JP5279339B2 - 逆転写反応用組成物 - Google Patents

Description

本発明は、逆転写反応に有用な組成物、該組成物を用いるｃＤＮＡの合成方法、及び逆転写反応に有用なキットに関する。

生命現象を解明するためには、様々な遺伝子のｍＲＮＡ分子の解析が非常に重要である。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、即ち逆転写酵素の発見により、ＲＮＡを鋳型にｃＤＮＡを合成する逆転写反応が可能となり、ｍＲＮＡ分子の解析法は長足の進歩を遂げ、逆転写酵素を用いたｍＲＮＡ分子の解析法は現在、遺伝子に関する研究において必須の実験法となっている。更に該方法はクローニング技術やＰＣＲ技術にも応用され、遺伝子に関する研究のみならず、生物学、医学、農業等、幅広い分野において不可欠の技術となっている。

逆転写反応の反応性を改善するための取組みも行われている。例えば、逆転写反応を高温で行う方法、逆転写酵素及び３´−５´エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いるｃＤＮＡの合成方法（特許文献１）、並びにＮｃｐ７、ｒｅｃＡ、ＳＳＢ、及びＴ４ｇｐ３２のような核酸結合タンパク質を利用する方法（特許文献２）等が検討されてきた。

一方、コールドショックタンパク質は、種々の微生物から見出されており、低温への生育温度シフトへの適応に関与するものと考えられている。このうち、Ｍａｊｏｒ Ｃｏｌｄ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎとして知られるＣｓｐＡは、その遺伝子が単離され、組換え体が製造されている（特許文献３）。しかしながら、コールドショックタンパク質の用途として提案されているものは、植物体の低温に対する感受性を低下させるための抗凍結タンパク質としての利用に限られている。

日本特許第３９１００１５号公報 国際公開第００／５５３０７号パンフレット 国際公開第９０／０９４４７号パンフレット

逆転写反応は、その反応性について改善がなされてきたが、現在においても、十分な鎖長を持ったｃＤＮＡを合成できない場合や十分な量のｃＤＮＡを合成することができない場合がある。従って、逆転写反応の更なる反応性の改善が望まれている。

本発明の目的は、逆転写反応に有用な組成物、該組成物を用いるｃＤＮＡの合成方法、及び逆転写反応に有用なキットを提供することにある。

本発明の第１の発明は、コールドショックタンパク質及び逆転写酵素を含む逆転写反応用組成物に関する。本発明の第１の発明において、コールドショックタンパク質としてはＣｓｐＡ又はそのホモローグが例示され、ＣｓｐＡとしては大腸菌由来ＣｓｐＡが例示される。また、本発明の第１の発明において、逆転写酵素としては、モロニーマウス白血病ウイルス由来逆転写酵素及び／又はトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素が挙げられる。また、本発明の第１の発明の組成物は、少なくとも１種のプライマー及び少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。

本発明の第２の発明は、（Ａ）本発明の第１の発明の組成物を用いて、コールドショックタンパク質、逆転写酵素、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及び鋳型となるＲＮＡを含有する溶液を調製する工程、及び（Ｂ）（Ａ）工程で調製した溶液をインキュベーションする工程を含む、ｃＤＮＡの合成方法に関する。

本発明の第３の発明は、コールドショックタンパク質及び逆転写酵素を含む逆転写反応用キットに関する。

本発明により、逆転写反応に有用な組成物、該組成物を用いるｃＤＮＡの合成方法、及び逆転写反応に有用なキットが提供される。本発明により、特異性、合成鎖長、合成量等の反応性に優れた逆転写反応が可能となる。

（１）本発明の組成物
本発明の組成物は、コールドショックタンパク質及び逆転写酵素を含む。本願の発明者らは、コールドショックタンパク質及び逆転写酵素を含む反応組成物を利用して逆転写反応を行うことにより、驚くべきことに、逆転写酵素のみを用いた場合に比べて逆転写反応の反応性が向上することを見出した。

逆転写反応の反応性の向上とは、特に限定するものではないが、例えば反応特異性の向上、核酸合成量の増大、及び合成鎖長の増大から選択される効果のことを言う。

特に本発明は、長鎖のｃＤＮＡの合成を目的とした逆転写反応の際に有用であり、目的とするｃＤＮＡの合成量が増加する。また、非特異的なｃＤＮＡの合成を抑えることもできる。従来、長鎖のｃＤＮＡ合成には、耐熱性の逆転写酵素を用いる高温での逆転写反応が効果的であると提唱されていた（例えば、国際公開第０１／９２５００号パンフレット）が、本発明によれば、逆転写反応を高温で行うことなく、長鎖のｃＤＮＡの合成を効率よく行うことができる。さらに、本発明は、高温での逆転写反応にも適用可能であり、種々の酵素を用いた逆転写反応を改善することが可能である。

コールドショックタンパク質は生物、特に微生物においてその生育温度が正常の温度から低下した際、コールドショックにさらされた際に発現誘導されるタンパク質の総称である。

大腸菌の培養温度を３７℃から１５℃に低下させると、ＣｓｐＡというコールドショックタンパク質が一過性に高レベルで発現される。大腸菌にはＣｓｐＡとアミノ酸配列上の同一性のあるホモローグとしてＣｓｐＢ〜ＣｓｐＩの８種のタンパク質が知られているが、このうちのＣｓｐＢ、ＣｓｐＧ、ＣｓｐＩがコールドショックタンパク質である［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）， １９９９， １８１， １６０３−１６０９］。さらに、これらのコールドショックタンパク質のホモローグがＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＣｓｐＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ（ＣｓｐＢ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（ＣｓｐＢ、ＣｓｐＬ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ（ＣｓｐＬ）等の微生物にも存在していることが知られている。なお、本発明においてＣｓｐＡのホモローグとは、大腸菌由来ＣｓｐＡのアミノ酸配列に対して５０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有するコールドショックタンパク質のことを言う。

本発明には、これらのコールドショックタンパク質を使用することができる。本発明に使用されるコールドショックタンパク質としては、好ましくはＣｓｐＡが、より好ましくはグラム陰性菌由来のＣｓｐＡが、さらにより好ましくは大腸菌由来のＣｓｐＡが使用される。また、本発明に用いるＣｓｐＡは、組換え体であっても微生物から単離されたものであっても良い。

本発明の組成物におけるＣｓｐＡの作用としては、低温時のミスプライミングの抑制による反応特異性の向上及び増幅量の増大や、ＲＮＡの２次構造の解消効果による伸長性の改善及び増幅量の増大が考えられる。

逆転写酵素は、逆転写活性、すなわちＲＮＡを鋳型としてこれに相補的なＤＮＡを合成する活性を有するものであれば本発明に使用でき、このような逆転写酵素としては、モロニーマウス白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ由来逆転写酵素）やトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ由来逆転写酵素）等のウイルス由来の逆転写酵素、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ等）や好熱性バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ等）等の真正細菌由来の耐熱性の逆転写酵素が例示される。

本発明には、ウイルス由来の逆転写酵素が好適に使用され、ＭＭＬＶ由来逆転写酵素がより好適に使用される。また、逆転写活性を有する範囲で天然由来のアミノ酸配列に改変が施された逆転写酵素も本発明に使用できる。

本発明の組成物には、コールドショックタンパク質及び逆転写酵素に加えて、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド及び／又は反応緩衝液が含まれていても良い。

プライマーは、鋳型ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、使用される反応条件において鋳型となるＲＮＡに対してアニールするものであれば特に限定されるものではない。該プライマーはオリゴ（ｄＴ）等のオリゴヌクレオチドやランダムな配列を有するオリゴヌクレオチド（ランダムプライマー）であっても良い。

プライマーの鎖長は、特異的なアニーリングを行う観点から、好ましくは６ヌクレオチド以上であり、更に好ましくは１０ヌクレオチド以上であり、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは１００ヌクレオチド以下であり、更に好ましくは３０ヌクレオチド以下である。前記オリゴヌクレオチドは、例えばＡＢＩ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミタイト法により合成出来る。他にもリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等いかなる方法で合成されたものであっても良い。また、生物試料由来のオリゴヌクレオチドであっても良く、例えば天然の試料より調製したＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化物から単離して作製しても良い。

デオキシリボヌクレオチドは、有機塩基に結合されているデオキシリボースにホスホエステル結合によって結合されたリン酸基からなる。天然型ＤＮＡは、各々４つの異なるヌクレオチドを含有する。アデニン、グアニン、シトシン及びチミン塩基を有するヌクレオチドが天然型ＤＮＡに見られる。塩基のアデニン、グアニン、シトシン、及びチミンはそれぞれ、Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴと略されることが多い。

デオキシリボヌクレオチドは、遊離の一リン酸型、二リン酸型及び三リン酸型（すなわち、リン酸基が、それぞれ、１つ、２つ又は３つのリン酸部分を有する）を含む。従って、デオキシリボヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）並びにそれらの誘導体を含む。

デオキシリボヌクレオチド誘導体は、［αＳ］ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、７−デアザ−ｄＡＴＰ及び核酸分解に抵抗性を示すデオキシヌクレオチド誘導体を含む。ヌクレオチド誘導体は、例えば、^３２Ｐ若しくは^３５Ｓなどの放射性同位体、蛍光部分、化学発光部分、生物発光部分又は酵素で検出できるように標識されているデオキシリボヌクレオチドを含む。

反応緩衝液とは、緩衝剤又は緩衝剤混合物を含む溶液のことを示し、２価陽イオン及び１価陽イオンをさらに含む場合もある。

なお、コールドショックタンパク質を含む逆転写反応用の組成物又はコールドショックタンパク質を含む逆転写反応の反応性促進剤も、本発明の態様の一つである。

（２）本発明の方法
本発明のｃＤＮＡの合成方法は、本発明の組成物を用いて、（Ａ）コールドショックタンパク質、逆転写酵素、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及び鋳型となるＲＮＡを含有する溶液を調製する工程、及び（Ｂ）（Ａ）工程で調製した溶液をインキュベートする工程を含む。本発明のｃＤＮＡの合成方法により、コールドショックタンパク質を含まない組成物を用いた場合と比較して、逆転写反応の反応性が向上する。

逆転写反応の反応性向上は、例えばｃＤＮＡの合成量や合成鎖長を確認することにより、評価することができる。

逆転写反応によって得られたｃＤＮＡの合成量は、例えば、逆転写反応後の反応液の一定量をリアルタイムＰＣＲに供し、目的とする核酸配列の合成量を定量することにより確認することができる。本発明の組成物を用いて逆転写反応を行なった場合、コールドショックタンパク質を含まない組成物を用いて逆転写反応を行なった場合と比較してｃＤＮＡの合成量が増大する。

逆転写反応によって得られたｃＤＮＡの合成鎖長は、例えば、逆転写反応で用いたプライマーのプライミング領域下流近傍から増幅鎖長が異なる複数種類のプライマー対を設定し、各プライマー対を用いたＰＣＲに逆転写反応後の反応液の一定量をそれぞれ供し、その増幅産物量より確認することができる。本発明の組成物を用いて逆転写反応を行なった場合、コールドショックタンパク質を含まない組成物を用いて逆転写反応を行なった場合と比較して長鎖のｃＤＮＡの合成量が増大する。

鋳型となるＲＮＡは、プライマーがハイブリダイズした場合に、プライマーからの逆転写反応の鋳型として働くことができるＲＮＡである。本発明の組成物には、１種類の鋳型を含んでも、又は異なるヌクレオチド配列を有する複数種の鋳型が含まれていてもよい。特定の鋳型に特異的なプライマーを使用することによって、核酸混合物中の複数種の鋳型についてプライマー伸長産物を作製することができる。複数の鋳型は、異なる核酸内に存在しても、同一の核酸内に存在してもよい。

本発明に適用することができる鋳型となるＲＮＡとしては特に制限はなく、試料中の全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等のＲＮＡ分子群、あるいは特定のＲＮＡ分子群（例えば、共通の塩基配列モチーフを有するＲＮＡ分子群、ＲＮＡポリメラーゼによる転写物、サブトラクション法によって濃縮されたＲＮＡ分子群）が挙げられ、逆転写反応に使用されるプライマーが作製可能な任意のＲＮＡが挙げられる。

本発明において、鋳型となるＲＮＡは、例えば細胞、組織、血液のような生体由来試料、食品、土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料に含有されたものであっても良く、該試料等を公知の方法で処理することによって得られる核酸含有調製物に含有されたものであっても良い。該調製物としては、例えば細胞破砕物やそれを分画して得られる試料、該試料中の全ＲＮＡ、あるいは特定のＲＮＡ分子群、例えば、ｍＲＮＡを富化した試料等が挙げられる。

本発明の方法におけるコールドショックタンパク質の使用量は、特に限定はないが、反応液量２０μＬで逆転写反応を行う場合、好適には０．５〜２０μｇであり、より好適には１〜１０μｇであり、さらにより好適には２〜５μｇである。

本発明の方法における逆転写酵素の使用量は、特に限定はないが、例えば従来の逆転写反応において使用されていた量を使用すれば良い。例えばＭＭＬＶ由来逆転写酵素を用いて反応液量２０μＬで逆転写反応を行う場合、反応液中の該酵素量は１０Ｕ以上であり、ｃＤＮＡ合成効率の観点から、好ましくは１００Ｕ以上であり、更に好ましくは２００Ｕ以上である。従来の方法では、過剰量の逆転写酵素による反応阻害を避けるために鋳型ＲＮＡ量やｃＤＮＡ合成鎖長に応じて酵素量を調節する必要があったが、本発明の方法においてはその必要はない。

なお、本明細書に記載の逆転写酵素の活性は市販の酵素の表示に基づくものであり、例えば、Ｐｏｌｙ（ｒＡ）・ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）_{１２−１８}を鋳型／プライマーとし、３７℃、１０分間に１ｎｍｏｌの［^３Ｈ］ｄＴＴＰ を取り込む酵素活性を１Ｕとする。

本発明の方法におけるプライマーの濃度は、特に制限はないが、鋳型ＲＮＡからの最大限のｃＤＮＡ合成の観点から、特異的プライマーで逆転写反応を行う場合、好ましくは０．１μＭ以上、Ｏｌｉｇｏ ｄＴプライマーで逆転写反応を行う場合、好ましくは２．５μＭ以上、ランダムプライマーで逆転写反応を行う場合、好ましくは５μＭ以上の十分量のプライマー濃度で行えばよい。従来の方法では、過剰量のプライマーによる反応阻害を避けるために鋳型ＲＮＡ量やｃＤＮＡ合成鎖長に応じてプライマー量を調節する必要があったが、本発明の方法においてはその必要はない。

本発明のｃＤＮＡの合成方法は、好適には（Ａ）ＣｓｐＡ、逆転写酵素、少なくとも一種のリボヌクレオチド、少なくとも１種のプライマー、及び鋳型となるＲＮＡを混合し、反応組成物を調製する工程、及び（Ｂ）鋳型ＲＮＡに相補的なプライマー伸長鎖を合成するために十分な条件で（Ａ）工程で調製した反応組成物をインキュベートする工程を含む。

鋳型ＲＮＡに相補的なプライマー伸長鎖を合成するために十分な条件とは、特に限定するものではないが、温度条件としては３０℃〜６５℃が例示され、４２℃〜４５℃がより好適である。また、反応時間としては、５分〜１２０分が例示され、１５分〜６０分がより好適である。なお、本発明のｃＤＮＡの合成方法によれば、上記の温度条件に満たない温度に反応液を放置することに起因する、非特異的なプライマー伸長鎖の合成を抑制又は低減することができる。従って、本発明のｃＤＮＡの合成方法は、例えば、反応液の調製に長時間を要するような多検体を取り扱うｃＤＮＡの合成の際に、特に有用である。

なお、本発明の方法により得られたｃＤＮＡを鋳型として核酸増幅反応を実施することにより、ｃＤＮＡを増幅することが出来る。核酸増幅反応としては、特に限定するものではないが、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法が例示される。

（３）本発明のキット
本発明のキットは、コールドショックタンパク質及び逆転写酵素を含む。本発明のキットにより、反応性が高い逆転写反応を行うことができる。本発明のキットとしては、逆転写反応に用いられるためのキットであれば特に限定されるものではなく、試験管内での逆転写反応を行なうためのキットが挙げられる。具体的には、例えば、核酸標識用キット、ＲＴ−ＰＣＲ用キット、ｃＤＮＡ合成用キット、部位特異的変異導入用キット等が挙げられる。

本発明のキットには、コールドショックタンパク質及び逆転写酵素に加えて、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、鋳型となる核酸及び／又は反応緩衝液が含まれていても良い。

コールドショックタンパク質、逆転写酵素、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、鋳型となる核酸及び／又は反応緩衝液は、これらのうち一部又は全部が混合された状態でキットに包含されていても、それぞれが単独のコンポーネントの状態でキットに包含されていてもよい。

また、本発明のキットには、逆転写反応によって得られるｃＤＮＡを鋳型とした遺伝子増幅反応、例えばＰＣＲを行うための試薬がさらに含有されていても良い。このような試薬としては、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝液、少なくとも一種のデオキシリボヌクレオチド、及び少なくとも一対のプライマー対が挙げられる。

本発明のキットに含まれるコールドショックタンパク質、逆転写酵素、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、鋳型となる核酸及び反応緩衝液としては、前記の（１）「本発明の組成物」に記載のものが例示される。

以下に実施例をもってさらに詳細に本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。なお、下記実施例において各酵素の活性は、各酵素に添付の説明書の表示に基づいて示した。

調製例 ＣｓｐＡ溶液及び酵素保存バッファーの調製
ＣｓｐＡをＳ．Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．）， １９９３， １１４， ６６３−６６９］に記載の方法に従って発現、精製した後、２μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液（２μｇ／μＬ ＣｓｐＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８（４℃））、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、５０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、及び５μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液（５μｇ／μＬ ＣｓｐＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８（４℃））、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、５０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を調製した。

また、ＣｓｐＡを含まない酵素保存バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８（４℃））、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、５０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）についても調製した。

以下の実施例における酵素保存バッファーとしては、本調製例で調製したものを使用した。また、ＣｓｐＡ溶液としては、実施例１〜６では本調製例において調製した２μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液を使用し、実施例７〜８では本調製例において調製した５μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液を使用した。

実施例１ Ｏｌｉｇｏ ｄＴをプライマーとして用いた逆転写反応におけるＰｏｌｙＡ以外からの非特異的伸長産物量（バックグランド）の確認１
Ｈｕｍａｎ ｈｅａｒｔ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １μｇ（クロンテック社）を鋳型とし、Ｏｌｉｇｏ ｄＴ（終濃度２．５μＭ）によりｃＤＮＡを合成するための逆転写反応液２０μＬをＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴａｓｅ（タカラバイオ社）を用いて氷上調製した。その際、逆転写反応液の組成は、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴａｓｅに添付の説明書に記載の逆転写反応液の組成に加えて２μｇ ＣｓｐＡを含むものとした。また、対照として、２μｇ ＣｓｐＡの代わりに酵素保存バッファー１μＬを加えたＣｓｐＡを含まない逆転写反応液についても調製した。次に、氷上調製したこれらの逆転写反応液について、０〜２０分間氷上放置した後、９５℃まで加熱して逆転写酵素を失活させた。続いて、０〜２０分間の氷上放置により生成したｃＤＮＡ量を確認するため、これらの反応液のうちそれぞれ２μＬを、ディストロフィン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿００４００６）のＰｏｌｙＡから約７ｋｂ離れた領域の１３９塩基（６５２９−６６６７）、及びＰｏｌｙＡの近傍から６９３０塩基の鎖長（６５２９−１３４５８）をターゲットとしたリアルタイムＰＣＲに供した。

上記１３９塩基をターゲットとしたリアルタイムＰＣＲは、プライマーとして配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号２の塩基配列からなるプライマーを用い、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ社）を用いて添付の説明書の推奨条件に従って行った。一方、上記６９３０塩基をターゲットとした長鎖のリアルタイムＰＣＲは、プライマーとして配列番号１の塩基配列からなるプライマー及び配列番号３の塩基配列からなるプライマーを用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） ＧＸＬ（タカラバイオ社）及びＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉ（タカラバイオ社）を用いて行った。リアルタイムＰＣＲの反応液は、最終濃度が×０．３３となるようにＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉを加えた点以外はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） ＧＸＬに添付の説明書に記載の高速ＰＣＲプロトコールの反応液組成に従って調製した。また、リアルタイムＰＣＲは、９８℃、１０秒間のインキュベートの後、９８℃、５秒〜６８℃、２分を１サイクルとした４０サイクルの条件で実施した。なお、本明細書に記載のいずれの実施例においても、リアルタイムＰＣＲにはＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標） Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｃｙｓｔｅｍ ＴＰ８００（タカラバイオ社）を使用した。また、検量線は、上記領域を含む１３５４２塩基（１７３−１３７１４）のｃＤＮＡをｐＵＣ１１８のＨｉｎｃ ＩＩサイトにクローン化したプラスミドの希釈系列を用いて作成した。

その結果、ＰｏｌｙＡ近傍から６９３０塩基の長鎖のｃＤＮＡ産物は、逆転写反応液中のＣｓｐＡの有無にかかわらず検出されなかった。一方、ＰｏｌｙＡから約７ｋｂ離れた領域の１３９ｂｐのｃＤＮＡ量は、逆転写反応液中にＣｓｐＡが存在しない場合には氷上放置時間が長くなるに従い増加した。これに対し、逆転写反応液中にＣｓｐＡが存在する場合は、同領域のｃＤＮＡ量がほとんど増加せず、氷上放置２０分のｃＤＮＡ合成量は反応液中にＣｓｐＡが存在しない場合の４０分の１であった（図１）。ＰｏｌｙＡ近傍から６９３０塩基の長鎖のｃＤＮＡ産物は検出されないことから、逆転写反応液調製時及び氷上放置で生じるＰｏｌｙＡから約７ｋｂ離れた領域の１３９ｂｐのｃＤＮＡ合成産物は、ＰｏｌｙＡから伸長した産物ではなくＰｏｌｙＡ以外からの非特異的な伸長産物であることが分かる。このような非特異的な伸長産物は、完全長のｃＤＮＡを得る目的においてはバックグランドとなる。また、この非特異的な伸長産物は、ＰｏｌｙＡからＲＮＡの５′端までの伸長反応を阻害し、不完全長のｃＤＮＡ合成産物の増加をもたらす。

本実施例において、逆転写反応液中のＣｓｐＡにより、逆転写反応液調製時及び氷上放置で生じるｐｏｌｙＡ以外からの非特異的伸長産物（バックグランド）の生成がほぼ完全に抑制されることが示された。

実施例２ Ｏｌｉｇｏ ｄＴをプライマーとして用いた逆転写反応におけるＰｏｌｙＡ以外からの非特異的伸長産物量（バックグランド）の確認２
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴａｓｅに代えてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴａｓｅ（インビトロジェン）を用い、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴａｓｅに添付の説明書に沿って２μｇ ＣｓｐＡを含む逆転写反応液２０μＬ及び対照のＣｓｐＡを含まない逆転写反応液２０μＬを調製する点以外は、実施例１と同様の方法で、ＣｓｐＡの効果を検討した。なお、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴａｓｅはＭＭＬＶ由来逆転写酵素の変異体である。

その結果、逆転写酵素にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴａｓｅを用いた場合も、ＰｏｌｙＡ近傍から６９３０塩基の長鎖のｃＤＮＡ産物は反応液中のＣｓｐＡの有無にかかわらず検出されなかった。また、ＰｏｌｙＡから約７ｋｂ離れた領域の１３９ｂｐのｃＤＮＡ産物量は、反応液中にＣｓｐＡが存在しない場合は氷上放置時間が長くなるに従い増加するのに対し、反応液中にＣｓｐＡが存在する場合はほとんど増加せず、氷上放置２０分のｃＤＮＡ合成量が反応液中にＣｓｐＡが存在しない場合の８７分の１であった（図２）。以上のことより、逆転写酵素にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴａｓｅを用いても、逆転写反応液中のＣｓｐＡにより、逆転写反応液調製時及び氷上放置で生じるＰｏｌｙＡ以外からの非特異的伸長産物（バックグランド）の生成がほぼ完全に抑制されることが示された。

実施例３ Ｏｌｉｇｏ ｄＴをプライマーとして用いた逆転写反応におけるＰｏｌｙＡ以外からの非特異的伸長産物量（バックグランド）の確認３
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴａｓｅに代えてＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ）（タカラバイオ社）を用い、１μｇ／μＬのＨｕｍａｎ ｈｅａｒｔ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（クロンテック社）１μＬ、５０μＭのＯｌｉｇｏ ｄＴ １μＬ、各２．５ｍＭのｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ １．６μＬ、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ） Ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ、４０Ｕ／μＬのＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ０．５μＬ、２５Ｕ／μＬのＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ） ０．８μＬ、及び２μｇ／μＬのＣｓｐＡ １μＬを含む逆転写反応液２０μＬを調製する点、並びにこの反応液の対照としてＣｓｐＡを含まない逆転写反応液２０μＬを調製する点以外は、実施例１と同様の方法で、ＣｓｐＡの効果を検討した。なお、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ）は、ＡＭＶ由来逆転写酵素である。

その結果、逆転写酵素にＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ）を用いた場合も、ＰｏｌｙＡ近傍から６９３０塩基の長鎖のｃＤＮＡ産物は、反応液中のＣｓｐＡの有無にかかわらず検出されなかった。また、ＰｏｌｙＡから約７ｋｂ離れた領域の１３９ｂｐのｃＤＮＡ産物量は、反応液中にＣｓｐＡが存在しない場合は氷上放置時間が長くなるに従い増加するのに対し、反応液中にＣｓｐＡが存在する場合はほとんど増加せず、氷上放置２０分のｃＤＮＡ合成量は反応液中にＣｓｐＡが存在しない場合の８４分の１であった（図３）。以上のことから、ＡＭＶ由来逆転写酵素を用いても、逆転写反応液中のＣｓｐＡにより、逆転写反応液調製時及び氷上放置で生じるＰｏｌｙＡ以外からの非特異的伸長産物（バックグランド）の生成がほぼ完全に抑制されることが示された。

実施例４ Ｏｌｉｇｏ ｄＴをプライマーとして用いた逆転写反応における長鎖ｃＤＮＡ合成反応の阻害１
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴａｓｅ（タカラバイオ社）を用いて、２μｇ ＣｓｐＡを含む逆転写反応液２０μＬ、及びＣｓｐＡを含まない対照の逆転写反応液２０μＬを、実施例１と同様の方法で調製した。氷上調製した反応液は、０〜２０分間氷上放置した後、４２℃、３０分の条件で逆転写反応を行ない、９５℃で５分間加熱し反応を中止した。この反応液のうち２μＬについて、ディストロフィン遺伝子のＰｏｌｙＡ近傍から６９３０塩基の長鎖をターゲットとしたリアルタイムＰＣＲを実施例１と同様の方法で行い、逆転写反応により生成したｃＤＮＡ量を定量した。

その結果、ＣｓｐＡを含まない反応液では、２０分の氷上放置によりＰｏｌｙＡ近傍からの６９３０塩基の長鎖の伸長産物量が氷上放置しない場合の５２％に減少した。これに対し、ＣｓｐＡを含む反応液では２０分氷上放置してもｃＤＮＡ合成量は全く減少しなかった（図４）。このＣｓｐＡの効果は、反応液中のＣｓｐＡによりＰｏｌｙＡ以外からの非特異的な伸長反応がほぼ完全に抑制され、ＰｏｌｙＡからの伸長反応阻害が起こらなかったことに起因すると考えられる。

以上の結果から、反応液中のＣｓｐＡにより、反応液調製後、逆転写反応するまでに要する時間を気にする必要がなく、ＰｏｌｙＡからのｃＤＮＡ合成において極めてバックグランドが少なく、完全長の割合が高い高品質なｃＤＮＡ合成反応が可能であることが分かった。

実施例５ Ｏｌｉｇｏ ｄＴをプライマーとして用いた逆転写反応における長鎖ｃＤＮＡ合成反応の阻害２
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴａｓｅに代えてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴａｓｅ（インビトロジェン社）を用い、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴａｓｅに添付の説明書に沿って２μｇ ＣｓｐＡを含む逆転写反応液、対照のＣｓｐＡを含まない逆転写反応液２０μＬを調製する点、及び５０℃、３０分の条件で逆転写反応を行い、７０℃で１５分間加熱し反応を中止する点以外は実施例４と同様の方法で試験を行い、逆転写反応により生成したｃＤＮＡ量を定量し、ＣｓｐＡの効果を確認した。

その結果、ＣｓｐＡを含まない反応液では、２０分の氷上放置によりＰｏｌｙＡ近傍からの長鎖の伸長産物量が氷上放置しない場合の１１％に減少した。これに対し、ＣｓｐＡを含む反応液では、２０分氷上放置しても氷上放置しない場合と比較して８０％のｃＤＮＡ合成量を保った（図５）。本実施例により、逆転写酵素にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴａｓｅを用いた場合であっても、ＣｓｐＡが逆転写反応液調製や氷上放置によるＰｏｌｙＡからの長鎖ｃＤＮＡ合成反応の阻害を抑制することが確認できた。

実施例６ Ｏｌｉｇｏ ｄＴをプライマーとして用いた逆転写反応における長鎖ｃＤＮＡ合成反応の阻害３
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴａｓｅに代えてＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ）（タカラバイオ社）を用い、１μｇ／μＬのＨｕｍａｎ ｈｅａｒｔ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（クロンテック社） １μＬ、５０μＭのＯｌｉｇｏ ｄＴ １μＬ、各２．５ｍＭのｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ １．６μＬ、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ） Ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ、４０Ｕ／μＬのＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ０．５μＬ、２５Ｕ／μＬのＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ） ０．８μＬ、及び２μｇ／μＬのＣｓｐＡ １μＬを含む逆転写反応液２０μＬを調製する点、並びにこの反応液の対照としてＣｓｐＡを含まない逆転写反応液２０μＬを調製する点以外は実施例４と同様の方法で試験を行い、逆転写反応により生成したｃＤＮＡ合成量を定量し、ＣｓｐＡの効果を確認した。

その結果、ＣｓｐＡを含まない反応液では、２０分の氷上放置によりＰｏｌｙＡ近傍からの長鎖の伸長産物量が氷上放置しない場合の３３％に減少した。これに対し、ＣｓｐＡを含む反応液では、２０分氷上放置しても氷上放置しない場合と比較して７５％のｃＤＮＡ合成量を保った（図６）。本実施例により、ＡＭＶ由来逆転写酵素を用いた場合であっても、ＣｓｐＡが逆転写反応液調製や氷上放置によるＰｏｌｙＡからの長鎖ｃＤＮＡ合成反応の阻害を抑制することが確認できた。

実施例７ 未変性ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応に及ぼすＣｓｐＡの効果
調製例で調製した５μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液を酵素希釈バッファーで希釈し、０．２μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液、１μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液、及び２μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液を調製した。次に、１μｇ／μＬのＨｕｍａｎ ｈｅａｒｔ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（クロンテック社） １μＬ、５０μＭのＯｌｉｇｏ ｄＴ １μＬ、各１０ｍＭのｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ １μＬ、及び滅菌蒸留水６μＬに、酵素希釈バッファー、０．２μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液、１μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液、２μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液、又は５μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液を１μＬ加えた計１０μＬの混合液をそれぞれ調製した。酵素希釈バッファーを用いて調製したＣｓｐＡを含まない混合液については、６５℃、５分のＲＮＡ変性処理を行った場合と行わない場合の２種類の試料を調製し、ＣｓｐＡを含む各混合液についてはＲＮＡの変性処理を行わなかった。

これらの混合液各１０μＬに対し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）に含まれる５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ｂｕｆｆｅｒ ４μＬ、４０Ｕ／μＬのＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ０．５μＬ、２００Ｕ／μＬのＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴａｓｅ ０．５μＬ、及び滅菌蒸留水５μＬを添加して計２０μＬの反応液を調製した後、４２℃、３０分の逆転写反応を行い、９５℃、５分の加熱により反応を中止した。次に、これらの反応液各２．５μＬを、ディストロフィン遺伝子の約８ｋｂの領域をターゲットとするＰＣＲに供した。ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（登録商標） Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社）を用いて添付の説明書記載の反応組成により行った。プライマーとしては、配列番号４の塩基配列からなるプライマーと配列番号５の塩基配列からなるプライマーを用い、ＰＣＲ反応液中の各プライマーの濃度は、２００ｎＭとした。また、ＰＣＲは、９８℃、１０秒〜６８℃、８分を１サイクルとする３０サイクルのＰＣＲ条件で、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標）（タカラバイオ社）を用いて実施した。ＰＣＲ反応終了後、反応液のうち３μＬをアガロースゲル電気泳動に供して増幅鎖長と増幅量を確認し、各逆転写反応におけるｃＤＮＡ合成量と反応特異性を評価した（図７）。

その結果、未変性のＲＮＡを鋳型とした逆転写反応において、反応液中にＣｓｐＡを添加することで、その後のＰＣＲにより確認できる約８ｋｂの長鎖のｃＤＮＡの増幅量が大きく増加するとともにターゲット以外のＤＮＡの増幅量が減少した（図７）。以上のことより、ＲＮＡの変性操作を行わなくても反応液中にＣｓｐＡを加えることで効率よく、かつ高い特異性でｃＤＮＡ合成されることが示された。

実施例８ １ ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲに及ぼすＣｓｐＡの効果
５ｎｇ又は５０ｎｇのＨｕｍａｎ ｈｅａｒｔ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（クロンテック社）を鋳型として用い、ディストロフィン遺伝子の約２ｋｂの領域をターゲットとする１ ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲについて、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて行った。プライマーとしては、配列番号５の塩基配列を有するプライマー及び配列番号６の塩基配列を有するプライマーを用いた。１ ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲの反応液の組成は、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔに添付の説明書に記載の組成に加えて、５μｇのＣｓｐＡを２５μＬの反応液に加えた。また、対照として、５μｇ ＣｓｐＡの代わりに酵素保存バッファー１μＬを加えたＣｓｐＡを含まない反応液と、Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＳＢ）溶液（ｕｓｂ社）（５μｇ／μＬ ＳＳＢ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、５０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を１μＬ加えた反応液についても調製した。それぞれの反応液について、４２℃、３０分の逆転写反応、９４℃、２分の熱処理を行った後、９４℃、３０秒〜５５℃、３０秒〜７２℃、２分を１サイクルとする３０サイクルのＰＣＲ反応をＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標）で行った。反応終了後、反応液のうち３μＬを１％アガロースゲル電気泳動に供して、反応産物を解析した（図８）。

その結果、図８に示すように、ＣｓｐＡを添加することにより約２ｋｂの目的サイズ以外の非特異的な増幅産物が著しく減少した。一方、ＳＳＢを添加した場合、目的サイズの増幅産物は得られなかった。

本発明の組成物、該組成物を用いる核酸合成方法、及びキットは、広く遺伝子工学の分野に有用である。

非特異的な伸長産物のＣｓｐＡによる阻害効果を示す図である。 非特異的な伸長産物のＣｓｐＡによる阻害効果を示す図である。 非特異的な伸長産物のＣｓｐＡによる阻害効果を示す図である。 ＣｓｐＡによる逆転写反応の反応性の向上効果を示す図である。 ＣｓｐＡによる逆転写反応の反応性の向上効果を示す図である。 ＣｓｐＡによる逆転写反応の反応性の向上効果を示す図である。 ＣｓｐＡによる逆転写反応の反応性の向上効果を示す図である。なお、図中のＭは、λ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（タカラバイオ社）マーカー２．５μＬの電気泳動を行ったレーンであることを示す。 ＣｓｐＡによる逆転写反応の反応性の向上効果を示す図である。なお、図中のＭは、λ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（タカラバイオ社）マーカー２．５μＬの電気泳動を行ったレーンであることを示す。

SEQ ID NO:1 ;Synthetic primer for real time PCR quantification of dystrophin cDNA.
SEQ ID NO:2 ;Synthetic primer for real time PCR quantification of dystrophin cDNA.
SEQ ID NO:3 ;Synthetic primer for real time PCR quantification of dystrophin cDNA.
SEQ ID NO:4 ;Synthetic primer to amplify a DNA fragment of dystrophin gene.
SEQ ID NO:5 ;Synthetic primer to amplify a DNA fragment of dystrophin gene.
SEQ ID NO:6 ;Synthetic primer to amplify a DNA fragment of dystrophin gene.

Claims (7)

1. ＣｓｐＡ及び逆転写酵素を含む逆転写反応用組成物。
2. ＣｓｐＡが大腸菌由来ＣｓｐＡである請求項１記載の組成物。
3. 逆転写酵素がモロニーマウス白血病ウイルス由来逆転写酵素及び／又はトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素である請求項１記載の組成物。
4. 少なくとも１種のプライマー及び少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチドをさらに含む、請求項１記載の組成物。
5. （Ａ）請求項１〜４いずれか１項に記載の組成物を用いて、ＣｓｐＡ、逆転写酵素、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及び鋳型となるＲＮＡを含有する溶液を調製する工程、及び（Ｂ）（Ａ）工程で調製した溶液をインキュベーションする工程を含む、ｃＤＮＡの合成方法。
6. ＣｓｐＡ及び逆転写酵素を含む逆転写反応用キット。
7. 請求項１〜４いずれか１項に記載の組成物を用いて、ＣｓｐＡ、逆転写酵素、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及び鋳型となるＲＮＡを含有する溶液を調製することを特徴とする、ｃＤＮＡの合成における低温時のミスプライミングの抑制方法。

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