JP2023002557A - シングルプライマーからデュアルプライマーのアンプリコンへのスイッチング - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は、増幅反応中に、アンプリコン末端をスイッチングする方法に関する。特に、シングルプライマーPCRアンプリコンをデュアルプライマーPCRアンプリコンに変換することに関する。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの増幅反応は、多くの用途において広く使用されている。例えば、DNAシーケンシング(例えば、次世代シーケンシング)用のライブラリーを調製するためにDNAまたはRNAが増幅され得る。全ゲノム増幅(WGA)または全トランスクリプトーム増幅(WTA)は、シングルプライマーPCRを含み、これはデュアルプライマー生成アンプリコンを必要とする用途には直接適合しない可能性がある。これは、アダプターをWGAまたはWTAアンプリコンに直接連結することによって、またはWGA/WTAプライマー配列を切除した後に、通常達成される。PCR中のプライマーをスイッチングするための迅速かつ効率的な手段が必要とされている。
本開示は、プライマースイッチングのための方法を提供する。さらに具体的には、シングルプライマーPCRアンプリコンをデュアルプライマーPCRアンプリコンに変換するための方法が、本明細書で提供される。定義によると、シングルプライマーPCRは、5’-3’相補的なアンプリコンを作製する(図1参照)。これらのアンプリコンの変性および冷却により、3’-5’融解温度(Tm)がプライマー配列によって決定される、分子間および分子内5’-3’ハイブリッドの混合物が作製される。これらのシングルプライマーアンプリコンを、デュアルプライマーアンプリコンに変換すること(ここでは、デュアルプライマーの3’部分が、シングルプライマーPCRアンプリコンの3’部分に相補的である)は、デュアルプライマーの1本鎖(すなわち、変性)シングルプライマーアンプリコンへのアニーリングを必要とする。しかしながら、デュアルプライマーのTmは、シングルプライマーのTmよりも、必ず低いものである。このように、シングルプライマーPCRアンプリコン分子間/分子内ハイブリッドは、デュアルプライマーハイブリダイゼーションに必要とされるよりも高い温度でアニールし、それ故、デュアルプライマーのアニーリングおよびプライマー伸長を、阻害するか、または、それらと不利に競合するであろう。本明細書で開示される方法は、アンプリコンの5’末端の消化を可能にするシングルプライマーPCR用のプライマーを使用することにより、この問題を解決する。従って、5’消化末端と3’相補的末端との間の相互作用は安定性が低く、それによって異なるプライマーへのアニーリングが可能になる。
本開示の一局面は、シングルプライマーPCRアンプリコンをデュアルプライマーPCRアンプリコンに変換するための方法を包含する。本方法は、以下を含む:標的核酸を、場合により消化可能な5’末端と、完全にまたは部分的に縮重した3’末端とを含み、その間を、デュアルプライマーPCRプライマー配列に相同な一連の塩基と、場合により任意のタグ配列とによって区切られた複数の合成プライマーと接触させることにより、シングルプライマーPCR鋳型を形成すること;シングルプライマーPCR鋳型を、増幅をサポートする条件下で、消化可能な5’部分と、場合により消化不可能な3’部分とを含むプライマーと、接触させること(以下に記載のステップI、II、およびIII);
シングルプライマーPCRアンプリコンを、シングルプライマーPCRアンプリコンの5’部分を消化できる酵素で処理して、消化されたアンプリコンを形成すること(以下に詳述のステップIV);および、消化されたアンプリコンの未消化部分に相同性を有する一対のPCRプライマーで、消化されたアンプリコンを増幅し(以下に詳述のステップV)、それにより、デュアルプライマーPCRアンプリコンを形成すること。
本方法の第1のステップは、プライマー伸長条件下で、標的核酸を合成プライマーと接触させることにより、シングルプライマーPCRアンプリコンを形成することを含む。
本明細書で用いられる合成プライマーは、少なくとも3つの部分を含む:シングルプライマーPCRプライマーと相同な5’部分、デュアルプライマーPCRプライマーの3’末端に場合により相同な入れ子部分、および3’鋳型ターゲティング配列である。5’部分は、場合により消化可能である。3’部分は、完全にランダムな配列、準ランダム(quasi random)な配列、またはプールされたターゲティングプライマー配列の合計であり得る。いくつかの実施形態において、合成プライマーは、合成方向および/または分子同一性をモニターするのに有用な、タグ配列(本明細書では、バーコードまたはインデックス配列とも呼ばれる)を含み得る。シングルプライマーPCRプライマーは、少なくとも合成プライマーの第1の5’部分を含み、消化可能である。いくつかの実施形態において、シングルプライマーPCRプライマーは、2つの異なる部分である、消化可能な5’部分および消化不可能な3’部分を含む(図3B参照)。いくつかの実施形態において、シングルプライマーPCRプライマーの消化可能な5’部分は、少なくとも1つのグリコシラーゼ感受性塩基を含む。他の実施形態において、シングルプライマーPCRプライマーは、シングルプライマーPCRプライマーの消化可能な5’部分と消化不可能な3’部分との境界に、少なくとも1つのヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを含む。消化可能部分の配列は、場合により、以下に詳述したデュアルプライマーPCRプライマーの3’部分に相同である。
本開示の一局面は、ランダム3’配列、半ランダム3’配列、または特異的3’配列のプール、固定の5’配列、場合により存在する内部タグ配列、並びに5’配列と内部タグおよび/または3’鋳型ターゲティング配列との間の入れ子配列を含む、人工オリゴヌクレオチドを包含する(図3A参照)。さらなる局面は、RNAのディレクショナルな増幅に用いられ得る、複数の第1オリゴヌクレオチドおよび複数の第2オリゴヌクレオチドを含む、複数の人工オリゴヌクレオチドを提供する。複数の第1オリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドは、ランダム3’配列、半ランダム3’配列、または特異的3’配列のプール、少なくとも1つの消化可能残基を場合により含む固定の5’配列、アダプター配列に相同な入れ子配列、および場合により、第1タグ配列を含む内部タグ配列を含む。複数の第2オリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドは、ランダム3’配列、半ランダム3’配列、または特異的3’配列のプール、少なくとも1つのデオキシウリジン残基を含む固定の5’配列、アダプター配列に対応する入れ子配列、および場合により、第2タグ配列を含む内部タグ配列を含むが、ただし、複数の第1および第2オリゴヌクレオチドの一方または両方は、第1および/または第2タグ配列を含む(図21および図22参照)。
配列を含み得る(図3A参照)。一般に、タグ配列は、(固定の5’配列の3’末端の)入れ子配列と、ランダム3’配列、半ランダム3’配列、または特異的3’配列のプールとの間に存在する。タグ配列は、出発RNA分子の方向および/または分子同一性に関してcDNA産物をタグ付けするのに役立つ。オリゴヌクレオチドが、場合により存在するタグ配列を含有する場合、タグ配列は、RNAの3’末端の方向性を示す働きをする第1タグ配列、または、RNAの5’末端の方向性を示す働きをする第2タグ配列であり得る。
本方法は、プライマー伸長条件下で標的核酸を合成プライマーと接触させ、その後増幅条件下でシングルプライマーPCRプライマーと接触させることにより、シングルプライマーPCRアンプリコンを形成することを含む。様々な標的核酸を、シングルプライマーPCRで増幅することができる。いくつかの実施形態において、標的核酸はゲノムDNAであり得る。ゲノムDNAは、核、ミトコンドリア、または色素体DNAであり得る。いくつかの実施形態において、標的核酸は、ゲノムライブラリー、すなわち、細胞または細胞集団の全ゲノムを含み得る。他の実施形態において、標的核酸は、メッセンジャーRNA(mRNA)または非コードRNA(例えば、マイクロRNA(miRNA)、長鎖非コードRNA(lncRNA)、長鎖遺伝子間非コードRNA(lincRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、Piwi結合RNA(piRNA)、トランス作動性RNA(rasiRNA)、リボソームRNA(rRNA)、トランスファーRNA(tRNA)、ミトコンドリアtRNA(MT-tRNA)、核内低分子RNA(snRNA)、核小体低分子RNA(snoRNA)、SmY RNA、Y RNA、スプライスリーダーRNA(SL RNA)、および/またはテロメラーゼRNA要素)から転写された、相補DNA(cDNA)であり得る。ある実施形態において、標的核酸は、細胞または細胞集団のトランスクリプトームに由来する、cDNAのライブラリーであり得る。当業者は、ゲノムDNAの単離、RNAの単離、および/またはRNAからのcDNAの調製のための手段(例、標準的プロトコール、市販のキットなど)に精通している。
上記に詳述したように、合成プライマーの後に、シングルプライマーPCRプライマーを、増幅条件下で、上記に詳述したように、標的核酸と接触させて、シングルプライマーPCRアンプリコンを形成する。増幅条件は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増幅を含む(図14、15および16参照)。
あるいは、増幅反応は、多置換増幅(MDA)、転写増幅(TMA)、核酸配列ベースの(nucleic acid sequence-based)増幅(NASBA)、鎖置換増幅(SDA)、ループ介在等温増幅(LAMP)、ヘリカーゼ依存増幅(HAD)、ニッキング酵素増幅反応(NEAR)、ローリングサークル増幅(RCA)、またはライゲーション媒介(ligation mediated)増幅であり得る。
DNAについては、非ディレクショナルな増幅ステップは、複数の合成プライマーの存在下で少なくとも1つのDNA分子を複製して、複数の2本鎖鋳型を生成することを含み、ここで、複数の合成プライマーのそれぞれが、(5’から3’に)固定の、場合により消化可能な5’配列、アダプター配列に相補性を有する入れ子配列、場合により存在するタグ配列、およびランダム3’配列、半ランダム3’配列、または目的のDNA分子に相補性を有する特異的3’配列のプールを含む(図14参照)。
あるいは、ステップIIは、RNAをディレクショナルに増幅すること、およびシーケンシングのために増幅産物を調製することを含み得る。ディレクショナルな増幅プロセスは、以下に記載される、2つのサブステップAおよびBを含む。
ステップII非ディレクショナルまたはステップIIディレクショナルにおいて、DNA、非ディレクショナルRNA、またはディレクショナルRNA増幅プロセスが、用いられるかに関わらず、本明細書に記載される方法の次のステップは、1つ以上の増幅プライマー存在下で、複数の2本鎖DNA産物を増幅して、DNA産物の増幅ライブラリーを生成することを含む。
ステップIIIの増幅の次は、消化である(図14、図15および図16の消化ステップ参照)。このステップIVは、DNA産物の増幅ライブラリーを消化酵素と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、消化酵素は、ウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)である。UDGによる処理は、増幅cDNA産物の5’末端でウラシル塩基を加水分解し、各アンプリコンの末端塩基対形成を効果的に弱める。UDGは、細菌、酵母、または哺乳動物起源のものであり得る。いくつかの実施形態において、UDGは、大腸菌(E.coli)由来である。cDNA産物の増幅ライブラリーと接触するUDGの量は、変化し得るものであり、実際に変化する。当業者は、適切な量および好適な反応条件 (例えば、温度、時間など)を、容易に決定することができる。プライマースイッチングの別の実施形態において、エキソヌクレアーゼによる処理は、ヌクレアーゼ耐性塩基に遭遇するまでアンプリコンから5’塩基を除去し、各アンプリコンの末端塩基対形成を効果的に排除する。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼはT7エキソヌクレアーゼである。DNA産物の増幅ライブラリーと接触するエキソヌクレアーゼの量は、変化し得るものであり、実際に変化する。当業者は、適切な量および好適な反応条件 (例えば、温度、時間など)を、容易に決定することができる。
グリコシラーゼは、中温性または好熱性で有り得る。シングルプライマーPCRアンプリコンと接触させるグリコシラーゼの量は、例えば、グリコシラーゼ酵素の同一性、アンプリコンにおけるグリコシラーゼ感受性塩基の数などに応じて、変化し得るものであり、実際に変化する。当業者は容易に、適切な量を決定することができる。グリコシラーゼ反応ステップの温度は、約20℃~約80℃の範囲であり得、グリコシラーゼ反応ステップの時間は、約5分~約2時間の範囲であり得る。
消化の次のステップは、DNA産物の増幅ライブラリーの5’末端に、アダプターを付与することを含む。増幅されたcDNA産物の末端の塩基対形成は、消化のために弱められ、各産物の3’末端は、アダプターに相補的な配列を含有する。このように、アダプタープライマーは、貫入することができ、効果的に、DNA産物にアニーリングすることができる。アダプターは、ポリメラーゼ連鎖反応の間に、DNA産物に付与することができる。それぞれの末端にペアードアダプター配列を持つ構造のみが、効率的に増幅されるであろう。
本開示の別の局面は、少なくとも2つの異なるシングルプライマーPCRプライマー間のスイッチングのための方法を提供する。本方法は、本質的に、図4および図5における繰り返しステップを含み、ここでは、異なるシングルプライマーPCRプライマーが、デュアルPCRプライマーに取って代わる。特に、本方法は、増幅条件下で、標的核酸を、消化可能な5’部分を含む第1シングルプライマーPCRプライマーと接触させることにより、シングルプライマーPCRアンプリコンの第1セットを調製すること、および、シングルプライマーPCRアンプリコンの第1セットを、シングルプライマーPCRアンプリコンの第1セットの5’部分を消化できる酵素で処理して、消化されたアンプリコンを形成することを含む。本方法はさらに、増幅条件下で、消化されたアンプリコンの第1セットを、場合により消化可能な5’部分を含む第2シングルプライマーPCRプライマーと接触させて、シングルプライマーPCRアンプリコンの第2セットを形成すること含む。ある実施形態において、シングルプライマーPCRアンプリコンの第2セットを、第2シングルプライマーPCRアンプリコンの5’部分を消化することができる酵素で処理して、消化されたアンプリコンの第2セットを形成し得る。いくつかの実施形態において、消化されたアンプリコンの第2セットは、上記に詳述したように、デュアルプライマーPCRプライマーと接触させることができる。
本明細書に開示される方法は、DNA増幅中に用いられ得、ここで、DNAは、染色体、ミトコンドリア、プラスミド、または細胞質のDNAであり得る。本方法はまた、RNA増幅中にも用いられ得、ここで、増幅は、ディレクショナルまたは非ディレクショナルであり得、RNAは、コードまたは非コードであり得る。
本開示のさらに別の局面は、上述の方法を実施するためのキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、シングルプライマーPCRプライマーと、得られたシングルプライマーPCRアンプリコンを消化するための対応する酵素(すなわち、グリコシラーゼまたは5’-3’エキソヌクレアーゼ)を含む。いくつかの実施形態において、キットはさらに、デュアルプライマーPCRプライマーを含む。他の実施形態において、キットは、デュアルプライマーPCR、対応する酵素、および場合によりアダプター配列を含む。キットは、さらに、PCRに好適な、好適な反応バッファーおよび/またはDNAポリメラーゼ、およびデオキシリボヌクレオチドを含む。
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明で使用される多くの用語の一般的定義を当業者に提供する:Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で使用される場合、以下の用語は、他に特定されない限り、それらに帰する意味を有する。
ヒトゲノムDNA(10ng)を、改良されたDNA増幅キット(SeqPlex(商標);Sigma-Aldrich)を用いて、半縮重ライブラリープライマー(5’-UGGUUGUGUUUGCTCTTCCGATCTKNNNKNKNK-3’;配列番号:7)およびWGAプライマー(5’-UGGUUGUGUUUGCTCTTCCGATCT-3’(配列番号:1)を用いて、増幅した。シングルプライマーアンプリコンを、10%v/vのウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)の非存在下または存在下で、30分間、37℃でインキュベートした。消化/未消化アンプリコンを、フォワードプライマー(5’-TCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’;配列番号:2)およびリバースプライマー(5’CCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’;配列番号:3)を用いて、94°C/30秒、50°C/10分で2サイクル、その後、94°C/30秒でxサイクル(xは、SYBRGreenがプラトーになるまでのサイクル数)、リアルタイムで(すなわち、蛍光色素SYBR Greenでモニターして)増幅した。デュアルプライマーPCR増幅のバイオアナライザーのトレースを、図9に表す。約150~250bpの平均サイズを有するデュアルプライマーPCRアンプリコンが、UDGで処理されたシングルプライマーアンプリコンの後に検出された。UDG処理をしないと、はるかに大きい産物が低い収量で、検出された。
実施例1で上述したように、ゲノムDNAを増幅して、得られたアンプリコンをUDGで処理した。消化されたアンプリコンを、実施例1由来の、シングルWGA、フォワード、および/またはリバースプライマーの、1つまたは2つの組み合わせを用いて、リアルタイムで(すなわち、蛍光色素でモニターして)増幅した。各組み合わせについてのバイオアナライザーのトレースおよびサイクル閾値(Ct)の値を、図11に示す。フォワード/リバースの2つの組み合わせのCt値は、これらのプライマー単独のいずれかよりも、約8~9サイクル低く、これは、増幅産物の1%未満が、相補的な5’-3’末端を有することを示していた(すなわち、2-(8~9)<0.01)。(図8もまた参照)。また、プライマーの、1つの組み合わせと2つの組み合わせとでは、増幅サンプルのサイズ分布に違いがあった。
実施例1で上述したように、ゲノムDNAを増幅して、得られたアンプリコンを、UDGで処理した。消化されたアンプリコンを、実施例1で上述したフォワードおよびリバースの(短鎖)PCRプライマーを用いて、または、上述のフォワード(5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATAGCCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’;配列番号4)およびリバース(5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTACTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’;配列番号:5)(長鎖)PCRプライマーを用いて、リアルタイムで(すなわち、蛍光色素でモニターして)増幅した(図7参照)。結果を図12に表す。短鎖デュアルプライマーを用いて生成したアンプリコンの平均の長さは、約200bpであり、長鎖デュアルプライマーを用いて生成したアンプリコンの平均の長さは、約275bpであった。
実施例1で上述したように、ゲノムを、単一ヒト細胞から、WGAの22サイクルにより増幅して、その後UDGで消化した。消化されたアンプリコンを、実施例1で記載したデュアルプライマーを用いて、9サイクルで増幅した。図13に示したように、本明細書に開示されるシングルプライマーからデュアルプライマーへの方法は、ごく少量の核酸を増幅するために使用することができる。
ユニバーサルヒト標準(Universal human reference)(UHR)RNAを、本質的に上記に詳述した(および図16に概説した)プロセスを用いて、増幅した。本プロセスで用いた複数の第1および第2合成プライマーを、以下の表1に示す(入れ子配列はイタリック体で示し、内部タグ配列は下線を引いた)。
ヒトゲノムDNA(10ng)を、改良されたDNA増幅キット(SeqPlex(商標);Sigma-Aldrich)を用いて、半縮重ライブラリープライマー(5’-UGGUUGUGUUUGCTCTTCCGATCTKNNNKNKNK-3’;配列番号:1)およびWGAプライマー(5’-UGGUUGUGUUUGCTCTTCCGATCT-3’(配列番号:2)を用いて、増幅した。シングルプライマーアンプリコンを、10%v/vのウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)の非存在下または存在下で、30分間、37℃でインキュベートした。消化/未消化アンプリコンを、フォワードプライマー(5’-TCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’;配列番号:3)およびリバースプライマー(5’CCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’;配列番号:4)を用いて、94°C/30秒、50°C/10分で2サイクル、その後、94°C/30秒でxサイクル(xは、SYBRGreenがプラトーになるまでのサイクル数)、リアルタイムで(すなわち、蛍光色素SYBR Greenでモニターして)増幅した。デュアルプライマーPCR増幅のバイオアナライザーのトレースを、図9に表す。約150~250bpの平均サイズを有するデュアルプライマーPCRアンプリコンが、UDGで処理されたシングルプライマーアンプリコンの後に検出された。UDG処理をしないと、はるかに大きい産物が低い収量で、検出された。
実施例1で上述したように、ゲノムDNAを増幅して、得られたアンプリコンを、UDGで処理した。消化されたアンプリコンを、実施例1で上述したフォワードおよびリバースの(短鎖)PCRプライマーを用いて、または、上述のフォワード(5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATAGCCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’;配列番号:5)およびリバース(5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTACTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’;配列番号:6)(長鎖)PCRプライマーを用いて、リアルタイムで(すなわち、蛍光色素でモニターして)増幅した(図7参照)。結果を図12に表す。短鎖デュアルプライマーを用いて生成したアンプリコンの平均の長さは、約200bpであり、長鎖デュアルプライマーを用いて生成したアンプリコンの平均の長さは、約275bpであった。
ユニバーサルヒト標準(Universal human reference)(UHR)RNAを、本質的に上記に詳述した(および図16に概説した)プロセスを用いて、増幅した。本プロセスで用いた複数の第1および第2合成プライマーを、以下の表1に示す(入れ子配列はイタリック体で示し、内部タグ配列は下線を引いた)。
Claims (59)
- シングルプライマーPCRアンプリコンをデュアルプライマーPCRアンプリコンに変換するための方法であって、
シングルプライマーPCRアンプリコンを、シングルプライマーPCRアンプリコンの5’部分を消化できる酵素で処理して、消化されたアンプリコンを形成すること;および
消化されたアンプリコンを、消化されたアンプリコンの未消化部分に相同性を有する一対のプライマーで増幅することにより、デュアルプライマーPCRアンプリコンを形成すること、
を含む、方法。 - シングルプライマーPCRアンプリコンが、増幅条件下で、核酸とシングルPCRプライマーとを接触させることにより生成され、かつ、シングルPCRプライマーが消化可能な5’部分を含む、請求項1に記載の方法。
- シングルプライマーPCRアンプリコンが、RNAまたはDNAに由来する、請求項1に記載の方法。
- 酵素がグリコシラーゼである、請求項1に記載の方法。
- グリコシラーゼが、ウラシルDNAグリコシラーゼ、チミンDNAグリコシラーゼ、チミングリコールDNAグリコシラーゼ、8-オキソグアニンDNAグリコシラーゼ、3-メチルプリンDNAグリコシラーゼ、NthDNAグリコシラーゼ、NeiDNAグリコシラーゼ、MutY/MigDNAグリコシラーゼ、またはアルキルアデニンDNAグリコシラーゼである、請求項4に記載の方法。
- シングルプライマーPCRアンプリコンの5’部分が、少なくとも1つのグリコシラーゼ感受性塩基を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 少なくとも1つのグリコシラーゼ感受性塩基が、ウラシル、カルボキシルシトシン、2,6-ジアミノ-4-ヒドロキシ-5-ホルムアミドピリミジン(FapyG)、4,6-ジアミノ-5-ホルムアミドピリミジン(FapyA)、ホルミルウラシル、ヒドロキシウラシル、ヒドロキシシトシン、ヒドロキシメチルウラシル、ヒポキサンチン、3-メチルアデニン、8-オキソグアニン、8-オキソアデニン、チミングリコール、ウレア、またはキサンチンである、請求項6に記載の方法。
- 酵素がウラシルDNAグリコシラーゼであり、かつ、少なくとも1つのグリコシラーゼ感受性塩基がウラシルである、請求項3~6のいずれか一項に記載の方法。
- 酵素が、5’-3’エキソヌクレアーゼである、請求項1に記載の方法。
- 5’-3’エキソヌクレアーゼが、バクテリオファージT7エキソヌクレアーゼ、バクテリオファージT5エキソヌクレアーゼ、バクテリオファージλエキソヌクレアーゼ、バクテリアエキソヌクレアーゼVIII、またはバクテリアDNAポリメラーゼIである、請求項9に記載の方法。
- シングルプライマーPCRアンプリコンが、その5’末端から約5ヌクレオチド~約25ヌクレオチドの範囲内に、少なくとも1つのヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 少なくとも1つのヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドが、3’-5’ホスホロチオエート結合、3’-5’ホスホロボラン結合、2’-5’ホスホジエステル結合、2’O-メチル部分、2’フルオロ部分、プロピン塩基アナログ、またはこれらの組み合わせを含む、請求項11に記載の方法。
- シングルPCRプライマーの消化可能な5’部分が、ウラシル、カルボキシルシトシン、2,6-ジアミノ-4-ヒドロキシ-5-ホルムアミドピリミジン(FapyG)、4,6-ジアミノ-5-ホルムアミドピリミジン(FapyA)、ホルミルウラシル、ヒドロキシウラシル、ヒドロキシシトシン、ヒドロキシメチルウラシル、ヒポキサンチン、3-メチルアデニン、8-オキソグアニン、8-オキソアデニン、チミングリコール、ウレア、またはキサンチンから選択される少なくとも1つのグリコシラーゼ感受性塩基を含む、請求項12に記載の方法。
- シングルPCRプライマーが、消化不可能な3’部分に、または、消化可能な5’部分 と消化不可能な3’部分との境界に、少なくとも1つのヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを含み、かつ、少なくとも1つのヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドが、3’-5’ホスホロチオエート結合、3’-5’ホスホロボラン結合、2’-5’ホスホジエステル結合、2’O-メチル部分、2’フルオロ部分、プロピン塩基アナログ、またはこれらの組み合わせを含む、請求項2に記載の方法。
- シングルプライマーアンプリコンが、DNAで開始して調製される請求項1に記載の方法であって:
複数の合成プライマーの存在下で、少なくとも1つのDNA分子を複製して、DNAの複数の第1鎖および第2鎖を生成すること、ここで、各合成プライマーは、(5’から3’に)場合により存在する消化可能な5’配列、アダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列、場合により存在する第1タグ配列を含む内部タグ配列、および前記DNA分子の一部に相補性を有する3’配列を含む;
1つの増幅プライマーの存在下で、複数の2本鎖DNA産物を増幅して、DNA産物の増幅ライブラリーを生成すること、ここで、1つの増幅プライマーは、前記複数の合成プライマーの5’配列を含む;
DNA産物の増幅ライブラリーを、ヌクレアーゼまたはグリコシラーゼで消化すること;および
アダプター配列を、消化したcDNA産物のライブラリーの各5’末端に付与して、増幅RNAのライブラリーを生成すること、
を含む方法。 - ステップ(a)が、DNAポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチドの存在下で行われる、請求項15に記載の方法。
- シングルプライマーアンプリコンが、RNAで開始して調製される請求項1に記載の方法であって:
複数の合成プライマーの存在下で、少なくとも1つのRNA分子を逆転写して、相補DNA(cDNA)の複数の第1鎖および第2鎖を生成すること、ここで、各合成プライマーは、(5’から3’に)場合により存在する消化可能な5’配列、アダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列、場合により存在する第1タグ配列を含む内部タグ配列、および前記RNA分子の一部に相補性を有する3’配列を含む;
1つの増幅プライマーの存在下で、複数の2本鎖cDNA産物を増幅して、cDNA産物の増幅ライブラリーを生成すること、ここで、1つの増幅プライマーは、前記複数の合成プライマーの5’配列を含む;
cDNA産物の増幅ライブラリーを、ヌクレアーゼまたはグリコシラーゼで消化すること;および
アダプター配列を、消化したcDNA産物のライブラリーの各5’末端に付与して、増幅RNAのライブラリーを生成すること、
を含む方法。 - ステップ(a)が、逆転写酵素、デオキシリボヌクレオチド、および場合によりDNAポリメラーゼの存在下で行われる、請求項17に記載の方法。
- シングルプライマーアンプリコンが、ディレクショナルなアンプリコンとなるように調製される、請求項1に記載の方法であって:
複数の第1合成プライマーの存在下で、少なくとも1つのRNA分子を逆転写して、相補DNA(cDNA)の複数の第1鎖を生成すること、ここで、第1合成プライマーのそれぞれは、(5’から3’に)消化可能な5’配列、アダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列、場合により存在する第1タグ配列を含む内部タグ配列、および前記RNA分子の一部に相補性を有する3’配列を含む;
複数のcDNAの第1鎖を、複数の第2合成プライマーと接触させることにより、複数の2本鎖cDNA産物を合成すること、ここで、第2合成プライマーのそれぞれは、(5’から3’に)消化可能な5’配列、アダプタープライマー配列に相 同性を有する入れ子配列、場合により存在する第2タグ配列を含む内部タグ配列、およびcDNAの第1鎖の一部に相補性を有する3’配列を含み、ただし、各2本鎖cDNA産物が第1タグ配列または第2タグ配列の少なくとも1つに隣接するように、複数の第1および第2合成プライマーのいずれか一方または両方が、第1および/または第2タグ配列を含む;
1つの増幅プライマーの存在下で複数の2本鎖cDNA産物を増幅してcDNA産物の増幅ライブラリーを生成すること、ここで、1つの増幅プライマーは、複数の第1および第2合成プライマーの5’配列と入れ子配列とを含む;
cDNA産物の増幅ライブラリーを、ヌクレアーゼまたはグリコシラーゼで消化すること;および
アダプターを、消化したcDNA産物のライブラリーの各5’末端に付与して、ディレクショナルに増幅したRNAのライブラリーを生成すること、
を含む、方法。 - ステップ(a)が、逆転写酵素、デオキシリボヌクレオチド、および場合によりアクチノマイシンDの存在下で行われる、請求項19に記載の方法。
- ステップ(b)が、複数の第2合成プライマーの存在下での複数のcDNAの第1鎖の熱変性で始まり、ステップ(b)が、非鎖置換型DNAポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチドの存在下で行われる、請求項20に記載の方法。
- ステップ(a)の後に、1本鎖特異的デオキシリボヌクレアーゼと接触させて、ハイブリダイズしていない合成プライマーを分解させる、請求項15から20のいずれか一項に記載の方法。
- 場合により、ステップ(b)の後に1本鎖特異的デオキシリボヌクレアーゼと接触させて、ハイブリダイズしていない第2鎖合成プライマーを分解させる、請求項15~20のいずれか一項に記載の方法。
- 複数の合成プライマーの3’配列が、ランダムプライマー、半ランダムプライマー、または2対以上のプールされた特異的プライマーを含む、縮重ヌクレオチドを含む、請求項15~20のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)で、複数の第1合成プライマーが、異なる内部タグを有する1つ以上のプライマーを含む、請求項15~20のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)で、複数の第2合成プライマーが、異なる内部タグを有する1つ以上のプライマーを含む、請求項15~20のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅が、少なくとも1つの増幅プライマーの存在下での複数の2本鎖DNA産物の熱変性で始まり、耐熱性DNAポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチドの存在下で行われる、請求項15~20のいずれか一項に記載の方法。
- 1つ以上の精製ステップがない、請求項15~20のいずれか一項に記載の方法。
- 合成プライマーの5’部分が、少なくとも1つのグリコシラーゼ感受性塩基を含む、請求項15~20のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つのグリコシラーゼ感受性塩基が、ウラシル、カルボキシルシトシン、2,6-ジアミノ-4-ヒドロキシ-5-ホルムアミドピリミジン(FapyG)、4,6-ジアミノ-5-ホルムアミドピリミジン(FapyA)、ホルミルウラシル、ヒドロキシウラシル、ヒドロキシシトシン、ヒドロキシメチルウラシル、ヒポキサンチン、3-メチルアデニン、8-オキソグアニン、8-オキソアデニン、チミングリコール、ウレア、またはキサンチンである、請求項29に記載の方法。
- 複数の合成プライマーの5’配列が、デオキシウリジンヌクレオチドを含む、請求項15~20のいずれか一項に記載の方法。
- 合成プライマーが、その5’末端から約5ヌクレオチド~約25ヌクレオチドの範囲内に、少なくとも1つのヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを含む、請求項15~20のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つのヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドが、3’-5’ホスホロチオエート結合、3’-5’ホスホロボラン結合、2’-5’ホスホジエステル結合、2’O-メチル部分、2’フルオロ部分、プロピン塩基アナログ、またはこれらの組み合わせを含む、請求項32に記載の方法。
- タグ配列が、少なくとも6ヌクレオチド長である、請求項15~20のいずれか一項に記載の方法。
- シングルプライマーPCRの増幅プライマーが、少なくとも1つのグリコシラーゼ感受性塩基を含む、請求項15~20のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つのグリコシラーゼ感受性塩基が、ウラシル、カルボキシルシトシン、2,6-ジアミノ-4-ヒドロキシ-5-ホルムアミドピリミジン(FapyG)、4,6-ジアミノ-5-ホルムアミドピリミジン(FapyA)、ホルミルウラシル、ヒドロキシウラシル、ヒドロキシシトシン、ヒドロキシメチルウラシル、ヒポキサンチン、3-メチルアデニン、8-オキソグアニン、8-オキソアデニン、チミングリコール、ウレア、またはキサンチンである、請求項35に記載の方法。
- 増幅プライマーが、少なくとも1つのデオキシウリジンヌクレオチドを含む、請求項35に記載の方法。
- シングルプライマーPCRの増幅プライマーが、その5’末端から約5ヌクレオチド~約25ヌクレオチドの範囲内に、少なくとも1つのヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを含む、請求項15~20のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つのヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドが、3’-5’ホスホロチオエート結合、3’-5’ホスホロボラン結合、2’-5’ホスホジエステル結合、2’O-メチル部分、2’フルオロ部分、プロピン塩基アナログ、またはこれらの組み合わせを含む、請求項38に記載の方法。
- タグ配列が、少なくとも6ヌクレオチド長である、請求項21~39のいずれか一項に記載の方法。
- 5’から3’に、
少なくとも1つの消化可能残基を場合により含む5’配列;
アダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列;
場合により存在する内部タグ配列;および
標的核酸に相補的な配列を含む3’配列
を含む、人工オリゴヌクレオチド。 - 5’から3’に、
少なくとも1つのヌクレアーゼ耐性残基を場合により含む5’配列;
アダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列;
場合により存在する内部タグ配列;および
標的核酸に相補的な配列を含む3’配列
を含む、人工オリゴヌクレオチド。 - 5’配列が、約5~約30ヌクレオチドの長さを有し、入れ子配列が、約5~約25ヌクレオチドの長さを有し、場合により存在する内部タグ配列が、約4~約20ヌクレオチドの長さを有し、かつ、3’配列が、約5ヌクレオチド~約30ヌクレオチドの長さを有する、請求項41または42に記載の人工オリゴヌクレオチド。
- 5’から3’に、
少なくとも1つの消化可能残基を含む5’配列;
場合により、アダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列;
場合により存在する内部タグ配列;および
標的核酸に相補的な配列を含む3’配列
を含む、人工オリゴヌクレオチド。 - 5’から3’に、
ヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを含む5’配列;
場合により、アダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列;
場合により存在する内部タグ配列;および
標的核酸に相補的な配列を含む3’配列
を含む、人工オリゴヌクレオチド。 - 5’配列が、約5~約30ヌクレオチドの長さを有し、場合により存在する入れ子配列が、約5~約25ヌクレオチドの長さを有する、請求項41または42に記載の人工ヌクレオチド。
- 消化可能残基が、グリコシラーゼ感受性塩基である、請求項41または44に記載の人工オリゴヌクレオチド。
- 少なくとも1つのグリコシラーゼ感受性塩基が、ウラシル、カルボキシルシトシン、2,6-ジアミノ-4-ヒドロキシ-5-ホルムアミドピリミジン(FapyG)、4,6-ジアミノ-5-ホルムアミドピリミジン(FapyA)、ホルミルウラシル、ヒドロキシウラシル、ヒドロキシシトシン、ヒドロキシメチルウラシル、ヒポキサンチン、3-メチルアデニン、8-オキソグアニン、8-オキソアデニン、チミングリコール、ウレア、またはキサンチンである、請求項47に記載の人工オリゴヌクレオチド。
- 5’配列が、デオキシウリジンヌクレオチドを含む、請求項46に記載の人工オリゴヌクレオチド。
- 5’配列が、3’-5’ホスホロチオエート結合、3’-5’ホスホロボラン結合、2’-5’ホスホジエステル結合、2’O-メチル部分、2’フルオロ部分、プロピン塩基アナログ、またはこれらの組み合わせを含むヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを含む、請求項44に記載の人工オリゴヌクレオチド。
- 5’配列が、約5~約30ヌクレオチドの長さを有し、場合により存在する入れ子配列が、約5~約25ヌクレオチドの長さを有する、請求項44または45に記載の人工オリゴヌクレオチド。
- それぞれが、(5’から3’に)少なくとも1つの消化可能残基またはヌクレアーゼ耐性残基を場合により含む5’配列;アダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列、場合により存在する内部タグ配列、および標的核酸に相同な配列を含む3’配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドを含む、複数の人工オリゴヌクレオチド。
- 複数の合成プライマーの5’配列が、グリコシラーゼ(glycosolase)感受性残基またはヌクレアーゼ耐性残基を含む、請求項52に記載の複数の人工オリゴヌクレオチド。
- 3’末端が、2つ以上の鋳型配列を標的とする、請求項52または53に記載の複数の人工オリゴヌクレオチド。
- DNAまたはRNAを増幅するためのキットであって、
それぞれの第1合成プライマーが、少なくとも1つの消化可能残基またはヌクレアーゼ耐性残基を場合により有する5’配列、アダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列、場合により存在する内部タグ配列、および鋳型ターゲティング3’配列を含む、複数の合成プライマー;および
少なくとも1つの消化可能残基またはヌクレアーゼ耐性残基と、場合によりアダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列とを含む合成プライマーの、5’配列を含む、少なくとも1つの増幅プライマー、
を含むキット。 - さらに、逆転写酵素、鎖置換型DNAポリメラーゼ、1本鎖特異的デオキシリボヌクレアーゼ、耐熱性DNAポリメラーゼ、ウリジンDNAグリコシラーゼ、および/または5’-3’エキソヌクレアーゼを含む、請求項55に記載のキット。
- RNAをディレクショナルに増幅するためのキットであって、
それぞれの第1合成プライマーが、少なくとも1つの消化可能残基またはヌクレアーゼ耐性残基を場合により有する5’配列、アダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列、場合により存在する内部タグ配列、および鋳型ターゲティング3’配列を含む、複数の第1合成プライマー;
それぞれの第2合成プライマーが、少なくとも1つの消化可能残基またはヌクレアーゼ耐性残基を場合により有する5’配列、アダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列、場合により存在する内部タグ配列、および鋳型ターゲティング3’配列を含む、複数の第2合成プライマー;および
少なくとも1つの消化可能残基またはヌクレアーゼ耐性残基と、場合によりアダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列とを含む、合成プライマーの5’配列を含む、少なくとも1つの増幅プライマー、
を含むキット。 - RNAをディレクショナルに増幅するためのキットであって、
それぞれの第1合成プライマーが、少なくとも1つの消化可能残基を有する5’配列、アダプタープライマー配列に相同性を有する入れ子配列、場合により存在する第1タグ配列を含む内部タグ配列、および鋳型ターゲティング3’配列を含む、複数の第1合成プライマー;
それぞれの第2合成プライマーが、非相補的ヌクレオチドおよび少なくとも1つのデオキシウリジン残基を含む5’配列、アダプター配列に相補性を有する入れ子配列、場合により存在する第2タグ配列を含む内部タグ配列、およびランダムまたは半ランダムの3’配列を含む、複数の第2合成プライマー、ただし、複数の第1および第2合成プライマーのいずれか一方または両方が、第1および/または第2タグ配列を含む;および、
第1および第2合成プライマーの5’配列を含む少なくとも1つの増幅プライマー、
を含むキット。 - さらに、逆転写酵素、非鎖置換型DNAポリメラーゼ、3’-5’デオキシリボヌクレアーゼ、耐熱性DNAポリメラーゼ、ウリジンDNAグリコシラーゼまたは5’-3’エキソヌクレアーゼ、および/またはアクチノマイシンDを含む、請求項57または58に記載のキット。
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