Fusion法用的试剂等。

使用本发明的试剂盒可以实施的同源重组方法，例如是上述本发明的同源重组方法，但对用于除此以外的方法则没有限制。

并且，使用本发明的试剂盒得到的重组DNA分子可以用于靶基因的克隆方法，所述克隆方法包括：扩增具有该重组DNA分子的重组体。

实施例

以下，利用实施例进一步详细说明本发明。

实施例1

靶DNA片段与非靶DNA片段混在一起时，内部序列依赖性同源重组法的优点如以下实验1～4所示。

[实验材料概略]

使用引物(a)和(b)，利用PCR法扩增2种DNA片段(1)和(2)。

DNA片段(1)是同源重组的靶DNA，在其一端存在来自PCR用引物(a)序列的序列，并且在其内侧(靶DNA侧)存在来自poly dG/dC序列的序列。在另一端存在来自引物(b)序列的序列，并且在内侧(靶DNA侧)存在来自人免疫球蛋白γ(Igγ)链恒定区的序列(参照上述DNA片段I核苷酸序列)。

DNA片段(2)是非靶DNA，在其一端存在来自PCR用引物(a)序列的序列，在另一端存在来自引物(b)序列的序列(参照DNA片段II核苷酸序列)。

直链状载体(I)中，作为同源重组区，具有来自引物(a)的序列、以及在其内侧具有poly dG/dC序列，在另一端具有来自引物(b)的序列、以及在其内侧具有来自免疫球蛋白γ(Igγ)链恒定区的序列(参照载体I序列)。

直链状载体(II)中，作为同源重组区，只具有来自引物(a)的序列以及来自引物(b)的序列(参照载体II序列)。

引物(a)：(pCMV EGFP N1来自多克隆位点)

5’-CTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGA-3’(SEQ ID NO：1)

引物(b)：(来自人Igγ链恒定区)

5’-AGCCGGGAAGGTGTGCACGCCGCTG-3(SEQ ID NO：2)

内部序列(poly dG/dC)

5’-TCCCCCCCCCCCCC-3’(SEQ ID NO：3)

3’-AGGGGGGGGGGGGG-5’(SEQ ID NO：4)

内部序列(来自人Igγ链恒定区)

5’-CGTGGAACTCAGGCGCCCTGAC-3’(SEQ ID NO：5)

3’-GCACCTTGAGTCCGCGGGACTG-5’(SEQ ID NO：6)

载体(I)同源重组序列：引物序列(a)+内部序列(poly dG/dC)

5’-CTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGA

-3’(SEQ ID NO：7)

3’-GAAGCTTAAGACGTCAGCTGCCATGGCGCCCGGGCCCT

-5’(SEQ ID NO：8)

载体(I)同源重组序列：内部序列(来自人Igγ链恒定区)+引物序列(b)

5’-

CAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCT-3’(SEQ ID NO：9)

3’-

GTCGCCGCACGTGTGGAAGGGCCGA-5’(SEQ ID NO：10)

载体(II)同源重组序列：引物序列(a)

5’-CTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGA-3’(SEQ ID NO：11)

3’-GAAGCTTAAGACGTCAGCTGCCATGGCGCCCGGGCCCT-5’(SEQ ID NO：12)

载体(II)同源重组序列：引物序列(b)

5’-CAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCT-3’(SEQ ID NO：13)

3’-GTCGCCGCACGTGTGGAAGGGCCGA-5(SEQ ID NO：14)

DNA片段(1)(图8、SEQ ID NO：15)是具有人免疫球蛋白γ链的可变区和一部分恒定区的683bp的靶DNA片段，具有用于PCR扩增的引物(a)以及引物(b)序列。另外，作为用于内部序列特异性同源重组反应的序列，在引物(a)的内侧具有poly dG/dC序列、在引物(b)序列的内侧具有来自免疫球蛋白γ链恒定区的序列。用于扩增的引物(a)、(b)的位置以箭头显示。

DNA片段(2)(图9、SEQ ID NO：16)是628bp的来自GPF基因的DNA片段，其两端具有用于PCR扩增的引物(a)序列和引物(b)序列。在两引物序列的内侧不存在用于内部序列特异性同源重组反应的序列，而是存在来自GFP基因的序列。

在pCMV EGFPN1(Clontech社)的Eco RI和NotI位点插入图8的序列，制作载体I(图10、SEQ ID NO：17)。该质粒在Eco RI位点下游具有用于同源重组的引物(a)序列以及作为内部序列的poly dC/dG序列，所述内部序列用于特异性插入使用5’-RACE PCR扩增的人免疫球蛋白γ链DNA片段。在poly dC/dG序列的下游，将SacB基因(2kb)插入EcoRV位点(SEQ ID NO：17的62位与63位之间)，所述SacB基因是用于在含有蔗糖的培养基上致死导入有经限制酶切断未形成直链状的质粒的大肠杆菌的负选择标志物。在SacB基因下游，存在用于特异性插入使用5’-RACE PCR扩增的人免疫球蛋白γ链DNA片段的另一个作为内部序列的人免疫球蛋白γ链恒定区的序列。在其下游存在引物(b)序列。

将该载体用EcoRV切断后，通过乙醇沉淀，回收直链状质粒DNA，制成最终浓度为0.1μg/μl的浓度(图7)。

在pCMV EGFPN1(Clontech社)的Eco RI和NotI位点插入图9的序列，制成载体II(图11、SEQ ID NO：18)。该质粒在Eco RI位点下游具有用于同源重组的引物(a)序列。在引物(a)序列的下游，将SacB基因(2kb)插入EcoRV位点(SEQ ID NO：18的51位与52位之间)，所述SacB基因是用于在含有蔗糖的培养基上致死导入有未进行同源重组的质粒的大肠杆菌的负选择标志物。在SacB基因下游存在用于同源重组的引物(b)序列。

该载体经EcoRV切断后，通过乙醇沉淀，回收直链状质粒DNA，制成最终浓度为0.1μg/μl的浓度。

(实验1)

使用常规ET重组法的同源重组反应

[方法]

以插入有DNA片段1和2的质粒为模板，使用引物(a)和(b)进行PCR反应，扩增DNA片段1和2。PCR反应如下进行：在50μl反应体系中加入2ng模板质粒DNA、10pmol各引物、10nmol dNTP，使用タカラバイオ社制PrimeSTAR耐热性DNA聚合酶，进行30个循环94℃下30秒-68℃下40秒的反应。通过离心柱法纯化扩增的DNA片段，制成50ng/μl的浓度。

感受态细胞按照GeneBridges社的Red/ET重组体系来制备。将DNA片段1、2和载体(II)以50ng∶50ng∶100ng的比例混合的3μl溶液导入大肠杆菌中。针对所得的耐药性菌的菌落，进行使用引物(a)和(b)的菌落PCR法，扩增插入到载体中的DNA片段。

在菌落PCR法中，将大肠杆菌菌落悬浮于50μl的PBS-0.1％TritonX溶液中，将其在95℃下加热5分钟，使质粒DNA从菌体中溶出。PCR反应如下进行：向1μl上述菌体加热溶液中加入10pmol引物(a)和(b)、10nmol dNTP，利用50μl反应体系进行使用タカラバイオ的PrimeSTAR耐热性DNA聚合酶的PCR反应(94℃下30秒-68℃下40秒的反应，30个循环)。将2μl反应液用1％琼脂糖凝胶进行电泳，分离扩增的DNA片段。

[结果]

菌落PCR产物的电泳结果(图12)，检测到6个插入有来自IgG的683bp的DNA片段1的质粒。检测到5个插入有来自GFP的628bp的DNA片段2的质粒、1个未插入DNA片段1和2的质粒。即，由结果判明：在常规ET重组法中，当靶DNA片段与非特异性DNA片段混在一起时，难以只将靶DNA片段高效率地导入载体中。

(实验2)

使用内部序列依赖性同源重组反应的靶DNA的选择性克隆化

[方法]

将实验1中制备的DNA片段1、2和载体(I)以50ng∶50ng∶100ng的比例混合的3μl溶液导入大肠杆菌中。由所得的耐药性菌的菌落，按照与实验1相同的方法扩增导入到载体(I)中的DNA片段，利用电泳法进行分析。

[结果]

菌落PCR产物的电泳结果(图13)，检测到8个插入有来自IgG的DNA片段1的质粒。检测到2个插入有来自GFP的DNA片段2的质粒、2个未插入DNA片段1和2的质粒。由以上结果可知：通过进行内部序列依赖性同源重组反应，即使在靶DNA片段与非靶DNA片段混在一起的情况下，也可以将靶DNA片段高效率地导入载体中。

(实验3)

使用S化-寡引物的内部序列依赖性同源重组法

使用将引物(a)和(b)的5’端3个核苷酸S化的寡引物，按照与实验1相同的方法，制备S化DNA片段1、2。

将本S化DNA片段1、2和载体(I)以50ng∶50ng∶100ng的比例混合的3μl溶液导入大肠杆菌中。针对耐药性菌的菌落进行使用引物(a)和(b)的菌落PCR法，扩增插入到载体中的DNA片段。其结果(图14)，检测到9个插入有来自IgG的DNA片段1的质粒。检测到0个插入有来自GFP的DNA片段2的质粒、2个未插入DNA片段1和2的质粒。

(实验4)

将实验3中制备的S化DNA片段1、2和载体(I)以10ng∶50ng∶100ng的比例混合的3μl溶液导入大肠杆菌中，利用相同的方法分析插入到载体中的DNA片段。其结果(图15)，检测到7个插入有来自IgG的DNA片段1的质粒、1个插入有来自GFP的DNA片段2的质粒、3个未插入DNA片段1和2的质粒。根据以上结果，通过使用经S化-寡引物扩增的PCR产物和内部序列依赖性同源重组反应，可以以35倍的正确性将靶DNA插入载体中。

(实验5)

采用ET重组法将人末梢血B淋巴细胞免疫球蛋白γ链可变区DNA片段导入载体中

将1个人末梢血B淋巴细胞加入到3μl细胞溶解液(100mM TrisHCl(pH7.5)、500mM LiCl、1％十二烷基硫酸锂(LiDS)、5mM二硫苏糖醇)中，该细胞溶解液中添加有寡dT25所结合的3μg磁珠(Dynabeads)，使细胞内的mRNA与磁珠结合。接下来，将磁珠用3μlmRNA清洗用溶液A(10mM Tris HCl(pH7.5)，0.15M LiCl，0.1％LiDS)清洗1次，之后用3μl mRNA清洗用溶液B(75mM KCl，3mM MgCl₂，0.1％TritonX，0.5mM dNTP，5mM DTT，2单位RNase抑制剂)清洗1次，然后进行cDNA合成。即，向清洗后的磁珠中加入3μl cDNA合成用溶液(50mM Tris HCl(pH8.3)，75mM KCl，3mM MgCl₂，0.1％TritonX-100，0.5mM dNTP，5mM DTT，2单位RNase抑制剂，10单位SuperScript III逆转录酶(Invitrogen)，在50℃下反应1小时。接下来，用3μl 3’拖尾(テ一リング)清洗溶液(50mM磷酸钾(pH7.0)，0.5mMdGTP，0.1％Triton X-100，4mM氯化镁)清洗磁珠，重新加入3μl 3’拖尾反应溶液(50mM磷酸钾(pH7.0)，0.5mM dGTP，0.1％Triton X-100，4mM氯化镁、10U末端脱氧核苷酸转移酶)，在37℃下反应30分钟。

用3μl TE溶液(10mM Tris HCl(pH7.5)，1mM EDTA，0.1％TritonX)清洗磁珠，之后采用5’-RACE PCR法进行人免疫球蛋白γ链基因的扩增。在第1次PCR反应中，向磁珠中加入25μl的PCR反应溶液(引物1和2各10pmol、10nmol dNTP、1UタカラバイオPrimeSTAR耐热性DNA聚合酶)，进行35个循环94℃下30秒-68℃下40秒的反应。引物1的序列为：5’-CGGTACCGCGGGCCCGGGATCCCCCCCCCCCCC DN-3’(SEQ ID NO：19)，通过TdT在添加在cDNA的3’端的polydG处退火。引物2的序列为：5’-ACGCTGCTGAGGGAGTAGAGTCCTGA G-3’(SEQ ID NO：20)，来自人免疫球蛋白γ链基因恒定区。反应后，向PCR溶液中加入225μl水，以1μl稀释10倍的溶液为模板，使用引物(a)5’-CTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGA-3’(SEQ ID NO：1)和(b)5’-AGCCGGGAAGGTGTGCACGCCGCTG-3’(SEQ ID NO：2)，在与第1次PCR相同的条件下进行反应。引物(a)在与经第1次PCR扩增的DNA片段的引物1序列互补的区退火。引物(b)来自人免疫球蛋白γ链基因恒定区，位于用于第1次PCR的引物2的上游。

引物的位置关系如下所示。

如图16所示，利用琼脂糖凝胶电泳法分离2μl所得的PCR反应液时，将其加入到来自目标免疫球蛋白γ链的DNA片段(约0.8kb)中，在100-300bp附近检测到拖尾状(スメア状)的来自非特异性扩增的DNA片段。

使用0.5μl该PCR反应液与100ng通过EcoRV切断形成直链的载体(I)混合的2μl溶液，进行ET重组反应。使大肠杆菌在含有0.5％蔗糖的卡那霉素琼脂平板上增殖，将形成的5个菌落用2ml的LB培养基培养一夜，从菌体中提取质粒DNA。用BamHI/NotI切断质粒DNA后，采用琼脂糖凝胶电泳法研究靶人免疫球蛋白γ链可变区DNA片段导入到载体中的导入效率。由其结果(图17)判明：在分析的5个菌落中，靶DNA片段均被正确地插入载体中。

(实验6)

采用In-Fusion法的内部序列依赖性同源重组反应

将实验1中制备的DNA片段1、2和载体(I)以50ng∶50ng∶100ng混合的10μl溶液加入タカラバイオ/Clontech社的In-Fusion IIdry-down试剂中，在37℃下反应15分钟。将2μl用TE溶液稀释至5倍的反应液导入化学感受态细胞中进行转化。使用所得的耐药性大肠杆菌菌落，按照与实验1相同的方法进行菌落PCR，扩增插入到载体中的DNA片段。其结果(图18-1)，检测到7个插入有来自IgG的DNA片段1的质粒。检测到0个插入有来自GFP的DNA片段2的质粒、4个未插入DNA片段1和2的质粒。由以上结果判明：内部序列依赖性同源重组法是不仅适用于ET重组法、也可适用于In-Fusion法的技术。

(实验7)

采用In-Fusion法将人末梢血B淋巴细胞免疫球蛋白γ链可变区DNA 片段导入载体中

将实验5中制备的靶人免疫球蛋白γ链可变区DNA片段和载体(I)以50ng∶100ng混合的10μl溶液加入タカラバイオ/Clontech社的In-Fusion II dry-down试剂中，在37℃下反应15分钟，之后在50℃下反应15分钟。将用TE溶液5倍稀释2μl的反应液导入化学感受态细胞中进行转化。采用与实验5相同的方法，从所得的耐药性大肠杆菌菌落中提取质粒DNA。用BamHI/NotI切断质粒DNA，利用琼脂糖凝胶电泳法研究靶人免疫球蛋白γ链可变区DNA片段导入到载体中的导入效率。由其结果(图18-2)判明：在所分析的12个菌落中，靶免疫球蛋白基因片段均被正确插入载体中。根据以上结果，本发明证实：即使在作为与ET重组法的反应机理不同的同源重组法的In-Fusion法中，也可以将目标PCR产物特异性地插入载体中。

实施例2

DNA片段的制备

以实验1中使用的DNA片段I为模板，使用引物1(5’-CGGTACCGCGGGCCCGGGATCCCCCCCCCCCCCDN-3’)(SEQ IDNO：19)和分别使用以下所示的引物(b)～(e)，进行PCR反应。PCR反应条件按照实验1来进行。

以下使用的引物序列和DNA片段1的位置关系见图19。

引物(b)5’-AGCCGGGAAGGTGTGCACGCCGCTG-3’(SEQ ID NO：21)

引物(c)5’-AGGTGTGCACGCCGCTGGTC-3’(SEQ ID NO：22)

引物(d)5’-CACGCCGCTGGTCAGGGCGCCTG-3’(SEQ ID NO：23)

引物(e)5’-CTGGTCAGGGCGCCTGAGTTCCA-3’(SEQ ID NO：24)

利用离心柱法纯化PCR后的样品，之后利用琼脂糖凝胶电泳分析1μl溶液。其结果，确认到予想的尺寸的DNA片段(图20)。使用100ng实验1中制备的载体(I)与25ng各DNA片段混合的2μl溶液，进行采用Red/ET重组法的同源重组反应。使大肠杆菌在含有0.5％蔗糖的卡那霉素琼脂平板上增殖，研究形成的菌落数。所得菌落数如下：146个(DAN片段1-(b))、125个(DAN片段1-(c))、144个(DAN片段1-(d))、80个(DAN片段1-(e))。

将形成的5个菌落用2ml的LB培养基培养一夜，从菌体中提取质粒DNA。用BamHI/NotI切断质粒DNA，利用琼脂糖凝胶电泳法研究各DNA片段导入到载体中的导入效率(图21)。插入有靶DNA片段的质粒经BamHI/NotI切断后，检测到全长人免疫球蛋白γ链(约1.5kb)和载体(约4kb)。

其结果(图21)，使用DAN片段1-(b)时，以100％的比例将目的DNA片段导入载体中；使用1-(c)B、1-(d)C时，以80％的比例将目的DNA片段导入载体中；使用1-(e)时，以60％的比例将目的DNA片段导入载体中。由以上结果可知：在内部序列依赖性同源重组中，除至少单侧2个核苷酸以上的内部序列之外，还需要与扩增用引物序列合计为25个核苷酸以上。各DNA片段与载体的同源重组区图见图22。

产业实用性

本发明在基因工程学领域有用。

附图说明

图1是常规的同源重组方法的反应机理(实验1)的说明图。

图2是内部序列依赖性同源重组反应的反应机理(实验2)的说明图。

图3是基于S化-寡引物的内部序列依赖性同源重组反应的反应机理(实施例1之实验3)的说明图。

图4是使用In-Fusion法的常规同源重组反应(B图)和本发明的同源重组反应(A图)的反应机理(实施例1之实验6)的说明图。

图5是通过2次PCR制备PCR产物的方法的说明图。

图6是使用磁珠的cDNA合成法(免疫球蛋白可变区扩增法)的说明图。

图7是使用免疫球蛋白可变区的同源重组的载体导入法的说明图。

图8是实施例1中使用的DNA片段(1)(SEQ ID NO：15)的核苷酸序列。

图9是实施例1中使用的DNA片段(2)(SEQ ID NO：16)的核苷酸序列。

图10是实施例1中使用的载体I(SEQ ID NO：17)的核苷酸序列。

图11是实施例1中使用的载体II(SEQ ID NO：18)的核苷酸序列。

图12是实施例1的实验1中菌落PCR产物的电泳结果。

图13是实施例1的实验2中菌落PCR产物的电泳结果。

图14是实施例1的实验3中菌落PCR产物的电泳结果。

图15是实施例1的实验4中菌落PCR产物的电泳结果。

图16是实施例1的实验5中PCR反应液的琼脂糖凝胶电泳结果。

图17是实施例1的实验5中用BamHI/NotI切断的质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳结果。插入有靶DNA片段的质粒经BamHI/NotI切断后，检测到全长人免疫球蛋白γ链(约1.5kb)和载体(约4kb)。未插入经PCR扩增的人免疫球蛋白γ链可变区时，通过BamHI/NotI切断，检测到人免疫球蛋白γ链恒定区(约0.8kb)和载体(约4kb)。

图18-1是实施例1的实验6中菌落PCR产物的电泳结果。

图18-2是实施例1的实验7中琼脂糖凝胶电泳结果。

图19显示实施例2中使用的引物序列与DNA片段1的位置关系。

图20是实施例2中PCR后的样品(利用离心柱法进行纯化)的琼脂糖凝胶电泳结果。

图21是实施例2中用BamHI/NotI切断的质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳结果。

图22是显示实施例2中的各DNA片段与载体的同源重组区的图。

Claims (16)

1.同源重组方法，该方法使用PCR产物和线性化载体，所述PCR产物包含两末端具有扩增用引物序列P1和P2的靶基因序列；所述线性化载体具有包含与该PCR产物的扩增用引物序列P1和P2同源的核苷酸序列的同源重组区VP1和VP2，并且，在VP1的末端侧具有包含与P1内侧的部分序列T1同源的核苷酸序列的同源重组区VT1、和/或在VP2的末端侧具有包含与P2内侧的部分序列T2同源的核苷酸序列的同源重组区VT2，其中T1和T2的至少一方具有靶基因所特有的核苷酸序列，

该方法包括：使上述PCR产物参与同源重组反应，以将其插入上述载体中，由此得到在载体中特异性地插入有目标PCR产物的重组DNA分子。

2.权利要求1所述的方法，其中T1和T2的两方具有靶基因所特有的核苷酸序列。

3.权利要求1或2所述的方法，其中扩增用引物序列P1和P2的一方或两方具有靶基因所特有的核苷酸序列。

4.权利要求1～3中任一项所述的方法，其中PCR产物通过2次PCR来制备，在第1次PCR中，使用包含T1序列的扩增用引物和包含P3序列的扩增用引物来实施，其中P3序列与上述载体所具有的同源重组区VT1、VP1、VT2和VP2不具有同源性；在第2次PCR中，使用包含P1序列的扩增用引物和包含P2序列的扩增用引物来实施。

5.权利要求4所述的方法，其中包含P1序列的扩增用引物的3’端侧区和包含T1序列的扩增用引物的5’端侧区具有部分重复的序列，而包含P2序列的扩增用引物和包含P3序列的扩增用引物具有或不具有部分重复的序列。

6.权利要求1～5中任一项所述的方法，其中扩增用引物序列P1和P2分别为10个核苷酸以上。

7.权利要求1～6中任一项所述的方法，其中载体的同源重组区VP1+VT1和VP2+VT2分别为11个核苷酸以上。

8.权利要求1～7中任一项所述的方法，其中扩增用引物序列P1和P2的一方或两方来自核酸酶耐性寡引物。

9.权利要求1～8中任一项所述的方法，其中上述靶基因为抗体基因或T细胞受体基因，该靶基因包含来自上述抗体基因或T细胞受体基因的恒定区的序列和来自可变区的序列，上述载体的同源重组区VP1+VT1和VP2+VT2的一方为来自抗体基因或T细胞受体基因的恒定区的序列。

10.权利要求9所述的方法，其中上述载体的同源重组区VP1+VT1和VP2+VT2的另一方不具有来自抗体基因和T细胞受体基因的核苷酸序列。

11.权利要求1～10中任一项所述的方法，其中上述同源重组反应是使用Red即Redα/β或RecE/T体系在细胞内进行。

12.权利要求1～10中任一项所述的方法，其中上述同源重组反应通过In-Fusion法来进行。

13.靶基因的克隆方法，该方法包括：利用权利要求1～12中任一项所述的同源重组方法，制备在载体中特异性地插入有目标PCR产物的重组DNA分子，之后扩增具有所得重组DNA分子的重组体。

14.试剂盒，其中含有线性化载体，该线性化载体用于同源重组方法，所述同源重组方法包括：得到在载体中特异性地插入有PCR产物的重组DNA分子，所述PCR产物含有在两末端具有扩增用引物序列P1和P2的靶基因序列，

上述线性化载体具有包含与PCR产物的扩增用引物序列P1和P2同源的核苷酸序列的同源区VP1和VP2，并且，在VP1的末端侧具有包含与P1内侧的部分序列T1同源的核苷酸序列的同源重组区VT1、和/或在VP2的末端侧具有包含与P2内侧的部分序列T2同源的核苷酸序列的同源重组区VT2。

15.权利要求14所述的试剂盒，其中上述同源重组方法为权利要求1～12中任一项所述的方法。

16.权利要求14或15所述的试剂盒，其中上述重组DNA分子用于靶基因的克隆方法，所述靶基因的克隆方法包括：扩增具有该重组DNA分子的重组体。

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