CN109804083A - 单引物至双引物扩增子转换 - Google Patents
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Abstract
提供了用于在扩增反应期间引物转换的方法。具体而言,提供了用于将单引物PCR扩增子转化为双引物PCR扩增子的方法。
Description
公开领域
本公开涉及用于在扩增反应期间转换扩增子末端的方法。具体而言,其涉及将单引物PCR扩增子转化为双引物PCR扩增子。
背景
扩增反应,诸如聚合酶链式反应(PCR),广泛用于许多应用中。例如,可以扩增DNA或RNA用于制备文库用于DNA测序(例如,下一代测序)。全基因组扩增(WGA)或全转录组扩增(WTA)包括单引物PCR,其可以与需要双引物产生的扩增子的应用直接不相容。这通常通过将衔接子直接连接至WGA或WTA扩增子或在切除WGA/WTA引物序列后完成。需要一种在PCR期间转换引物的快速且有效的手段。
用于制备文库用于下一代测序的一般工作流程包括模板片段化、末端修复、衔接子连接和PCR扩增。成功扩增的关键是将衔接子连接至DNA片段的两个末端。连接通常是非定量的,因此当对难以察觉低量的核酸进行测序时,该工作流程变得困难。这些方法通常需要两个或更多个纯化步骤用于移除衔接子(在扩增前),可能影响扩增后的文库代表。
引入衔接子序列的另一种通常高产的选项是通过引物延伸。对于WGA/WTA,这涉及延伸有尾的简并或聚-A引物,在一些RNA种类的情况下,其与模板杂交。当使用简并末端的5’侧不同正向和反向尾部时,引物二聚体扩增通常是最普遍的产物。当使用简并碱基的5’侧的单一共同引发序列时,引物二聚体被有效地最小化。这是由于形成非常低效扩增的短稳定引物二聚体发夹。较长的扩增子也形成发夹,但比小引物-引物“棒棒糖”引物二聚体结构(相对于茎的小得多的环)稳定性小得多,允许更有效的扩增。
对于核酸文库,知道文库扩增子相对于其模板的“方向性”或方向经常是重要的。经设计以定向扩增低量RNA的一种基于引物延伸的WTA方法涉及使用“模板转换”,而不是与本文所述的“引物转换”概念混淆。另一种定向RNA扩增方法采用连接(和多个纯化步骤)。该方法依赖于第二链cDNA合成期间的dUTP掺入,随后连接测序衔接子和尿嘧啶DNA糖基化酶消化第二链,随后进一步对所得反义cDNA文库进行双引物PCR扩增。
因此,需要适用于低输入量和/或低质量(FFPE)、缺乏纯化步骤并且能够指示扩增产物链型(strandedness)的核酸扩增方法。
概述
在本公开的各个方面中,提供了将单引物PCR扩增子转化为双引物PCR扩增子的方法。所述方法包括用能够消化单引物PCR扩增子的5'部分的酶处理单引物PCR扩增子以形成消化的扩增子,和用一对与消化的扩增子的未消化部分具有同源性的引物扩增消化的扩增子,由此形成双引物PCR扩增子。
本公开的其他方面和迭代包括从DNA或RNA扩增。RNA具有定向和非定向扩增的选项。方法也可以应用于多重扩增,其中减少第一引物末端的3’简并性以包括预定组的靶扩增子而不是完全或部分简并的混合物。在所有情况下,通过使用单一PCR引物用于初始扩增来抑制引物二聚体扩增。
DNA的扩增需要使用靶向模板的引物合成复制文库,所述靶向模板的引物5'用单一PCR引物序列加尾,随后进行PCR。使靶向模板的引物退火,使用链置换DNA聚合酶延伸,然后使用单一PCR引物进行PCR扩增。类似地进行非定向RNA扩增。使靶向模板的引物退火,使用链置换逆转录酶/DNA聚合酶延伸,然后使用单一PCR引物进行PCR扩增(参见图4和5)。定向RNA扩增通过在非链置换条件下依次的第一链合成、然后第二链合成来完成。使用经工程改造至第一和/或第二链靶向模板的引物中的定向标签来监测方向性(参见图21、22和23)。可以通过工程改造至合成引物中的标签类似地监测分子身份。
将单引物转化为双引物扩增子需要双引物与单引物扩增子的杂交。当双引物与一些、但不是全部单一引物同源时,分子间和分子内扩增子杂合体的稳定性有效地与双引物杂交竞争(参见图6)。通过将可消化的或外切核酸酶抗性的残基工程改造至单一扩增引物和任选靶向模板的引物的序列中来减轻这种影响。消化降低了分子间和分子内扩增子杂合体的稳定性,允许通过双引物有效引发。可消化的残基包括本领域众所周知的糖基化酶敏感性和核酸酶抗性部分。优选的实施方案将尿嘧啶残基与尿嘧啶DNA糖基化酶配对以使链间/链内杂交不稳定(参见图4和5)。
可以一般性地概述工作流程:引物延伸杂交第一引物,然后是第二(如果适用)引物,用单引物扩增,消化5’扩增子末端,然后用双引物扩增。双引物扩增子适合于下游应用,诸如但不限于下一代测序。第一和第二引物通常是多种引物,其范围为3’随机引物至定向引物对的合并物,导致产生数个至数百万个独特的扩增子(参见图14、15和16)。
本公开的一个进一步方面提供了多种人工寡核苷酸,其包含(a)多种寡核苷酸,其中每种寡核苷酸包含(5'至3') 5'序列,其包含:任选地包含至少一个可消化或核酸酶抗性残基的5'序列;与衔接子引物序列具有同源性的嵌套序列;任选的内部标签序列,其包含用于定向或和/或分子ID扩增,标签序列,和3'序列,其包含随机、半随机或合并的靶标特异性序列(参见图3A)。对于定向扩增,多种第二寡核苷酸,其中每种寡核苷酸包含(5'至3') 包含任选地至少一个可消化或核酸酶抗性残基的5'序列;与衔接子引物序列具有同源性的嵌套序列,任选的包含第二标签序列的内部标签序列,和包含随机、半随机或合并的靶标特异性序列的3'序列,条件是对于定向扩增,多种第一和第二寡核苷酸中的一者或两者包含第一和/或第二标签序列。无论是从DNA还是RNA开始并且是定向的还是非定向的,一个进一步方面是包含至少一个可消化或核酸酶抗性残基的人工寡核苷酸(参见图3B)。
本公开的又另一个方面涵盖用于扩增DNA或RNA的试剂盒。所述试剂盒包含(a)任选多种合成引物,其中每种合成引物包含任选地包含至少一个可消化或核酸酶抗性残基的5'序列,与衔接子引物序列具有同源性的嵌套序列,任选的内部标签序列,以及随机或半随机3'序列;和任选地(b)多种第二合成引物,其中每种第二合成引物包含任选地包含至少一个可消化或核酸酶抗性残基的5'序列,与衔接子序列具有互补性的嵌套序列,任选的包含第二标签序列的内部标签序列,以及随机或半随机3'序列。对于定向扩增,多种第一和第二合成引物中的一者或两者包含第一和/或第二标签序列。另外,试剂盒包含至少一种扩增引物,其包含合成引物的5'序列和至少一个可消化或核酸酶抗性残基。在优选的实施方案中,可消化的残基是尿嘧啶。
下面详述本公开的其他方面和特征。
附图简述
本专利或申请文件含有至少一个以颜色绘制的图。本专利或专利申请公开的具有彩图的拷贝在要求和支付必要费用后由专利和商标局提供。
图1说明单引物 vs 双引物PCR的引物和模板序列。
图2图解影响单引物PCR期间发夹模板形成 vs 引物延伸的优势的变量。
图3说明引物设计。A. 合成引物。标签可以用于方向性、分子条形码或两者。B. 本文公开的单引物PCR引物。C图解双引物PCR引物。如相同颜色所示,双引物的3'区域与合成和任选扩增引物具有序列同源性。
图4呈现单引物PCR扩增子的实例,其中5'可消化部分包含糖基化酶敏感的碱基(例如,尿嘧啶碱基)。在此,扩增子用糖基化酶消化,然后用衔接子引物退火/延伸以进行双引物PCR。包含衔接子引物序列的低Tm茎结构是任选的。也就是说,红色衔接子部分不需要是互补的。
图5说明单引物PCR扩增子的实例,其中5'可消化部分包含核酸酶抗性碱基。在此,扩增子用5’-3’外切核酸酶消化,然后用衔接子引物退火/延伸以进行双引物PCR。包含衔接子引物序列的茎结构是任选的。
图6显示用双引物PCR引物对未消化的单引物PCR扩增子的低效引发。
图7说明示例性的含有尿嘧啶的单引物和双引物PCR扩增引物。
图8说明示例性外切核酸酶抗性单引物和双引物PCR扩增引物。
图9呈现在用在5'末端附近包含尿嘧啶碱基的单引物PCR扩增子的UDG进行+/-处理后的双引物PCR的生物分析仪迹线表明在没有消化单引物PCR扩增子的5'末端的情况下,退火(和PCR)是非常低效的。
图10图解双引物选择。与单一正向或反向引物相比,用一对正向和反向PCR引物扩增更有效。
图11显示在单引物PCR扩增子的UDG消化后的双引物PCR的生物分析仪迹线,其中PCR在所示的单引物或双引物组合存在的情况下进行。还显示各种组合的阈值循环(Ct)。
图12呈现在单引物PCR扩增子的UDG消化后的双引物PCR的生物分析仪迹线,其中PCR在短或长双引物PCR引物存在的情况下进行。
图13显示使用本文公开的单引物至双引物转换方法的来自单个细胞的全基因组扩增。
图14说明典型的DNA扩增工作流程。
图15说明典型的RNA扩增工作流程。
图16说明典型的定向RNA扩增工作流程。
图17显示用于Y衔接子系统的示例性引物设计。如图3中所述的引物区段的合成。
图18显示用于配对的衔接子系统的示例性引物设计。如图3中所述的引物区段的合成。
图19显示在单链核酸上的引物和链置换引物延伸。
图20显示来自图19的引物延伸产物上的引发和引物延伸。
图21显示单链核酸上的定向第一链引发和引物延伸。
图22显示来自图21的引物延伸产物上的定向链引发和引物延伸。
图23显示引物延伸和扩增模板上的单引物和双引物扩增引物。
详述
本公开提供了用于引物转换的方法。更具体地,本文提供了用于将单引物PCR扩增子转化为双引物PCR扩增子的方法。通过定义,单引物PCR产生5'-3'互补的扩增子(参见图1)。此类扩增子的变性和冷却产生分子间和分子内5’-3’杂合体的混合物,其3’-5’解链温度(Tm)由引物序列决定。将这些单引物扩增子转换为双引物扩增子(其中双引物的3'部分与单引物PCR扩增子的3'部分互补)需要将双引物退火为单链(即变性)单引物扩增子。然而,双引物的Tm必然小于单引物的Tm。因此,单引物PCR扩增子分子间/分子内杂合体将在比双引物杂交所需的更高温度下退火,因此抑制双引物的退火和引物延伸或不利地与双引物的退火和引物延伸竞争。本文公开的方法通过使用用于单引物PCR(其允许消化扩增子的5'末端)的引物来解决该问题。因此,5'消化的末端和3'互补末端之间的相互作用不太稳定,由此允许与不同的引物退火。
本文还提供了单引物至双引物转换的修饰。例如,可以使用类似的方法在不同的单一PCR引物之间转换。作为另一个实例,可以使用类似的方法来将衔接子序列附加至PCR扩增子。
(I)单引物至双引物扩增子转换
本公开的一个方面涵盖用于将单引物PCR扩增子转化为双引物PCR扩增子的方法。所述方法包括:通过使靶核酸与多种合成引物接触来形成单引物PCR模板,所述合成引物包含被与双引物PCR引物序列同源的一系列碱基分开的任选可消化的5'末端和完全或部分简并的3'末端和任选地任何标签序列,在支持扩增的条件下使单引物PCR模板与包含可消化的5'部分和任选不可消化的3'部分的引物接触(下文描述的步骤I、II和III);用能够消化单引物PCR扩增子的5'部分的酶处理单引物PCR扩增子以形成消化的扩增子(下面详细描述的步骤IV);和用一对PCR引物扩增消化的扩增子,所述PCR引物与消化的扩增子的未消化部分具有同源性(下面详细描述的步骤V),由此形成双引物PCR扩增子。
步骤I:形成单引物PCR扩增子
该方法的第一步包括通过在引物延伸条件下使靶核酸与合成引物接触来形成单引物PCR扩增子。
(a)合成和单引物PCR引物
本文使用的合成引物包含至少三个部分:与单引物PCR引物同源的5'部分,任选与双引物PCR引物的3'末端同源的嵌套部分和3'模板靶向序列。5'部分任选地是可消化的。3'部分可以是完全随机的,准随机的或合并的靶向引物序列的总和。在一些实施方案中,合成引物可以包括可用于监测合成方向和/或分子身份的标签序列(本文中也称为条形码或索引序列)。单引物PCR引物至少包含合成引物的第一5'部分并且是可消化的。在一些实施方案中,单引物PCR引物包含两个不同的部分,可消化的5'部分和不可消化的3'部分(参见图3B)。在一些实施方案中,单引物PCR引物的可消化的5'部分包含至少一个糖基化酶敏感的碱基。在其他实施方案中,单引物PCR引物在单一引物PCR引物的可消化的5'部分和不可消化的3'部分之间的接口处包含至少一个核酸酶抗性核苷酸。不可消化部分的序列任选地与下文详述的双引物PCR引物的3'部分同源。
在一些实施方案中,合成引物可用于扩增条件中。
在某些实施方案中,单引物PCR引物的5'部分包含一个或多个糖基化酶敏感的碱基(参见图3B)。合适的糖基化酶敏感的碱基的非限制性实例包括尿嘧啶、5-羧基胞嘧啶(5-caC)、2,6-二氨基-4-羟基-5-甲酰胺基嘧啶(FapyG)、4,6-二氨基-5-甲酰胺基嘧啶(FapyA)、5-甲酰基胞嘧啶(fC)、5-甲酰基尿嘧啶(fU)、5-羟基胞嘧啶(hoC)、5-羟基尿嘧啶(hoU)、6-羟基尿嘧啶、5,6-二羟基尿嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶(hmC)、5-羟甲基尿嘧啶(hmU)、次黄嘌呤、3-甲基腺嘌呤(3-mA)、3-甲基胞嘧啶(3-mC)、5-甲基胞嘧啶(5-mC)、8-氧代腺嘌呤(8-oxoA)、8-氧代鸟嘌呤(8-oxoG)、胸腺嘧啶甘醇(Tg)、尿素或黄嘌呤。在具体实施方案中,糖基化酶敏感的碱基是尿嘧啶。
通常,存在于单引物PCR引物的可消化的5'部分中的至少40%的碱基是糖基化酶敏感的碱基。在一些实施方案中,存在于单引物PCR引物的可消化的5'部分中的至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或至少约100%的碱基是糖基化酶敏感的碱基。在替代实施方案中,单引物PCR引物可以含有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个糖基化酶敏感的碱基。
在其他实施方案中,单引物PCR引物在PCR引物的3'部分内或在PCR引物的可消化的5'部分和3'部分之间的接口处包含至少一个核酸酶抗性核苷酸(参见图3B)。例如,单引物PCR引物可以在距其5'末端约5个核苷酸至约15个核苷酸内包含至少一个核酸酶抗性核苷酸。合适的核酸酶抗性核苷酸的实例包括但不限于包含以下的那些:3'-5'硫代磷酸酯键、3'-5'磷代硼烷键、2'-5'磷酸二酯键、2' O-甲基部分、2'氟代部分、丙炔碱基类似物或其组合。例如,核酸酶抗性核苷酸可以包含3'-5'硫代磷酸酯键、3'-5'磷代硼烷键或2'-5'磷酸二酯键核酸酶以及2'氟代部分和/或丙炔碱基类似物。在一些实施方案中,单一引物PCR引物的不可消化的3'部分或可消化的5'部分和不可消化的3'部分之间的接口包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少6个、至少7个、至少8个、至少九个、至少十个、至少十一个或至少十二个核酸酶抗性核苷酸。
单引物PCR引物的长度可以变化。通常,单引物PCR引物长度范围可以为约14个核苷酸至约40个核苷酸。在各个实施方案中,单引物PCR引物可以长度为约14、15、16、17、18、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。在一些实施方案中,可消化的5'部分长度可以为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸,且不可消化的3'部分长度可以为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在具体实施方案中,可消化的5'部分长度范围可以为约8至约14个核苷酸,且不可消化的3'部分长度范围可以为约10至约16个核苷酸。
在一些实施方案中,合成引物可以进一步包含3'末端的简并区域。简并核苷酸可以具有2倍简并性(即,其可以是两个核苷酸之一),3倍简并性(即,其可以是三个核苷酸之一),或4倍简并性(即,其可以是四个核苷酸之一,A或C或G或T)。具有3倍简并性的核苷酸包括“B”(可以是C或G或T),“D”(可以是A或G或T),“H”(可以是A或C或T)和“V” (可以是A或C或G)。具有2倍简并性的核苷酸包括“K”(可以是G或T),“M”(可以是A或C),“R”(可以是A或G),“Y”(可以是C或T) ,“S”(可以是C或G)和“W”(可以是A或T)。简并区域长度范围可以为约4至约18个核苷酸。在某些实施方案中,简并区域长度可以为约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个核苷酸。这种简并性可以来自混合碱基合成方法或合并单独合成的寡核苷酸。
通常,合成引物和单引物PCR引物是单链的并且在3'末端具有羟基用于引发DNA合成。扩增引物可以包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其组合。所述核苷酸可以是标准核苷酸(即腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷/尿苷)或核苷酸类似物。核苷酸类似物是指具有修饰的嘌呤或嘧啶碱基和/或修饰的核糖部分的核苷酸。核苷酸类似物可以是天然存在的核苷酸(例如,肌苷)或非天然存在的核苷酸。核苷酸的糖或碱基部分上的修饰的非限制性实例包括添加(或除去)乙酰基、氨基、羧基、羧甲基、羟基、甲基、磷酰基和硫醇基团,以及用其他原子取代碱基的碳和氮原子(例如7-脱氮嘌呤)。核苷酸类似物还包括双脱氧核苷酸、2'-O-甲基核苷酸、锁定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和吗啉代类似物。
合成和扩增引物的设计将取决于预期用途和衔接子引物设计。
通常,单引物PCR引物将具有约40-60%的平均GC含量,和约50℃至约85℃的平均解链温度(Tm)。在某些实施方案中,单引物PCR引物可以具有约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃或约75℃的Tm。
合成和扩增引物设计取决于下游衔接子系统。在所有情况下,合成引物将包含与扩增引物的全部或部分同源的可消化区段,与衔接子引物序列的全部或部分同源的嵌套不可消化的区段,用于定向和或分子条形码化的任选的标签序列和3'模板启动部分(参见图3A和3B)。模板引发区段可以是完全简并的(全部N)或特异性引发序列的合并物和其之间的任何组合物。对于Y衔接子应用,可以存在一个可消化的+一个嵌套的不可消化的区段(参见图17)。嵌套的不可消化的区段与Y衔接子茎的序列同源。对于配对的衔接子应用,将存在两种合成引物:一种可消化的扩增+两种嵌套的衔接子引物区段。扩增引物将包含用于Y衔接子应用的可消化和不可消化的区段,而对于成对的衔接子应用仅包含可消化的区段(参见图18)。
单引物PCR引物可以使用容易获得的引物设计软件(例如,Primer3, PrimerQuestTool, NPprimer, Multiplex引物设计等)设计,并且可以使用标准寡核苷酸化学合成方法合成。
(b)寡核苷酸
本公开的一个方面涵盖人工寡核苷酸,其包含随机序列、半随机序列或特定3'序列的合并物,固定的5'序列,任选的内部标签序列,以及5'序列和内部标签和/或3'模板靶向序列之间的嵌套序列(参见图3A)。一个进一步方面提供了多种人工寡核苷酸,其包含多种第一寡核苷酸和多种第二寡核苷酸,其可用于RNA的定向扩增。多种第一寡核苷酸中的每种寡核苷酸包含随机序列、半随机序列或特定3'序列的合并物,任选地包含至少一个可消化残基的固定5'序列,与衔接子序列同源的嵌套序列,和任选地包含第一标签序列的内部标签序列。多种第二寡核苷酸的每种寡核苷酸包含随机序列、半随机序列或特定3'序列的合并物,包含至少一个脱氧尿苷残基的固定5'序列,对应于衔接子序列的嵌套序列,和任选地包含第二标签序列的内部标签序列,条件是多种第一和第二寡核苷酸中的一者或两者包含第一和/或第二标签序列(参见图21和22)。
通常,寡核苷酸是单链的。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。寡核苷酸可以包含标准核苷酸(即A、C、G、T、U、dU等等),以及核苷酸类似物。核苷酸类似物是指具有修饰的嘌呤或嘧啶碱基和/或修饰的核糖部分的核苷酸。核苷酸类似物可以是天然存在的核苷酸(例如,肌苷)或非天然存在的核苷酸。核苷酸的糖或碱基部分上的修饰的非限制性实例包括添加(或除去)乙酰基、氨基、羧基、羧甲基、羟基、甲基、磷酰基和硫醇基团,以及用其他原子取代碱基的碳和氮原子(例如7-脱氮嘌呤)。核苷酸类似物还包括双脱氧核苷酸、2'-O-甲基核苷酸、锁定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和吗啉代类似物。寡核苷酸的主链可以包含磷酸二酯键,以及硫代磷酸酯、亚磷酰胺、或二氨基磷酸酯键。
(i) 3'序列
多种寡核苷酸中的每种寡核苷酸包含随机序列、半随机序列或特定3'序列的合并物(参见图3A)。随机或半随机序列通常与靶核酸具有足够的互补性,使得寡核苷酸的3'序列与靶RNA(或cDNA产物)杂交。在一些实施方案中,3'序列可以是随机的并且由4倍简并核苷酸(即N)组成。例如,3'序列可以是聚-N。在其他实施方案中,3'序列可以是半随机的并且包含至少一个2倍、3倍或4倍简并核苷酸。在某些实施方案中,3'序列可以包含2倍简并核苷酸(即,K、M、R、Y和/或S),3倍简并核苷酸(即,B、D、H和/或V),4倍简并核苷酸或其组合。在具体实施方案中,3'序列可以包含N和K(即,G和T)简并核苷酸的组合。例如,3'序列可以包含约相等数量的N和K核苷酸,其以任何顺序排列。合适的“NK”序列的实例包括5'-KNNNKNKNK-3'、5'-NNNKNKKNK-3'和5'-NKNNKNNKK-3'。在额外实施方案中,3'序列可以包含非简并和简并核苷酸的组合。例如,3'序列可以在3'末端包含聚-dT序列和简并核苷酸。此类序列的实例包括聚-dT-NN、聚-dT-VN等。在又进一步实施方案中,3'序列可以包含任何前述序列的组合。作为一个实例,5'-KNNNKNKNK-3'、5'-NNNKNKKNK-3'、5'-NKNNKNNKK-3'和聚-dT14-VN的组合可得自完整全转录组扩增试剂盒(WTA2);Sigma-Aldrich。
3'序列的长度可以并且将变化。通常,3'序列长度范围可以为约5个核苷酸至约30个核苷酸。在某些实施方案中,3'序列可以长度为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在具体实施方案中,3'序列长度范围可以为约6个核苷酸至约20个核苷酸。
(ii) 5' 序列
每种寡核苷酸包含固定的5'序列(参见图3A和3B)。在一些实施方案中,5'序列包含非互补核苷酸,由此减少每种寡核苷酸内的分子内相互作用和/或多种寡核苷酸中寡核苷酸的5'序列之间的分子间相互作用。非互补核苷酸的实例包括K(即,G和T),M(即,A和C),R(即,A和G)或Y(即C和T)。此外,选择非互补核苷酸,使得至少一个胸苷残基可以被脱氧尿苷残基替代。因此,5'序列可以包含K(即,G和T)或Y(即C和T)核苷酸,其中一个或多个胸苷残基被脱氧尿苷(dU)替代。在具体实施方案中,5'序列可以包含G和dU残基。在一些实施方案中,5'序列可以含有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个dU残基。
固定的5'序列的长度可以并且将变化。通常,固定的5'序列长度范围可以为约5个核苷酸至约40个核苷酸。在某些实施方案中,固定的5'序列可以长度为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。在具体实施方案中,固定的5'序列长度范围可以为约6个核苷酸至约18个核苷酸。
(iii) 嵌套序列
每种寡核苷酸进一步包含在固定的5'序列的3'末端的嵌套序列(参见图3A)。嵌套序列与衔接子序列的区域具有同源性。例如,嵌套序列可以与衔接子序列的双链区域具有同源性(例如,来自Illumina® (San Diego, CA))。嵌套序列可以与本领域已知的其他衔接子的区域具有同源性。
嵌套序列的长度可以并且将变化。通常,嵌套序列长度范围可以为约5个核苷酸至约25个核苷酸。在某些实施方案中,5'序列可以长度为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在具体实施方案中,嵌套序列长度范围可以为约8个核苷酸至约15个核苷酸。
(iv)内部标签序列
每种寡核苷酸还可以包含任选的内部标签(或条形码)序列(参见图3A)。通常,标签序列位于嵌套序列(在固定的5'序列的3'末端)和随机序列、半随机序列或特定3'序列的合并物之间。标签序列用于就起始RNA分子的方向和/或分子身份而言标记cDNA产物。如果寡核苷酸含有任选的标签序列,则标签序列可以是第一标签序列(其用于标记RNA的3'末端的方向),或第二标签序列(其用于标记RNA的5'末端的方向)。
标签序列的核苷酸序列可以并且将变化。通常,标签序列是不存在于靶RNA分子中的人工序列。可以平衡人工标签序列中核苷酸的含量以提供G/T和C/A的多样性。另外,第一和第二寡核苷酸可以按照Watson-Crick碱基配对进行平衡,以解决在引物退火至靶核酸期间发生的偏差。
通常,标签序列长度范围可以为约4个核苷酸至约20个核苷酸。在各个实施方案中,标签序列可以范围为约5个核苷酸至约15个核苷酸长度,约6个核苷酸至约12个核苷酸长度,或者约7个核苷酸至约10个核苷酸长度。在一些实施方案中,标签序列为至少6个核苷酸长度。在其他实施方案中,标签序列为7个核苷酸长度,8个核苷酸长度,或9个核苷酸长度。
(c)靶核酸
所述方法包括通过在引物延伸条件下使靶核酸与合成引物接触,随后在扩增条件下与单引物PCR引物接触,形成单引物PCR扩增子。可以通过单引物PCR扩增各种靶核酸。在一些实施方案中,所述靶核酸可以是基因组DNA。所述基因组DNA可以是核、线粒体或质体。在一些实施方案中,所述靶核酸可以包含基因组文库,即细胞或细胞群的全基因组。在其他实施方案中,所述靶核酸可以是从以下转录的互补DNA(cDNA):信使RNA (mRNA)或非编码RNA(例如,微小RNA (miRNA),长非编码RNA (IncRNA),长基因间非编码RNA (lincRNA),小干扰RNA(siRNA),Piwi相互作用RNA (piRNA),反式作用RNA (rasiRNA),核糖体RNA (rRNA),转移RNA (tRNA),线粒体tRNA (MT-tRNA),小核RNA (snRNA),小核仁RNA (snoRNA),SmY RNA,YRNA,剪接前导RNA(SL RNA)和/或端粒酶RNA组分)。在某些实施方案中,靶核酸可以是源自细胞或细胞群的转录组的cDNA文库。本领域技术人员熟悉用于分离基因组DNA、分离RNA和/或从RNA制备cDNA的手段(例如,标准方案、市售试剂盒等)。
靶核酸可以是野生型,可以含有单核苷酸多态性(SNP),可以含有多核苷酸取代,可以含有插入和/或缺失(插入缺失),和/或可以含有表观遗传修饰(例如,甲基化胞嘧啶,其他修饰的核苷酸等)。
靶核酸可以源自真核细胞、古细菌细胞或细菌细胞。合适的真核细胞包括哺乳动物细胞(例如,人,灵长类动物,狗,猫,农场动物,动物园动物,啮齿动物,研究动物等),非哺乳动物脊椎动物细胞(例如,家禽,鱼,青蛙等),植物细胞(例如,玉米,豆科植物,禾本科植物,芸苔属植物等等),无脊椎动物细胞(例如,昆虫,蠕虫等),真菌细胞,单细胞生物等。
包括在扩增反应中的靶核酸的量可以范围为约1微微微克(ag)至约100纳克(ng)。在一些实施方案中,单个(哺乳动物)细胞提供靶核酸。
(d)扩增条件
在扩增条件下,将如上所详述的合成引物、然后单引物PCR引物与如上所详述的靶核酸接触,以形成单引物PCR扩增子。扩增条件包括经由聚合酶链式反应(PCR)进行扩增(参见图14、15和16)。
PCR包括在合适的缓冲液存在的情况下与DNA聚合酶和脱氧核糖核苷酸(例如,dNTP)接触。通常,用于PCR扩增的DNA聚合酶具有聚合酶活性和任选3'至5'校正外切核酸酶活性。通常,DNA聚合酶将是嗜热的(例如,Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Tli DNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶、其变体或其组合)。或者,DNA聚合酶可以是嗜常温的(例如,大肠杆菌DNA聚合酶I、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、phi29 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、其变体或其组合)。
PCR扩增反应可以是常规PCR、实时PCR、定量PCR、快速PCR、热启动PCR、降落PCR、多重PCR、长程PCR等。或者,扩增反应可以是多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、环介导的等温扩增(LAMP)、解旋酶依赖性扩增(HAD)、切口酶扩增反应(NEAR)、滚环扩增(RCA)或连接介导的扩增。
PCR扩增反应包括在变性步骤和退火/延伸步骤之间循环。循环总数可以范围为约10至约60。退火/延伸可以在单个步骤期间发生,或者退火/延伸可以在单独的退火和延伸步骤期间发生。通常,变性步骤的温度可以范围为约90℃至约100℃,并且变性步骤的持续时间可以范围为约10秒至约10分钟。单个退火/延伸步骤可以范围为约50℃至约75℃,并且单个退火/延伸步骤的持续时间可以范围为约1分钟至约12分钟。或者,退火步骤的温度可以范围为约50℃至约75℃,并且退火步骤的持续时间可以范围为约20秒至约12分钟,并且延伸步骤的温度可以范围为约68℃至约75℃,并且延伸步骤的持续时间可以在约20秒至约5分钟变化。最后的延伸步骤可以随后为在延伸温度下进行末端伸长步骤,其持续约5分钟、10分钟或更长时间。
因此,本文公开的方法的第一步产生单引物PCR扩增子,其包含可消化的5'部分。在一些实施方案中,单引物PCR扩增子在扩增子的5'末端附近包含一个或多个糖基化酶敏感的碱基。在其他实施方案中,单引物PCR扩增子在扩增子的5'末端附近包含一个或多个核酸酶抗性核苷酸。在双链扩增子变性后,单链扩增子可以形成分子内(发夹)和/或分子间结构,因为在单引物PCR反应期间产生的扩增子的5'和3'末端是互补的(参见图1、2、4和5)。
步骤II:DNA或RNA的非定向或定向扩增
在步骤II中,DNA或RNA被非定向或定向扩增,如下面分别在部分步骤II非定向和步骤II定向中所述。
步骤II非定向:DNA或RNA的非定向扩增
对于DNA,非定向扩增步骤包括在多种合成引物存在的情况下复制至少一种DNA分子以产生多种双链模板,其中多种合成引物各自包含(5'至3')固定的任选可消化的5'序列,与衔接子序列具有互补性的嵌套序列,任选的标签序列,以及与目标DNA分子具有互补性的随机序列、半随机序列或特定3'序列的合并物(参见图14)。
对于RNA,非定向过程包括在多种合成引物存在的情况下逆转录至少一种RNA分子以产生多种双链cDNA模板,其中多种合成引物各自包含(5'至3')固定的任选可消化的5'序列,与衔接子序列具有互补性的嵌套序列,任选的标签序列,以及与目标DNA分子具有互补性的随机序列、半随机序列或特定3'序列的合并物(参见图15)。
非定向子步骤A-文库合成
非定向扩增过程的单一步骤包括在多种第一合成引物存在的情况下复制至少一种DNA或逆转录至少一种RNA分子以产生多种双链模板(参见图14、15、19和20)。
(i) 核酸
可以使用本文公开的方法扩增各种不同类型的RNA分子。在一些实施方案中,RNA可以是信使RNA (mRNA)或其片段。mRNA可以是多腺苷酸化的,或mRNA可以是非多腺苷酸化的。在某些实施方案中,RNA可以是不同mRNA的群体。在其他实施方案中,RNA可以是非编码RNA(ncRNA)。例如,ncRNA可以是长非编码RNA (IncRNA)、长基因间非编码RNA (lincRNA)、微小RNA (miRNA)、小干扰RNA (siRNA)、Piwi相互作用RNA (piRNA)、反式作用RNA (rasiRNA)、核糖体RNA (rRNA)、转移RNA (tRNA)、线粒体tRNA (MT-tRNA)、小核RNA (snRNA)、小核仁RNA (snoRNA)、SmY RNA、Y RNA、剪接的前导RNA (SL RNA)、端粒酶RNA组分(TERC)、其片段或其组合。在又进一步实施方案中,RNA可以是细胞或细胞群的转录组。RNA可以源自真核细胞、古细菌细胞或细菌细胞。
可以扩增多种类型的DNA分子。这可能包括,例如,真核生物、原核生物、古细菌、质粒、噬菌体、合成的等。
输入核酸的量可以并且将变化。通常,本文公开的方法可以扩增低或单细胞输入量的核酸。在一些实施方案中,输入核酸的量可以是至少约10飞克(fg),100fg,5皮克(pg),至少约10 pg,至少约20 pg,至少约50 pg,至少约100 pg,至少约200 pg,至少约500 pg,或超过约500 pg的核酸。在具体实施方案中,输入核酸的量可以范围为约10 pg至约100 pg。
核酸的质量或完整性也可以变化。例如,输入RNA的质量可以范围为低质量(即,降解或片段化的)至高质量(即,完整)。本领域技术人员熟悉估计目标RNA的质量的手段。例如,可以基于28S rRNA与18S rRNA的比率来估计总RNA的质量。在一些实施方案中,RNA可以具有至少约2:1的28S:18S比率,至少约1:1的28S:18S比率,小于约1:1的28S:18S比率,或不可检测的28S:18S比率。
(ii)双链模板合成
使一种或多种RNA分子与多种合成引物接触(参见图3A和19)。合成引物如上所详述。每种合成引物包含(5'至3')任选可消化的固定的5'序列,与衔接子序列具有同源性的嵌套序列,任选的内部标签序列,以及与RNA分子具有互补性的随机序列、半随机序列或3'序列的合并物。
在与靶核酸接触后,合成引物的3'序列与核酸的互补区域杂交。对于RNA,在脱氧核糖核苷酸(即,dCTP、dGTP、dATP和dTTP)和合适的RT缓冲液存在的情况下,通过链置换逆转录酶(RT)催化cDNA的第一链的合成。通过链置换DNA聚合酶催化第二链合成。聚合酶活性可以来自单一或多种酶。对于DNA,在脱氧核糖核苷酸(即,dCTP、dGTP、dATP和dTTP)和合适的缓冲液存在的情况下,通过链置换DNA聚合酶催化DNA的第一和第二链的合成。本领域技术人员熟悉反应物的适当浓度和逆转录dnDNA复制的合适反应条件。
逆转录酶可以是嗜常温的或嗜热的,并且逆转录酶可以是RNA酶H+或RNA酶H-。合适的逆转录酶的实例包括M-MLV RT(来自Moloney鼠白血病病毒),HIV-1 RT (来自人免疫缺陷病毒1型),AMV RT(来自禽成髓细胞瘤病毒)、其变体和其工程改造的形式。DNA聚合酶可以是嗜常温的或嗜热的。实例包括pol I,Klenow聚合酶,Klenow exo-聚合酶,T4 DNA聚合酶,Bst聚合酶,Taq聚合酶,phi29聚合酶,T7聚合酶等。
在双链模板完成后,可通过热处理使逆转录酶和/或DNA聚合酶失活。热灭活可以在约70℃、约80℃或约90℃的温度下持续约3分钟、约5分钟、约10分钟或约15分钟。通常,失活温度越低,加热步骤的持续时间越长。
步骤II定向:RNA的定向扩增
或者,步骤II可以涉及定向扩增RNA并制备扩增产物用于测序。定向扩增过程包括下面描述的两个子步骤A和B。
通常,子步骤A包括在多种第一合成引物存在的情况下逆转录至少一种RNA分子以产生多种cDNA的第一链(参见图21),其中多种第一合成引物各自包含(5'至3')固定的任选可消化的5'序列,与衔接子序列具有互补性的嵌套序列,任选的包含第一标签序列的内部标签序列,以及与目标RNA分子具有互补性的随机序列、半随机序列或特定3'序列的合并物。优选地,在子步骤A中,逆转录在放线菌素D存在的情况下进行,因为这倾向于减轻来自逆转录病毒逆转录酶对cDNA的再复制的反义伪影。参见Ruprecht等人, Biochim BiophysActa. 1973 Jan 19; 294(2):192-203; Perocchi等人, Nucleic Acids Res. 2007; 35(19):e128。子步骤B(参见图22)包括在多种第二合成引物和优选地非链置换DNA聚合酶存在的情况下复制多种cDNA的第一链以产生多种双链cDNA产物,其中多种第二合成引物各自包含(5'至3')任选可消化的固定的5'序列,与衔接子序列具有互补性的嵌套序列,任选的包含第二标签序列的内部标签序列,和与cDNA的第一链具有互补性的随机序列、半随机序列或3'序列的合并物。
定向子步骤A-第一链cDNA合成
定向扩增步骤的子步骤A包括在多种第一合成引物存在的情况下逆转录至少一种RNA分子以产生多种cDNA的第一链(参见图21)。
(i) RNA
可以使用本文公开的方法扩增各种不同类型的RNA分子。在一些实施方案中,RNA可以是信使RNA (mRNA)或其片段。mRNA可以是多腺苷酸化的,或mRNA可以是非多腺苷酸化的。在某些实施方案中,RNA可以是不同mRNA的群体。在其他实施方案中,RNA可以是非编码RNA(ncRNA)。例如,ncRNA可以是长非编码RNA (IncRNA)、长基因间非编码RNA (lincRNA)、微小RNA (miRNA)、小干扰RNA (siRNA)、Piwi相互作用RNA (piRNA)、反式作用RNA (rasiRNA)、核糖体RNA (rRNA)、转移RNA (tRNA)、线粒体tRNA (MT-tRNA)、小核RNA (snRNA)、小核仁RNA (snoRNA)、SmY RNA、Y RNA、剪接的前导RNA (SL RNA)、端粒酶RNA组分(TERC)、其片段或其组合。在又进一步实施方案中,RNA可以是细胞或细胞群的转录组。RNA可以源自真核细胞、古细菌细胞或细菌细胞。
输入RNA的量可以并且将变化。通常,本文公开的方法可以扩增低或单细胞输入量的RNA。在一些实施方案中,输入RNA的量可以是至少约5皮克(pg),至少约10 pg,至少约20pg,至少约50 pg,至少约100 pg,至少约200 pg,至少约500 pg,或超过约500 pg的RNA。在具体实施方案中,输入RNA的量可以范围为约10 pg至约100 pg。
RNA的质量或完整性也可以变化。例如,输入RNA的质量可以范围为低质量(即,降解或片段化的)至高质量(即,完整)。本领域技术人员熟悉估计目标RNA的质量的手段。例如,可以基于28S rRNA与18S rRNA的比率来估计总RNA的质量。在一些实施方案中,RNA可以具有至少约2:1的28S:18S比率,至少约1:1的28S:18S比率,小于约1:1的28S:18S比率,或不可检测的28S:18S比率。
(ii)第一链合成
使一种或多种RNA分子与多种第一合成引物接触(参见图21)。第一合成引物如上所详述。每种第一合成引物包含(5'至3')任选可消化的固定的5'序列,与衔接子序列具有同源性的嵌套序列,任选的包含第一标签序列的内部标签序列,以及与RNA分子具有互补性的随机序列、半随机序列或3'序列的合并物。
在与靶RNA接触后,第一合成引物的3'序列与RNA的互补区域杂交。在脱氧核糖核苷酸(即,dCTP、dGTP、dATP和dTTP)和合适的RT缓冲液存在的情况下,通过逆转录酶(RT)催化cDNA的第一链的合成(参见图21)。本领域技术人员熟悉反应物的适当浓度和第一链cDNA合成的合适反应条件。
逆转录酶可以是嗜常温的或嗜热的,并且逆转录酶可以是RNA酶H+或RNA酶H-。合适的逆转录酶的实例包括M-MLV RT(来自Moloney鼠白血病病毒),HIV-1 RT (来自人免疫缺陷病毒1型),AMV RT(来自禽成髓细胞瘤病毒)、其变体和其工程改造的形式。
如上所示,在一些实施方案中,第一链cDNA合成可以在放线菌素D存在的情况下进行,以减少来自链置换的cDNA的第一链的不期望的引发。然而,可能发生一些链置换和第二链延伸,产生侧接下游条形码的背景产物。放线菌素D的使用可以降低侧接相同条形码序列的产物水平。
在第一链合成反应完成后,可通过热处理使逆转录酶失活。热灭活可以在约70℃、约80℃或约90℃的温度下持续约3分钟、约5分钟、约10分钟或约15分钟。通常,失活温度越低,加热步骤的持续时间越长。
(iii)单链第一合成引物的除去
该方法进一步包括使多种cDNA的第一链与单链特异性3'-5'脱氧核糖核酸酶(即外切核酸酶)接触以降解单链(即未杂交的)第一合成引物。双链cDNA-RNA杂合体不会通过与优选的3'-5'脱氧核糖核酸酶接触而降解。在一些实施方案中,3'-5'脱氧核糖核酸酶可以是大肠杆菌外切核酸酶I、大肠杆菌外切核酸酶X或哺乳动物Trex1(DNA酶III)。在具体实施方案中,3'-5'脱氧核糖核酸酶可以是大肠杆菌外切核酸酶I。用于降解过量的第一合成引物的外切核酸酶的量可以并且将变化,这取决于各种因素,包括子步骤A中使用的第一合成引物的起始量。通常,与外切核酸酶的接触在范围为约35℃至约40℃的温度下进行约5分钟至约60分钟的时间段。外切核酸酶可以用本文所述的热失活(例如,在约70℃、约80℃或约90℃的温度下持续约3分钟、约5分钟、约10分钟或约15分钟)。
定向子步骤B-第二链cDNA合成
定向扩增步骤的子步骤B包括在多种第二合成引物存在的情况下复制多种cDNA的第一链以产生多种双链cDNA产物(参见图22)。
(i)第二链合成
每种第二合成引物包含(5'至3')任选地包含可消化的残基的固定的5'序列,与衔接子序列具有互补性的嵌套序列,任选的包含第二标签序列的内部标签序列,和与cDNA的第一链具有互补性的随机序列、半随机序列或特异性靶向3'序列的合并物。选择第一和第二合成引物,使得任一者或两者包含第一和/或第二标签序列。
该过程的该步骤开始于在多种第二合成引物存在的情况下使步骤A期间产生的cDNA/RNA双链体热变性。热处理产生单链cDNA模板,并且还将用于降解单链第一合成引物的3'-5'-外切核酸酶失活。热处理可以在约90℃、约92℃、约94℃、约96℃或约100℃的温度下持续约1分钟、约2分钟、约5分钟或约10分钟。在热处理后,温度降低至反应温度,并且随着温度下降,第二合成引物的3'序列与cDNA的第一链的互补区杂交(参见图22)。
在脱氧核糖核苷酸和合适的缓冲液存在的情况下,通过非链置换DNA聚合酶催化cDNA的第二链的合成(参见图22)。非链置换DNA聚合酶可以是嗜常温的或嗜热的。合适的非链置换DNA聚合酶的实例包括大肠杆菌DNA聚合酶I、T4 DNA聚合酶、T7 DNA 聚合酶、其变体和其工程改造的版本。本领域技术人员熟悉反应物的适当浓度和第二链cDNA合成的合适反应条件。每种双链cDNA产物侧接第一和第二标签序列中的至少一者,其表明cDNA产物就输入RNA分子而言的方向(参见图22)。
尽管第二链合成由非链置换DNA聚合酶驱动,但也可以产生一些背景产物。
(ii)单链第二寡核苷酸的任选除去
该方法任选地可以进一步包括与3'-5'脱氧核糖核酸酶(即外切核酸酶)接触以降解单链(即未杂交的)第二合成引物,基本上如上对于除去第一链合成引物所述。
(iii)“单管”过程
本文公开的定向扩增的子步骤A和B依次进行,而没有中间纯化步骤。没有纯化步骤允许单管形式,避免材料损失。单管形式也适用于高通量。纯化步骤的缺乏通过第一和第二寡核苷酸的逐步外切核酸酶除去以及酶的热失活来完成。
步骤III:扩增
无论在步骤II非定向或步骤II定向中是否采用DNA、非定向或定向RNA扩增过程,本文所述的方法的下一步包括在一种或多种扩增引物存在的情况下扩增多种双链DNA产物以产生扩增的DNA产物文库。
(i)扩增引物
扩增引物包含固定的可消化的5'序列,并且在适当时包含与合成引物的嵌套部分同源的3'序列。通常,扩增引物是单链的并且包含脱氧核糖核苷酸。脱氧核糖核苷酸可以包含标准核苷酸(即A、C、G、T、U、dU等等),以及核苷酸类似物。核苷酸类似物是指具有修饰的嘌呤或嘧啶碱基和/或修饰的核糖部分的核苷酸。核苷酸类似物可以是天然存在的核苷酸(例如,肌苷)或非天然存在的核苷酸。核苷酸的糖或碱基部分上的修饰的非限制性实例包括添加(或除去)乙酰基、氨基、羧基、羧甲基、羟基、甲基、磷酰基和硫醇基团,以及用其他原子取代碱基的碳和氮原子(例如7-脱氮嘌呤)。核苷酸类似物还包括双脱氧核苷酸、2'-O-甲基核苷酸、锁定核酸、肽核酸和吗啉代类似物。扩增引物的主链可以包含磷酸二酯键,以及硫代磷酸酯、亚磷酰胺、或二氨基磷酸酯键。(参见图3B)。
(ii)扩增反应
扩增开始于在扩增引物存在的情况下使上述产生的多种双链DNA产物热变性的步骤。热处理产生单链模板。热处理可以在约90℃、约92℃、约94℃、约96℃或约100℃的温度下持续约15秒、30秒、45秒、1分钟、约2分钟、约5分钟或约10分钟。
在热处理之后,将温度降低至退火或退火/延伸温度,以允许扩增引物退火至DNA模板链。随着温度下降,在短产物的末端的5—3’互补序列的分子内杂交阻止扩增引物与这些产物的退火。对于定向RNA扩增,由引发链置换序列产生的背景产物将比第一和第二链引发的产物具有更大的5'-3'互补性,且因此假设扩增效率更低。通过相同的逻辑,具有源自链置换引发的不同上游或下游条形码的任何产物将更有效地扩增。
在热稳定DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸和合适的缓冲液存在的情况下进行DNA产物的扩增。热稳定DNA聚合酶可以是Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Tli(也称为Vent) DNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、其变体及其组合。适合于热循环反应的缓冲液(含或不含镁)是本领域众所周知的。
在其中使用单一扩增引物的实施方案中,该方法可以包括3个步骤(即,变性、退火和延伸)或2个步骤(即,变性和退火/延伸)。例如,在其中扩增引物的解链温度低于70℃的实施方案中,扩增过程可以包括3个步骤。或者,在其中扩增引物的解链温度等于或高于70℃的实施方案中,扩增过程可以包括2个步骤。在其中使用多于一种扩增引物的实施方案中,该方法通常包括3个步骤(即,变性、退火和延伸)。退火或退火/延伸步骤的温度可以并且将变化,例如,从约50℃至约75℃。延伸或退火/延伸的温度可以范围为约70℃至约75℃,或约72℃。扩增步骤的持续时间可以从几秒至几分钟变化。通常,延伸或退火/延伸步骤的持续时间可以范围为1至5分钟。(参见图14、15和16中的PCR1步骤)。
步骤IV:消化
在步骤III中扩增后进行消化(参见图14、15和16中的消化步骤)。该步骤IV包括使扩增的DNA产物文库与消化酶接触。在一些实施方案中,消化酶是尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)。用UDG的处理在扩增的cDNA产物的5'末端处水解尿嘧啶碱基,有效地减弱每个扩增子的末端碱基配对。UDG可以是细菌、酵母或哺乳动物来源的。在一些实施方案中,UDG来自大肠杆菌。与扩增的cDNA产物文库接触的UDG的量可以并且将变化。技术人员可以容易地确定适当的量和合适的反应条件(例如,温度、持续时间等)。在用于引物转换的另一个实施方案中,用外切核酸酶处理从扩增子除去5'碱基,直至遇到核酸酶抗性碱基,有效地消除每个扩增子的末端碱基配对。在一些实施方案中,所述外切核酸酶是T7外切核酸酶。与扩增的DNA产物文库接触的外切核酸酶的量可以并且将变化。技术人员可以容易地确定适当的量和合适的反应条件(例如,温度、持续时间等)。
(i)糖基化酶
在其中单引物PCR扩增子在扩增子的5'末端附近包含一个或多个糖基化酶敏感的碱基的实施方案中,单引物PCR扩增子与至少一种糖基化酶接触。糖基化酶从单引物PCR扩增子的5'末端水解或切除糖基化酶敏感的碱基,由此减弱扩增子的5'和3'末端之间的碱基配对(参见图4)。
取决于单引物PCR扩增子中糖基化酶敏感的碱基的身份,糖基化酶可以是尿嘧啶DNA糖基化酶、胸腺嘧啶DNA糖基化酶、胸腺嘧啶甘醇DNA糖基化酶、8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶、3-甲基嘌呤DNA糖基化酶、Nth DNA糖基化酶、Nei DNA糖基化酶、MutY/Mig DNA糖基化酶或烷基腺嘌呤-DNA糖基化酶。例如,尿嘧啶DNA糖基化酶切除尿嘧啶碱基;胸腺嘧啶DNA糖基化酶切除5-羧基胞嘧啶碱基;胸腺嘧啶甘醇DNA糖基化酶切除胸腺嘧啶甘醇碱基;等等。
糖基化酶可以是细菌、古细菌、酵母或哺乳动物来源的。糖基化酶可以是嗜常温的或嗜热的。与单引物PCR扩增子接触的糖基化酶的量可以并且将变化,其取决于例如糖基化酶的身份、扩增子中糖基化酶敏感的碱基的数量等等。本领域技术人员可以容易地确定适当的量。糖基化酶反应步骤的温度可以范围为约20℃至约80℃,并且糖基化酶反应步骤的持续时间可以范围为约5分钟至约2小时。
在具体实施方案中,单引物PCR扩增子中的糖基化酶敏感的碱基是尿嘧啶碱基,且糖基化酶是尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)。UDG可以源自例如大肠杆菌或海洋细菌BMTU 3346。用于消化单引物PCR扩增子中的尿嘧啶碱基的UDG的量可以范围为约0.001单位至约20单位的酶。在一些实施方案中,使约10% v/v的1单位/µL UDG溶液与单引物PCR扩增子接触。消化步骤的温度可以范围为约25℃至约45℃,或约35℃至约40℃。消化步骤的持续时间可以范围为约10分钟至约60分钟。
在一些实施方案中,在消化步骤完成后,可以通过在约85℃至约105℃的温度下热处理约1分钟至约30分钟来使糖基化酶失活。
在一些实施方案中,糖基化酶可以用双引物PCR试剂配制。
(ii)5'-3'外切核酸酶
在其中单引物PCR扩增子在5'末端附近包含一个或多个核酸酶抗性核苷酸的实施方案中,单引物PCR扩增子与5'-3'外切核酸酶接触。5'-3'外切核酸酶从扩增子的5'末端水解并除去核苷酸,直至遇到核酸酶抗性核苷酸。因此,除去单引物PCR扩增子的5'末端的核苷酸,导致扩增子的5'和3'末端之间的碱基配对减弱(参见图5)。核酸酶抗性引物的非限制性具体实例说明于图8中。
合适的5'-3'外切核酸酶的非限制性实例包括噬菌体T7外切核酸酶、噬菌体T5外切核酸酶、噬菌体λ外切核酸酶、细菌外切核酸酶VIII或细菌DNA聚合酶I。5'-3'外切核酸酶可以是野生型或修饰的,使得改变酶的特性(例如,稳定性、特异性、动力学)。
与单引物PCR扩增子接触的5'-3'外切核酸酶的量可以并且将变化,这取决于例如外切核酸酶的身份、扩增子的数量等。通常,与单引物PCR扩增子接触的5'至3'外切核酸酶的量可以范围为约0.01至约20单位的酶。外切核酸酶消化步骤的温度可以范围为约25℃至约45℃,或约35℃至约40℃。消化步骤的持续时间可以范围为约10分钟至约60分钟。
在一些实施方案中,在消化步骤完成后,可以通过在约75℃至约100℃的温度下热处理约1分钟至约30分钟来使5'至3'外切核酸酶失活。
步骤V:附加序列衔接子
消化后的下一步包括将衔接子附加至扩增的DNA产物文库的5'末端。由于消化,扩增的cDNA产物的末端的碱基配对减弱,并且每种产物的3'末端含有与衔接子互补的序列。因此,衔接子引物能够穿透并有效地与DNA产物退火。在聚合酶链式反应期间,衔接子可以附加至DNA产物。只有在每个末端具有配对的衔接子序列的结构才能有效地扩增。
在该过程结束时,可以通过电泳、色谱、基于珠粒的净化或其他标准核酸纯化方法除去过量的扩增引物和衔接子。
包含衔接子的扩增cDNA文库可以进入各种应用,包括高通量测序程序,包括下一代测序,定向深度测序,Illumina®测序,454测序,离子激流测序,SOLiD测序,纳米孔测序,单分子读取时间测序等。扩增的DNA文库也可用于其他众所周知的基于PCR和微阵列的应用中。(参见图14、15和16中的PCR2步骤)。
(i)双引物PCR引物
通过在扩增条件下与双引物PCR引物接触,将上面在步骤IV中详述的消化的扩增子转化为双引物PCR扩增子。双引物PCR引物包含正向或有义引物和反向或反义引物。通常,双引物PCR引物的3'部分与合成引物的嵌套部分同源。在合成引物的嵌套部分和双引物PCR引物中同源的3'部分的长度可以范围为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在具体实施方案中,嵌套和双引物PCR引物中同源的3'部分可以长度范围为约10至约16个核苷酸。
双引物的总长度可以范围为约14个核苷酸至约100个核苷酸。在一些实施方案中,双引物长度范围可以为约18个核苷酸至约100个核苷酸。在其他实施方案中,总双引物长度范围可以为约60个核苷酸至约80个核苷酸。
通常,双引物PCR引物是单链的并且在3'末端具有羟基用于引发DNA合成。扩增引物可以包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其组合。所述核苷酸可以是标准核苷酸(即腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷/尿苷)或核苷酸类似物。核苷酸类似物是指具有修饰的嘌呤或嘧啶碱基和/或修饰的核糖部分的核苷酸。核苷酸类似物可以是天然存在的核苷酸(例如,肌苷)或非天然存在的核苷酸。核苷酸的糖或碱基部分上的修饰的非限制性实例包括添加(或除去)乙酰基、氨基、羧基、羧甲基、羟基、甲基、磷酰基和硫醇基团,以及用其他原子取代碱基的碳和氮原子(例如7-脱氮嘌呤)。核苷酸类似物还包括双脱氧核苷酸、2'-O-甲基核苷酸、锁定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和吗啉代类似物。
通常,双重PCR引物将具有约40-60%的平均GC含量,和约50℃至约85℃的平均解链温度(Tm)。在某些实施方案中,单引物PCR引物可以具有约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃或约75℃的Tm。
(ii)扩增条件
经由双引物PCR扩增消化的单引物PCR扩增子以形成双引物PCR扩增子。扩增条件提供至少两个循环,其具有退火温度和时间以允许双引物引发。随后的循环退火仅需要足以进行双引物引发。使用长双引物的非限制性实例包括两个循环的变性(94℃/15秒),退火(60℃/5分钟),延伸(70℃/1分钟),随后为6至10个循环的变性(94℃/15秒),退火/延伸(70℃/1分钟)。
消化的扩增子的5'消化的末端和3'末端之间减弱或不存在的碱基配对有利于双引物与消化的扩增子的退火。因此,双引物被延伸并且扩增子被复制,除了5'消化的末端。在两个扩增循环之后,产生指数可扩增的模板。在某些实施方案中,这些循环的退火温度低于指数扩增循环。额外轮的扩增导致双引物PCR扩增子的形成。
双引物PCR扩增子可以直接用于后续反应或下游应用中,而没有任何中间纯化步骤。或者,可以使用众所周知的核酸纯化方法(例如,PCR纯化试剂盒等)从核苷酸、扩增引物、酶和盐中纯化双引物PCR扩增子。
由于在单引物至双引物扩增子引发期间形成的单引物加合物的低效扩增,双引物PCR扩增子是双引物(参见图10和11)。
(II)在单引物PCR引物之间的转换
本公开的另一个方面提供了用于在至少两种不同的单引物PCR引物之间转换的方法。该方法基本上包括图4和5中的重复步骤,其中不同的单引物PCR引物替代双重PCR引物。具体而言,所述方法包括通过在扩增条件下使靶核酸与包含可消化的5'部分的第一单引物PCR引物接触来制备第一组单引物PCR扩增子,和用能够消化第一组单引物PCR扩增子的5'部分的酶处理第一组单引物PCR扩增子,以形成第一组消化的扩增子。所述方法进一步包括在扩增条件下使第一组消化的扩增子与包含任选可消化的5'部分的第二单引物PCR引物接触,以形成第二组单引物PCR扩增子。在某些实施方案中,可以用能够消化第二单引物PCR扩增子的5'部分的酶处理第二组单引物PCR扩增子,以形成第二组消化的扩增子。在一些实施方案中,可以使第二组消化的扩增子与如上所详述的双引物PCR引物接触。
(III) 应用
本文公开的方法可以在DNA扩增期间使用,其中DNA可以是染色体、线粒体、质粒或细胞质DNA。所述方法也可以在RNA扩增期间使用,其中所述扩增可以是定向的或非定向的,并且RNA可以是编码的或非编码的。
单引物PCR扩增子和/或双引物PCR扩增子可用于各种下游应用中。在一些实施方案中,可以使用下一代测序(NGS)平台对单引物或双引物PCR扩增子进行测序。NGS平台的非限制性实例包括离子激流测序、SOLiD测序、Illumina®测序、基因组分析仪测序、454测序、定向深度测序、纳米孔测序、单分子读取时间测序等。NGS技术包括临床诊断、癌症诊断、分子诊断测试、癌症治疗、药物开发、微生物组技术、食品和农业技术以及基础研究。
在其他实施方案中,单引物或双引物PCR扩增子可以出于诊断、治疗、制药、工业、法医、农业和研究目的进行基于PCR的筛选/检测方法、qPCR、多重PCR、高通量测定、基于微阵列的技术、基于CHIP的测定、比较基因组杂交、SNP基因分型、RFLP分析等。
(IV) 试剂盒
本公开的又另一个方面提供了用于实施上述方法的试剂盒。在一些实施方案中,所述试剂盒包含单引物PCR引物和用于消化所得单引物PCR扩增子的相应的酶(即,糖基化酶或5'-3'外切核酸酶)。在一些实施方案中,所述试剂盒可以进一步包含双引物PCR引物。在其他实施方案中,所述试剂盒可以包含双引物PCR、相应的酶和任选衔接子序列。所述试剂盒可以进一步包含合适的反应缓冲液和/或适合于PCR和脱氧核糖核苷酸的DNA聚合酶。
本公开的又另一个方面提供了包含上述寡核苷酸的试剂盒,或用于使用上文详述的方法扩增RNA的试剂盒。
在一些实施方案中,所述试剂盒可以包含(a)多种合成引物,其中每种第一合成引物包含(5'至3')任选地包含至少一个dU残基的固定的5'序列,与衔接子序列具有互补性的嵌套序列,任选的内部标签序列,以及随机序列、半随机序列或特定3'序列的合并物,和(b)至少一种扩增引物,其包含含有至少一个dU残基的固定的5'序列和任选与衔接子序列具有互补性的嵌套序列。
在一些实施方案中,所述试剂盒可以包含(a)多种第一合成引物,其中每种第一合成引物包含(5'至3')包含至少一个dU残基的固定的5'序列,与衔接子序列具有互补性的嵌套序列,任选的包含第一标签序列的内部标签序列,以及随机序列、半随机序列或特定3'序列的合并物,(b)多种第二合成引物,其中每种第二合成引物包含(5'至3')包含至少一个dU残基的固定的5'序列,与衔接子序列具有互补性的嵌套序列,任选的包含第二标签序列的内部标签序列,以及随机序列、半随机序列或特定3'序列的合并物,条件是多种第一和第二合成引物中的一者或两者包含第一和/或第二标签序列,和(c)至少一种扩增引物,其包含含有至少一个dU残基的固定的5'序列和任选与衔接子序列具有互补性的嵌套序列。
所述试剂盒可以进一步包含链置换聚合酶、3'-5'脱氧核糖核酸酶、非链置换DNA聚合酶、嗜热DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶和/或放线菌素D。在一些实施方案中,所述试剂盒可以进一步包含测序衔接子。
所述试剂盒可以进一步包含逆转录酶、3'-5'、非链置换DNA聚合酶、嗜热DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶和/或放线菌素D。在一些实施方案中,所述试剂盒可以进一步包含测序衔接子。
任何试剂盒可以进一步包含脱氧核糖核苷酸和一种或多种合适的缓冲液(例如,逆转录酶缓冲液、第二链合成缓冲液、热循环缓冲液等)。
本文提供的试剂盒通常包括用于实施上文详述的方法的说明书。试剂盒中包括的说明书可以附加至包装材料,可以作为包装插页或作为可下载的文件包括。尽管说明书通常是书面或印刷材料,但它们不限于此。本公开考虑了能够存储此类说明书并将它们传送给最终用户的任何介质。此类介质包括但不限于电子存储介质(例如,磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)、光学介质(例如,CD ROM)等。如本文所用,术语“说明书”可以包括提供说明书的因特网站点的地址。
由于可以在不背离本发明的范围的情况下在上述方法和试剂盒中进行各种改变,所以意欲应当将上述描述和下面给出的实施例中含有的所有内容解释为说明性的而不是在限制性意义上解释。
定义
除非另有定义,本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。以下参考文献为本领域技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义:Singleton等人, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (第2版.1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker编辑, 1988);The Glossary of Genetics, 第5版, R. Rieger等人 (编辑), Springer Verlag(1991); 和Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。除非另有规定,如本文所用,以下术语具有归因于它们的含义。
当引入本公开的要素或其优选方面时,冠词“一个”、“一种”、“该”和“所述”意指存在该要素中的一个或多个。术语“包含”、“包括”和“具有”意在是包括性的,并且意味着除了所列要素之外可以存在额外要素。
简并核苷酸可以具有2倍简并性(即,其可以是两个核苷酸之一),3倍简并性(即,其可以是三个核苷酸之一),或4倍简并性(即,其可以是四个核苷酸之一,A或C或G或T)。具有3倍简并性的核苷酸包括“B”(可以是C或G或T),“D”(可以是A或G或T),“H”(可以是A或C或T)和“V” (可以是A或C或G)。具有2倍简并性的核苷酸包括“K”(可以是G或T),“M”(可以是A或C),“R”(可以是A或G),“Y”(可以是C或T) ,“S”(可以是C或G)和“W”(可以是A或T)。
如本文所用,术语“互补”或“互补性”是指通过经由特异性氢键的碱基配对的双链核酸的缔合。碱基配对可以是标准的Watson-Crick碱基配对(例如,5’-A G T C-3’与互补序列3’-T C A G-5’配对)。碱基配对也可以是Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键键合。通常相对于双链体区域测量互补性,因此例如排除突出端。如果只有一些碱基对是互补的,则双链体区域的两条链之间的互补性可以是部分的并且表示为百分比(例如,70%)。不互补的碱基是“错配的”。如果双链体区域的所有碱基对都是互补的,则互补性也可以是完全的(即,100%)。
如本文所用,术语“同源”是指两个或更多个序列相同的程度。如果两个序列在一组定义的条件下与相同的序列杂交,则认为它们是同源的。定义的条件包括但不限于缓冲液制剂、温度和序列浓度。
术语“核酸”和“多核苷酸”是指线形或环形构型和单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。为了本公开的目的,这些术语不应被解释为就聚合物的长度而言是限制性的。该术语可以涵盖天然核苷酸的已知类似物,以及在碱基、糖和/或磷酸酯部分(例如硫代磷酸酯骨架)中修饰的核苷酸。通常,特定核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性;即A的类似物将与T碱基配对。
术语“核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。所述核苷酸可以是标准核苷酸(即腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷和尿苷)或核苷酸类似物。核苷酸类似物是指具有修饰的嘌呤或嘧啶碱基或修饰的核糖部分的核苷酸。核苷酸类似物可以是天然存在的核苷酸(例如,肌苷)或非天然存在的核苷酸。核苷酸的糖或碱基部分上的修饰的非限制性实例包括添加(或除去)乙酰基、氨基、羧基、羧甲基、羟基、甲基、磷酰基和硫醇基团,以及用其他原子取代碱基的碳和氮原子(例如7-脱氮嘌呤)。核苷酸类似物还包括双脱氧核苷酸、2'-O-甲基核苷酸、锁定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和吗啉代类。
用于确定核酸和氨基酸序列同一性的技术是本领域已知的。通常,此类技术包括确定基因的mRNA的核苷酸序列和/或确定由此编码的氨基酸序列,和将这些序列与第二核苷酸或氨基酸序列进行比较。也可以以这种方式确定和比较基因组序列。通常,同一性是指两个多核苷酸或多肽序列分别的确切核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸对应性。两个或更多个序列(多核苷酸或氨基酸)可以通过确定其百分比同一性来比较。两个序列(无论是核酸或氨基酸序列)的百分比同一性是两个比对序列之间的精确匹配数除以较短序列的长度并乘以100。核酸序列的近似比对由Smith和Waterman, Advances in AppliedMathematics 2:482-489 (1981)的局部同源性算法来提供。该算法可以通过使用由Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff编, 5 suppl.3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA开发并由Gribskov, Nucl.Acids Res.14(6):6745-6763 (1986)进行标准化的评分矩阵来应用于氨基酸序列。该算法确定序列百分比同一性的示例性实施由Genetics Computer Group(Madison, Wis.)在“BestFit”效用应用中提供。用于计算序列之间的百分比同一性或相似性的其他合适程序是本领域通常已知的,例如,另一种比对程序是以默认参数使用的BLAST。例如,可以使用以下默认参数使用BLASTN和BLASTP:遗传密码=标准;过滤器=无;链=两条;截止值= 60;期望值= 10;矩阵= BLOSUM62;描述= 50个序列;排序方式= 高评分;数据库=非冗余,GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR。这些程序的详情可以在GenBank网站上找到。
实施例
以下实施例说明本发明的某些方面。
实施例1:全基因组扩增 - 单引物至双引物转换
使用半简并文库引物(5'-UGGUUGUGUUUGCTCTTCCGATCTKNNNKNKNK-3'; SEQ ID NO:7)和WGA引物(5'-UGGUUGUGUUUGCTCTTCCGATCT-3' (SEQ ID NO:1)使用增强的DNA扩增试剂盒(SeqPlex™; Sigma-Aldrich)扩增人基因组DNA (10 ng)。将单引物扩增子在10% v/v的尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)不存在或存在的情况下在37℃下孵育30分钟。使用正向引物(5'-TCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'; SEQ ID NO:2)和反向引物(5'CCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'; SEQ ID NO:3)实时(即,通过荧光染料SYBR Green监测)扩增+/-消化的扩增子,持续两个循环的94℃/30秒、50℃/10分钟,且然后x个循环的94℃/30秒,70℃/1分钟,其中x是至SYBR Green平台期的循环数。双引物PCR扩增的生物分析仪迹线呈现于图9中。在用UDG处理单引物扩增子后检测到具有约150-250 bp的平均大小的双引物PCR扩增子。在没有UDG处理的情况下检测到大得多的产物的低产率。
实施例2:全基因组扩增 - 引物组合
扩增基因组DNA,并用UDG处理所得扩增子,如上文实施例1中所述。使用来自实施例1的单一WGA、正向和/或反向引物的单一或双重组合实时(即,通过荧光染料监测)扩增消化的扩增子。每种组合的生物分析仪迹线和阈值循环(Ct)值显示于图11中。双重正向/反向组合的Ct值比单独这些引物中的任一个低约8-9个循环,表明<1%的扩增产物具有互补的5'-3'末端(即,2-(8至9) < 0.01)。(还参见图8)。另外,在单引物和双引物组合之间的产物大小分布中存在差异。
实施例3:全基因组扩增 - 短 vs. 长双引物
扩增基因组DNA,并用UDG处理所得扩增子,如上文实施例1中所述。使用上文实施例1中所述的正向和反向(短)PCR引物或使用如上所述的正向5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATAGCCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'; SEQ IS NO:4)和反向(5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTACTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'; SEQ ID NO:5)(长)PCR引物实时(即,通过荧光染料监测)扩增消化的扩增子(参见图7)。结果呈现于图12中。使用短双引物产生的扩增子的平均长度为约200 bp,并且使用长双引物产生的扩增子的平均长度为约275 bp。
实施例3:全基因组扩增–单细胞
通过22个循环的WGA从单个人细胞扩增基因组,随后用UDG消化,如上文实施例1中所述。使用实施例1中描述的双引物扩增消化的扩增子9个循环。如图13中所示,本文公开的单引物至双引物方法可用于扩增非常少量的核酸。
实施例4:RNA的定向扩增
使用基本上如上所详述(并且在图16中概述)的方法扩增通用人参考(UHR) RNA。该过程中使用的多种第一和第二合成引物显示于下表1中(嵌套序列用斜体表示,并且内部标签序列用下划线表示)。
使用(1)不具有条形码序列的单一引物,和(2)包含上游或下游标签序列(条形码)的两个或更多个核苷酸的多种引物类型,通过实时PCR一式三份进行扩增。扩增引物的实例显示于表2中(条形码或标签序列用下划线表示)。
监测扩增并在循环平台期手动停止。在两种扩增引物类型之间未观察到显著差异。结果显示于表3中。用四种条形码特异性引物进行的扩增对于对于第一链合成背景显示~6.5 – 6.9的△C(t),并且对于第二链合成背景显示9.6 – 10的△C(t)。可以通过配对末端测序辨别定量百分比背景。
在GenElute PCR净化之后,扩增产物似乎实际上不含引物、引物二聚体、衔接子和衔接子二聚体。扩增产物(减去122 bp Illumina®衔接子序列)范围为~80至180个碱基对,其中每个反应的产率为10至12微克。
Claims (59)
1.用于将单引物PCR扩增子转化为双引物PCR扩增子的方法,所述方法包括:
用能够消化所述单引物PCR扩增子的5'部分的酶处理所述单引物PCR扩增子以形成消化的扩增子;和
用一对与所述消化的扩增子的未消化部分具有同源性的引物扩增所述消化的扩增子,由此形成双引物PCR扩增子。
2.权利要求1的方法,其中所述单引物PCR扩增子通过在扩增条件下使核酸与单一PCR引物接触而产生,并且所述单一PCR引物包含可消化的5'部分。
3.权利要求1的方法,其中所述单引物PCR扩增子衍生自RNA或DNA。
4.权利要求1的方法,其中所述酶是糖基化酶。
5.权利要求4的方法,其中所述糖基化酶是尿嘧啶DNA糖基化酶、胸腺嘧啶DNA糖基化酶、胸腺嘧啶甘醇DNA糖基化酶、8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶、3-甲基嘌呤DNA糖基化酶、NthDNA糖基化酶、Nei DNA糖基化酶、MutY/Mig DNA糖基化酶或烷基腺嘌呤-DNA糖基化酶。
6.权利要求1或2的方法,其中所述单引物PCR扩增子的5'部分包含至少一个糖基化酶敏感的碱基。
7.权利要求6的方法,其中所述至少一个糖基化酶敏感的碱基是尿嘧啶、羧基胞嘧啶、2,6-二氨基-4-羟基-5-甲酰胺基嘧啶(FapyG)、4,6-二氨基-5-甲酰胺基嘧啶(FapyA)、甲酰基尿嘧啶、羟基尿嘧啶、羟基胞嘧啶、羟甲基尿嘧啶、次黄嘌呤、3-甲基腺嘌呤、8-氧代鸟嘌呤、8-氧代腺嘌呤、胸腺嘧啶甘醇、尿素或黄嘌呤。
8.权利要求3至6中任一项的方法,其中所述酶是尿嘧啶DNA糖基化酶,并且所述至少一个糖基化酶敏感的碱基是尿嘧啶。
9.权利要求1的方法,其中所述酶是5'-3'外切核酸酶。
10.权利要求9的方法,其中所述5'-3'外切核酸酶是噬菌体T7外切核酸酶、噬菌体T5外切核酸酶、噬菌体λ外切核酸酶、细菌外切核酸酶VIII或细菌DNA聚合酶I。
11.权利要求1或2的方法,其中单引物PCR扩增子在距其5'末端约5个核苷酸至约25个核苷酸内包含至少一个核酸酶抗性核苷酸。
12.权利要求11的方法,其中所述至少一个核酸酶抗性核苷酸包含3'-5'硫代磷酸酯键、3'-5'磷代硼烷键、2'-5'磷酸二酯键、2' O-甲基部分、2'氟代部分、丙炔碱基类似物或其组合。
13.权利要求12的方法,其中单一PCR引物的可消化的5'部分包含至少一个选自以下的糖基化酶敏感的碱基:尿嘧啶、羧基胞嘧啶、2,6-二氨基-4-羟基-5-甲酰胺基嘧啶(FapyG)、4,6-二氨基-5-甲酰胺基嘧啶(FapyA)、甲酰基尿嘧啶、羟基尿嘧啶、羟基胞嘧啶、羟甲基尿嘧啶、次黄嘌呤、3-甲基腺嘌呤、8-氧代鸟嘌呤、8-氧代腺嘌呤、胸腺嘧啶甘醇、尿素或黄嘌呤。
14.权利要求2的方法,其中所述单一PCR引物在所述不可消化的3'部分中或在所述可消化的5'部分和所述不可消化的3'部分之间的接口处包含至少一个核酸酶抗性核苷酸,并且所述至少一个核酸酶抗性核苷酸包含3'-5'硫代磷酸酯键、3'-5'磷代硼烷键、2'-5'磷酸二酯键、2' O-甲基部分、2'氟代部分、丙炔碱基类似物或其组合。
15.权利要求1的方法,其中所述单引物扩增子已用DNA开始进行制备,其包括:
在多种合成引物存在的情况下复制至少一种DNA分子,以产生多种DNA的第一和第二链,每种合成引物包含(5'至3')任选的可消化的5'序列,与衔接子引物序列具有同源性的嵌套序列,任选的包含第一标签序列的内部标签序列,和与DNA分子的一部分具有互补性的3'序列;
在一种扩增引物存在的情况下扩增多种双链DNA产物以产生扩增的DNA产物文库,所述一种扩增引物包含多种合成引物的5'序列;
用核酸酶或糖基化酶消化扩增的DNA产物文库;和
将衔接子序列附加至消化的cDNA产物的文库的每个5'末端,以产生扩增的RNA的文库。
16.权利要求15的方法,其中步骤(a)在DNA聚合酶和脱氧核糖核苷酸存在的情况下进行。
17.权利要求1的方法,其中所述单引物扩增子已用RNA开始进行制备,其包括:
在多种合成引物存在的情况下逆转录至少一种RNA分子,以产生多种互补DNA(cDNA)的第一和第二链,每种合成引物包含(5'至3')任选的可消化的5'序列,与衔接子引物序列具有同源性的嵌套序列,任选的包含第一标签序列的内部标签序列,和与RNA分子的一部分具有互补性的3'序列;
在一种扩增引物存在的情况下扩增多种双链cDNA产物以产生扩增的cDNA产物文库,所述一种扩增引物包含多种合成引物的5'序列;
用核酸酶或糖基化酶消化扩增的cDNA产物文库;和
将衔接子序列附加至消化的cDNA产物的文库的每个5'末端,以产生扩增的RNA的文库。
18.权利要求17的方法,其中步骤(a)在逆转录酶脱氧核糖核苷酸和任选DNA聚合酶存在的情况下进行。
19.权利要求1的方法,其中已制备单引物扩增子以实现定向扩增子,其包括:
在多种第一合成引物存在的情况下逆转录至少一种RNA分子,以产生多种互补DNA(cDNA)的第一链,每种第一合成引物包含(5'至3')可消化的5'序列,与衔接子引物序列具有同源性的嵌套序列,任选的包含第一标签序列的内部标签序列,和与RNA分子的一部分具有互补性的3'序列;
通过使多种cDNA的第一链与多种第二合成引物接触来合成多种双链cDNA产物,每种第二合成引物包含(5'至3')可消化的5'序列,与衔接子引物序列具有同源性的嵌套序列,任选的包含第二标签序列的内部标签序列,和与cDNA的第一链的一部分具有互补性的3'序列,条件是多种第一和第二合成引物中的一者或两者包含第一和/或第二标签序列,使得每种双链cDNA产物侧接第一或第二标签序列中的至少一者;
在一种扩增引物存在的情况下扩增多种双链cDNA产物以产生扩增的cDNA产物文库,所述一种扩增引物包含5'序列和多种第一和第二合成引物的嵌套序列;
用核酸酶或糖基化酶消化扩增的cDNA产物文库;和
将衔接子附加至消化的cDNA产物的文库的每个5'末端,以产生定向扩增的RNA的文库。
20.权利要求19的方法,其中步骤(a)在逆转录酶、脱氧核糖核苷酸和任选放线菌素D存在的情况下进行。
21.权利要求20的方法,其中步骤(b)开始于在多种第二合成引物存在的情况下使多种cDNA的第一链热变性,并且步骤(b)在非链置换DNA聚合酶和脱氧核糖核苷酸存在的情况下进行。
22.权利要求15至20的方法,其中步骤(a)随后为与单链特异性脱氧核糖核酸酶接触以降解未杂交的合成引物。
23.权利要求15至20的方法,其中步骤(b)任选地随后为与单链特异性脱氧核糖核酸酶接触以降解未杂交的第二链合成引物。
24.权利要求15至20的方法,其中多种合成引物的3'序列包含简并核苷酸,包括随机、半随机和两对或更多对合并的特异性引物。
25.权利要求15至20的方法,其中步骤(a),多种第一合成引物包含一种或多种具有不同内部标签的引物。
26.权利要求15至20的方法,其中步骤(b),多种第二合成引物包含一种或多种具有不同内部标签的引物。
27.权利要求15至20的方法,其中扩增开始于在至少一种扩增引物存在的情况下多种双链DNA产物的热变性,并且在热稳定DNA聚合酶和脱氧核糖核苷酸存在的情况下进行。
28.权利要求15至20的方法,其缺乏一个或多个纯化步骤。
29.权利要求15至20的方法,其中所述合成引物的5'部分包含至少一个糖基化酶敏感的碱基。
30.权利要求29的方法,其中所述至少一个糖基化酶敏感的碱基是尿嘧啶、羧基胞嘧啶、2,6-二氨基-4-羟基-5-甲酰胺基嘧啶(FapyG)、4,6-二氨基-5-甲酰胺基嘧啶(FapyA)、甲酰基尿嘧啶、羟基尿嘧啶、羟基胞嘧啶、羟甲基尿嘧啶、次黄嘌呤、3-甲基腺嘌呤、8-氧代鸟嘌呤、8-氧代腺嘌呤、胸腺嘧啶甘醇、尿素或黄嘌呤。
31.权利要求15至20的方法,其中多种合成引物的5'序列包含脱氧尿苷核苷酸。
32.权利要求15至20的方法,其中合成引物在距其5'末端约5个核苷酸至约25个核苷酸内包含至少一个核酸酶抗性核苷酸。
33.权利要求32的方法,其中所述至少一个核酸酶抗性核苷酸包含3'-5'硫代磷酸酯键、3'-5'磷代硼烷键、2'-5'磷酸二酯键、2' O-甲基部分、2'氟代部分、丙炔碱基类似物或其组合。
34.权利要求15至20的方法,其中所述标签序列长度为至少6个核苷酸。
35.权利要求15至20的方法,其中所述单引物PCR扩增引物包含至少一个糖基化酶敏感的碱基。
36.权利要求35的方法,其中所述至少一个糖基化酶敏感的碱基是尿嘧啶、羧基胞嘧啶、2,6-二氨基-4-羟基-5-甲酰胺基嘧啶(FapyG)、4,6-二氨基-5-甲酰胺基嘧啶(FapyA)、甲酰基尿嘧啶、羟基尿嘧啶、羟基胞嘧啶、羟甲基尿嘧啶、次黄嘌呤、3-甲基腺嘌呤、8-氧代鸟嘌呤、8-氧代腺嘌呤、胸腺嘧啶甘醇、尿素或黄嘌呤。
37.权利要求35的方法,其中所述扩增引物包含至少一个脱氧尿苷核苷酸。
38.权利要求15至20的方法,其中所述单引物PCR扩增引物在距其5'末端约5个核苷酸至约25个核苷酸内包含至少一个核酸酶抗性核苷酸。
39.权利要求38的方法,其中所述至少一个核酸酶抗性核苷酸包含3'-5'硫代磷酸酯键、3'-5'磷代硼烷键、2'-5'磷酸二酯键、2' O-甲基部分、2'氟代部分、丙炔碱基类似物或其组合。
40.权利要求21至39的方法,其中所述标签序列长度为至少6个核苷酸。
41.人工寡核苷酸,其5'至3'包含:
任选地包含至少一个可消化残基的5'序列;
与衔接子引物序列具有同源性的嵌套序列;
任选的内部标签序列;和
包含与靶核酸互补的序列的3'序列。
42.人工寡核苷酸,其5'至3'包含:
任选地包含至少一个核酸酶抗性残基的5'序列;
与衔接子引物序列具有同源性的嵌套序列;
任选的内部标签序列;和
包含与靶核酸互补的序列的3'序列。
43.权利要求41或42的人工寡核苷酸,其中所述5'序列具有约5至约30个核苷酸的长度,所述嵌套序列具有约5至约25个核苷酸的长度,所述任选的内部标签序列具有约4至约20个核苷酸的长度,并且所述3'序列具有约5个核苷酸至约30个核苷酸的长度。
44.人工寡核苷酸,其5'至3'包含:
包含至少一个可消化残基的5'序列;
任选地与衔接子引物序列具有同源性的嵌套序列;
任选的内部标签序列;和
包含与靶核酸互补的序列的3'序列。
45.人工寡核苷酸,其5'至3'包含:
5'序列,包含核酸酶抗性核苷酸;
任选地与衔接子引物序列具有同源性的嵌套序列;
任选的内部标签序列;和
包含与靶核酸互补的序列的3'序列。
46.权利要求41或42的人工寡核苷酸,其中所述5'序列具有约5至约30个核苷酸的长度,所述任选的嵌套序列具有约5至约25个核苷酸的长度。
47.权利要求41或44的人工寡核苷酸,其中所述可消化残基是糖基化酶敏感的碱基。
48.权利要求47的人工寡核苷酸,其中所述至少一个糖基化酶敏感的碱基是尿嘧啶、羧基胞嘧啶、2,6-二氨基-4-羟基-5-甲酰胺基嘧啶(FapyG)、4,6-二氨基-5-甲酰胺基嘧啶(FapyA)、甲酰基尿嘧啶、羟基尿嘧啶、羟基胞嘧啶、羟甲基尿嘧啶、次黄嘌呤、3-甲基腺嘌呤、8-氧代鸟嘌呤、8-氧代腺嘌呤、胸腺嘧啶甘醇、尿素或黄嘌呤。
49.权利要求46的人工寡核苷酸,其中所述5'序列包含脱氧尿苷核苷酸。
50.权利要求44的人工寡核苷酸,其中所述5'序列包含核酸酶抗性核苷酸,包括3'-5'硫代磷酸酯键、3'-5'磷代硼烷键、2'-5'磷酸二酯键、2' O-甲基部分、2'氟代部分、丙炔碱基类似物或其组合。
51.权利要求44或45的人工寡核苷酸,其中所述5'序列具有约5至约30个核苷酸的长度,所述任选的嵌套序列具有约5至约25个核苷酸的长度。
52.多种人工寡核苷酸,其包含多种寡核苷酸,其中各自包含(5'至3') 包含任选地至少一个可消化或核酸酶抗性残基的5'序列;与衔接子引物序列具有同源性的嵌套序列,任选的内部标签序列,和包含与靶核酸同源的序列的3'序列。
53.权利要求52的多种人工寡核苷酸,其中多种合成引物的5'序列包含糖苷酶敏感或核酸酶抗性残基。
54.权利要求52或53的多种人工寡核苷酸,其中3'末端靶向两个或更多个模板序列。
55.用于扩增DNA或RNA的试剂盒,所述试剂盒包含:
多种合成引物,其中每种第一合成引物包含任选地具有至少一个可消化或核酸酶抗性残基的5'序列,与衔接子引物序列具有同源性的嵌套序列,任选的内部标签序列,以及靶向模板的3'序列;
和至少一种扩增引物,其包含含有至少一个可消化或核酸酶抗性残基的合成引物的5'序列和任选地与衔接子引物序列具有同源性的嵌套序列。
56.权利要求55的试剂盒,其进一步包含逆转录酶、链置换DNA聚合酶、单链特异性脱氧核糖核酸酶、热稳定DNA聚合酶、尿苷DNA糖基化酶和/或5'-3'外切核酸酶。
57.用于定向扩增RNA的试剂盒,所述试剂盒包含:
多种第一合成引物,其中每种第一合成引物包含任选地具有至少一个可消化或核酸酶抗性残基的5'序列,与衔接子引物序列具有同源性的嵌套序列,任选的内部标签序列,以及靶向模板的3'序列;
多种第二合成引物,其中每种第二合成引物包含任选地具有至少一个可消化或核酸酶抗性残基的5'序列,与衔接子引物序列具有同源性的嵌套序列,任选的内部标签序列,以及靶向模板的3'序列;
和至少一种扩增引物,其包含含有至少一个可消化或核酸酶抗性残基的合成引物的5'序列和任选地与衔接子引物序列具有同源性的嵌套序列。
58.用于定向扩增RNA的试剂盒,所述试剂盒包含:
多种第一合成引物,其中每种第一合成引物包含具有至少一个可消化残基的5'序列,与衔接子引物序列具有同源性的嵌套序列,任选的包含第一标签序列的内部标签序列,以及靶向模板的3'序列;多种第二合成引物,其中每种第二合成引物包含含有非互补核苷酸和至少一个脱氧尿苷残基的5'序列,与衔接子序列具有互补性的嵌套序列,任选的包含第二标签序列的内部标签序列,以及随机或半随机3'序列,条件是多种第一和第二合成引物中的一者或两者包含第一和/或第二标签序列;
和至少一种扩增引物,其包含第一和第二合成引物的5'序列。
59.权利要求57或58的试剂盒,其进一步包含逆转录酶、非链置换DNA聚合酶、3'-5'脱氧核糖核酸酶、热稳定DNA聚合酶、尿苷DNA糖基化酶或5'-3'外切核酸酶和/或放线菌素D。
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