CN104805074A - 一种制备粘性末端dna组装底物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备粘性末端DNA组装底物的方法，通过对PCR扩增引物一些位点进行硫代磷酸修饰，然后利用这对修饰引物进行PCR扩增，再利用5′→3′核酸外切酶对PCR产物进行消化，由于硫代磷酸可抑制外切酶进一步切割，从而形成一些具有粘性末端的DNA组装产物，与此粘性末端相连接的另一组装产物可以按以上方法制备，当在连接酶作用下，可以很容易进行两产物的组装。本发明方法实现了对核酸分子组装不需要内切酶，因此不受核酸分子的内切酶位点影响，简单实用。

Description

一种制备粘性末端DNA组装底物的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种制备粘性末端DNA组装底物的方法，具体为基于硫代磷修饰引物PCR联合5′→3′核酸外切酶制备粘性末端DNA组装底物的方法。

背景技术

将两个或更多DNA片段按照设计组装在一起一直是生物学研究中非常基础且重要的一步。在启动子和外显子功能研究、蛋白质功能研究以及基因操作等传统领域中DNA连接技术都有广泛的应用。而在合成生物学这门新兴学科中，DNA连接更是成为许多研究必不可少的核心步骤。尽管一系列相关手段已经被开发出来，其中包括经典的typeⅡ型限制酶技术及同源重组技术等，他们都旨在获得更高的效率、准确度、适用性和通量，但直到现在DNA连接技术仍然在平末端片段连接、一次性连接数量、连接长度、酶切位点依赖以及片段处理方面有着诸多限制，依然有很大的改进余地。本发明开发的一种新型DNA连接技术。该技术通过对PCR引物进行硫代磷酸修饰以及核酸外切酶作用下形成粘性末端的可连接低物。本技术在插入大片段的定点突变、载体构建、敲除基因片段以及嵌合编码序列上具有独特的优势。

发明内容

本发明针对现有技术存在的缺陷，旨在提供一种制备粘性末端DNA组装底物的方法，本方法具有无需核酸内切酶、快速、简单、经济、准确的优点。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种制备粘性末端DNA组装底物的方法，通过对PCR扩增引物5’端第2个位点以后的任意一磷酸二脂键位点进行硫代磷酸修饰，利用该修饰引物进行PCR扩增；再用具有5’→3′核酸外切酶活性的酶对PCR产物进行消化，获得3′突出游离端的粘性末端的DNA组装产物，利用T7连接酶将获得的DNA组装产物进行组装。

本发明所述的具有5’→3′核酸外切酶活性的酶为T7核酸外切酶和/或Lambda核酸外切酶，其反应具体为：

T7核酸外切酶：1XNEBuffer 4[50mM KAc，20mM Tris-Ac，10mM Mg(Ac)₂，1mM DTT(pH 7.925℃)]，25℃温育；

Lambda核酸外切酶：1X Lambda核酸外切酶反应缓冲液[67mM Glycine-KOH(pH 9.425℃)，2.5mM MgCl₂，50μg/ml BSA]，37℃温育。

本发明DNA组装产物之间在T7连接酶作用下进行组装的反应条件为：T7连接酶：1X T7DNA连接酶反应缓冲液[66mM Tris-HCl，1mM ATP，10mM MgCl₂，1mM DTT，7.5％PEG 6000(pH 7.625℃)]，25℃温育。

本发明所述PCR扩增引物，其连接端对第2个或之后的碱基进行硫代磷酸修饰，非连接端对第一个碱基进行硫代磷酸修饰；单链寡核苷酸DNA片段被硫代修饰的磷酸二酯键为单硫代修饰或双硫代修饰。

本发明方法按照常规的分子生物学方法进行。

本发明制备方法运用于对基因进行点突变或载体构建。

本发明的有益效果为：由于双链粘性末端是通过5′→3′核酸外切酶产生，而引物中的硫代磷酸可以抑制核酸外切酶进一步的切割，因此可以产生唯一的核酸外切酶消化后的粘性末端产物，与传统内切酶方法相比，可以不需要内切酶的使用，因此，无需要考虑目标序列是否含有内切酶位点的限制，可应用于任何核酸序列的组装；该方法按照流行的分子生物学方法进行，所需要的试剂和仪器均为常用，无需特殊购买。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1

一种制备粘性末端DNA组装底物的方法，将BDNF基因编码第100-106氨基酸序列进行删除突变，BDNF基因编码序列如SEQ ID NO.1 所示。其中删除序列为：GAGCTTTGTGTGGACCCTGAG。具体通过以下方法：

1)用Trizol法提取大鼠VTA区总RNA；

2)利用反转录引物T(18)(因绝大多数真核细胞mRNA 3’端具有Poly(A)尾，Oligo(dT)与其配对，仅mRNA可被反转录)及反转录试剂盒，把RNA转为cDNA；

3)在PCR反应体系中加入cDNA,以及表1引物组合：1和2；3和4。然后分别利用成对修饰引物进行PCR扩增(PCR反应体系为高保真聚合酶的常规PCR反应)。进行30个循环扩增，分别得到扩增产物A，扩增产物B。

产物A双链序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

产物B双链序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

表1 引物组合物

      

*代表硫代修饰位点

4)把扩增产物A和扩增产物B混合在一起，经过纯化，在5′→3′核酸外切酶(T7核酸外切酶，反应体系如上所述)及DNA连接酶(T7连接酶，反应体系如上所述)作用下可完成制备BDNF基因突变体，序列如SEQ ID NO.6所示。

      

      

      

      

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Claims (5)

1.一种制备粘性末端DNA组装底物的方法，其特征在于:包括以下步骤：对PCR扩增引物5’端第2个位点以后的任意一磷酸二脂键位点进行硫代磷酸修饰，通过PCR扩增，在具有5′→3′核酸外切酶活性的DNA外切酶作用下，获得3′突出游离端的粘性末端的DNA组装产物；利用T7连接酶将获得的DNA组装产物进行组装。

2.根据权利要求1所述的一种制备粘性末端DNA组装底物的方法，其特征在于：所述的具有5’→3′核酸外切酶活性的酶为T7核酸外切酶和/或Lambda核酸外切酶。

3.根据权利要求2所述的一种制备粘性末端DNA组装底物的方法，其特征在于：

T7核酸外切酶条件为：50mM KAc，20mM Tris-Ac，10mMMg(Ac)₂，1mM DTT，25℃温育；

Lambda核酸外切酶条件67mM Glycine-KOH，2.5mM MgCl₂，50μg/ml BSA，37℃温育。

4.根据权利要求1所述的一种制备粘性末端DNA组装底物的方法，其特征在于：所述的PCR扩增引物，其连接端对第2个或之后的碱基进行硫代磷酸修饰，非连接端对第一个碱基进行硫代磷酸修饰；单链寡核苷酸DNA片段被硫代修饰的磷酸二酯键为单硫代修饰或双硫代修饰。

5.根据权利要求1所述的一种制备粘性末端DNA组装底物的方法，其特征在于：所述的DNA组装产物之间在T7连接酶作用下进行组装的反应条件为：66mM Tris-HCl，1mMATP，10mM MgCl₂，1mM DTT，7.5％PEG 6000，25℃温育。