JP6029636B2

JP6029636B2 - Ｒｎａの検出方法

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Publication number: JP6029636B2
Application number: JP2014224007A
Authority: JP
Inventors: 圭名子碓井; 上森　隆司; 隆司上森; 向井　博之; 博之向井; 加藤　郁之進; 郁之進加藤
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 2008-09-03
Filing date: 2014-11-04
Publication date: 2016-11-24
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Description

本発明は、ＲＮＡの検出方法、及び、該方法に有用な組成物に関する。

核酸増幅方法、なかでもポリメラーゼ連鎖反応（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）法は、試験管内において簡便に所望の核酸断片を増幅する技術であり、近年、遺伝子に関する研究のみならず、生物学、医学、農業等幅広い分野において不可欠の実験手法となっている。また、ＰＣＲによる核酸の増幅を、例えばインターカレーティング色素を利用して経時的に測定することで、鋳型となるＤＮＡの定量を精度良く行う方法が開発されている（非特許文献１）。この方法は、それまで知られていた定量的ＰＣＲと区別する意味で、リアルタイムＰＣＲ法と呼ばれている。

リアルタイムＰＣＲ法は、インターカレーティング色素を用いる方法以外に、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）オリゴヌクレオチドプローブを用いる方法も知られている。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブを用いるリアルタイムＰＣＲとしては、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を利用する方法（ＴａｑＭａｎＰｒｏｂｅ法）、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｅａｃｏｎプローブを用いる方法、標的核酸にハイブリダイズした場合にＦＲＥＴが起こるように設計された２種類のオリゴヌクレオチドプローブを用いる方法（ＨｙｂｒｉＰｒｏｂｅ法）、及びリボヌクレオチドを含有するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブと耐熱性リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）とを利用する方法（ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ法、特許文献１）等が知られている。

ＰＣＲ法は、ＲＮＡの検出方法にも応用され、ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法と呼ばれている。ＲＴ−ＰＣＲ法は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性、すなわち逆転写活性を有する逆転写酵素、あるいは逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡに相補的なＤＮＡ転写物（ｃＤＮＡ）を合成し、続いてこれを鋳型としてＰＣＲを行うことによりＲＮＡ由来ｃＤＮＡを特異的に増幅、検出する方法である。ＲＴ−ＰＣＲ法は、ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡのクローニングやｃＤＮＡライブラリーの作製に利用されるほか、特定のｍＲＮＡの発現状態を調べる方法としても有用である。また、ＲＴ−ＰＣＲをリアルタイムＰＣＲに応用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法は、ｍＲＮＡの定量を精度良く行えるため、遺伝子の発現解析や発現プロファイルの作成等に応用されている。

ＲＴ−ＰＣＲにおいて、逆転写反応後のｃＤＮＡは逆転写酵素の鋳型として用いたＲＮＡとＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを形成している。このため、ＲＴ−ＰＣＲが開発された当初より、ＲＴ−ＰＣＲの反応性を向上させるためには、逆転写反応後にアルカリ、熱、又は酵素での処理によって、ＰＣＲの前にｃＤＮＡを一本鎖にしておくことが良いとされている。例えば、鋳型となるＲＮＡのＧＣ含量が高い場合には、逆転写反応後に大腸菌由来のリボヌクレアーゼＨによる酵素処理の実施が効果的であるとの報告がある（非特許文献２）。

国際公開第２００３／０７４６９６号パンフレット

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）．１９９３Ｓｅｐ；１１（９）：１０２６−１０３０．ＢｉｏｓｃｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｃｈｅｍ．２００３Ｎｏｖ；６７（１１）：２４７４−２４７６．

ＲＴ−ＰＣＲにおいて、逆転写反応後にアルカリ、熱、又は酵素による処理を行うと、これらの処理を行わない場合に比べて反応終了までにより多くの時間を要する。また、アルカリや酵素での処理を行う場合には、逆転写反応液にアルカリや酵素を添加する工程が必要となるため、操作が煩雑となり、コンタミネーションの危険も増す。従って、これらの問題点の改善が望まれている。

本発明の課題は、従来のものに比べて優れた、ＲＮＡの検出方法、及び該方法にて用いる組成物を提供することにある。

本発明者らは上記課題を解決するべく鋭意努力した結果、驚くべきことに、ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡを鋳型とする核酸増幅反応において、耐熱性リボヌクレアーゼＨを利用することによって、簡便で、高い特異性で、かつ高い効率での核酸増幅反応が可能であることを見出した。また、更に驚くべきことに、インターカレーティング色素の存在下であっても耐熱性リボヌクレアーゼＨが機能することを見出し、本発明を完成させた。

本発明の第１の発明は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性リボヌクレアーゼＨ、及びインターカレーティング色素を含有する、逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡを増幅し、逆転写反応の鋳型となったＲＮＡを検出するための組成物に関する。本発明の第１の発明において、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては高度好熱菌由来のＤＮＡポリメラーゼが例示される。また、本発明の第１の発明において、耐熱性リボヌクレアーゼＨとしては、Ｔｈｅｒｍｕｓ属細菌やＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属古細菌のような高度好熱菌に由来するリボヌクレアーゼＨが例示される。本発明の第１の発明の組成物は、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及び反応用緩衝液からなる群より選ばれる少なくとも１つをさらに含有していても良い。

本発明の第２の発明は、
（Ａ）逆転写酵素、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及び逆転写反応の鋳型となるＲＮＡを含有する組成物を調製する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で調製した組成物をインキュベーションし、ｃＤＮＡを合成する工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）で合成したｃＤＮＡ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性リボヌクレアーゼＨ、及びインターカレーティング色素を含有する組成物を調製する工程、
（Ｄ）工程（Ｃ）で調製した組成物を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、核酸を増幅する工程、並びに
（Ｅ）工程（Ｄ）において増幅された核酸を、インターカレーティング色素からの蛍光シグナルの強度を測定することによって検出する工程、
を包含する、ＲＮＡを検出するための方法に関する。本発明の第２の発明において、工程（Ｅ）は工程（Ｄ）におけるポリメラーゼ連鎖反応中に実施されていても良い。また、工程（Ｅ）で測定されたシグナル強度から鋳型となるＲＮＡの定量が実施されても良い。

本発明の第３の発明は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性リボヌクレアーゼＨ、及びインターカレーティング色素を含有する、ＲＮＡを検出するためのキットに関する。本発明の第３の発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及び耐熱性リボヌクレアーゼＨとしては、本発明の第１の発明において例示されたものと同様のものが例示される。本発明の第３の発明のキットは、逆転写酵素、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及び反応用緩衝液からなる群より選ばれる少なくとも１つをさらに含有していても良い。

本発明により、従来に比べて作業時間が短く、簡便な操作で行うことができ、かつ反応性が優れた、ＲＮＡ検出用試薬、ＲＮＡの検出方法、及びＲＮＡの検出用キットが提供される。

ＰＣＲ反応液中のＲＮａｓｅＨ量とＣｔ値との関係を示す図である。ＰＣＲ反応液中のＲＮａｓｅＨ量とＣｔ値との関係を示す図である。

（１）本発明の組成物
本発明の組成物は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性リボヌクレアーゼＨ、及びインターカレーティング色素を含む。

また、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及び耐熱性リボヌクレアーゼＨを含み、かつリボヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドプローブを含まない組成物も本発明の一態様である。この態様の組成物は、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブを用いるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲや、ＲＴ−ＰＣＲによって得られた増幅産物を電気泳動により確認する方法等に有用である。

核酸増幅反応の反応性は、特に限定するものではないが、ＰＣＲにおいて核酸増幅量がある一定量に達する時の温度サイクル数（Ｃｔ値）により確認することができる。例えば、２つの異なる核酸増幅反応系の反応性を比較する場合、同じ量の鋳型を用いてそれぞれの系の核酸増幅反応を実施してＣｔ値を確認すれば、Ｃｔ値が低い方を反応性が高い核酸増幅反応系と見なすことができる。

本明細書において、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとは、７５℃以上の温度で３０分間処理した後であっても活性を保持するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの事を言う。当該耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性、及び／又はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性をさらに有していてもよい。

本発明に使用される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲに使用可能なものであればよく、すでに多くの種類のものが市販されている。本発明を特に限定するものではないが、本発明に使用される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、高度好熱菌由来のＤＮＡポリメラーゼが例示される。高度好熱菌とは７５℃以上の環境下でも生育できる菌の事を指す。高度好熱菌としては、例えば真正細菌ではＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕ、Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓ、及びＴｈｅｒｍｕｓｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓのようなＴｈｅｒｍｕｓ属の真正細菌、古細菌ではＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｗｏｓｅｉｉ、ＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのようなＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属の古細菌、並びにＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｃｅｌｌｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｓｉｃｕｌｉ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＫＳ−１、及びＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓのようなＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属の古細菌が挙げられる。なお、本発明における耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、２種以上の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの混合物を用いても良い。

リボヌクレアーゼＨとは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖のみを特異的にエンド型で切断する加水分解酵素の事を言い、ＲＮａｓｅＨと表記されることもある。本明細書において、耐熱性リボヌクレアーゼＨとは、６０℃以上の温度で１５分間処理した後であっても活性を保持するリボヌクレアーゼＨの事を言う。

本発明における耐熱性リボヌクレアーゼＨとしては、特に限定するものではないが、高度好熱菌由来のリボヌクレアーゼＨが例示され、ＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓやＴｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓ等のＴｈｅｒｍｕｓ属細菌由来リボヌクレアーゼＨ、及びＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ等のＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属古細菌由来リボヌクレアーゼＨがより好適に例示される。国際公開第０２／２２８３１号パンフレットにも耐熱性リボヌクレアーゼＨが開示されている。

インターカレーティング色素とは、二本鎖核酸へのインターカレーションにより蛍光が増強される色素のことを言う。例えば臭化エチジウム、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ９、ＳＹＴＯ１３、ＥｖａＧｒｅｅｎ、ＹＯＹＯ、ＴＯＴＯ、及びこれらの類似体等がリアルタイムＰＣＲ用のインターカレーティング色素として利用されている。本発明におけるインターカレーティング色素としては、上記の色素が例示されるが、特にこれらに限定されるものではなく、核酸へのインターカレーションにより蛍光が増強される色素であれば、本発明におけるインターカレーティング色素に包含される。

本発明の組成物には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性リボヌクレアーゼＨ、及びインターカレーティング色素に加えて、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及び／又は反応用緩衝液が含まれていても良い。

オリゴヌクレオチドプライマー（単に、プライマーともいう）は、使用される反応条件において鋳型となる核酸又は相補鎖側のプライマー伸長鎖に対してアニールするオリゴヌクレオチドであれば特に限定されるものではない。プライマーの鎖長は、特異的なアニーリングを行う観点から、好ましくは６ヌクレオチド以上であり、より好ましくは１０ヌクレオチド以上であり、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは１００ヌクレオチド以下であり、より好ましくは３０ヌクレオチド以下である。前記オリゴヌクレオチドは、例えばＡＢＩ社（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍＩｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイト法により合成出来る。他にもリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等いかなる方法で合成されたものであっても良い。また、生物試料由来のオリゴヌクレオチドであっても良く、例えば天然の試料より調製したＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化物から単離して作製しても良い。

デオキシリボヌクレオチドは、有機塩基に結合しているデオキシリボースにホスホエステル結合によってリン酸基が結合したものである。天然型ＤＮＡは、４種類のヌクレオチドを含有する。アデニン、グアニン、シトシン及びチミン塩基を有する各ヌクレオチドが天然型ＤＮＡに含まれる。塩基のアデニン、グアニン、シトシン、及びチミンはそれぞれ、Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴと略されることが多い。

デオキシリボヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシドの一リン酸型、二リン酸型及び三リン酸型（すなわち、リン酸部分が、それぞれ、１つ、２つ又は３つのリン酸基を有する）を含む。従って、デオキシリボヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）並びにそれらの誘導体を含む。好適には、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの４種のデオキシリボヌクレオチドを含有する組成物が本発明に使用される。

デオキシリボヌクレオチド誘導体は、［αＳ］ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、７−デアザ−ｄＡＴＰ、及び核酸分解に抵抗性を示すデオキシヌクレオチド誘導体を含む。ヌクレオチド誘導体は、例えば、^３２Ｐ若しくは^３５Ｓなどの放射性同位体、蛍光部分、化学発光部分、生物発光部分又は酵素で検出できるように標識されているデオキシリボヌクレオチドを含む。これらのデオキシリボヌクレオチド誘導体は、必要に応じて本発明の組成物に添加され、又は前記の天然型ＤＮＡに対応するデオキシリボヌクレオチドと置換される。

反応用緩衝液とは、反応液のｐＨを調節するための１種又は複数の緩衝成分を含む溶液のことを示し、２価陽イオン及び１価陽イオンをさらに含む場合もある。反応用緩衝液は前記の成分の他、界面活性剤や耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及び／又は耐熱性リボヌクレアーゼＨの活性や安定性を向上させるための成分を含んでもよい。

本発明の組成物の調製方法に特に限定はなく、具体的には、例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、インターカレーティング色素、必要により、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及び反応用緩衝液を含有する混合物に、耐熱性リボヌクレアーゼＨ及び少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプライマーを混合することで調製することができる。なお、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、インターカレーティング色素、デオキシリボヌクレオチド、及び反応用緩衝液を含有する混合物としては、ＳＹＢＲ（登録商標）ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｇ^ＴＭ（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）（タカラバイオ社製）等の市販品を好適に使用することができる。

本発明の組成物の一つの態様として、本発明の組成物に鋳型ＤＮＡを添加して、滅菌蒸留水等で用時に希釈することにより、各種成分がＰＣＲに適した濃度となるように配合された、濃縮型の組成物が挙げられる。本態様により、核酸増幅用反応液を簡便に調製することが可能となる。

（２）本発明の方法
本発明のＲＮＡの検出方法は、
（Ａ）逆転写酵素、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及び鋳型となるＲＮＡを含有する組成物を調製する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で調製した組成物をインキュベーションし、ｃＤＮＡを合成する工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）で合成したｃＤＮＡ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性リボヌクレアーゼＨ、及びインターカレーティング色素を含有する組成物を調製する工程、
（Ｄ）工程（Ｃ）で調製した組成物を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、核酸を合成する工程、並びに
（Ｅ）工程（Ｄ）において合成された核酸を、インターカレーティング色素からの蛍光シグナルの強度を測定することによって検出する工程、
を含む。

上記の工程（Ａ）における逆転写酵素は、逆転写活性、すなわちＲＮＡを鋳型としてこれに相補的なＤＮＡを合成する活性を有するものであれば本発明に使用でき、このような逆転写酵素としては、モロニーマウス白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ由来逆転写酵素）やトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ由来逆転写酵素）等のウイルス由来の逆転写酵素、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ等）や好熱性バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ等）等の真正細菌由来の耐熱性の逆転写酵素が例示される。市販の逆転写酵素を使用してもよい。

本発明の方法には、ウイルス由来の逆転写酵素が好適に使用され、ＭＭＬＶ由来逆転写酵素がより好適に使用される。また、逆転写活性を有する範囲で天然由来のアミノ酸配列に改変が施された逆転写酵素も本発明に使用できる。

鋳型となるＲＮＡは、プライマーがアニーリングした場合に、プライマーからの逆転写反応の鋳型として働くことができるＲＮＡである。工程（Ａ）で調製される組成物中には、１種類の鋳型ＲＮＡが含まれていても、又は異なるヌクレオチド配列を有する複数種の鋳型が含まれていてもよい。特定の鋳型ＲＮＡに特異的なプライマーを使用することによって前記鋳型に相補的なｃＤＮＡを作製することができる。複数の鋳型ＲＮＡにアニーリングしうるプライマーを選択した場合には、核酸混合物中の複数種の鋳型についてプライマー伸長産物を作製することができる。複数の鋳型は、異なる核酸内に存在しても同一の核酸内に存在してもよい。

本発明に適用することができる鋳型となるＲＮＡとしては特に制限はなく、試料中の全ＲＮＡ、即ち、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等のＲＮＡ分子群、あるいは特定のＲＮＡ分子群（例えば、共通の塩基配列モチーフを有するＲＮＡ分子群、ＲＮＡポリメラーゼによる転写物、サブトラクション法によって濃縮されたＲＮＡ分子群）が挙げられ、逆転写反応に使用されるプライマーが作製可能な任意のＲＮＡが挙げられる。

本発明において、鋳型となるＲＮＡは、例えば細胞、組織、血液のような生体由来試料、食品、土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料に含有されたものであっても良く、該試料等を公知の方法で処理することによって得られる核酸含有調製物に含有されたものであっても良い。該調製物としては、例えば細胞破砕物やそれを分画して得られる試料、該試料中の全ＲＮＡ、あるいは特定のＲＮＡ分子群、例えば、ｍＲＮＡを富化した試料等が挙げられる。

逆転写反応を行うための組成物、すなわち逆転写反応液の調製方法は当業者に周知であり、上記の各種成分を適切な濃度で含む反応液を調製すればよい。市販の逆転写用キットを使用すれば容易に逆転写反応液を調製できる。

上記の方法における工程（Ｂ）では、鋳型となるＲＮＡに相補的なｃＤＮＡが合成される。当該工程（Ｂ）におけるインキュベーションの条件としては、特に限定するものではないが、温度条件としては３０℃〜６５℃が例示され、３７℃〜４５℃がより好適である。また、反応時間としては、５分〜１２０分が例示され、１５分〜６０分がより好適である。前記条件は使用する逆転写酵素や鋳型ＲＮＡ量に応じて適宜調節すればよい。

上記の方法における工程（Ｃ）では、工程（Ｂ）で合成したｃＤＮＡ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性リボヌクレアーゼＨ、及びインターカレーティング色素を含有する組成物を調製する。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性リボヌクレアーゼＨ、及びインターカレーティング色素としては、前記の（１）「本発明の組成物」に記載のものが例示され、工程（Ｂ）で合成したｃＤＮＡに、本発明の組成物を混合して調製してもよい。

上記の方法における工程（Ｄ）では、工程（Ｃ）で調製した組成物を用いて、工程（Ｂ）において合成されたｃＤＮＡを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応により核酸増幅を行う。本発明の方法におけるＰＣＲは、３段階の温度を１サイクルとする温度サイクルで行うＰＣＲであっても良く、２段階の温度を１サイクルとする温度サイクルで行うシャトルＰＣＲであっても良い。ＰＣＲは、例えば２０サイクル〜５０サイクルの温度サイクルで行えばよい。

また、上記の３段階又は２段階の温度サイクルの前に、９０℃以上、１５秒〜１０分の熱処理を施しても良い。逆転写反応により生成したｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにおいては、反応性の向上の観点から、ＰＣＲの温度サイクル前に熱処理を行うことが好ましい。驚くべきことに、ｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲに本発明の組成物を用いた場合には、上記のＰＣＲの温度サイクル前に熱処理を行うＰＣＲの増幅効率が更に向上する。

上記方法における工程（Ｅ）では、工程（Ｄ）において増幅された核酸を、インターカレーティング色素からの蛍光シグナルの強度を測定することによって検出する。これにより、増幅された核酸の鋳型となったＲＮＡを検出することができる。インターカレーティング色素からの蛍光シグナルは、インターカレーティング色素の励起光を反応組成物に照射することによって発せられ、２本鎖核酸量の増大とともにその強度が増大する。蛍光シグナル強度の検出は、ＰＣＲ反応終了後に行っても良いし、工程（Ｄ）におけるＰＣＲ反応の温度サイクルごとに行っても良い。ＰＣＲ反応の温度サイクルごとにインターカレーティング色素からの蛍光シグナル強度を測定することにより、ＰＣＲの鋳型のｃＤＮＡ量を定量することが可能であり、さらには、定量されたｃＤＮＡ量から、増幅されたｃＤＮＡの鋳型となったＲＮＡ量を決定することが可能となる。従って、本発明のＲＮＡの検出方法は、さらに、（Ｆ）工程（Ｅ）で測定されたシグナル強度から鋳型となるＲＮＡの定量を行う工程を含んでもよい。

ＰＣＲ反応における蛍光シグナル強度の測定には、例えば市販のリアルタイムＰＣＲ用の機器を用いれば良い。市販のリアルタイムＰＣＲ用の機器としては、ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＤｉｃｅ（登録商標）ＲｅａｌＴｉｍｅＳｙｓｔｅｍ（タカラバイオ社製）、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ＩＩＳｙｓｔｅｍ（タカラバイオ社製）が例示される。

（３）本発明のキット
本発明のキットは、ＲＮＡの検出を行うためのキットであり、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性リボヌクレアーゼＨ、及びインターカレーティング色素を含む。本発明のキットは、逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡを鋳型とする核酸増幅反応を効率よく行うことができるため、目的の配列を有するＲＮＡの検出に有用であり、また、目的の配列を有するＲＮＡの定量により有用である。

本発明のキットには、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性リボヌクレアーゼＨ、インターカレーティング色素に加えて、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及び／又は反応用緩衝液が含まれていても良い。

耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性リボヌクレアーゼＨ、インターカレーティング色素、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及び／又は反応用緩衝液は、これらのうち一部又は全部が混合された状態でキットに包含されていても、それぞれが単独のコンポーネントの状態でキットに包含されていてもよい。例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、インターカレーティング色素、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及び反応用緩衝液が混合されたものとして、ＳＹＢＲ（登録商標）ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｇ^ＴＭ（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）（タカラバイオ社製）等の市販品が挙げられる。

また、本発明のキットには、逆転写反応を行うための試薬がさらに含有されていても良い。このような試薬としては、逆転写酵素、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及び／又は反応用緩衝液が挙げられる。なお、ここでいうプライマーとしては、逆転写用に好適に用いられるものが挙げられ、特に限定はない。

本発明のキットに含まれる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性リボヌクレアーゼＨ、インターカレーティング色素、逆転写酵素、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及び反応用緩衝液としては、前記の（１）「本発明の組成物」や（２）「本発明の方法」に記載のものが例示される。

本発明の組成物は、ｃＤＮＡ合成の鋳型となったＲＮＡによる核酸増幅反応への影響を抑えることができるため、ＲＮＡの検出に有用であり、さらには、ＲＮＡを検出し、その定量を行うために使用されてもよい。また、目的の配列を有するＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる定量により有用である。

以下に実施例をもってさらに詳細に本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲に何ら限定されるものではない。なお、下記実施例において各酵素の活性は、特段の記載がない限り各酵素に添付の説明書の表示に基づいて示した。

実施例１
（１）ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成
ＨｕｍａｎＴｅｓｔｉｓＴｏｔａｌＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型として、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴｒｅａｇｅｎｔＫｉｔ（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）（タカラバイオ社製、製品コード：ＲＲ０３７Ａ）を利用し、製品の標準プロトコールに従い逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを調製した。

（２）ｃＤＮＡの増幅及び検出
リアルタイムＰＣＲ装置としては、ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＤｉｃｅ（登録商標）ＲｅａｌＴｉｍｅＳｙｓｔｅｍ（タカラバイオ社製）を用いた。逆転写反応により得られたｃＤＮＡのうち２０ｎｇ分を鋳型に、ＳＹＢＲ（登録商標）ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｇ^ＴＭ（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）（タカラバイオ社製、製品コード：ＲＲ０４１）を使用して、ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ（ＡＰＯＥ）遺伝子の配列を増幅・検出した。具体的には、ｃＤＮＡの増幅及び検出用の反応液として、（１）により得られたｃＤＮＡ２０ｎｇに、ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｇ^ＴＭ（登録商標）（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）に添付の２倍濃度の反応液に、配列表の配列番号１に示される塩基配列を有するＡＰＯＥ−Ｆプライマー１０ｐｍｏｌ、配列表の配列番号２に示される塩基配列を有するＡＰＯＥ−Ｒプライマー１０ｐｍｏｌ、及び滅菌蒸留水を添加し、さらに、０．０００１Ｕ、０．００１Ｕ、０．０１Ｕ、０．１Ｕ、１Ｕ、１０Ｕ、又は１００ＵのＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｒａｌｉｓ由来リボヌクレアーゼＨ（以下、ＴｌｉＲＮａｓｅＨという、国際公開第０２／２２８３１号パンフレットの記載に従って調製）を添加したものを加え、ＴｌｉＲＮａｓｅＨの含有量がそれぞれ異なる７種類の反応液（各２５μＬ）を調製した。また、ＴｌｉＲＮａｓｅＨを含まない以外は上記の反応液と同様の組成を持つ反応液を調製した（計２５μＬ）。上記８種類の反応液について、１段階：９５℃、５秒、２段階：６０℃、３０秒を１Ｃｙｃｌｅとする４０ＣｙｃｌｅｓのＰＣＲに供した（ｎ＝２）。このとき、ＰＣＲのＣｙｃｌｅごとに、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩからの蛍光強度を測定し、増幅産物量の変化を観測した。反応終了後、リアルタイム装置により、Ａｕｔｏ設定でＣｒｏｓｓｉｎｇＰｏｉｎｔ法により算出されたＣｔ値を確認し、また、平均値を求めた。

（３）結果
算出されたＣｔ値を表１に示す。また、ＰＣＲ反応液中のＲＮａｓｅＨ量とＣｔ値との関係を図１のグラフに示す。

その結果、ＲＮａｓｅＨ無添加の場合と比較し、ＴｌｉＲＮａｓｅＨを含む反応液では低いＣｔ値であった。このことから、逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲの際に、反応液中に耐熱性ＲＮａｓｅＨを添加することにより増幅効率が向上することが明らかとなった。

実施例２
実施例１と同様の装置及び試薬を使用し、熱変性をＰＣＲ核酸増幅前に行った場合についても、ＲＮａｓｅＨを添加することでＣｔ値が低下することを確認した。

実施例１（１）と同様の方法で調製したｃＤＮＡ１０ｎｇに、ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ^ＴＭ（登録商標）（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）に添付の２倍濃度の反応液に、ＡＰＯＥ−Ｆプライマー１０ｐｍｏｌ、ＡＰＯＥ−Ｒプライマー１０ｐｍｏｌ、及び滅菌蒸留水を添加し、さらに、１ＵのＴｌｉＲＮａｓｅＨを加えたものを添加して、計２５μＬのＡＰＯＥ遺伝子断片の増幅及び検出用反応液を調製した。また、ＡＰＯＥ−Ｆプライマー及びＡＰＯＥ−Ｒプライマーの代わりに、配列表の配列番号３に示される塩基配列を有するＳＯＸ−Ｆプライマー及び配列表の配列番号４に示される塩基配列を有するＳＯＸ−Ｒプライマーを用いる以外は上記と同様の方法で、Ｓｅｘ−ＤｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇＲｅｇｉｏｎＹＢｏｘ１８（ＳＯＸ１８）遺伝子断片の増幅及び検出用反応液を調製した。同様に、ＡＰＯＥ−Ｆプライマー及びＡＰＯＥ−Ｒプライマーの代わりに、配列表の配列番号５に示される塩基配列を有するＮＡＴ−Ｆプライマー及び配列表の配列番号６に示される塩基配列を有するＮＡＴ−Ｒプライマーを用いてＮ−ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ１４（ＮＡＴ１４）遺伝子断片の増幅及び検出用反応液を調製した。また、１ＵのＴｌｉＲＮａｓｅＨを含まない以外は上記の各反応液と同様の組成を持つ各標的配列の増幅及び検出用の反応液を調製した。

上記６種類の反応液それぞれについて、ＰＣＲ前に熱変性を実施しない場合と、ＰＣＲ前に熱変性を実施する場合の増幅効率を確認した。ＰＣＲ反応前に熱変性を実施しない場合は、１段階：９５℃、５秒、２段階：６０℃、３０秒を１Ｃｙｃｌｅとする４０ＣｙｃｌｅｓのＰＣＲに反応液を供し、ＰＣＲ前に熱変性を実施する場合は、熱変性９５℃、３０秒の処理後に１段階：９５℃、５秒、２段階：６０℃、３０秒を１Ｃｙｃｌｅとする４０ＣｙｃｌｅｓのＰＣＲに反応液を供した（各ｎ＝１）。ＰＣＲの際には、ＣｙｃｌｅごとにＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩからの蛍光強度を測定して増幅産物量の変化を観測した。反応終了後、リアルタイム装置によりＡｕｔｏ設定でＣｒｏｓｓｉｎｇＰｏｉｎｔ法により算出されたＣｔ値を確認した。算出されたＣｔ値を表２に示す。

その結果、ＰＣＲの反応前に熱変性を実施した場合においても、ＲＮａｓｅＨを添加することにより更に反応効率が向上することが分かった。この結果から、逆転写反応後のｃＤＮＡと逆転写反応の鋳型となったＲＮＡとで形成されるＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを、熱変性により核酸増幅反応前に解消した場合であっても、ＰＣＲ反応液中の耐熱性ＲＮａｓｅＨが効果を示すことが明らかとなった。

実施例３
ＴｌｉＲＮａｓｅＨの代わりにＨｙｂｒｉｄａｓｅ^ＴＭ（登録商標）ＴｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅＲＮａｓｅＨ（以下、Ｈｙｂｒｉｄａｓｅという、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製、Ｔｈｅｒｍｕｓ属細菌由来耐熱性ＲＮａｓｅＨ）を用いる点、ＲＮａｓｅＨ量を反応液２５μＬ当り０．０００１Ｕ、０．００１Ｕ、０．０１Ｕ、０．１Ｕ、及び１Ｕとする点、並びに９５℃、３０秒間の初期変性をＰＣＲの前に実施する点以外は、実施例１と同様の方法でｃＤＮＡの増幅及び検出を行い、Ｃｔ値を確認した。

算出されたＣｔ値を表３に示す。また、反応液中のＲＮａｓｅＨ量とＣｔ値との関係を図２に示す。

その結果、耐熱性ＲＮａｓｅＨとしてＴｈｅｒｍｕｓ属細菌由来のものを用いた場合も、ＲＮａｓｅＨの添加による核酸増幅効率の向上が見られた。

なお、本発明の態様として、以下のものが挙げられる。

〔１〕逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡを増幅し、前記逆転写反応の鋳型となったＲＮＡを検出するための組成物であって、
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、
耐熱性リボヌクレアーゼＨ、及び
インターカレーティング色素
を含有してなる組成物。
〔２〕耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが高度好熱菌由来のＤＮＡポリメラーゼである、〔１〕記載の組成物。
〔３〕耐熱性リボヌクレアーゼＨが高度好熱菌由来のリボヌクレアーゼＨである、〔１〕記載の組成物。
〔４〕高度好熱菌由来のリボヌクレアーゼＨが、Ｔｈｅｒｍｕｓ属細菌由来リボヌクレアーゼＨ、及び／又はＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属古細菌由来のリボヌクレアーゼＨである、〔３〕記載の組成物。
〔５〕さらに、
少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプライマー、
少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及び
反応用緩衝液
からなる群より選ばれる少なくとも１つを含有してなる〔１〕記載の組成物。
〔６〕逆転写反応の鋳型となったＲＮＡを検出し、さらに定量するために使用される、〔１〕〜〔５〕いずれか記載の組成物。
〔７〕ＲＮＡを検出するための方法であって、
（Ａ）逆転写酵素、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及び逆転写反応の鋳型となるＲＮＡを含有する組成物を調製する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で調製した組成物をインキュベーションし、ｃＤＮＡを合成する工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）で合成したｃＤＮＡ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性リボヌクレアーゼＨ、及びインターカレーティング色素を含有する組成物を調製する工程、
（Ｄ）工程（Ｃ）で調製した組成物を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、核酸を増幅する工程、並びに
（Ｅ）工程（Ｄ）において増幅された核酸を、インターカレーティング色素からの蛍光シグナルの強度を測定することによって検出する工程、
を含む方法。
〔８〕工程（Ｅ）が工程（Ｄ）におけるポリメラーゼ連鎖反応中に実施される、〔７〕記載の方法。
〔９〕さらに、（Ｆ）工程（Ｅ）で測定されたシグナル強度から鋳型となるＲＮＡの定量を行う工程を含む、〔７〕又は〔８〕記載の方法。
〔１０〕ＲＮＡを検出するためのキットであって、
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、
耐熱性リボヌクレアーゼＨ、及び
インターカレーティング色素
を含有してなるキット。
〔１１〕耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが高度好熱菌由来のＤＮＡポリメラーゼである、〔１０〕記載のキット。
〔１２〕耐熱性リボヌクレアーゼＨが高度好熱菌由来のリボヌクレアーゼＨである、〔１０〕記載のキット。
〔１３〕高度好熱菌由来のリボヌクレアーゼＨが、Ｔｈｅｒｍｕｓ属細菌由来リボヌクレアーゼＨ、及び／又はＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属古細菌由来のリボヌクレアーゼＨである、〔１２〕記載のキット。
〔１４〕さらに、逆転写酵素、
少なくとも１種のプライマー、
少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及び
反応用緩衝液
からなる群より選ばれる少なくとも１つを含有してなる〔１０〕〜〔１３〕いずれか記載のキット。

本発明の組成物、該組成物を用いるＲＮＡの検出方法、及びＲＮＡの検出用キットは、広く遺伝子工学の分野に有用である。なかでも、本発明によりｃＤＮＡ合成の鋳型となったＲＮＡによる核酸増幅反応への影響を抑えることができるため、ＲＮＡの検出に有用であり、また、目的の配列を有するＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる定量により有用である。

SEQ ID NO:1 ;Primer to amplify the cDNA fragment of human APOE gene.
SEQ ID NO:2 ;Primer to amplify the cDNA fragment of human APOE gene.
SEQ ID NO:3 ;Primer to amplify the cDNA fragment of human SOX18 gene.
SEQ ID NO:4 ;Primer to amplify the cDNA fragment of human SOX18 gene.
SEQ ID NO:5 ;Primer to amplify the cDNA fragment of human NAT14 gene.
SEQ ID NO:6 ;Primer to amplify the cDNA fragment of human NAT14 gene.

Claims

ＲＮＡを検出するための方法であって、
（Ｃ）逆転写酵素、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及び逆転写反応の鋳型となるＲＮＡを含有する組成物を逆転写反応に供して得られるｃＤＮＡと鋳型となったＲＮＡとで形成されるＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性リボヌクレアーゼＨ、及びインターカレーティング色素を含む成分とを混合して組成物を調製する工程、
（Ｄ）工程（Ｃ）で調製した組成物を９０℃以上、１５秒〜１０分の熱処理と連続してポリメラーゼ連鎖反応に供し、核酸を増幅する工程、並びに
（Ｅ）工程（Ｄ）において増幅された核酸を、インターカレーティング色素からの蛍光シグナルの強度を測定することによって検出する工程、
を含む方法。
工程（Ｅ）が工程（Ｄ）におけるポリメラーゼ連鎖反応中に実施される、請求項１記載の方法。
さらに、（Ｆ）工程（Ｅ）で測定されたシグナル強度から鋳型となるＲＮＡの定量を行う工程を含む、請求項１又は２記載の方法。
請求項１〜３いずれか記載のＲＮＡを検出するための方法に使用するための組成物であって、
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、
耐熱性リボヌクレアーゼＨ、及び
インターカレーティング色素
を含有してなる組成物。
さらに、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及び反応用緩衝液からなる群より選ばれる少なくとも１つを含有してなる請求項４記載の組成物。