CN110551794B

CN110551794B - 对rna分子进行处理的方法及试剂盒和复合体

Info

Publication number: CN110551794B
Application number: CN201810565937.1A
Authority: CN
Inventors: 江媛; 徐旭; 章文蔚; 席阳; 汪为茂; 赵霞; 任悍; 王欧
Original assignee: MGI Tech Co Ltd; Complete Genomics Inc
Current assignee: MGI Tech Co Ltd; Complete Genomics Inc
Priority date: 2018-06-04
Filing date: 2018-06-04
Publication date: 2023-05-30
Anticipated expiration: 2038-06-04
Also published as: CN110551794A

Abstract

本发明涉及基因测序领域，具体涉及一种对RNA分子进行处理的方法及试剂盒和复合体。所述方法包括：基于所述RNA分子，形成第一RNA‑DNA复合体，所述第一RNA‑DNA复合体包括：双链区，所述双链区由匹配DNA单链和匹配RNA单链形成；DNA单链区，所述DNA单链区与所述匹配DNA单链的5’末端相连；以及RNA单链区，所述RNA单链区与所述匹配RNA单链的5’末端相连；在所述匹配RNA单链的3’末端连接具有平末端的双链DNA接头，以便获得第二RNA‑DNA复合体。还提供了一种对RNA处理的试剂盒。利用该方法和试剂盒，可以简化接头连接步骤，降低成本，以实现对小RNA的检测或建库测序。

Description

对RNA分子进行处理的方法及试剂盒和复合体

技术领域

本发明涉及基因测序领域，具体涉及一种对RNA分子进行处理的方法及试剂盒和复合体。

背景技术

小RNA(Small RNA)是生命活动的一类重要调控因子，长约10～40nt，广泛存在生物体中。它可通过参与调节mRNA降解、翻译抑制、异染色质形成等多种途径，在生物体基因表达调控、生物个体发育、代谢及疾病的发生等过程中发挥着重要作用。

新一代高通量测序可以在一次测序中获得样本细胞中小RNA的序列信息，能够快速鉴定出不同组织、不同发育阶段、不同疾病状态下已知和未知的小RNA表达水平及其表达差异，为研究小RNA对细胞进程的作用及其生物学影响提供了有力工具，尤其能通过测序鉴别新的小RNA。由于该技术的应用，越来越多的小RNA被发现和功能鉴定。而它在细胞内重要的调控功能，也使其具有作为疾病诊断标记物或药物靶标的潜力，并将广泛应用于疾病诊断、个性化治疗和预后等领域。

然后对于小RNA分子的测序手段还需要进一步改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种对RNA分子进行处理的方法，可以借助于高通量测序常规建库的酶及试剂，实现对小RNA的检测或建库测序，简化接头连接步骤，降低成本。

本发明是基于发明人的如下发现获得的：

针对小RNA的测序或者分析技术，通常是将小RNA从总的RNA中分离出来，然后在小RNA的两端加上特定接头后，体外反转录成cDNA后，扩增后利用测序仪对于DNA片段进行单向末端直接测序。而通过直接对小RNA连接接头，反转录进行测序或者分析的技术，存在一些技术上的难点以及成本较高的问题，主要表现在：由于建库模板为RNA，比较难直接利用常规试剂进行接头的连接，需要利用特殊的酶进行加接头反应，因此成本比较高。而且其次模板的片段太小，模板加上接头后，比较难与各种dimer(二聚物)进行分离。

为此，本发明提出了如下技术方案：

根据本发明的第一方面，本发明提出了一种对RNA分子进行处理的方法，包括：基于所述RNA分子，形成第一RNA-DNA复合体，所述第一RNA-DNA复合体包括：双链区，所述双链区由匹配DNA单链和匹配RNA单链形成；DNA单链区，所述DNA单链区与所述匹配DNA单链的5’末端相连；以及RNA单链区，所述RNA单链区与所述匹配RNA单链的5’末端相连；在所述匹配RNA单链的3’末端连接双链DNA接头，以便获得第二RNA-DNA复合体，所述双链DNA接头具有平末端。通过形成DNA和RNA的复合体结构，可以用来捕获RNA分子，尤其适用于捕获小片段RNA分子，实现RNA分子核酸信息的捕获，利于后续对RNA分子的建库和测序。

根据本发明的实施例，以上对RNA分子进行处理的方法可以进一步附加如下技术特征：

根据本发明的实施例，利用T4连接酶在所述匹配RNA单链的3’末端连接所述双链DNA接头。T4连接酶或者称T4DNA连接酶可以修补DNA-RNA复合体上的单链缺口，将双链DNA接头连接到所述匹配RNA单链的3’末端，从而可以利用DNA探针捕获RNA分子，形成第二RNA-DNA复合体结构，利于后续对RNA分子的建库和测序。

根据本发明的实施例，所述双链区上所述匹配DNA单链的3’末端含有封闭基团。所述匹配DNA单链的3’末端连有封闭基团可以防止双链DNA接头连接到所述匹配DNA单链的3’末端，同时防止第一RNA-DNA复合体上的DNA链与其发生自连。

根据本发明的实施例，所述封闭基团包括选自3'磷酸，3'开环糖如3'-磷酸-α，β-不饱和醛(PA)，3'氨基修饰，3'二脱氧核苷酸，3'硫代磷酸酯(PS)键或3'磷酸酯中的至少一种。

根据本发明的实施例，所述RNA分子的核酸长度大于等于10nt。

根据本发明的实施例，所述双链区的核酸长度大于等于6bp。

根据本发明的实施例，所述RNA单链区的核酸长度大于等于0nt。

根据本发明的实施例，所述DNA单链区的核酸长度大于等于1nt。

根据本发明的实施例，所述RNA分子选自小RNA或者mRNA中的一种。

根据本发明的实施例，所述小RNA包括SiRNA、miRNA、piRNA。根据本发明的实施例，所述小RNA包括但不限于siRNA(small interfering RNA，又称小干扰RNA)、miRNA(microRNA，也称小分子RNA或者微RNA)以及piRNA(PIWI-interacting RNA)，其中siRNA的长度通常在21～25nt之间，是由Dicer(RNAase III家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成。SiRNA主要功能是激发与之互补的目标mRNA的沉默。MiRNA长度通常在21～25nt之间，其来自于非编码RNA，主要功能是通过与靶信使核糖核酸(mRNA)特异性结合，从而抑制转录后基因表达，在调控基因表达、细胞周期、生物体发育时序等方面起着重要的作用。piRNA是一类新型的非编码小分子RNA，能够与PIWI蛋白相互作用，称为piRNA，其长度通常在24～31nt之间，通过与Argonaute家族蛋白等结合来调控mRNA的稳定性、蛋白质的合成、染色质组织和基因组的结构。

根据本发明的实施例，通过将所述RNA分子与DNA探针接触形成所述第一RNA-DNA复合体。

根据本发明的实施例，所述DNA探针的3’末端含有封闭基团。

根据本发明的实施例，所述DNA探针选自下列至少之一：与所述RNA分子部分匹配的核酸片段；含有6-30个任意核苷酸的核酸片段的混合物。针对特定序列的RNA分子所设计的DNA探针为一段特异的靶核酸杂交序列，能够与所述RNA分子部分匹配，形成所述第一RNA-DNA复合体结构。针对序列未知的RNA分子，例如小RNA分子，可以通过含有6-30个任意核苷酸的核酸片段的混合物作为DNA探针，用来捕获所有RNA分子的核酸信息。

根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：将所述第二RNA-DNA复合体进行反转录处理，以便获得反转录产物。

根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：对所述反转录产物进行环化处理，以便获得环化产物。

根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：基于所述反转录产物和所述环化产物的至少之一构建测序文库。

根据本发明的第二方面，本发明提供了一种对RNA分子进行处理的装置，包括：

RNA-DNA复合模块，所述RNA-DNA复合模块基于所述RNA分子，形成第一RNA-DNA复合体，所述第一RNA-DNA复合体包括：

双链区，所述双链区由匹配DNA单链和匹配RNA单链形成；

DNA单链区，所述DNA单链区与所述匹配DNA单链的5’末端相连；以及

RNA单链区，所述RNA单链区与所述匹配RNA单链的5’末端相连；

接头连接模块，所述接头连接模块与所述RNA-DNA复合模块相连，所述接头连接模块在所述匹配RNA单链的3’末端连接双链DNA接头，以便获得第二RNA-DNA复合体，所述双链DNA接头具有平末端。

根据本发明的实施例，以上对于RNA分子进行处理的装置可以进一步附加如下技术特征：

根据本发明的实施例，所述接头连接模块利用T4连接酶在所述匹配RNA单链的3’末端连接所述双链DNA接头。

根据本发明的实施例，所述双链区上所述匹配DNA单链的3’末端含有封闭基团。

根据本发明的实施例，所述双链DNA接头的另一端长短不一，所述双链DNA接头的长链与所述匹配RNA单链的3’末端连接。

根据本发明的实施例，所述RNA分子的核酸长度大于等于10nt。

根据本发明的实施例，所述双链区的核酸长度大于等于6bp。

根据本发明的实施例，所述小RNA包括SiRNA、miRNA、piRNA。

根据本发明的实施例，所述装置进一步包括：

反转录模块，所述反转录模块与所述接头连接模块相连，所述反转录模块适于对所述第二RNA-DNA复合体进行反转录处理，以便获得反转录产物。

根据本发明的实施例，所述装置进一步包括：

环化处理模块，所述环化处理模块与所述反转录模块相连，所述环化处理模块适于对所述反转录产物进行环化处理，以便获得环化产物。

根据本发明的实施例，所述装置进一步包括：

测序文库构建模块，所述测序文库构建模块与所述反转录模块或者与所述环化处理模块相连，所述测序文库构建模块基于所述反转录产物和所述环化产物的至少之一构建测序文库。

上述对本发明任一实施例中的RNA进行处理的方法的优点和技术特征的描述，同样适用本发明这一实施方式的对RNA进行处理的装置，在此不再赘述。

根据本发明的第三方面，本发明提供了一种试剂盒，包括：DNA探针，所述DNA探针用来捕获RNA分子；双链DNA接头，所述双链DNA接头具有平末端。利用本发明提供的试剂盒，用DNA探针捕获RNA分子，形成至少部分匹配的RNA-DNA复合体，然后将具有平末端的双链DNA接头连接到RNA-DNA复合体上的RNA分子的3’末端，形成连接有双链DNA接头的RNA-DNA复合体，然后通过反转录PCR和/或荧光定量PCR等，实现RNA分子的建库以及定量检测等。

根据本发明的实施例，所述试剂盒可以进一步附加如下技术特征：

根据本发明的实施例，所述双链DNA接头的另一端为粘性末端。

根据本发明的实施例，所述DNA探针的3’末端含有封闭基团。

根据本发明的实施例，所述封闭基团包括选自3’磷酸，3’开环糖如3’-磷酸-α，β-不饱和醛(PA)，3’氨基修饰，3’二脱氧核苷酸，3’硫代磷酸酯(PS)键或3’磷酸酯中的至少一种。

根据本发明的实施例，所述DNA探针选自下列至少之一：与所述RNA分子部分匹配的核酸片段；含有6-30个任意核苷酸的核酸片段的混合物。

根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包括T4DNA连接酶。所述T4DNA连接酶用于将双链DNA接头连接到RNA-DNA复合体上的RNA分子的3’末端。

根据本发明的实施例，所述DNA探针与所述RNA分子形成第一RNA-DNA复合体，所述第一RNA-DNA复合体包括：双链区，所述双链区由匹配DNA单链和匹配RNA单链形成；DNA单链区，所述DNA单链区与所述匹配DNA单链的5’末端相连；以及RNA单链区，所述RNA单链区与所述匹配RNA单链的5’末端相连。

根据本发明，所述试剂盒还可以进一步包括缓冲液，例如包括但不限于用于DNA探针和RNA分子杂交的杂交缓冲液，这些杂交缓冲液可以通过商业获得，或者本领域技术人员配制得到，例如可以为Epicentre公司的TA缓冲液；用于双链DNA接头与RNA-DNA复合体上RNA分子3’末端连接的连接缓冲液，所述连接缓冲液也可以称作连接混合液，例如可以包括BSA、Tris-HCl、氯化镁、DTT、PEG-8000和ATP等。

根据本发明，所述试剂盒还可以进一步包括其他物质，例如用来进行反转录扩增的反转录引物以及用来进行荧光定量的荧光定量PCR引物等等。该试剂盒还可以配合其他商用试剂盒一并使用，例如，在对全血的小RNA进行建库测序的时候，可以利用商用的小RNA试剂盒提取血样中的小RNA，还可以利用商用的反转录试剂盒对连接了双链DNA探针后的连接产物进行反转录处理等等。

根据本发明的第四方面，本发明提供了一种试剂盒在RNA分子测序领域中的应用，所述试剂盒为根据本发明第三方面所述的试剂盒。根据本发明的实施例，所述RNA分子的核酸长度大于等于10nt。

根据本发明的第五方面，本发明提供了一种RNA-DNA复合体，所述RNA-DNA复合体包括：双链区，所述双链区由匹配DNA单链和匹配RNA单链形成；

DNA单链区，所述DNA单链区与所述匹配DNA单链的5’末端相连；

RNA单链区，所述RNA单链区与所述匹配RNA单链的5’末端相连；以及

双链DNA接头区，所述双链DNA接头区与所述匹配RNA单链的3’末端相连，所述双链DNA接头具有平末端。

根据本发明的实施例，以上所述RNA-DNA复合体可以进一步附加如下技术特征：

根据本发明的实施例，以上所述RNA-DNA复合体中，所述双链区上所述匹配DNA单链的3’末端含有封闭基团。

根据本发明的实施例，以上所述RNA-DNA复合体中，所述封闭基团包括选自3’磷酸，3’开环糖如3’-磷酸-α，β-不饱和醛(PA)，3’氨基修饰，3’二脱氧核苷酸，3’硫代磷酸酯(PS)键或3’磷酸酯中的至少一种。

根据本发明的实施例，以上所述RNA-DNA复合体中，所述双链DNA接头的另一端长短不一，所述双链DNA接头的长链与所述匹配RNA单链的3’末端连接。

根据本发明的实施例，以上所述RNA-DNA复合体中，所述RNA分子的核酸长度大于等于10nt。

根据本发明的实施例，以上所述RNA-DNA复合体中，所述双链区的核酸长度大于等于6bp。

根据本发明的实施例，以上所述RNA-DNA复合体中，所述RNA单链区的核酸长度大于等于0nt。

根据本发明的实施例，以上所述RNA-DNA复合体中，所述DNA单链区的核酸长度大于等于1nt。

根据本发明的实施例，以上所述RNA-DNA复合体中，所述RNA分子选自小RNA或mRNA中的一种。

根据本发明的实施例，以上所述RNA-DNA复合体中，所述小RNA包括SiRNA、miRNA、piRNA。

本发明所取得的有益效果为：通过本发明对RNA进行处理的方法以及装置，可以利用NGS常规建库的酶及试剂，实现对RNA分子的检测或建库测序，主要解决现有技术接头连接步骤复杂及成本高的问题，尤其适用于小RNA的建库以及测序或者检测。

附图说明

图1为根据本发明的一个实施例提供的第一RNA-DNA复合体的结构示意图。

图2为根据本发明的一个实施例提供的第二RNA-DNA复合体的结构示意图。

图3为根据本发明的一个实施例提供的进行所述连接反应的示意图。

图4为根据本发明的一个实施例提供的一种对于小RNA的检测方案图。

图5为根据本发明的一个实施例提供的反转录产物的结构示意图。

图6为根据本发明的一个实施例提供的一种对于小RNA的检测方案图。

图7为根据本发明的一个实施例提供的对于连接产物利用10％的变性聚丙烯酰胺凝胶胶图。

图8为根据本发明的一个实施例提供的对于连接产物利用10％的变性聚丙烯酰胺凝胶胶图。

图9为根据本发明的一个实施例提供的对于反转录产物进行荧光定量PCR的结果图。

图10为根据本发明的一个实施例提供的环化结果图。

图11为根据本发明的一个实施例提供的对于环化产物进行荧光定量PCR的结果图。

图12为根据本发明的一个实施例提供的对于环化产物进行荧光定量PCR的结果图。

图13为根据本发明的一个实施例提供的对于反转录产物进行荧光定量PCR的结果图。

图14为根据本发明的一个实施例提供的对RNA分子进行处理的装置的示意图。

图15为根据本发明的一个实施例提供的对RNA分子进行处理的装置的示意图。

图16为根据本发明的一个实施例提供的对RNA分子进行处理的装置的示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明通过利用常规酶反应试剂实现将接头加入RNA分子中，极大程度节约成本，将受益于多种科研应用和试剂盒包装，市场潜力和前景非常广阔。

本发明利用常规NGS接头加入方法实现在RNA分子上加入接头，并提供了一系列基于该方法的技术方案，包括该技术方案所需要的寡核苷酸序列组成、酶和试剂组分、反应条件、方法步骤等。

本发明是基于如下原理所实现的：在适当的反应条件下，DNA探针和RNA分子杂交，形成DNA-RNA杂交复合体，然后利用某些连接酶将平末端接头连接到RNA分子的3’末端。

基于上述基本原理和元素设计，本发明提出了一系列实施方案，下文将逐一介绍。特别地，除下文介绍的实施方案，其他类似方案及其变形方案也包括在本发明的权利范围之内。

需要说明的是，为了使本领域技术人员更容易理解本发明，本文中对于本发明中的某些术语进行解释和说明，这些解释和说明不应当看做是对于本发明的限制。

对RNA分子进行处理的方法

本发明提出了一种对RNA进行处理的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：

将所述RNA与DNA探针接触，形成第一RNA-DNA复合体；

将具有平末端的双链DNA接头连接到所述第一RNA-DNA复合体上的RNA分子的3’末端，获得含有平末端接头的第二RNA-DNA复合体。

利用本发明的方法在将具有平末端的双链DNA接头连接到所述第一RNA-DNA复合体上的RNA分子的3’末端时，连接反应所需试剂简单，无需额外特殊的酶，成本较低。

在本文中，所述第一RNA-DNA复合体如图1所示。该第一RNA-DNA复合体包括双链区，所述双链区由相互匹配的DNA单链和RNA单链形成；DNA单链区，所述DNA单链区与所述匹配DNA单链的5’末端相连；以及RNA单链区，所述RNA单链区与所述匹配RNA单链的5’末端相连。所述第一RNA-DNA复合体包括一条与所述RNA分子部分匹配的DNA链以及所述RNA分子链，通过形成双链区、DNA单链区以及RNA单链区捕获所述RNA分子，以便实现后续对于RNA分子的建库或者测序等等。

根据本发明的实施例，所形成的第一RNA-DNA复合体中，也可以不含有RNA单链区，即RNA单链区的核酸长度为0nt。这样所形成的RNA-DNA复合体中可以仅包含有双链区以及DNA单链区。

在本文中，所述RNA分子，也可以称为RNA片段，其可以是长度为10-500nt的核酸片段样品，优选为长度为10-100nt的核酸片段。根据本发明的实施例，其可以是small RNA片段也可以是经过打断后的其他RNA片段，例如mRNA分子。由此，采用本发明的方法可以实现对小RNA分子的测序。也可以通过对打断后的RNA分子进行测序，然后得到未打断前的长的RNA分子的核酸信息。所述RNA分子样品可以从感兴趣的任何生物获得或提供。这些生物体包括植物、动物(例如，哺乳动物，包括人和非人灵长类动物)、病原体(如细菌和病毒)。从生物体获得多核苷酸(例如RNA等)的方法是本领域熟知的。

在本文中，DNA探针可以是一段可与RNA分子进行序列互补配对的核酸片段，也可以是一段含N的核酸片段。当目标区域的RNA分子序列已知时，所述DNA探针可以是一段特异的能够与目标区域的RNA分子序列互补配对的核酸片段，通过将DNA探针与相应的RNA分子接触，反应，可以用于目标序列捕获建库。当目标区域的RNA分子序列未知时，例如对未知小RNA进行建库测序，所述的DNA探针可以是一段随机序列片段，所述随机序列片段上的碱基任意排列，选自A/T/G/C四种碱基中的任意一种，所述DNA探针为包含这些随机序列片段的混合物。所述DNA探针的核酸长度优选为6-30bp。每一条DNA探针均包含这些长度的核酸的任意排列。将所有DNA探针的混合物与未知序列的RNA序列混合，可以用于未知序列的RNA序列的建库以及测序。

同时，所述DNA探针的3’末端含有3'封闭基团，所述3’封闭基团包括但不限于3'磷酸，3'开环糖如3'-磷酸-α，β-不饱和醛(PA)，3'氨基修饰，3'二脱氧核苷酸，3'硫代磷酸酯(PS)键或3'磷酸酯等。所述DNA探针的3’末端经过封闭基团处理，可以后续在连接双链DNA接头的过程中，防止DNA探针与双链DNA接头连接。

根据本发明的一种具体实施方式，将所述RNA分子与所述DNA探针混合后，然后加入缓冲液，进行杂交反应获得所述第一RNA-DNA复合体。根据本发明的实施例，所述杂交反应为在80～95℃条件下进行1～2分钟，然后在60～70℃进行10～20分钟，然后在37℃进行10～20分钟。根据本发明的又一实施例，所述杂交反应为在80～95℃条件下进行1～2分钟，然后在以0.1～0.5秒/每℃的速率降温至37℃，然后在37℃条件下进行10～20分钟。

将所述DNA探针与所述RNA分子接触形成所述第一RNA-DNA复合体后，需要将双链DNA接头连接到所述第一RNA-DNA复合体上，即进行连接反应，形成第二RNA-DNA复合体。在进行所述连接反应时，本发明使用的连接酶能够在合适的条件下和适当的底物浓度下，介导DNA与RNA 3’末端的连接。例如可以利用T4DNA连接酶将DNA探针和RNA模板进行连接。已知，T4DNA ligase(T4DNA连接酶)不仅可介导双链DNA分子间平末端的连接，还可介导双链DNA分子间粘性末端的连接。而且，T4DNA ligase还可介导以DNA为模板的DNA与RNA的缺口之间的连接。

根据本发明的实施例，所述双链DNA接头的一端具有平末端，平末端用来同所述RNA分子进行连接。所述双链DNA接头的另一端可以是粘性末端，可以是平末端，也可以仅仅是长短不同，并不作特殊要求。

根据本发明的一种具体实施方式，将所述第一RNA-DNA复合体以及双链DNA接头，连同其他连接混合液混合，在37℃条件下发生连接反应。根据本发明的实施例，所述连接混合液包括BSA、Tris-Cl、氯化镁、DTT、PEG-8000和ATP以及T4DNA连接酶。

在本文中，所述第二RNA-DNA复合体相比较于所述第一RNA-DNA复合体来说，在所述匹配RNA单链的3’末端连接上具有平末端的双链DNA接头，如图2所示。所述第二RNA-DNA复合体包括：双链区，所述双链区由匹配DNA单链和匹配RNA单链形成；DNA单链区，所述DNA单链区与所述匹配DNA单链的5’末端相连；RNA单链区，所述RNA单链区与所述匹配RNA单链的5’末端相连；以及双链DNA接头区，所述双链DNA接头区与所述匹配RNA单链的3’末端相连，所述双链DNA接头具有平末端。

根据本发明的实施例，所形成的第二RNA-DNA复合体中，也可以不含有RNA单链区，即RNA单链区的核酸长度为0nt。这样所形成的RNA-DNA复合体仅包含双链区，DNA单链区，双链DNA接头区。

根据本发明的一种具体实施方式，本发明提供了一种Small RNA测序检测方案。如图4所示，将所述第二RNA-DNA复合体进行反转录处理，即将所述第二RNA-DNA复合体与反转录引物通过热变性杂交，经反转录扩增得到反转录产物，然后利用酶反应直接成环，得到环化产物，进行扩增建库。

根据本发明的实施例，所形成的反转录产物如图5所示，包括所述RNA分子以及双链DNA接头中与所述RNA分子相连的DNA链(即来自双链DNA接头的长链)，以及反转录引物链，所述反转录引物链与所述双链DNA接头中与所述RNA分子相连的DNA链部分互补配对，未配对部分构成了接头区域。所述接头区域可以用于后续的环化处理。

根据本发明的实施例，利用反转录产物形成包含有反转录引物链核酸的单链环，作为环化产物。所述环化产物中含有所述RNA分子的反转录产物，可以通过对所述环化产物进行测序或者扩增后测序，来获得所述RNA分子的核酸信息，例如所述RNA分子的长度以及碱基排列等。

根据本发明的实施例，对所述环化产物进行建库，得到含有相应的RNA分子核酸序列的文库。例如，根据华大生产的BGI SEQ-500高通量基因测序仪或其衍生产品对环状DNA进行建库，可以快速便捷的获得建库样本。

根据本发明的一种具体实施方式，本发明提供了一种小RNA测序检测方案，如图6所示。将所述第二RNA-DNA复合体进行反转录处理，即将所述第二RNA-DNA复合体与反转录引物通过热变性杂交，经反转录扩增得到反转录产物，然后经PCR进行扩增建库。根据本发明的实施例，利用T4DNA连接酶在RNA模板3’末端加入一部分DNA接头，然后利用PCR在反转录产物的3’端加入第二部分DNA接头。

根据本发明的另一种具体实施方式，本发明提供了一种Small RNA定量检测方案，即将所述第二RNA-DNA复合体进行反转录处理，即将所述第二RNA-DNA复合体与反转录引物通过热变性杂交，经反转录扩增得到反转录产物，然后再利用荧光定量PCR的方式进行定量检测。

另外，需要说明的是，本文中在表述核酸分子之间“连接”或者“相连”等时，指的是核酸分子之间通过5’-3’磷酸二酯键进行连接。

本文中，所述RNA-DNA复合体或者RNA-DNA杂交复合体，均是指同时包含RNA和DNA分子的杂交片段，这些复合体根据情况可以是部分互补配对的杂交片段，也可以是全部互补配对的杂交片段。所述RNA-DNA复合体或者RNA-DNA杂交复合体也可以表述为DNA-RNA复合体或者DNA-RNA杂交复合体。

本文中“反转录”作本领域常规理解，是指以RNA为模板，通过反转录酶，合成DNA的过程。反转录也称作逆转录。

本文中，所述“互补”或者“配对”或者“匹配”或者“互补配对”等为本领域的通常解释，指的是核酸分子的碱基之间的一种一一对应的关系，是由于碱基之间的氢键具有固定的数目和DNA两条链之间的距离保持不变，使得碱基配对遵循的一种规律，具体可以是在双链DNA分子之间或者某些双链RNA分子之间，或者是单链DNA与单链RNA分子之间，腺嘌呤A与胸腺嘧啶T(或尿嘧啶U)，鸟嘌呤G与胞嘧啶C配对。

对RNA分子进行处理的装置

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种对RNA分子进行处理的装置，所述装置如图14所示，包括RNA-DNA复合模块以及接头连接模块，所述RNA-DNA复合模块与所述接头连接模块相连，所述RNA-DNA复合模块基于所述RNA分子，形成第一RNA-DNA复合体，所述第一RNA-DNA复合体包括：双链区，所述双链区由匹配DNA单链和匹配RNA单链形成；DNA单链区，所述DNA单链区与所述匹配DNA单链的5’末端相连；以及RNA单链区，所述RNA单链区与所述匹配RNA单链的5’末端相连。所述接头连接模块在所述匹配RNA单链的3’末端连接双链DNA接头，以便获得第二RNA-DNA复合体，所述双链DNA接头具有平末端。

根据本发明的另一种具体实施方式，所述装置如图15所示，进一步包括：反转录模块以及测序文库构建模块；所述反转录模块与所述接头连接模块相连，所述反转录模块适于对所述第二RNA-DNA复合体进行反转录处理，以便获得反转录产物；所述测序文库构建模块与所述反转录模块相连，所述测序文库构建模块基于所述反转录产物构建测序文库。

根据本发明的又一种具体实施方式，所述装置如图16所示，进一步包括：反转录模块、环化处理模块以及测序文库构建模块。所述反转录模块与所述接头连接模块相连，所述反转录模块适于对所述第二RNA-DNA复合体进行反转录处理，以便获得反转录产物；所述环化处理模块与所述反转录模块相连，所述环化处理模块适于对所述反转录产物进行环化处理，以便获得环化产物；所述测序文库构建模块与所述环化处理模块相连，所述测序文库构建模块基于所述环化产物构建测序文库。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1连接测试

1、探针去磷酸化反应

分别取20pmol合成的YJ438和YJ439引物(具体见表1)加入5U rSAP酶(NEB公司)，补加1μL buffer2反应缓冲液(NEB公司)，用水补到10μL。涡旋混匀后放入PCR仪中，反应程序如下所示：37℃，30分钟，65℃反应15分钟，然后4℃保存。

其中rSAP酶为虾碱性磷酸酶，是一种热敏感的重组碱性磷酸酶，能够非特异性的催化DNA和RNA 5’和3’磷酸单脂的去磷酸化反应。

经过去磷酸化处理的YJ438和YJ439引物分别作为DNA探针序列，用于下述和RNA分子杂交。

2、变性杂交

分别取上述处理后的0pmol～2pmol YJ-438和YJ439与0pmol～10pmol YJ-824RNA分子(具体见表1)混合，加入2μL 10x TA反应缓冲液(Epicentre公司)，其他用水补到20μL。涡旋混匀后放入PCR仪中，反应程序如下所示：95℃，1分钟，以0.1秒的速率降温至37℃。

3、连接

然后加入连接混合液，使得反应的总体积为50μL，其中，所述连接混合液包括：0.05mg/mL BSA(New England Biolabs),50mM Tris-Cl pH7.8(Amresco),10mM MgCl₂(EMDMillipore),0.5mM DTT(VWR Scientific),10％PEG-8000(Sigma Aldrich)and 1mM ATP(Sigma Aldrich),52pmol of adapter142_3’(Ad_top and Ad_bottom，具体见表1)，1800UT4 DNA ligase(Enzymatics)。

其中，各核酸序列如下表所示：

表1各核酸序列

其中表1中SEQ ID NO:4或者SEQ ID NO:5中的3ddC代表相应核酸的3’末端进行了封闭修饰。其中，3ddC代表3’末端的胞嘧啶核苷酸进行了双脱氧修饰。3phos代表3’末端进行了3’磷酸修饰。

4.聚丙烯酰胺凝胶电泳

取3.5μL连接产物进行10％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

结果如图7所示，图7的上方分别给出了反应体系中加入的物质。其中泳道1和2为重复测试组，反应体系中均含有YJ438，YJ824，连接酶和接头，所得聚丙烯酰胺凝胶电泳图中显示在80bp处有条带，其对应YJ438探针序列；在48bp处有条带，对应RNA分子YJ824和接头连接后的产物；在29bp左右有条带，对应RNA分子YJ824；在15bp左右有两条条带，分别对应DNA接头的两条链。从泳道1和2的结果可以看出，YJ438探针序列和YJ824RNA分子以及DNA接头能够形成RNA-DNA杂交复合体。

其中，泳道3-13为阴性对照组。和泳道1和2相比，泳道3的反应体系中只有YJ438，YJ824和连接酶。泳道4的反应体系中只有YJ438，接头和连接酶。泳道5的反应体系中只有YJ824，连接酶和接头。泳道6的反应体系中只有接头和连接酶。泳道7只有YJ438，泳道8只有YJ824。泳道9只有接头。泳道10只有YJ439，所得聚丙烯酰胺凝胶电泳图中显示在90bp处有条带，其对应YJ439探针序列。泳道11均含有YJ439，YJ824，连接酶和接头，但是电泳图中未见有连接后的产物生成。泳道12的反应体系中只有YJ439，YJ824和连接酶，泳道13的反应体系中只有YJ439，接头和连接酶。

YJ438探针序列可以和YJ824RNA分子互补杂交，而YJ439探针序列则不与YJ824RNA分子互补杂交。对比lane 1-13可知，当DNA和RNA杂交形成杂交复合体后，T4DNA ligase可介导平末端接头与RNA 3’末端的连接。

实施例2：连接及表达水平检测

1、变性杂交

分别取0μL～1μL 10μM miR-39(RNA分子)和0μL～1μL 10μM miR-39CO探针(DNA探针)混合，加入2μL 10x杂交缓冲液，其他用水补到20μL。涡旋混匀后放入PCR仪中，反应程序如下所示：80℃，2分钟；68℃，15分钟；37℃，15分钟。

2、连接

然后加入连接混合液，使得反应总体积为50μL。其中，所述连接混合液包括：0.05mg/mL BSA(New England Biolabs)，50mM Tris-Cl pH7.8(Amresco)，10mM MgCl₂(EMDMillipore),0.5mM DTT(VWR Scientific)，10％PEG-8000(Sigma Aldrich)and 1mM ATP(Sigma Aldrich)，10μL 10μM Binding-adapter(Branch-AD-P and ON3665，具体见表2),1800U T4 DNA ligase(Enzymatics)。

3.聚丙烯酰胺凝胶电泳

取5μL连接产物进行10％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图8所示。其中，泳道1的反应体系中只加入了探针，泳道2的反应体系中只加入了miR-39，泳道3的反应体系中只加入了接头，泳道4的反应体系中加入了探针和接头，泳道5的反应体系中有探针和miR-39，泳道6的反应体系中是miR-39和接头；泳道7和8为实验组，加入了探针，miR-39和接头；泳道9为跑胶时作为对照的miR-39，泳道10为跑胶时作为对照的探针，泳道11为跑胶时作为对照的接头。

对比lane1-11可知，当DNA和RNA杂交形成杂交复合体之后，T4DNA连接酶可以高效的催化平末端接头与RNA的3’末端连接。而且在泳道6中可以见到很淡的产物条带(58nt)，泳道7和8中可以见到较亮的产物条带(58nt)。

4、逆转录

取5μL连接产物，使用Invitrogen SuperScript^TM IV First-Strand SynthesisSystem(货号：18091050)逆转录试剂盒进行逆转录，得到逆转录产物。

其中，反转录用到的引物如表2所示(SEQ ID NO:10)。反应方案遵循官方推荐，反应体系20μL。

5、荧光定量PCR检测miR-39表达水平

逆转录产物稀释100倍进行荧光定量PCR检测，检测体系10μL，检测试剂为ABIFast SYBR Green qPCR Master Mix(2X)，检测仪器为Applied Biosystems^TM StepOne^TMReal-Time PCR System,laptop(货号：4376373)，所用到的引物如表2所示(SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12)。

检测结果如图9所示。其中，图9是逆转录产物荧光定量PCR的结果图。其中第一组的反应体系中只有探针；第二组的反应体系中只有miR-39；第三组的反应体系中只有接头；第四组的反应体系中有探针和接头；第五组的反应体系中有探针和miR-39；第六组的反应体系中是miR-39和接头，可以检测到少量的miR-39；第七组为实验组，加入了探针，miR-39和接头，可以检测到较高水平的miR-39。

由此，对比1-7组的结果可知，本方案可以有效的捕获是小RNA分子。

表2实施例2中所用到的核酸序列

实施例3：测试small RNA建库

1、small RNA制备

利用合成的5种类不同small RNA(sRNA1,sRNA2,sRNA3,sRNA4,sRNA5)，将其等分子量pooling混合，作为测试的样本模板。5种RNA信息如表3所示。

2、变性杂交

分别取1μL 10μM第一步中的small RNA分别和1μL 10μM DNA探针(即sRNA1CO和sRNA3CO的混合物)以及1μL 10μM DNA random DNA探针(random CO)混合，加入2μL 10x杂交缓冲液，其他用水补到20μL。涡旋混匀后放入PCR仪中，反应程序如下所示：80℃，2分钟；68℃，15分钟；37℃，15分钟。

其中，所述DNA探针信息见表3。

3、连接

然后加入连接混合液，使得反应总体积为50μL。其中，所述连接混合液包括：0.05mg/mL BSA(New England Biolabs)，50mM Tris-Cl pH7.8(Amresco)，10mM MgCl₂(EMDMillipore),0.5mM DTT(VWR Scientific)，10％PEG-8000(Sigma Aldrich)and 1mM ATP(Sigma Aldrich),10μL 10μM Binding-adapter(Branch-AD-P and ON3665，具体序列与实施例2相同，为了方便也列举在表3中)，1800U T4DNA ligase(Enzymatics)。

利用醇沉法纯化连接产物，最后溶解到10μL。

4、逆转录PCR(RT-PCR)

取10μL连接产物，使用Invitrogen SuperScript^TM IV First-Strand SynthesisSystem(货号：18091050)逆转录试剂盒进行逆转录，得到逆转录产物。

其中，反转录用到的引物(RT primer，与实施例2相同，为了方便查看，也表示在表3中)如表3所示。反应方案遵循官方推荐，反应体系20μL。

5、切胶回收RT-PCR产物

利用10％的TBE-PAGE胶，进行切胶回收，回收相应片段的DNA产物。

6、反转录产物环化

取10μL反转录产物，然后加入CircLigase I/II的连接混合液，使得反应的总体积为20μL，其中，CircLigase I的连接混合液包括：2μL 10x CircLigase Reaction Buffer，1μL 1mM ATP，1μL 50mM MnCl₂，1μL CircLigase ssDNA ligase(100U)；CircLigase II的连接混合液包括：2μL 10x CircLigase Reaction Buffer，4μL 5M Betaine，1μL 50mMMnCl₂，1μL CircLigase II ssDNA ligase(100U)。

环化结果如图10所示，其中第一组为环化连接酶I(CircLigase I)的环化结果，第二组为环化连接酶II(CircLigase II)的环化结果，第三组为对照ssDNA。由此可见，线性DNA可以经酶反应直接成环，因此消化掉DNA和RNA杂交链后的单链逆转录产物，可以直接进行环化，用于后续测序检验。

7荧光定量PCR检测

将反转录产物进行稀释100倍进行荧光定量PCR检测，检测体系10μL，检测试剂为ABI Fast SYBR Green qPCR Master Mix(2X)，检测仪器为Applied Biosystems^TMStepOne^TM Real-Time PCR System,laptop(货号：4376373)，所用到的引物(qF-sRNA1、qF-sRNA2、qF-sRNA3、qF-sRNA4、qF-sRNA5、qR)如表3所示。

表3测试小RNA检测用到的序列

由于sRNA模板是5种sRNA的混合物，只有在杂交捕获的时候加入相应的探针(即DNA探针sRNA1CO和sRNA3CO)，才能检测到对应的sRNA种类，检测结果如图11所示。而当使用随机探针的时候，可以检测出所有种类的sRNA，如图12所示。以上结果证实了本方案应用的可行性。

实施例4：细胞样品small RNA建库

1、small RNA制备

根据试剂盒说明书及商家官网记载，利用QIAGEN的QIAseq miRNA Library Kit(货号：331502)提取商业化NA12878cell的small RNA。

2、变性杂交

取10pmol第一步中的small RNA或10pmol化学合成的let-7b(表4中名称为Has-let-7b，作为内参)和1μL 10μM let-7b DNA探针(即表4中的Has-let-7b CO)混合，加入2μL10x杂交缓冲液，其他用水补到20μL。涡旋混匀后放入PCR仪中，反应程序如下所示：80℃，2分钟；68℃，15分钟；37℃，15分钟。

其中，所述DNA探针以及内参RNA序列信息见表4。

3、连接

然后加入连接混合液，使得反应总体积为50μL。其中，所述连接混合液包括：0.05mg/mL BSA(New England Biolabs)，50mM Tris-Cl pH7.8(Amresco)，10mM MgCl₂(EMDMillipore),0.5mM DTT(VWR Scientific)，10％PEG-8000(Sigma Aldrich)and 1mM ATP(Sigma Aldrich),10μL 10μM Binding-adapter(Branch-AD-P and ON3665，同实施例3)，1800U T4DNA ligase(Enzymatics)。其中连接接头，即Binding-adapter的核酸序列同实施例3相同，也列在表4中。

利用醇沉法纯化连接产物，最后溶解到10μL。

4、逆转录PCR(RT-PCR)

其中，反转录用到的引物核酸序列(RT primer)同实施例3相同，也列举在表4中。反应方案遵循官方推荐，反应体系20μL。

5、荧光定量PCR检测

将内参组稀释为多个浓度梯度和反转录产物进行荧光定量PCR检测，检测体系10μL，检测试剂为ABI Fast SYBR Green qPCR Master Mix(2X)，检测仪器为AppliedBiosystems^TM StepOne^TM Real-Time PCR System,laptop(货号：4376373)，所用到的引物(qF-let 7b，qR)如表4所示。

表4细胞样品小RNA检测用到的序列

检测结果如图13所示，其中标准1为稀释10^7倍后内参组相对定量结果，将该结果定义为1，标准2为稀释10^8倍后内参组相对定量结果，样品为细胞样品反转录产物的相对定量结果。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接或彼此可通讯；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 完整基因有限公司，深圳华大生命科学研究院

<120> 对RNA分子进行处理的方法及试剂盒和复合体

<130> PIDC3182179

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgatggccag cgtggacaac ccccacgtgt gccgcctgct gggcatctgc ctcacctcca 60

ccgtgcagct catcacgcag 80

<210> 2

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctcatgccct tcggctgcct cctggactat gtccgggaac acaaagacaa tattggctcc 60

cagtacctgc tcaactggtg tgtgcagatc 90

<210> 3

<211> 29

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

cccguacucc ugcgugauga gcugcacgg 29

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tctgctgagt cgagaacgt 19

<210> 5

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgactcagca ga 12

<210> 6

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

ucaccgggug uaaaucagcu ug 22

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cagcactaca agctgattta cacccggtgc catagtccat gcta 44

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gtctccagtc gaagcatagt cggaggccaa gcggt 35

<210> 9

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcttcgactg gaga 14

<210> 10

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgtgagccaa ggagttgttg tcttcctaag accgcttggc ctccgact 48

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tcaccgggtg taaatcagct tg 22

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tgtgagccaa ggagttg 17

<210> 13

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 13

ucaccgggug uaaaucagcu ug 22

<210> 14

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 14

uacccguaau cuucauaauc cgag 24

<210> 15

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 15

uuuguacucc gaugccauuc aga 23

<210> 16

<211> 29

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 16

cccguacucc ugcgugauga gcugcacgg 29

<210> 17

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 17

ugagguagua gguugugugg uu 22

<210> 18

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cagcactaca agctgattta cacccggtgc catagtccat gcta 44

<210> 19

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cagcactatc tgaatggcat cggagtacaa accatagtcc atgcta 46

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(24)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 20

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnn 24

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tcaccgggtg taaatcagct tg 22

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

tacccgtaat cttcataatc cgag 24

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tttgtactcc gatgccattc aga 23

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

cccgtactcc tgcgtgat 18

<210> 25

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

aggctgaggt agtaggttgt gtggtt 26

<210> 26

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 26

ugagguagua gguugugugg uu 22

<210> 27

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

cagcactaca agctgattta cacccggtgc catagtccat gcta 44

<210> 28

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

aggctgaggt agtaggttgt gtggtt 26

Claims

1.一种对RNA分子进行处理的方法，其特征在于，包括：

基于所述RNA分子，形成第一RNA-DNA复合体，所述第一RNA-DNA复合体包括：

双链区，所述双链区由匹配DNA单链和匹配RNA单链形成；

RNA单链区，所述RNA单链区与所述匹配RNA单链的5’末端相连；

在所述匹配RNA单链的3’末端连接双链DNA接头，以便获得第二RNA-DNA复合体，所述双链DNA接头具有平末端。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用T4连接酶在所述匹配RNA单链的3’末端连接所述双链DNA接头。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双链区上所述匹配DNA单链的3’末端含有封闭基团。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述封闭基团包括选自3’磷酸，3’开环糖，3’氨基修饰，3’二脱氧核苷酸，3’硫代磷酸酯（PS）键或3’磷酸酯中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述3’开环糖为3’-磷酸-α，β-不饱和醛（PA）。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA分子的核酸长度大于等于10nt。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双链区的核酸长度大于等于6bp。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA单链区的核酸长度大于等于0nt。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA单链区的核酸长度大于等于1nt。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA分子选自小RNA、或者mRNA。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述小RNA包括SiRNA、miRNA、piRNA。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过将所述RNA分子与DNA探针接触形成所述第一RNA-DNA复合体。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述DNA探针的3’末端含有封闭基团。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述封闭基团包括选自3’磷酸，3’开环糖，3’氨基修饰，3’二脱氧核苷酸，3’硫代磷酸酯（PS）键或3’磷酸酯中的至少一种。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述3’开环糖为3’-磷酸-α，β-不饱和醛（PA）。

16.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述DNA探针选自下列至少之一：

与所述RNA分子部分匹配的核酸片段；

含有6-30个任意核苷酸的核酸片段的混合物。

17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括：

将所述第二RNA-DNA复合体进行反转录处理，以便获得反转录产物。

18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，包括：

对所述反转录产物进行环化处理，以便获得环化产物。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，包括:

基于所述反转录产物和所述环化产物的至少之一构建测序文库。

20.一种试剂盒，其特征在于，包括：

DNA探针，所述DNA探针用来捕获RNA分子；

双链DNA接头，所述双链DNA接头具有平末端；

所述DNA探针与所述RNA分子形成第一RNA-DNA复合体，所述第一RNA-DNA复合体包括：

双链区，所述双链区由匹配DNA单链和匹配RNA单链形成；

RNA单链区，所述RNA单链区与所述匹配RNA单链的5’末端相连；

在所述匹配RNA单链的3’末端连接双链DNA接头，以便获得第二RNA-DNA复合体，。

21.根据权利要求20所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA探针的3’末端含有封闭基团。

22.根据权利要求21所述的试剂盒，其特征在于，所述封闭基团包括选自3’磷酸，3’开环糖，3’氨基修饰，3’二脱氧核苷酸，3’硫代磷酸酯（PS）键或3’磷酸酯中的至少一种。

23.根据权利要求22所述的试剂盒，其特征在于，所述3’开环糖为3’-磷酸-α，β-不饱和醛（PA）。

24.根据权利要求20所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA探针选自下列至少之一：

与所述RNA分子部分匹配的核酸片段；

含有6-30个任意核苷酸的核酸片段的混合物。

25.根据权利要求20所述的试剂盒，其特征在于，包括：T4 DNA连接酶。

26.权利要求20~25中任一项所述的试剂盒在RNA分子测序领域中的应用。

27.根据权利要求26所述的应用，其特征在于，所述RNA分子的核酸长度大于等于10nt。

28.一种RNA-DNA复合体，其特征在于，所述RNA-DNA复合体包括：

双链区，所述双链区由匹配DNA单链和匹配RNA单链形成；

DNA单链区，所述DNA单链区与所述匹配DNA单链的5’末端相连；

29.根据权利要求28所述的RNA-DNA复合体，其特征在于，所述双链区上所述匹配DNA单链的3’末端含有封闭基团。

30.根据权利要求29所述的RNA-DNA复合体，其特征在于，所述封闭基团包括选自3’磷酸，3’开环糖，3’氨基修饰，3’二脱氧核苷酸，3’硫代磷酸酯（PS）键或3’磷酸酯中的至少一种。

31.根据权利要求30所述的RNA-DNA复合体，其特征在于，所述3’开环糖为3’-磷酸-α，β-不饱和醛（PA）。

32.根据权利要求28所述的RNA-DNA复合体，其特征在于，所述双链DNA接头的另一端长短不一，所述双链DNA接头的长链与所述匹配RNA单链的3’末端连接。

33.根据权利要求28所述的RNA-DNA复合体，其特征在于，所述RNA分子的核酸长度大于等于10nt。

34.根据权利要求28所述的RNA-DNA复合体，其特征在于，所述双链区的核酸长度大于等于6bp。

35.根据权利要求28所述的RNA-DNA复合体，其特征在于，所述RNA单链区的核酸长度大于等于0nt。

36.根据权利要求28所述的RNA-DNA复合体，其特征在于，所述DNA单链区的核酸长度大于等于1nt。

37.根据权利要求28所述的RNA-DNA复合体，其特征在于，所述RNA分子选自小RNA或者mRNA中的一种。

38.根据权利要求28所述的RNA-DNA复合体，其特征在于，所述小RNA包括SiRNA、miRNA、piRNA。