KR101922124B1 - 시료 중 ｒｎａ로부터 ｄｎａ를 증폭하는 방법 - Google Patents

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Abstract

시료 중 RNA를 증폭하는 방법 및 시료 중 RNA의 풀을 증폭하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법에 의해 유전자 손실 및 증폭 편향을 최소화할 수 있다. 또는 증폭된 RNA에 방향성을 부여할 수 있다. 상기 방법은 염기서열 분석뿐만 아니라 일반적인 분자 진단 분야에도 적용가능하다.

Description

시료 중 ＲＮＡ로부터 ＤＮＡ를 증폭하는 방법{Method for amplifying DNA from RNA in a sample}
시료 중 RNA를 증폭하는 방법 및 시료 중 RNA의 풀을 증폭하는 방법에 관한 것이다.
한정된 생체 시료로부터 얻어진 소량의 RNA를 증폭하는 일은 이를 이용한 유전자 분석 과정에서 가장 근본적이며, 중요한 일이다. 전사체(transcriptome)를 분석하는 방법으로서 RNA의 정량적 분석 예를 들어, 유전자-발현 분석 및 정성적 분석 예를 들어, RNA의 서열 분석은 현재의 생체 조직의 상태에 대해서 명확하게 알 수 있는 주요한 방법이다. 이에 필요한 RNA의 양을 충분히, 변화없이 증폭하는 방법은 이러한 분석을 보다 정확하고 의미 있게 한다.
종래 전사체를 분석하기 위해 RNA 풀(pool)을 증폭시키는 방법은 선형의 RNA를 올리고 dT 프라이머나 랜덤(random) 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 단일 가닥의 DNA로 역전사시키고, 랜덤 프라이머를 사용하여 이중 가닥의 DNA로 치환하고, 이중 가닥 DNA의 5' 말단과 3' 말단에 다른 종류의 어댑터를 라이게이션시키고 및 DNA를 증폭시켜 상보적 DNA(complementary DNA; DNA) 라이브러리를 제작한다.
이 방법은 RNA의 경우 일차원적인 서열 및 2, 3차원적인 구조가 다양하기 때문에 RNA가 DNA로 바뀌는 역전사 과정에서 RNA 종류에 따라 DNA 전환 효율이 달라질 수 있다. 어댑터의 라이게이션 과정에서도 유전자의 손실이 발생할 수 있다.
또한, 이 방법은 라이게이션된 어댑터가 원래 RNA가 가지고 있는 방향성 즉 RNA의 5' 및 3' 부위를 구분시킬 수 없기 때문에 서열 분석 후 RNA를 원래의 방향으로 복원시킬 필요가 있다.
아울러, 이 방법은 DNA를 증폭하는 과정에서 증폭 편향(amplification bias)이 발생할 수 있다. 특이적 서열을 이용하는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR)은 표적 서열의 크기, 서열의 특성에 따라 각각의 표적 DNA들의 증폭된 정도가 처음과 많이 달라질 수 있다. 랜덤 서열의 프라이머를 이용하는 다중 치환 증폭(multiple displacement amplification; MDA) 방법도 단일 가닥 DNA의 구조 및 서열의 다양성으로 인하여 표적에 따라 프라이머의 결합 효율이 달라질 수 있다. 따라서, 유전자별 증폭 정도가 처음과 달라지는 증폭 편향이 존재할 수 있다.
따라서, DNA 라이브러리의 제작시 발생할 수 있는 유전자의 손실 및 증폭 편향을 최소화하고, 증폭된 DNA에 방향성을 부여할 수 있는 방법이 요구된다.
시료 중 RNA를 증폭하는 방법을 제공한다.
시료 중 RNA의 풀을 증폭하는 방법을 제공한다.
RNA를 포함하는 시료, 및 어댑터 핵산을 인큐베이션시켜 어댑터 핵산-RNA 연결체를 형성하는 단계;
어댑터 핵산-RNA 연결체를 인큐베이션시켜 원형 어댑터 핵산-RNA 연결체를 형성하는 단계; 및
원형 어댑터 핵산-RNA 연결체, 어댑터 핵산의 하나의 가닥으로부터 선택된 연속 뉴클레오티드 서열과 동일한 서열의 프라이머 및 어댑터 핵산의 하나의 가닥으로부터 선택된 연속 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열을 포함하는 프라이머를 인큐베이션시켜 RNA를 증폭하는 단계를 포함하는, 시료 중 RNA 를 증폭하는 방법이 제공된다.
상기 방법은 RNA를 포함하는 시료, 및 어댑터 핵산을 인큐베이션시켜 어댑터 핵산-RNA 연결체를 형성하는 단계를 포함한다.
RNA는 천연, 합성 또는 반합성된 RNA일 수 있다. 예를 들면, RNA는 mRNA, tRNA, rRNA, 마이크로 RNA, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 또는 안티센스 RNA일 수 있다.
RNA를 포함하는 시료는 생물학적 시료, 생물학적 시료로부터 분리된 RNA 또는 이의 단편일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 바이러스 또는 생물 유래의 시료를 포함할 수 있다. 예를 들면, 시료는 혈액, 타액, 뇨, 분변, 조직, 세포 및 생검물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 시료는 보관된 생물학적 시료 또는 그로부터 분리된 RNA를 포함하는 것일 수 있다. 상기 보관은 알려진 방법에 의하여 보관된 것일 수 있다. 상기 보관은 1년 이상, 예를 들면, 1년 내지 10년 동안 보관된 것일 수 있다. 상기 주형 RNA는 냉동 보관 또는 포르말린 고정된 파라핀 임베드된 조직을 상온에서 보관한 조직으로부터 유래된 RNA인 것일 수 있다. 생물학적 시료로부터 RNA를 분리하는 방법은 알려져 있다. 예를 들면, Trizol 방법 등이 사용될 수 있다. 상기 시료는 세포 중의 전사체(transcriptome) 또는 그 일부를 포함하는 것일 수 있다.
상기 시료는 생물학적 시료로부터 분리된 RNA의 분해된 산물을 포함하는 것일 수 있다. 상기 시료는 포르말린-고정된 파라핀-임베드된 (FFPE) 조직 시료로부터 분리된 RNA를 포함하는 것일 수 있다. 진핵 세포의 천연 mRNA는 5'-캡 구조를 갖고 3'-폴리(아데닐레이트) 서열을 갖는 구조를 갖는다. 그러나, 생물학적 시료 또는 그로부터 분리된 mRNA의 보관 또는 처리 중에서 mRNA는 분해될 수 있다. 이 경우, 분리된 산물은 천연 mRNA 구조의 5'-캡 구조 및 3'-폴리(아데닐레이트) 서열을 갖지 않을 수 있다. mRNA는 천연 mRNA의 구조를 갖지 않는 것도 포함될 수 있다. 예를 들면, 시료는 5'-캡 및 3'-OH를 갖는 RNA; 5'-캡 및 3'-모노포스페이트를 갖는 RNA; 5'-OH 및 3'-모노포스페이트를 갖는 RNA; 5'-0H 및 3'-OH를 갖는 RNA; 5'-모노포스페이트 및 3'-OH를 갖는 RNA; 및 5'-모노포스페이트 및 3'-모노포스페이트를 갖는 RNA;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 5'-캡 구조 (cap)는 7-메틸구아닐레이트가 5'-말단의 당의 5'-OH에 트리포스페이트 연결에 의하여 연결된 구조 또는 이의 분해산물로서 구아닐레이트가 5'-말단의 당의 5'-OH에 트리포스페이트 연결에 의하여 연결된 구조를 포함한다. 5'-캡 구조의 말단 구아닐레이트의 3'-OH, 및/또는 2'-OH 및 말단으로부터 첫번째, 두번째 뉴클레오티드의 2'-OH는 메틸화되어 있을 수 있다. 상기 방법은 시료 중 RNA의 5'-캡 구조를 제거하는 단계 또는 시료 중 RNA의 3'-말단을 포스파타제(phosphatase)에 의해 탈인산화시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
어댑터 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 또한, 어댑터는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있다. 예를 들면, 어댑터 핵산은 서열번호 7의 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 어댑터 핵산은 프라이머 서열과 동일한 서열, 프라이머 서열과 상보적인 서열 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
어댑터 핵산은 제한 효소 인식 부위를 더 포함할 수 있다. 제한 효소 및 제한 효소 인식 부위는 당업자가 적절하게 선택할 수 있다. 용어 "제한 효소(restriction enzyme)"는 DNA의 특정한 염기배열을 식별하고 이중사슬을 절단하는 엔도뉴클레아제를 말한다. 용어 "제한 효소 인식 부위(restriction enzyme recognition site)"는 제한 효소가 인지하여 작용하는 DNA 내부에 존재가 짧은 서열을 말한다. 예를 들면, 제한 효소는 NotI일 수 있다. 제한 효소 인식 부위를 포함하는 어댑터 어댑터 핵산을 이용하면, 어댑터의 제한효소 인식 부위를 인식하는 제한 효소로 증폭된 RNA를 절단시킬 수 있다. 증폭된 RNA를 제한 효소 인식 부위를 인식하는 제한 효소로 절단함으로써, 증폭된 RNA에 방향성을 부여할 수 있을 것이다. 어댑터 핵산은 프라미어 세트 중 어느 하나의 프라이머와 동일한 서열 및 다른 하나의 프라이머와 상보적인 서열을 더 포함할 수 있다.
어댑터 핵산-RNA 연결체는 RNA의 양 말단 중 어느 하나에 어댑터 핵산이 연결된 것을 말한다. 어댑터 핵산-RNA 연결체는 선형일 수 있다. 예를 들면, 5' 말단으로부터 어댑터 핵산-RNA 또는 RNA-어댑터 핵산의 순서로 연결된 것일 수 있다.
상기 어댑터 핵산-RNA 연결체를 형성하는 단계는 리가제의 존재 하에서 인큐베이션시키는 것일 수 있다.
리가제는 RNA 리가제일 수 있다. RNA 리가제는 당업계에 알려진 효소일 수 있다. 예를 들면, RNA 리가제는 T4 RNA 리가제1, T4 RNA 리가제2, 서클리가제 I (CircLigase™ I), 서클리가제 II (CircLigase™ II), Mth RNA 리가제 또는 이들의 조합일 수 있다. T4 RNA 리가제는 5'-포스페이트와 3'-히드록시기 사이의 포스포디에스테르 결합의 형성을 주형-비의존적으로 촉매할 수 있다. T4 RNA 리가제는 ATP 의존적이며 RNA, DNA, 올리고리보뉴클레오티드, 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 및 많은 뉴클레오티드 유도제를 포함한 넓은 범위의 기질에 대하여 활성이다.
인큐베이션은 라이게이션에 적합한 조건 하에서 이루어질 수 있다. 이러한 조건은 선택되는 효소에 따라 당업자가 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면, T4 RNA 리가제 1x 반응 버퍼의 존재 하에 수행될 수 있다. 어댑터는 뉴클레아제의 존재 하에 인큐베이션될 수 있다. 뉴클레아제는 예를 들어, 엑소뉴클레아제일 수 있다.
상기 방법은 어댑터 핵산-RNA 연결체를 인큐베이션시켜 원형 어댑터 핵산-RNA 연결체를 형성하는 단계를 포함한다.
어댑터 핵산-RNA 연결체는 전술한 바와 같다.
원형 어댑터 핵산-RNA 연결체는 어댑터 핵산-RNA 연결체가 원형화된 것을 의미한다. 예를 들면, 원형 어댑터 핵산-RNA 연결체는 일 분자의 어댑터 핵산-RNA 연결체가 분자 내 라이게이션 또는 자가-라이게이션(self-ligation)에 의해 형성될 수 있다. 예를 들면, 일 분자의 어댑터 핵산-RNA 연결체의 5' 말단과 그것의 3' 말단이 연결되어 형성된 것일 수 있다.
상기 원형 어댑터 핵산-RNA 연결체를 형성하는 단계는 리가제의 존재 하에서 인큐베이션시키는 것일 수 있다.
리가제는 RNA 리가제 또는 DNA 리가제일 수 있다. RNA 리가제는 전술한 바와 같다. DNA 리가제는 당업계에 알려진 효소일 수 있다. 예를 들면, T4 DNA 리가제, T3 DNA 리가제, T7 DNA 리가제, 대장균 DNA 리가제, Ampligase® DNA 리가제, 서클리가제(CircLigase™) ssDNA 리가제 또는 이들의 조합일 수 있다. 서클리가제(CircLigase™) ssDNA 리가제는 5'-포스페이트와 3'-히드록시기를 갖는 단일 가닥 DNA 주형의 분자 내 라이게이션(예를 들면, 원형화)을 촉매하는 열 안정성 ATP-의존적 리가제이다.
인큐베이션은 라이게이션에 적합한 조건 하에서 이루어질 수 있다. 이러한 조건은 선택되는 효소에 따라 당업자가 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 서클리가제(CircLigase™) ssDNA 리가제 1x 반응 버퍼의 존재 하에 수행될 수 있다. 1 M 베타인의 존재 하에 인큐베이션될 수 있다. 2.5 mM MnCl2의 존재 하에 인큐베이션될 수 있다. 예를 들면, 60℃에서 1시간 동안 인큐베이션될 수 있다.
어댑터 핵산-RNA 연결체를 형성하는 단계와 원형 어댑터 핵산-RNA 연결체를 형성하는 단계는 하나의 인큐베이션으로 수행될 수 있다.
상기 방법은 원형 어댑터 핵산-RNA 연결체, 어댑터 핵산의 하나의 가닥으로부터 선택된 연속 뉴클레오티드 서열과 동일한 서열의 프라이머 및 어댑터 핵산의 하나의 가닥으로부터 선택된 연속 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열을 포함하는 프라이머를 인큐베이션시켜 RNA를 증폭하는 단계를 포함한다.
원형 어댑터 핵산-RNA 연결체는 전술한 바와 같다.
어댑터 핵산의 하나의 가닥으로부터 선택된 연속 뉴클레오티드 서열과 동일한 서열의 프라이머 및 어댑터 핵산의 하나의 가닥으로부터 선택된 연속 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열을 포함하는 프라이머는 서로 상이한 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 용어 "프라이머(primer)"는 적합한 온도에서 적합한 버퍼 내에서 적합한 조건(예를 들면, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합 반응 효소)에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예를 들면, 온도와 프라이머의 용도에 따라 차이가 있지만 예를 들면 15 내지 35개의 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머는 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구할 수 있다. 상기 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성할 수 있다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 당업자에게 잘 알려져 있다. 프라이머는 어댑터 핵산의 서열과 동일한 서열 또는 어댑터 핵산에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 프라이머는 어댑터 핵산의 하나의 가닥으로부터 선택된 연속 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 프라이머는 어댑터 핵산의 상기 하나의 가닥으로부터 선택된 연속 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 어댑터 핵산의 하나의 가닥으로부터 선택된 연속 뉴클레오티드 서열과 동일한 서열의 프라이머 및 어댑터 핵산의 하나의 가닥으로부터 선택된 연속 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열을 포함하는 프라이머는 어댑터 핵산의 바깥 방향을 향해 핵산이 증폭되도록 디자인된 것일 수 있다. 예를 들면, 프라이머 서열은 서열 번호 8 또는 9의 염기서열과 동일하거나 상보적인 염기서열일 수 있다.
상기 RNA를 증폭하는 단계는 폴리머라제의 존재 하에서 인큐베이션시키는 것일 수 있다.
폴리머라제는 DNA 폴리머라제일 수 있다. DNA 폴리머라제는 예를 들면, RNA-의존성 DNA 폴리머라제일 수 있다. RNA-의존성 DNA 폴리머라제는 가닥 치환 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 것일 수 있다. 즉, 역전사 활성을 뿐만 아니라 DNA-의존성 DNA 중합효소 활성을 갖는 것일 수 있다. DNA 폴리머라제는 DNA 폴리머라제는 Bst DNA 폴리머라제, 엑소뉴클레아제 마이너스, HIV 역전사 효소, 피로파지 3173 DNA 폴리머라제, Tth 폴리머라제, BcaBEST DNA 폴리머라제 또는 이들의 조합일 수 있다. 예를 들면, Bst DNA 폴리머라제 엑소뉴클레아제 마이너스인 것일 수 있다. Bst DNA 폴리머라제, 엑소뉴클레아제 마이너스는 5'-3' 폴리머라제 활성 및 가닥 치환 활성을 갖고 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖고 있지 않은 67 kDa 바실러스 스테아로터모필루스(Bacillus stearothermophilus) DNA 폴리머라제 단백질(큰 단편)이다. 또한, 역전사 활성을 갖고 있다. Bst DNA 폴리머라제, 엑소뉴클레아제 마이너스는 등온 증폭을 포함한, 핵산 증폭, 전게놈 증폭(whole genome amplification), 다중 치환 증폭(MDA) 등에 사용될 수 있다.
인큐베이션은 핵산 중합에 적합한 조건 하에서 이루어질 수 있다. 이러한 조건은 선택되는 효소에 따라 당업자가 적절하게 선택할 수 있다. 프라이머의 존재 하에서 수행될 수 있다. 예를 들면, Bst DNA 폴리머라제 1x 반응 버퍼(20 mM Tris-HCl(pH 8.8, 25℃), 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0.1 % Triton X-100), 10 mg/ml BSA, 1 uM 양방향 증폭용 프라이머 세트, 1 유닛 Bst DNA 폴리머라제에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 45℃에서 2시간 동안 인큐베이션될 수 있다.
용어 "증폭 (amplification)"은 DNA의 카피 수를 증가시키는 것을 의미하며, RNA로부터 DNA를 생성시키는 것을 포함한다. 증폭을 위하여 알려진 방법일 수 있다. 증폭은 원형 RNA로부터 DNA를 증폭하는 단계는 어댑터의 프라이머 서열 또는 이와 상보적인 프라이머 서열을 포함하는 프라이머의 존재 하에서 수행될 수 있다. 증폭 방법은 열순환(thermal cycling)을 필요로 하는 것 또는 등온 (isothermal)에서 수행되는 것일 수 있다. 예를 들면, 증폭 방법은 폴리머라제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction: PCR), 핵산 서열-기초 증폭(nucleic acid sequence-based amplification: NASBA), 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction: LCR), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification: SDA), 다중치환 증폭(multiple displacement amplification; MDA), 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification: RCA) 등을 포함할 수 있다. 증폭 방법은 또한, RNA 증폭 방법을 포함할 수 있다. 예를 들면, 역전사(reverse transcription: RT) 또는 역전사-PCR을 포함할 수 있다. "PCR"은 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법일 수 있다. 예를 들면, 핵산 증폭은 변성(denaturation), 어닐링(annealing) 및 신장(elongation)의 단계를 반복한다. 상기 용어 "어닐링(annealing)"은 용어 "혼성화(hybridization)"와 혼용될 수 있다. 또한, 증폭 예를 들면, DNA 증폭 또는 RNA 증폭일 수 있다. 핵산 증폭은 예를 들면 실시간 핵산 증폭일 수 있다. 상기 용어 "실시간 핵산 증폭(Real-Time PCR, RT-PCR)"은 PCR 산물의 증가를 PCR의 매 사이클마다 실시간으로 관찰하는 방법으로, PCR 산물과 반응하는 형광물질의 검출 및 정량에 의해 시료를 분석하는 방법이다.
상기 방법은 어댑터 핵산-RNA 연결체의 5' 말단을 폴리뉴클레오티드 키나제(polynucleotide kinase; PNK)에 의해 인산화시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 5'말단을 인산화시키는 효소는 당업계에 알려진 효소일 수 있다. 예를 들면, 5'-말단을 인산화시키는 효소는 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 (T4 PNK) 또는 그의 변이체인 것일 수 있다. 인산화시키는 조건은 선택되는 효소에 따라 당업자가 적절하게 선택할 수 있다. 상기 단계는 5'-말단을 인산화시키기에 적합한 조건 하에서 수행될 수 있다. PNK는 ATP의 γ 위치의 인산의 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, 이중가닥- 및 단일가닥-DNA 및 RNA) 및 뉴클레오시드 3'-모노포스페이트의 5'-히드록실 말단으로 전이 및 교환을 촉매한다. PNK는 또한 3'-포스포릴 폴리뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오시드 3'-모노포스페이트 및 데옥시뉴클레오시드 3'-디포스페이트로부터 3'-포스포릴기의 제거를 촉매할 수 있다. 따라서, PNK를 사용하는 경우, 5'-OH의 인산화와 3'-포스포릴기의 제거는 동시에 또는 동일한 반응 과정 중에서 수행될 수 있다.
상기 방법은 원형 어댑터 핵산-RNA 연결체로부터 증폭된 RNA를 염기 서열 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 방법은 증폭된 RNA를 어댑터 핵산의 제한효소 인식 부위를 인식하는 제한 효소로 절단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 증폭된 RNA를 제한 효소로 절단함으로써, 증폭된 RNA에 방향성을 부여할 수 있을 것이다.
상기 방법에서, 원형 어댑터 핵산-RNA 연결체를 형성하므로 유전자 손실을 최소화할 수 있다. 또한, 어댑터 핵산의 하나의 가닥으로부터 선택된 연속 뉴클레오티드 서열과 동일한 서열의 프라이머 및 어댑터 핵산의 하나의 가닥으로부터 선택된 연속 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 원형 어댑터 핵산-RNA 연결체를 한번에 증폭하므로 역전사 및 DNA 증폭에서 발생하는 유전자 손실 및 증폭 편향을 최소화할 수 있다. 이에 의하여 질병의 작용 기전 연구 및 진단 마커 개발에 유용하게 이용가능하다. 아울러, 증폭된 RNA에 방향성을 부여할 수 있다.
상기 방법은 수성 성분이 포함된 유중수(water in oil)형 에멀젼의 마이크로구획 (microcompartment)을 포함된 반응기 내에서 수행될 수 있다(도 2). 각 마이크로구획 내에 포함된 주형 RNA 또는 DNA로부터 DNA가 충분하게 증폭되어, 각 마이크로구획 내에서 더 이상 증폭이 일어날 수 없을 정도로 공간 및 효소 작용이 제한될 때까지 반응시킬 수 있다.
2종 이상의 RNA를 포함하는 시료, 및 어댑터 핵산을 인큐베이션시켜 어댑터 핵산-RNA 연결체를 형성하는 단계;
어댑터 핵산-RNA 연결체를 인큐베이션시켜 원형 어댑터 핵산-RNA 연결체를 형성하는 단계; 및
원형 어댑터 핵산-RNA 연결체, 어댑터 핵산의 하나의 가닥으로부터 선택된 연속 뉴클레오티드 서열과 동일한 서열의 프라이머 및 어댑터 핵산의 하나의 가닥으로부터 선택된 연속 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열을 포함하는 프라이머를 인큐베이션시켜 RNA를 증폭하는 단계를 포함하는, 시료 중 RNA의 풀을 증폭하는 방법이 제공된다.
2종 이상의 RNA를 포함하는 시료는 RNA 풀(pool)일 수 있다. 2종 이상의 RNA는 길이, 핵산 서열 또는 구조가 다른 RNA가 2종 이상 포함하는 것을 말한다. 예를 들면, 동일한 RNA 구조를 갖는 것일지라도, 다른 길이 또는 서열 조성을 갖는 RNA 분자가 2종 이상 시료에 존재하는 것을 포함한다.
어댑터 핵산, 어댑터 핵산-RNA 연결체 및 원형 어댑터 핵산-RNA 연결체는 전술한 바와 같다.
RNA를 증폭하는 단계는 전술한 바와 같다.
원형 어댑터 핵산-RNA 연결체로부터 증폭된 RNA는 시료 중 RNA의 풀(pool)을 증폭한 것일 수 있다. 원형 어댑터 핵산-RNA 연결체를 형성하므로 유전자 손실을 최소화할 수 있다. 또한, 어댑터 핵산의 하나의 가닥으로부터 선택된 연속 뉴클레오티드 서열과 동일한 서열의 프라이머 및 어댑터 핵산의 하나의 가닥으로부터 선택된 연속 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 원형 어댑터 핵산-RNA 연결체를 한번에 증폭하므로 역전사 및 DNA 증폭에서 발생하는 유전자 손실 및 증폭 편향을 최소화할 수 있다. 시료 중 RNA가 2종 이상 포함된 RNA 풀인 경우 유전자 손실 및 증폭 편향을 최소화하여 RNA 풀을 증폭할 수 있다. 따라서, 보다 정확한 전사체 분석이 가능할 수 있다. 예를 들면, 원형 RNA로부터 증폭된 RNA는 분자 진단을 위하여 사용될 수 있다. 아울러, 증폭된 RNA에 방향성을 부여할 수 있다. 이에 의하여 질병의 작용 기전 연구 및 진단 마커 개발에 유용하게 이용가능하다. 예를 들면, 상기 방법은 염기서열 분석, 마이크로어레이, FISH(Fluorescence in Situ Hybridization) 기법, PCR(Polymerase Chain Reaction), RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction), TMA(Transcription Mediated Amplification), NASBA(Nucleic Acid Sequence Based Amplification), RCA(Rolling Circle Amplification), SDA(Strand Displacement Amplification) 등 일반적인 분자 진단 분야에도 이용할 수 있다.
도 1은 양방향 증폭용 프라이머 서열 또는 이와 상보적인 프라이머 서열을 포함하는 어댑터를 사용하여 시료 중 RNA를 증폭하는 방법에 관한 개요를 나타낸다.
도 2는 유중수(water in oil) 형태의 구분된 반응기 내에서 RNA 증폭 방법에 관한 개요를 나타낸다.
도 3는 일 구체예에 따라 수득된 선형 이중가닥 DNA를 나타낸다.
도 4은 일 구체예에 따라 인 비트로 전사 반응에 의해 선형 이중가닥 DNA로부터 수득된 RNA 산물을 나타낸다.
도 5은 일 구체예에 따라 수득된 RNA 산물에 단일 가닥 어댑터 핵산을 라이게이션시켜 수득된 어댑터 핵산-RNA 연결체를 나타낸다.
도 6은 일 구체예에 따라 수득된 RNA를 PNK로 처리하고, 리가제로 자가-라이게이션시킨 다음, 중합효소 반응에 의해 원형 어댑터 핵산-RNA 연결체를 증폭시켜 수득된 DNA를 나타낸다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
표적 RNA의 제작
1-1. 선형의 이중가닥 DNA 단편의 제작
두 종류의 플라스미드 벡터 pcDNA3.1 eIF2a(Kim et. al EMBO J. 2011 10;30(12):2454-64), pcDNA3.1 eIF5B(Kim et. al EMBO J. 2011 10;30(12):2454-64)로부터 하기 프라이머 쌍을 사용하여 PCR하여 선형의 이중가닥 DNA 단편을 얻었다.
T7-eIF2A 1252-정방향 : 5'-TTAATACGACTCACTATAGGGATGGAATATTTCCAGCAAA-3' (서열 번호 1), 및
eIF2A 1252-역방향 : 5'-TGGTGATTGGTTTATTTCTTAA-3' (서열 번호 2).
T7-eIF2A 1421-정방향 : 5'-TTAATACGACTCACTATAGGCAGGAAACGATAAGCCATTA-3' (서열 번호 3), 및
eIF2A 1421-역방향 : 5'-AGGAGTAGGTGCCAAATC-3' (서열 번호 4).
T7-eIF5B 2889-정방향 : 5'-TTAATACGACTCACTATAGGGATCCATGAGTTAAAGCAG-3' (서열 번호 5), 및
eIF5B 2889-역방향 : 5'-GCACTTCTGATGTTTTCA-3'(서열 번호 6).
구체적으로, 1x HS Prime Taq 프리믹스(GeNet bio), 0.5 uM 정방향 프라이머, 0.5 uM 역방향 프라이머, 10 ng 플라스미드 벡터, 및 물의 조성물로 반응시켰다. 상기 조성물을 94℃에서 10분 동안 인큐베이션시키고, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 30초의 열적 순환을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분 동안 인큐베이션시켰다.
수득된 선형의 이중가닥 DNA 단편을 전기 영동으로 확인하고 그 결과를 도 3에 나타내었다. 레인 1; eIF2A 1252:1372, 레인 2; eIF2A 1421:1539, 레인 3; eIF5B 2889:3010. 수득된 DNA 단편은 T7 프로모터 부위가 5' 말단 부분에 포함되고, 단편의 크기가 121 bp (eIF2A 1252:1372), 118 bp (eIF2A 1421:1539), 122 bp (eIF5B 2889:3010)였다.
1-2. RNA 의 제작
실시예 1-1에서 수득된 선형의 이중가닥 DNA 단편으로부터 인 비트로 전사 반응을 수행하여 mRNA를 수득하였다. 구체적으로, 100 ng의 실시예 1-1에서 수득된 선형의 이중가닥 DNA 단편, 2 ul T7 RNA 폴리머라제(invitrogen), 1x 반응 버퍼(40 mM Tris-HCl, 6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM 스퍼미딘, 25℃에서 pH 7.9), 7.5 mM NTPs(ATP, CTP, GTP 및 UTP), 및 물의 조성물을 37 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다.
수득된 RNA는 전기 영동으로 확인하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 레인 1; eIF2A 1252:1372, 레인 2; eIF2A 1421:1539, 레인 3; eIF5B 2889:3010.
어댑터 핵산의 라이게이션
실시예 1-2에서 수득된 RNA에 단일 가닥 DNA로 이루어진 어댑터 핵산을 라이게이션 시켰다.
P6 어댑터: 5'-OH-GGTTCAGCAGGAATGCCGAG GCGGCCG CACACGACGCTCTTCCGATCT-3'(서열 번호 7)
상기 어댑터 핵산의 서열에서 밑줄친 부분은 제한 효소 NotI의 인식 부위를 나타낸다.
구체적으로, 100 ng의 실시예 1-2에서 수득된 mRNA, 6.67 uM어댑터, 1 ul RNA 5' 피로포스포히드로라제(NEB), 1 unit T4 RNA 리가제 1(NEB), 1x 반응 버퍼(50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 25℃에서 pH 7.9), 0.1 mM ATP 및 물의 조성이다. 상기 조성물을 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다.
그 후, 1 유닛의 엑소뉴클레아제 I을 더 첨가하여 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션시켜 라이게이션 되지 않은 어댑터를 제거하였다.
어댑터 핵산이 라이게이션된 RNA, 즉 원형 어댑터 핵산-RNA 연결체를 수득하여 전기영동으로 확인하고, 하기 표 1에 나타난 조성으로 반응시키고 전기영동한 결과를 도 5에 나타내었다.
레인 1 2 3 4 5
어댑터 핵산 ○ ○ × ○ ○
RNA × × ○ ○ ○
RNA 리가제 1 × × × ○ ○
엑소뉴클레아제 I × ○ × × ○
원형 어댑터 핵산- RNA 연결체의 제작 및 증폭
3-1. 원형 어댑터 핵산- RNA 연결체의 제작
100 ng의 실시예 2에서 수득된 DNA-RNA 하이브리드, 1 유닛의 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(polynucleotide kinase; PNK)(NEB), 1x 반응 버퍼(70 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 25℃에서 pH 7.6), 및 물의 조성물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다.
그 후, 70 ng의 상기 PNK 처리 산물, 100 유닛 CircLigase™ II ssDNA 리가제(Epicentre), 1x 반응 버퍼(0.33 M Tris-아세테이트(pH 7.5), 0.66 M 포타슘 아세테이트 및 5 mM DTT), 1 M 베타인, 2.5 mM MnCl2 및 물의 조성으로, 60 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다.
3-2. 원형 어댑터 핵산- RNA 연결체로부터 RNA 의 증폭
수득된 원형 어댑터 핵산-RNA 연결체, 1 유닛의 Bst DNA 폴리머라제, 1 uM P6 AmP1 프라이머(서열 번호 8), 1 uM P6 AmP2 프라이머(서열 번호 9), 1x 반응 버퍼(20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0.1 % Triton X-100, 25℃에서 pH 8.8), 10 mg/ml BSA, 1.3 mM dNTPs의 조성물을, 45 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다.
상기 P6 AmP1 및 P6 AmP2 프라이머의 염기 서열은 하기와 같다.
P6 AmP1 : 5'-ACACGACGCTCTTCCGATCT-3' (서열 번호 8)
P6 AmP2 : 5'-CTCGGCATTCCTGCTGAACC-3' (서열 번호 9)
P6 AmP1 및 P6 AmP2 프라이머는 P6 어댑터에 상보적인 서열로서, P6 어댑터 핵산의 바깥 방향으로 증폭되도록 디자인되었다.
원형 어댑터 핵산-RNA 연결체를 P6 AmP1 및 P6 AmP2 프라이머를 사용하여 RNA에 상보적인 DNA를 다중 치환 증폭(MDA) 방법으로 증폭시키고, 전기영동한 결과를 도 6에 나타내었다. 레인 1; 음성 대조군, 레인 2; 원형 RNA.
<110> SAM SUNG ELECTRONICS <120> Method amplifying DNA from RNA in a sample <130> PN097220 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 1 ttaatacgac tcactatagg gatggaatat ttccagcaaa 40 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 2 tggtgattgg tttatttctt aa 22 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 3 ttaatacgac tcactatagg caggaaacga taagccatta 40 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 4 aggagtaggt gccaaatc 18 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 5 ttaatacgac tcactatagg gatccatgag ttaaagcag 39 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 6 gcacttctga tgttttca 18 <210> 7 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 7 ggttcagcag gaatgccgag gcggccgcac acgacgctct tccgatct 48 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 8 acacgacgct cttccgatct 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 9 ctcggcattc ctgctgaacc 20

Claims (20)

  1. RNA를 포함하는 시료, 및 단일 가닥의 어댑터 핵산을 인큐베이션시켜 어댑터 핵산-RNA 연결체를 형성하는 단계로서,
    상기 어댑터 핵산-RNA 연결체는 RNA 및, 상기 RNA의 양 말단 중 어느 하나에 결합된 단일 가닥의 어댑터 핵산으로 이루어진 것인 단계;
    어댑터 핵산-RNA 연결체를 인큐베이션시켜 원형 어댑터 핵산-RNA 연결체를 형성하는 단계; 및
    원형 어댑터 핵산-RNA 연결체, 어댑터 핵산의 하나의 가닥으로부터 선택된 연속 뉴클레오티드 서열과 동일한 서열의 프라이머 및 어댑터 핵산의 하나의 가닥으로부터 선택된 연속 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열을 포함하는 프라이머를 인큐베이션시켜 RNA를 증폭하는 단계를 포함하는, 시료 중 RNA를 증폭하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, RNA를 포함하는 시료는 생물학적 시료, 생물학적 시료로부터 분리된 RNA, 이의 단편 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 어댑터 핵산은 DNA 또는 RNA인 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 어댑터 핵산은 제한효소 인식 부위를 더 포함하는 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 어댑터 핵산-RNA 연결체를 형성하는 단계 또는 원형 어댑터 핵산-RNA 연결체를 형성하는 단계는 리가제의 존재 하에서 인큐베이션시키는 것인 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, RNA를 증폭하는 단계는 폴리머라제의 존재 하에서 인큐베이션시키는 것인 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 폴리머라제는 DNA 폴리머라제인 것인 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, DNA 폴리머라제는 Bst DNA 폴리머라제, 엑소뉴클레아제 마이너스, HIV 역전사 효소, 피로파지 3173 DNA 폴리머라제, Tth 폴리머라제, BcaBEST DNA 폴리머라제 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 어댑터 핵산-RNA 연결체의 5' 말단을 폴리뉴클레오티드 키나제(polynucleotide kinase; PNK)에 의해 인산화시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  10. 청구항 4에 있어서, 증폭된 RNA를 어댑터 핵산의 제한효소 인식 부위를 인식하는 제한효소로 절단하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  11. 2종 이상의 RNA를 포함하는 시료, 및 단일 가닥의 어댑터 핵산을 인큐베이션시켜 어댑터 핵산-RNA 연결체를 형성하는 단계로서,
    상기 어댑터 핵산-RNA 연결체는 RNA 및, 상기 RNA의 양 말단 중 어느 하나에 결합된 단일 가닥의 어댑터 핵산으로 이루어진 것인 단계;
    어댑터 핵산-RNA 연결체를 인큐베이션시켜 원형 어댑터 핵산-RNA 연결체를 형성하는 단계; 및
    원형 어댑터 핵산-RNA 연결체, 어댑터 핵산의 하나의 가닥으로부터 선택된 연속 뉴클레오티드 서열과 동일한 서열의 프라이머 및 어댑터 핵산의 하나의 가닥으로부터 선택된 연속 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열을 포함하는 프라이머를 인큐베이션시켜 RNA를 증폭하는 단계를 포함하는, 시료 중 RNA의 풀을 증폭하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, RNA를 포함하는 시료는 생물학적 시료, 생물학적 시료로부터 분리된 RNA, 이의 단편 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  13. 청구항 11에 있어서, 어댑터 핵산은 DNA 또는 RNA인 것인 방법.
  14. 청구항 11에 있어서, 어댑터 핵산은 제한효소 인식 부위를 더 포함하는 것인 방법.
  15. 청구항 11에 있어서, 어댑터 핵산-RNA 연결체를 형성하는 단계 또는 원형 어댑터 핵산-RNA 연결체를 형성하는 단계는 리가제의 존재 하에서 인큐베이션시키는 것인 방법.
  16. 청구항 11에 있어서, RNA를 증폭하는 단계는 폴리머라제의 존재 하에서 인큐베이션시키는 것인 방법.
  17. 청구항 11에 있어서, 폴리머라제는 DNA 폴리머라제인 것인 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, DNA 폴리머라제는 Bst DNA 폴리머라제, 엑소뉴클레아제 마이너스, HIV 역전사 효소, 피로파지 3173 DNA 폴리머라제, Tth 폴리머라제, BcaBEST DNA 폴리머라제 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  19. 청구항 11에 있어서, 어댑터 핵산-RNA 연결체의 5' 말단을 폴리뉴클레오티드 키나제(polynucleotide kinase; PNK)에 의해 인산화시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  20. 청구항 11에 있어서, 증폭된 RNA를 어댑터 핵산의 제한효소 인식 부위를 인식하는 제한효소로 절단하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
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