KR101587664B1 - 축퇴 올리고뉴클레오티드 및 이의 용도 - Google Patents

축퇴 올리고뉴클레오티드 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101587664B1
KR101587664B1 KR1020107008170A KR20107008170A KR101587664B1 KR 101587664 B1 KR101587664 B1 KR 101587664B1 KR 1020107008170 A KR1020107008170 A KR 1020107008170A KR 20107008170 A KR20107008170 A KR 20107008170A KR 101587664 B1 KR101587664 B1 KR 101587664B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
group
primer
nucleotides
oligonucleotide
dna polymerase
Prior art date
Application number
KR1020107008170A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20100074188A (ko
Inventor
브라이언 워드
케네쓰 이. 휴에르만
Original Assignee
시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 filed Critical 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨
Publication of KR20100074188A publication Critical patent/KR20100074188A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101587664B1 publication Critical patent/KR101587664B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/179—Modifications characterised by incorporating arbitrary or random nucleotide sequences

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

본 발명에서는 준무작위(semi-random) 서열을 포함하는 복수의 올리고뉴클레오티드, 여기서 준무작위 서열은 실질적으로 비-상보적인 축퇴 뉴클레오티드이다. 표적 핵산 집단을 증폭시키기 위하여 복수의 올리고뉴클레오티드를 이용하는 방법도 제공된다.

Description

축퇴 올리고뉴클레오티드 및 이의 용도{DEGENERATE OLIGONUCLEOTIDES AND THEIR USES}
본 발명은 준무작위 서열(semi-random sequence)을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 특히, 준무작위 서열은 실질적으로 비-상보적인(non-complementary) 축퇴(degenerate) 뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 축퇴 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 군(population)을 증폭시키는데 이용될 수 있다.
많은 연구 및 진단 분야에서, 실행될 수 있는 분석 형태는 이용가능한 핵산의 양에 의해 제한된다. 이와 같은 이유로 소량의 핵산을 증폭시키기 위해 다양한 기술들이 개발되어왔다. 이 가운데, 전체게놈증폭(whole genome amplification: WTA)와 전체 트란스크립톰 증폭(whole transcriptome amplification; WTA) 과정이 있는데, 이들은 전체 출발 게놈 또는 트란스크립톰의 비편파적인(unbiased) 연출을 제공하도록 디자인된 비-특이적 증폭 기술이다.
이들 많은 증폭 기술들은 축퇴 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하는데, 이때 각 올리고뉴클레오티드는 무작위서열 (가령, 각 뉴클레오티드는 임의의 뉴클레오티드이거나) 또는 비-상보적인 가변 서열 (가령, 각 뉴클레오티드는 두 개의 비-상보적인 뉴클레오티드이거나)을 포함한다. 무작위 프라이머는 상보적으로 과도한 프라이머-이량체 형성을 초래하지만, 서열 복합도(complexity)가 감소된 비-상보적인 가변 프라이머를 이용한 증폭은 출발 핵산 집단의 불완전한 적용(coverage)를 특징으로 한다.
따라서, 높은 서열 다양성을 가지면서도 실질적으로 비-상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머가 필요하다. 이와 같은 프라이머는 표적 핵산을 통하여 최대 수의 서열에 하이브리드될 수 있으며, 다른 프라이머와 교차-하이브리드 또는 자가-하이브리드 되는 경향을 최소화시킬 것이다. 이와 같은 프라이머는 WGA 또는 WTA 기술에 상당히 유용할 것이다.
발명의 요약
본 발명의 한 측면에는 복수의 올리고뉴클레오티드가 포함되는데, 이때 각 올리고뉴클레오티드는 화학식 NmXpZq을 포함하며, 여기서 N, X, 그리고 Z는 축퇴 뉴클레오티드이며; 그리고 m, p, 그리고 q 는 정수이다. 특히, m은 0이거나 2 내지 20이며, 그리고 p와 q는 0 내지 20이나; 단 조건은 두 개 정수가 0이 아니거나 m과 q 모두 0인 조건과, N을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 최소 두 개 N 잔기를 가지며, 이때, 두 개 N 잔기를 분리시키기 위해 최소 하나의 X 또는 Z 잔기를 가지는 조건이 더 포함된다. N은 4-배 축퇴 뉴클레오티드이고, 가령, N은 아데노신(A), 또는 시티딘(C), 또는 구아노신(G), 또는 티미딘/우리딘 (T/U)이 될 수 있다. X는 B, D, H, 그리고 V로 구성된 군에서 선택된 3-배 축퇴 뉴클레오티드이고, 여기서 B는 C, G, 또는 T/U일 수 있고; D는 A, G, 또는 T/U일 수 있으며; H는 A, C, 또는 T/U일 수 있고, 그리고 V는 A, C, 또는 G일 수 있다. Z는 K, M, R, 그리고 Y로 구성된 군에서 선택되는 2-배 축퇴 뉴클레오티드이며, 여기서 K는 G 또는 T/U일 수 있고; M는 A 또는 C일 수 있고; R는 A 또는 G일 수 있고; 그리고 Y는 C 또는 T/U일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 표적 핵산 집단을 증폭시키는 방법을 제공하는 것이다. 이 방법은 복수의 핵산-프라이머 이중나선이 형성되도록 표적 핵산 집단을 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머에 접촉시키는 것을 포함한다. 각 올리고뉴클레오티드 프라이머는 화학식 NmXpZq을 포함하는데 여기서 N, X, 그리고 Z는 상기에서 정의된 바와 같이 축퇴 뉴클레오티드이며, 그리고 m, p, 그리고 q 는 정수이다. 특히, m은 0이거나 2 내지 20이며, 그리고 p와 q는 0 내지 20이나, 단 조건은 두 개 정수가 0이 아닌 조건과, 그리고 N을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 최소 두 개 N 잔기를 가지며, 이때, 두 개 N 잔기를 분리시키기 위해 최소 하나의 X 또는 Z 잔기를 가지는 추가 조건이 포함된다. 이 방법에는 복제된 가닥의 라이브러리를 만들기 위하여 복수의 핵산-프라이머 이중나선을 복제시키는 것이 더 포함된다. 또한, 라이브러리에서 복제된 가닥의 양은 출발 표적 핵산의 양을 초과하고, 이는 표적 핵산 집단의 증폭을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 측면은 표적 핵산 집단을 증폭시키는 키트를 제공하는 것이다. 키트는 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 복제 효소를 포함한다. 각 올리고뉴클레오티드 프라이머는 화학식 NmXpZq을 포함하는데 여기서 N, X, 그리고 Z는 상기에서 정의된 바와 같이 축퇴 뉴클레오티드이며, 그리고 m, p, 그리고 q 는 정수이다. 특히, m은 0이거나 2 내지 20이며, 그리고 p와 q는 0 내지 20이나, 단 조건은 두 개 정수가 0이 아닌 것과, 그리고 N을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 최소 두 개 N 잔기를 가지며, 두 개 N 잔기를 분리시키기 위해 최소 하나의 X 또는 Z 잔기를 가지는 추가 조건이 포함된다.
본 발명의 다른 측면 및 특징들은 여기에서 더 상세하게 설명된다.
도면 1은 증폭된 cDNA와 증폭안된 cDNA의 실시간 정량적 PCR을 설명한다. 증폭안된 cDNA (밝은 회색 막대), D-증폭된 cDNA (짙은 회색 막대), 그리고 K-증폭된 cDNA (흰 막대)에 대해 각 프라이머의 deltaC(t) 값이 플롯되어 있다.
도면 2는 증폭된 cDNA와 증폭안된 cDNA의 마이크로어레이 분석을 설명한다. 증폭안된 cDNA 표적의 Log2 비율에 대하여 증폭된 cDNA 표적의 Log2 비율이 플롯되어 있다. (A)는 D-증폭된 cDNA를 나타내고, (B)는 K-증폭된 cDNA를 나타낸다.
도면 3은 적절하게 중단된 N 라이브러리 합성 프라이머 또는 대조군 프라이머 (1K9 및 1D9)와 NaOH-분해된 RNA로부터 증폭된 WTA 산물의 아가로즈 겔 영상을 나타낸다. 각 겔상에 로딩된 분자량 표준(bp)은 좌측에 표시되고, NaOH에 RNA 노출 시간(분)은 우측에 표시된다.
도면 4는 적절하게 중단된 N 라이브러리 합성 프라이머 또는 대조군 프라이머 (1K9 및 1D9)로 증폭된 WTA의 아가로즈 겔 영상을 나타낸다. 라이브러리 합성은RNA의 존(+)/부(-)하에, 그리고 MMLV 역전사효소 (M) 또는 MMLV 역전사효소, Klenow exominus DNA 중합효소 (MK)와 함께 실시된다. 라이브러리 증폭은 JUMPSTART™ Taq DNA 중합효소 (JST) 또는 KLENTAQ™ DNA 중합효소 (KT)로 촉매된다. 각 겔상에 로딩된 분자량 표준(bp)은 좌측에 표시되고, 상이한 반응 조건들은 우측에 표시된다.
도면 5는 가장 적절하게 중단된 5가지의 N 라이브러리 합성 프라이머, 바람직한 프라이머 또는 대조군 프라이머의 복합으로 증폭된 WTA 산물의 아가로즈 겔 영상을 나타낸다. 라이브러리 합성은 각 프라이머 또는 프라이머 세트의 다양한 조건으로 실시되었다. 영상의 상단에 삼각형으로 프라이머 농도 (좌에서 우측 방향으로 10, 2, 0.4, 또는 0.08 μM)가 나타나있다. 주어진 세트내 프라이머는 영상의 우측에 나열되어 있다.
4-배 축퇴 뉴클레오티드, 3-배 축퇴 뉴클레오티드, 및/또는 2-배 축퇴 뉴클레오티드의 혼합물을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 표적 분자의 대표적 증폭을 위한 적절한 서열 다양성을 보유하면서도 분자내(intramolecular) 및/또는 분자간(intermolecular) 상호작용은 감소된 것으로 발견되었다. 준무작위 부위를 포함하는 이들 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산을 통하여 많은 서열에 하이브리드될 수 있고, 표적 핵산의 복제 및 증폭을 위한 많은 프라이밍 부위를 제공한다. 그러나, 동시에 이들 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 프라이머 2차 구조를 형성하기 위한 자가-하이브리드를 하지 않으며, 프라이머-이량체 쌍을 형성하기 위한 교차-하이브리드도 하지 않는다.
(I) 복수의 올리고뉴클레오티드
본 발명의 한 측면은 준무작위 서열을 포함하는 복수의 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 올리고뉴클레오티드의 준무작위 서열은 실질적으로 비-상보적인 뉴클레오티드를 포함하여, 복수의 올리고뉴클레오티드의 분자내(intramolecular) 및/또는 분자간(intermolecular) 상호작용을 감소시킨다. 그러나, 올리고뉴클레오티드의 준무작위 서열은 표적 핵산 집단내 포함된 최대 수의 서열에 하이브리드를 허용하는 실질적인 서열 다양성을 제공한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 비-무작위서열을 더 포함한다.
(a) 준무작위 서열
복수의 올리고뉴클레오티드의 준무작위 서열은 축퇴 뉴클레오티드를 포함한다 (표 1). 축퇴 뉴클레오티드는 2-배 축퇴 (가령, 두 개 뉴클레오티드중에 하나이거나), 3-배 축퇴 (가령, 세 개 뉴클레오티드중에 하나이거나), 또는 4-배 축퇴 (가령, 네 개 뉴클레오티드중에 하나이거나)를 가질 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 축퇴이기 때문에, 유사한 올리고뉴클레오티드 혼합물이지만 동일한 올리고뉴클레오티드는 아니다. 올리고뉴클레오티드의 전체 축퇴는 다음과 같이 계산될 수 있다:
축퇴 = 2a x 3b x 4C
이때 "a"는 2-배 축퇴 뉴클레오티드 총 갯수 (상기 Z의 정의된 바와 같음)이고, "b"는 3-배 축퇴 뉴클레오티드의 총 갯수 (상기 X의 정의와 같음)이고, 그리고 "c"는 4-배 뉴클레오티드의 총 갯수 (상기 N의 정의와 같음)이다.
축퇴 뉴클레오티드는 상보적인, 비- 상보적인, 또는 부분적으로 비-상보적일 수 있다(표 1 참고). 두 뉴클레오티드간에 상보성은 특정 수소 결합을 통하여 Watson-Crick 염기쌍을 형성하는 능력을 지칭한다. (예를 들면, A 와 T는 두 개 수소 결합을 통하여 염기쌍을 이루고; 그리고 C와 G는 세 개 수소 결합을 통하여 염기쌍을 이룬다).
축퇴 뉴클레오티드.
심볼 심볼의 원천 의미* 상보성
K 케토의 k C 또는 T/U 비-상보적
M 아미노의 m A 또는 C 비-상보적
R 퓨린의 r A 또는 G 비-상보적
Y 피리미딘의 y C 또는 T/U 비-상보적
S 강한 상호작용의 s C 또는 G 상보적
W 약한 상호작용의 w A 또는 T/U 상보적
B A가 아닌 C 또는 G 또는 T/U 부분적 비-상보적
D C가 아닌 A 또는 G 또는 T/U 부분적 비-상보적
H G가 아닌 A 또는 C 또는 T/U 부분적 비-상보적
V T/U가 아닌 A 또는 C 또는 G 부분적 비-상보적
N 임의(any)의 n A 또는 C 또는 G 또는 T/U 상보적
.
* A = 아데노신, C = 시티딘, G = 구아노신, T = 티미딘, U = 우리딘
여기에서 사용된 것과 같이, "올리고뉴클레오티드"는 두 개 또는 그이상의 뉴클레오티드를 포함하는 분자를 지칭한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드가 될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 4개의 표준 뉴클레오티드 (가령, A, C, G, 그리고 T/U), 뿐만 아니라 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 유사체는 변형된 퓨린 또는 피리미딘 염기 및/또는 변형된 리보스 모이어티를 가지는 뉴클레오티드를 지칭한다. 뉴클레오티드 유사체는 자연 발생적 뉴클레오티드 (예를 들면, 이노신) 또는 비-자연발생적 뉴클레오티드가 될 수 있다. 뉴클레오티드의 당(sugar) 또는 염기 모이어티상에 비-제한적인 변형으로는 아세틸 기(group), 아미노 기, 카르복실 기, 카르복시메틸 기, 하이드록실 기, 메틸 기, 포스포릴 기, 그리고 티올 기의 삽입(또는 제거)이 포함되고 뿐만 아니라, 염기의 탄소 및 질소 원자가 다른 원자(예를 들면, 7-데아자 퓨린)으로의 치환도 포함된다. 뉴클레오티드 유사체에는 디데옥시 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 잠금(locked) 핵산 (LNA), 펩티드 핵산 (PNA), 그리고 몰폴리노스도 포함된다. 올리고뉴클레오티드의 골격은 포스포디에스테르 링키지 뿐만 아니라, 포스포티오에이트, 포스포라미디트, 또는 포스포로디아미디트 링키지를 포함할 수 있다.
본 발명의 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 NmXpZq를 가지며, 여기서: N은 아데노신(A), 시티딘(C), 구아노신(G), 그리고 티미딘/우리딘(T/U)로 구성된 군에서 선택된 4-배 축퇴 뉴클레오티드이며;
X는 B, D, H, 그리고 V로 구성된 군에서 선택된 3-배 축퇴 뉴클레오티드이며, 여기서 B는 C, G, 그리고 T/U로 구성된 군에서 선택되고; D는 A, G, 그리고 T/U로 구성된 군에서 선택되고; H는 A, C, 그리고 T/U로 구성된 군에서 선택되고; 그리고 V는 A, C, 그리고 G로 구성된 군에서 선택되고;
Z는 K, M, R, 그리고 Y로 구성된 군에서 선택되는 2-배 축퇴 뉴클레오티드, 여기서 K는 G 및 T/U로 구성된 군에서 선택되고; M은 A 및 C로 구성된 군에서 선택되고; R는 A 및 G로 구성된 군에서 선택되고; 그리고 Y는 C 및 T/U로 구성된 군에서 선택되고; 그리고 m, p와 q는 정수이고, m은 0이거나 2 내지 20이며, 그리고 p와 q는 0 내지 20이나, 단, 조건은 두 개 정수가 0이 아니거나 m과 q 모두 0이 되는 조건과, N을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 최소 두 개 N 잔기를 가지며, 이때, 두 개 N 잔기를 분리시키기 위해 최소 하나의 X 또는 Z 잔기를 가지는 조건이포함된다.
복수의 올리고뉴클레오티드는 상보적인 4-배 축퇴 뉴클레오티드 및/또는 부분적 비-상보적인 3-배 축퇴 뉴클레오티드 및/또는 비-상보적인 2-배 축퇴 뉴클레오티드를 포함한다. 더욱, N 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드에서, 최소 두 개 N 잔기는 최소한 하나의 X 또는 Z 잔기에 의해 분리된다. 따라서, 부분적 비-상보적인 3-배 축퇴 뉴클레오티드 및/또는 비-상보적인 2-배 축퇴 뉴클레오티드는 상보적인 N 잔기를 방해한다. 따라서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 비-상보적이다.
일부 구체예에서, 화학식 NmXpZq의 두 개 정수가 0이 아닌 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 N2 -20X1 -20Z1 -20(또는 NXZ), 화학식 N0X1 -20Z1 -20 (또는 XZ), 화학식 N2 -20X0Z1 -20 (또는 NZ), 또는 화학식 N2 -20X1 -20Z0 (또는 NX) (특정 화학식의 경우 표 2 참고)를 포함할 수 있다. 따라서, 화학식 NXZ를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 길이가 대략 4개 뉴클레오티드 내지 대략 60개가 된다. 좀더 특별하게는 화학식 NXZ을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 길이가 대략 48개 뉴클레오티드 내지 대략 60개, 대략 36개 뉴클레오티드 내지 대략 48개, 대략 24개 뉴클레오티드 내지 대략 36개, 대략 14개 뉴클레오티드 내지 대략 24개, 또는 대략 4개 뉴클레오티드 내지 대략 14개가 된다. 화학식 XZ를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 길이가 대략 2개 뉴클레오티드 내지 대략 40개가 된다. 좀더 특별하게는 이 화학식을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 길이가 대략 24개 뉴클레오티드 내지 대략 40개, 대략 14개 뉴클레오티드 내지 대략 24개, 또는 대략 2개 뉴클레오티드 내지 대략 14개 뉴클레오티드가 된다. 마지막으로, 화학식 NZ 또는 화학식 NX을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 길이가 대략 3개 뉴클레오티드 내지 대략 40개 뉴클레오티드가 된다. 좀더 특별하게는, 이와 같은 화학식을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 길이가 대략 24개 뉴클레오티드 내지 대략 40개 뉴클레오티드, 대략 14개 뉴클레오티드 내지 대략 24개 뉴클레오티드, 또는 대략 3개 뉴클레오티드 내지 대략 14개 뉴클레오티드가 된다.
Figure 112010023892278-pct00001
또 다른 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 NmXp를 포함하는데, 여기서 N과 X는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, m은 2 내지 13의 범위가 되며, p는 1 내지 12의 범위가 되며, m과 p의 합은 14이며, 최소 두 개 N 잔기는 최소한 하나의 X 잔기에 의해 분리되어 있다. 또 다른 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 NmXp를 포함하는데, 여기서 N과 X는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, m은 2 내지 12의 범위가 되며, p는 1 내지 11의 범위가 되며, m과 p의 합은 13이며, 최소 두 개 N 잔기는 최소한 하나의 X 잔기에 의해 분리되어 있다. 또 다른 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 NmXp를 포함하는데, 여기서 N과 X는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, m은 2 내지 11의 범위가 되며, p는 1 내지 10의 범위가 되며, m과 p의 합은 12이며, 최소 두 개 N 잔기는 최소한 하나의 X 잔기에 의해 분리되어 있다. 또 다른 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 NmXp를 포함하는데, 여기서 N과 X는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, m은 2 내지 10의 범위가 되며, p는 1 내지 9의 범위가 되며, m과 p의 합은 11이며, 최소 두 개 N 잔기는 최소한 하나의 X 잔기에 의해 분리되어 있다. 또 다른 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 NmXp를 포함하는데, 여기서 N과 X는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, m은 2 내지 9의 범위가 되며, p는 1 내지 8의 범위가 되며, m과 p의 합은 10이며, 최소 두 개 N 잔기는 최소한 하나의 X 잔기에 의해 분리되어 있다. 또 다른 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 NmXp를 포함하는데, 여기서 N과 X는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, m은 2 내지 7의 범위가 되며, p는 1 내지 6의 범위가 되며, m과 p의 합은 8이며, 최소 두 개 N 잔기는 최소한 하나의 X 잔기에 의해 분리되어 있다. 또 다른 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 NmXp를 포함하는데, 여기서 N과 X는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, m은 2 내지 6의 범위가 되며, p는 1 내지 5의 범위가 되며, m과 p의 합은 7이며, 최소 두 개 N 잔기는 최소한 하나의 X 잔기에 의해 분리되어 있다. 또 다른 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 NmXp를 포함하는데, 여기서 N과 X는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, m은 2 내지 5의 범위가 되며, p는 1 내지 4의 범위가 되며, m과 p의 합은 6이며, 최소 두 개 N 잔기는 최소한 하나의 X 잔기에 의해 분리되어 있다. 또 다른 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 NmXp를 포함하는데, 여기서 N과 X는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, m은 2 내지 8의 범위가 되며, p는 1 내지 7의 범위가 되며, m과 p의 합은 9이며, 최소 두 개 N 잔기는 최소한 하나의 X 잔기에 의해 분리되어 있다. 표 3은 이와 같은 적절한 구체예의 (5'→ 3') 서열, 가령, 9개 뉴클레오티드의 긴 준무작위 부위를 나타낸다.
Figure 112010023892278-pct00002
Figure 112010023892278-pct00003

또 다른 대안 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 NmXp를 포함하는데, 여기서 N과 X는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, m은 2 내지 13의 범위가 되며, p는 1 내지 12의 범위가 되며, m과 p의 합은 6 내지 14의 범위가 되며, 최소 두 개 N 잔기는 최소한 하나의 X 잔기에 의해 분리되어 있고, 단지 세 개 연속(consecutive) N 잔기가 있다. 따라서, 이 구체예에서, 부분적으로 비-상보적인 3-배 축퇴 뉴클레오티드는 서열을 통하여 산재(interspersed)되어, 상보적인 4-배 축퇴 뉴클레오티드 (N)가 >4 되는 긴 것은 없다. 일반적으로, 이와 같은 디자인은 복수의 올리고뉴클레오티드 내에서 자가-하이브리드화 및/또는 교차-하이브리드 반응을 감소시킬 수 있다. 예시적 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 NmXp를 포함하는데, 여기서 N과 X는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, m은 2 내지 8의 범위가 되며, p는 1 내지 7의 범위가 되며, m과 p의 합은 9가 되며, 최소 두 개 N 잔기는 최소한 하나의 X 잔기에 의해 분리되어 있고, 단지 세 개 연속(consecutive) N 잔기가 있다. 표 4는 이와 같은 적절한 구체예의 (5'→ 3') 서열, 가령, 세 개 연속 N 잔기가 포함된 9개 뉴클레오티드의 긴 준무작위 부위를 나타낸다.
Figure 112010023892278-pct00004
Figure 112010023892278-pct00005

또 다른 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 NmZq 포함하는데, 여기서 N과 Z는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, m은 2 내지 13의 범위가 되며, q는 1 내지 12의 범위가 되며, m과 q의 합은 14가 되며, 최소 두 개 N 잔기는 최소한 하나의 Z 잔기에 의해 분리되어 있다. 또 다른 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 NmZq 포함하는데, 여기서 N과 Z는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, m은 2 내지 12의 범위가 되며, q는 1 내지 11의 범위가 되며, m과 q의 합은 13이 되며, 최소 두 개 N 잔기는 최소한 하나의 Z 잔기에 의해 분리되어 있다. 또 다른 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 NmZq 포함하는데, 여기서 N과 Z는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, m은 2 내지 11의 범위가 되며, q는 1 내지 10의 범위가 되며, m과 q의 합은 12가 되며, 최소 두 개 N 잔기는 최소한 하나의 Z 잔기에 의해 분리되어 있다. 또 다른 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 NmZq 포함하는데, 여기서 N과 Z는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, m은 2 내지 10의 범위가 되며, q는 1 내지 9의 범위가 되며, m과 q의 합은 11이 되며, 최소 두 개 N 잔기는 최소한 하나의 Z 잔기에 의해 분리되어 있다. 또 다른 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 NmZq 포함하는데, 여기서 N과 Z는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, m은 2 내지 9의 범위가 되며, q는 1 내지 8의 범위가 되며, m과 q의 합은 10이 되며, 최소 두 개 N 잔기는 최소한 하나의 Z 잔기에 의해 분리되어 있다. 또 다른 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 NmZq 포함하는데, 여기서 N과 Z는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, m은 2 내지 7의 범위가 되며, q는 1 내지 6의 범위가 되며, m과 q의 합은 8이 되며, 최소 두 개 N 잔기는 최소한 하나의 Z 잔기에 의해 분리되어 있다. 또 다른 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 NmZq 포함하는데, 여기서 N과 Z는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, m은 2 내지 6의 범위가 되며, q는 1 내지 5의 범위가 되며, m과 q의 합은 7이 되며, 최소 두 개 N 잔기는 최소한 하나의 Z 잔기에 의해 분리되어 있다. 또 다른 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 NmZq 포함하는데, 여기서 N과 Z는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, m은 2 내지 5의 범위가 되며, q는 1 내지 4의 범위가 되며, m과 q의 합은 6이 되며, 최소 두 개 N 잔기는 최소한 하나의 Z 잔기에 의해 분리되어 있다. 또 다른 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 NmZq 포함하는데, 여기서 N과 Z는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, m은 2 내지 8의 범위가 되며, q는 1 내지 7의 범위가 되며, m과 q의 합은 9가 되며, 최소 두 개 N 잔기는 최소한 하나의 Z 잔기에 의해 분리되어 있다. 표 5는 이와 같은 적절한 구체예의 (5'→ 3') 서열, 가령, 9개 뉴클레오티드의 긴 준무작위 부위를 나타낸다.
Figure 112010023892278-pct00006
Figure 112010023892278-pct00007
Figure 112010023892278-pct00008
또 다른 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 NmZq 포함하는데, 여기서 N과 Z는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, m은 2 내지 13의 범위가 되며, q는 1 내지 12의 범위가 되며, m과 q의 합은 6 내지 14의 범위가 되며, 최소 두 개 N 잔기는 최소한 하나의 Z 잔기에 의해 분리되어 있고, 3개 연속 N 잔기가 있다. 이 구체예에서, 비-상보적 2배 축퇴 뉴클레오티드가 서열에 산재되어,상보적인 4-배 축퇴 뉴클레오티드 (N)의 긴 연장(≥4)이 없다. 일반적으로 이와 같은 디자인은 복수의 올리고뉴클레오티드내에 자가-하이브리드화 및/또는 교차-하이브리드화를 감소시킬 수 있다. 예시적인 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 NmZq 포함하는데, 여기서 N과 Z는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, m은 2 내지 8의 범위가 되며, q는 1 내지 7의 범위가 되며, m과 q의 합은 9 가 되며, 최소 두 개 N 잔기는 최소한 하나의 Z 잔기에 의해 분리되어 있고, 3개 연속 N 잔기가 있다. 표 6은 이와 같은 적절한 구체예의 (5'→ 3') 서열, 가령, 세 개 연속 N 잔기가 포함된 9개 뉴클레오티드의 긴 준무작위 부위를 나타낸다.
Figure 112010023892278-pct00009
Figure 112010023892278-pct00010

또 다른 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 XpZq 포함하는데, 여기서 X과 Z는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, p와 q는 1 내지 13의 범위가 되며, p과 q의 합은 14가 된다. 또 다른 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 XpZq 포함하는데, 여기서 X과 Z는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, p와 q는 1 내지 12의 범위가 되며, p과 q의 합은 13이 된다. 또 다른 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 XpZq 포함하는데, 여기서 X과 Z는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, p와 q는 1 내지 11의 범위가 되며, p과 q의 합은 12가 된다. 또 다른 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 XpZq 포함하는데, 여기서 X과 Z는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, p와 q는 1 내지 10의 범위가 되며, p과 q의 합은 11이 된다. 또 다른 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 XpZq 포함하는데, 여기서 X과 Z는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, p와 q는 1 내지 9의 범위가 되며, p과 q의 합은 10이 된다. 또 다른 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 XpZq 포함하는데, 여기서 X과 Z는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, p와 q는 1 내지 8의 범위가 되며, p과 q의 합은 9가 된다. 또 다른 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 XpZq 포함하는데, 여기서 X과 Z는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, p와 q는 1 내지 7의 범위가 되며, p과 q의 합은 8이 된다. 또 다른 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 XpZq 포함하는데, 여기서 X과 Z는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, p와 q는 1 내지 6의 범위가 되며, p과 q의 합은 7이 된다. 또 다른 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 XpZq 포함하는데, 여기서 X과 Z는 상기에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드이며, p와 q는 1 내지 5의 범위가 되며, p과 q의 합은 6이 된다.
m과 q가 모두 0인 다른 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 화학식 Xp의 화학식을 포함하고, 여기서 X는 3-배 축퇴 뉴클레오티드이며, p는 2 내지 20 범위의 정수가 된다. 따라서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 다음의 화학식을 포함할 수 있다: B2-20, D2 -20, H2 -20, 또는 V2 -20. 이와 같은 화학식을 가지는 복수의 올리고뉴클레오티드는 대략 2 개 뉴클레오티드 내지 대략 8개 뉴클레오티드 길이, 대략 8개 뉴클레오티드 내지 대략 14 개 뉴클레오티드 길이, 또는 대략 14개 뉴클레오티드 내지 대략 20개 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 적절한 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드는 대략 9개 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다.
(b) 선택적 비-무작위서열
상기에서 설명된 올리고뉴클레오티드는 표준 (비-축퇴) 뉴클레오티드를 포함하는 비-무작위서열을 더 포함할 수 있다. 비-무작위서열은 각 올리고뉴클레오티드의 5' 단부에 위치한다. 일반적으로, 비-축퇴 뉴클레오티드의 서열은 복수의 올리고뉴클레오티드중에서 불변(constant)이다. 불변 비-축퇴 서열은 일반적으로 보편적인 프라이밍 부위(universal priming site)와 같은 공지 서열을 포함한다. 적절한 보편적 프라이밍 부위의 비-제한적 예로는 T7 프로모터 서열, T3 프로모터 서열, SP6 프로모터 서열, M13 포워드(forward) 서열, 또는 M13 리버스(reverse) 서열이 포함된다. 대안으로, 불변 비-축퇴 서열은 증폭된 핵산내 존재하지 않는 임의의 인공 서열을 기본적으로 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 불변 비-축퇴 서열는 서열 5'-GTAGGTTGAGGATAGGAGGGTTAGG-3' (SEQ ID NO:3)을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 불변 비-축퇴 서열은 서열 5'-GTGGTGTGTTGGGTGTGTTTGG-3' (SEQ ID NO:28)를 포함할 수 있다.
불변 비-축퇴 서열은 길이가 대략 6개 뉴클레오티드 내지 대략 100개 뉴클레오티드가 된다. 한 구체예에서, 불변, 비-축퇴 서열은 길이가 대략 10개 뉴클레오티드 내지 대략 40개 뉴클레오티드가 된다. 또다른 구체예에서, 불변, 비-축퇴 서열은 길이가 대략 14개 뉴클레오티드 내지 대략 30개 뉴클레오티드가 된다. 또다른 구체예에서, 불변, 비-축퇴 서열은 길이가 대략 18개 뉴클레오티드 내지 대략 26개 뉴클레오티드가 된다. 또다른 구체예에서, 불변, 비-축퇴 서열의 길이는 대략 22개 뉴클레오티드 내지 대략 25개 뉴클레오티드가 된다.
일부 구체예에서, 복수의 각 올리고뉴클레오티드의 불변 비-축퇴 서열의 5' 말단에 추가적인 뉴클레오티드가 추가될 수 있다. 예를 들면, 뉴클레오티드가 추가되어 복수의 올리고뉴클레오티드의 용융 온도를 높일 수 있다. 추가적인 뉴클레오티드는 G 잔기, C 잔기, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 추가되는 뉴클레오티드의 수는 대략 1개 뉴클레오티드 내지 대략 10개 뉴클레오티드, 바람직하게는 대략 3개 뉴클레오티드 내지 대략 6개 뉴클레오티드, 그리고 더욱 바람직하게는 대략 4개 뉴클레오티드의 범위가 된다.
( II ) 표적 핵산 집단의 증폭 방법
본 발명의 또 다른 측면은 증폭가능한 분자의 라이브러리를 만들고, 표적 핵산 집단을 증폭시키는 방법을 제공하며, 이후 추가 증폭될 수도 있다. 표적 핵산에 복수의 복제 개시 부위를 제공하기 위하여 본 발명의 복수의 축퇴 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 증폭가능한 분자의 라이브러리는 서열 독립적 방식으로 만들어진다. 축퇴 올리고뉴클레오티드 프라이머의 준-무작위 서열은 서열 다양성은 제공하면서 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머들의 분자간 그리고 분자내 상호작용을 최소화시켜, 전체 표적 핵산의 복제가 실행된다. 따라서, 표적 핵산은 주어진 임의의 서열을 손상시키지 않고, 심각한 편향(가령, 3' 말단 편향) 없이 증폭될 수 있다. 증폭된 표적 핵산은 전체 게놈 또는 전체 트란스크립톰(transchptome)이 될 수도 있다.
(a) 라이브러리 생성
표적 핵산 집단의 대표적 증폭가능한 분자의 라이브러리는 표적 핵산에 본 발명의 복수의 축퇴 올리고뉴클레오티드 프라이머를 접촉시켜 만들어질 수 있다. 축퇴 올리고뉴클레오티드 프라이머는 표적 핵산내에 다소 균등하게 분산된 무작위 부위에 하이브리드되어 표적 핵산의 복제를 위한 복수의 프라이밍 부위를 제공한다. 표적 핵산은 가닥-대체 활성을 가지는 효소에 의해 복제되어, 복제된 가닥이 복제되는 동안 치환되고, 추가 복제 라운드에서 주형으로 작용된다. 대안으로, 표적 핵산은 두단계 공정을 통하여 복제될 수 있는데, 우선, 역전사효소에 의해 제 1 가닥 cDNA가 합성되고, 가닥-치환 활성이 없는 효소에 의해 제 2 가닥 cDNA가 합성된다. 이들 방법으로 복제된 가닥의 양은 출발 표적 핵산의 양을 초과하게 되고, 이는 표적 핵산이 증폭되었음을 나타내는 것이다.
(i) 표적 핵산
표적 핵산 집단은 매우 다양할 수 있다. 한 구체예에서, 표적 핵산 집단은 게놈 DNA일 수 있다. 게놈 DNA는 진핵 세포, 세균성(eubacterial) 세포, 고세균(archaeal) 세포 또는 바이러스의 핵 또는 기관 (예를 들면, 미토콘드리온, 엽록체 또는 운동핵(kinetoplast))에서 자연 발생되는 하나 또는 그 이상의 염색체 DNA 분자를 지칭한다. 이들 분자는 DNA로 전사되는 서열 뿐만 아니라 RNA로 전사되지 않는 서열도 포함한다. 이와 같이, 게놈 DNA는 유기체의 전체 게놈을 포함하거나 또는 게놈의 일부분, 가령, 단일 염색체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 표적 핵산 집단은 RNA 분자 집단이 될 수 있다. RNA 분자는 메신져 RNA 분자 또는 작은 RNA 분자가 될 수 있다. RNA 분자의 집단은 트란스크립톰을 포함할 수 있는데, 이는 하나의 세포 또는 세포 집단에서 발현되는 모든 RNA 분자 세트로 정의된다. RNA 분자 세트에는 메신져 RNA 및/또는 microRNA 및 기타 작은 RNA가 포함될 수 있다. 트란스크립톰 용어는 주어진 유기체의 전체 RNA 세트 또는 특정 세포 타입에 존재하는 특정 RNA 소집합 분자를 지칭할 수 있다.
표적 핵산 집단은 진핵 세포, 세균성(eubacterial) 세포, 고세균(archaeal) 세포 또는 바이러스로부터 유도될 수 있다. 적절한 진핵세포의 비-제한적 예로는 인간, 생쥐, 포유류, 척추동물, 무척추동물, 식물, 진균류, 효모, 그리고 원생동물문(protozoa)이 포함된다. 적절한 구체예에서, 핵산 집단은 인간으로부터 유도된다. 표적 핵산의 비-제한적 원천에는 게놈 DNA 준비물, 전체 RNA 준비물, poly(A)+ RNA 준비물, 폴리(A)+ RNA 준비물, 작은 RNA 준비물, 단일 세포, 세포 용해물, 배양된 세포, 조직 샘플, 고정된 조직, 냉동된 조직, 임베드된(embedded) 조직, 생검된(biopsied) 조직, 조직 스왑(swab), 또는 생물학적 유체등이 포함된다. 적절한 체액에는 전혈, 연막(buffy coats), 혈청, 타액, 뇌척수액, 늑막액, 림프액, 젖, 담액, 정액, 그리고 뇨가 포함되나 이에 국한되지는 않는다.
일부 구체예에서, 표적 핵산은 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머에 접촉되기 전에 무작위로 단편화될 수 있다. 기계적인 수단, 예를 들면, 좁은 모세관 또는 구멍을 통하여 통과시킴으로써 물리적으로 절단(shearing)되거나 핵산을 초음파파쇄시키거나, 및/또는 핵산을 분무하는 등의 방법으로 표적 핵산이 무작위로 단편화될 수 있다. 대안으로, 화학적 수단, 가령, 가수분해, 알칼리 가수분해, 포르말린 고정, 금속 복합물(예를 들면, 포르피린)에 의한 가수분해 및/또는 하이드록실 라디칼에 의한 가수분해 등에 의해 표적 핵산이 무작위로 단편화될 수 있다. 이온 강도가 낮은, 중성 pH의 용액에서 핵산을 가열시키는 것과 같은 열 수단에 의해 표적 핵산이 무작위로 단편화될 수 있다. 온도는 대략 90℃ 내지 대략 100℃, 그리고 적절하게는 대략 95℃ 범위가 될 수 있다. 이온 강도가 낮은 용액은 대략 10 mM 내지 대략 20 mM의 Tris-HCl 그리고 대략 0.1 mM 내지 대략 1 mM의 EDTA(pH는 대략 7.5 내지 대략 8.5임)을 포함할 수 있다. 가열 시간은 대략 1 분 내지 대략 10분 범위가 될 수 있다. 대안으로, 핵산은 DNase I 또는 RNase을 이용한 효소적 수단에 의한 부분적 절단으로 단편화될 수도 있다. 대안으로, 이가 양이온 존재하에 복수개의 테트라-뉴클레오티드 인지 서열(예를 들면, CviJI)을 인지하는 제한엔도뉴클라제로 절단시켜 DNA가 단편화될 수도 있다. 핵산을 단편화시키는데 이용되는 방법에 따라, 단편의 크기는 대략 100개 염기 쌍 내지 대략 5000개 염기 쌍, 또는 대략 50개 뉴클레오티드 내지 대략 2500개 뉴클레오티드 범위가 될 수 있다.
표적으로 이용가능한 핵산의 양은 핵산의 타입과 질에 따라 다양할 수 있다. 일반적으로, 표적 핵산의 양은 대략 0.1 picograms (pg) 내지 대략 1,000 nanograms (ng) 범위가 된다. 표적 핵산이 게놈 DNA인 구체예에서, 표적 DNA의 양은 박테리아의 게놈과 같은 단일 게놈의 경우 대략 1 ng 이 되며, 인간 게놈과 같은 복합 게놈의 경우, 대략 10 ng이 되고, 고정된 조직에서 추출된 부분적으로 분해된 DNA의 경우 대략 200 ng이 된다. 표적 핵산이 양질의 전체 RNA인 경우의 구체예에서, 표적 RNA의 양은 대략 0.1 pg 내지 대략 50 ng, 또는 더욱 바람직하게는 대략 10 pg 내지 대략 500 pg이 된다. 표적 핵산이 부분적으로 분해된 전체 RNA인 경우, 표적 RNA의 양은 대략 25 ng 내지 대략 1,000 ng이 된다. 표적 핵산이 단일 세포의 RNA인 구체예인 경우, 당업자는 세포내 RNA의 양은 상이한 세포 타입에서 다양할 것이라는 것을 인지할 것이다.
( ii ) 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머
표적 핵산에 접촉되는 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 상기 단락(1)(a)에서 설명된 것과 같다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 완전한 축퇴 뉴클레오티드(가령, 4-배) 및 부분적 축퇴(가령, 3-배 및/또는 2-배) 뉴클레오티드 혼합물을 포함하는 준-무작위 부위를 포함한다. 부분적 축퇴 뉴클레오티드는 완전한 축퇴 뉴클레오티드 사이에 분산되어, 최소한 하나의 2-배 축퇴 뉴클레오티드 또는 3-배 축퇴 뉴클레오티드가 최소 두 개의 4-배 축퇴 뉴클레오티드를 분리시킨다. 비-상보적인 2-배 축퇴 뉴클레오티드 및/또는 부분적 비-상보적인 3-배 축퇴 뉴클레오티드가 존재함으로써 완전한 축퇴 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 높은 서열 다양성을 제공하면서도, 자가-하이브리드화 및/또는 교차-하이브리드 반응 능력은 감소된다 (그리고 프라이머-이량체의 형성이 감소된다).
바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법에 이용된 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 화학식 NmXp, NmZq, 또는 이들의 조합을 포함하는데, 여기서 N, X, 그리고 Z는 상기에서 정의된 바와 같은 축퇴 뉴클레오티드이며, m은 2 내지 13이며, p 와 q는 각각 1 내지 12가 되며, 그리고 이들 두 정수의 총합은 6 내지 14가 되며, 그리고 최소 두 개의 N 잔기는 최소한 하나의 X 또는 Z 잔기에 의해 분리된다. 또 다른 적절한 구체예에서, 본 발명의 방법에 이용된 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 화학식 NmXp, NmZq, 또는 이들의 조합을 포함하는데, 여기서 N, X, 그리고 Z는 상기에서 정의된 바와 같은 축퇴 뉴클레오티드이며, m은 2 내지 8의 정수이며, p 와 q는 각각 1 내지 7이 되며, 그리고 이들 두 정수의 총합은 9가 되며, 그리고 최소 두 개의 N 잔기는 최소한 하나의 X 또는 Z 잔기에 의해 분리되고, 그리고 3개의 연속 N 잔기가 있다(표 4와 6 참고). 적절한 구체예에서, X는 D이고, Y는 K이다. 특별히 적절한 구체예에서, 본 발명의 방법에서 이용된 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 다음의 (5'-3') 서열을 가진다: KNNNKNKNK, NKNNKNNKK, 그리고 NNNKNKKNK. 바람직한 올리고뉴클레오티드 프라이머에는 상기(I)(b)에서 설명된 바와 같이, 각 올리고뉴클레오티드의 불변 비-축퇴 서열의 5' 말단에 불변 비-축퇴 서열이 더 포함될 수 있다.
표적 서열과 접촉되는 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 단일 서열을 가질 것이다. 예를 들면, 복수의 축퇴 올리고뉴클레오티드 프라이머의 (5'-3') 서열은 XNNNXNXNX가 될 수 있다. 이와 같은 올리고뉴클레오티드 프라이머의 축퇴는 상기에서 제시된 화학식(가령, 축퇴 = 82,944 = 34 x 45)으로 계산될 수 있다. 대안으로, 표적 핵산과 접촉되는 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 상이한 서열을 보유하는 축퇴 올리고뉴클레오티드 프라이머의 혼합물일 수 있다. 이와 같은 혼합물은 두 개의 축퇴 올리고뉴클레오티드 프라이머, 세 개의 축퇴 올리고뉴클레오티드 프라이머, 네 개의 축퇴 올리고뉴클레오티드 프라이머 등을 포함할 수 있다. 예를 들면, 혼합물은 다음의 (5'-3') 서열: XNNNXNXNX, NNNXNXXNX, XXXNNXXNX을 가지는 세 개의 축퇴 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함할 수 있다. 이와 같은 실시예에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머 혼합물의 축퇴는 212,544 [= (34 x 45) + (34 x 45) + (36 x 43)]이다. 이 혼합물은 3-배 축퇴 뉴클레오티드 및/또는 2-배 축퇴 뉴클레오티드 (가령, 화학식 NmXp 및/또는 NmZq)를 포함하는 축퇴 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 복수의 축퇴 올리고뉴클레오티드 프라이머에서 제시되는 다수의 서열 때문에, 올리고뉴클레오티드 프라이머의 부분 집합에는 일반적으로 표적 핵산 집단내에 분산된 많은 상보서열이 있을 것이다. 따라서, 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머의 부분 집합은 표적 집단과 하이브리드될 것이고, 따라서, 복수의 핵산-프라이머 이중나선이 형성되며, 핵산 복제를 위한 복수의 프라이밍 부위가 제공될 것이다.
일부 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머에 추가하여, 올리고 dT 또는 고정(anchor) 올리고 dT 프라이머가 표적 핵산 집단에 접촉될 수도 있다. 고정 올리고 dT 프라이머는 (5' → 3')데옥시티미딜산(dT)에 이어 두 개 추가 리보뉴클레오티드(V, N)(이때 V는 G, C, 또는 A이 되며, N은 G, C, A, 또는 U이 된다)를 포함할 수 있다. VN 리보뉴클레오티드 고정(anchor)으로 표적 메신져 RNA의 폴리(A) 꼬리의 5' 말단에만 프라이머가 하이브리드되어, 메신져 RNA가 cDNA로 역전사될 수 있다. 당업자는 올리고 dT 프라이머가 기타 뉴클레오티드 및/또는 다른 특징을 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
( iii ) 표적 핵산의 복제
프라임된 표적 핵산은 가닥-치환 활성을 가진 효소에 의해 복제될 수 있다. 적절한 가닥-치환 중합효소의 예로는 Exo-Minus Klenow DNA 중합효소 (가령, 5'→3' 및 3'→5' 엑소뉴클라제 활성이 모두 없는 DNA Pol I의 큰 단편), Exo-Minus T7 DNA 중합효소 (가령, SEQUENASE™ Version 2.0, USB Corp., Cleveland, OH), Phi29 DNA 중합효소, Bst DNA 중합효소, Bca 중합효소, Vent DNA 중합효소, 9°Nm DNA 중합효소, MMLV 역전사효소, AMV 역전사효소, HIV 역전사효소, 이의 변이체들 또는 이들의 복합물이 포함되나 이에 국한되지는 않는다. 한 구체예에서, 가닥-치환 중합효소는 Exo-Minus Klenow DNA 중합효소이다. 또 다른 구체예에서, 가닥-치환 중합효소는 MMLV 역전사효소가 될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 가닥-치환 중합효소는 MMLV 역전사효소와 Exo-Minus Klenow DNA 중합효소 모두를 포함할 수 있다.
대안으로, 프라임된 표적 핵산은 두 단계 공정을 통하여 복제될 수 있다. 즉, cDNA의 제 1 가닥이 역전사효소에 의해 합성될 수 있고, 그 다음 cDNA의 제 2 가닥이 Taq DNA 중합효소와 같은 가닥-치환 활성이 없는 효소에 의해 합성될 수 있다.
상보적인 서열 간에 하이브리드가 허용되고 뿐만 아니라 하이브리드된 프라이머의 연장도 허용되는 조건하에 가닥-치환 또는 복제 효소는 표적 핵산과 복수의 축퇴 올리고뉴클레오티드 프라이머와 함께 항온처리된다. 일반적으로 상보적인 서열 사이에 하이브리드를 허용하나 미스매취 서열(가령, 상보적이 없거나 제한된 서열)사이에 하이브리드 반응이 배제되도록 항온처리 조건이 선택된다. 프라이머 연장을 최적화시키고, 가닥-치환 활성을 촉진시키기 위해 항온처리 조건이 선택된다. 복제 동안 치환된 단일 가닥이 생성되어 올리고뉴클레오티드 프라이머 하이브리드와 프라이머 연장을 위한 새로운 주형이 된다. 따라서, 항온처리 조건에는 일반적으로, 최적 pH, 이온 강도, 그리고 Mg2 + 이온 농도를 가진 용액, 하이브리드 및 복제 모두 허용되는 온도에서 배양되는 것이 포함된다.
라이브러리 합성 완충액은 대략 6.5 내지 대략 9.5의 pH, 그리고 바람직하게는 pH 대략 7.5에서 작용하는 pH 수정 또는 완충제를 포함한다. 적절한 pH 수정제의 대표적 예로는 Tris 완충액, MOPS, HEPES, Bicine, Tricine, TES, 또는 PIPES이 포함된다. 라이브러리 합성 완충액은 NaCl(대략 1 mM 내지 대략 200 mM의 농도 범위에서)와 같은 단가 염을 포함할 수 있다. 라이브러리 합성 완충액내 MgCl2의 농도는 대략 5 mM 내지 대략 10 mM이다. 데옥시뉴클레오티드 삼인산염(가령, dNTP)의 필수 혼합물은 라이브러리 합성 완충액내 제공되거나, 또는 별도로 제공될 수 있다. 항온처리 온도는 사용되는 중합효소에 따라 대략 12℃ 내지 대략 70℃ 범위가 될 수 있다. 항온처리 기간은 대략 5분 내지 대략 4 시간 범위가 될 수 있다. 한 구체예에서, 항온처리는 단일 등온(isothermal) 단계, 예를 들면, 대략 30℃에서 대략 1시간을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 짧은 시간(예를 들면, 대략 1 - 2분) 동안 몇 가지의 온도 단계(예를 들면, 16℃, 24℃, 그리고 37℃)를 특정 횟수(예를 들면, 대략 15-20 회)로 반복하여 항온처리가 실시된다. 또 다른 구체예에서, 항온처리는 약 10 내지 30분간 지속되는 연속 등온 단계를 포함할 수 있다. 예로써, 항온처리는 10분간 18℃, 10분간 25℃, 30분간 37℃ 그리고 10분간 42℃의 단계를 포함할 수 있다. 반응 완충액은 단일-가닥 DNA 결합 단백질 (SSB) 또는 헬리카제(helicase)와 같은 사슬 치환(stand-displacement)을 촉진시키는 인자를 더 포함할 수 있다. SSB 또는 헬리카제는 세균, 바이러스 또는 진핵기원의 것이 될 수도 있다. Mg2 + 이온을 킬레이트시키는 충분한 양의 EDTA를 첨가하거나 및/또는 효소를 열에 의해 비활성화시킴으로써 복제 반응이 종료될 수 있다.
가닥-치환 효소에 의한 무작위-프라임된 표적 핵산의 복제로 대략 100개 염기 쌍 내지 대략 2000개 염기 쌍 범위가 오버랩된 분자의 라이브러리가 만들어지고, 이때 평균 길이는 대략 400개 내지 대략 500개 염기 쌍이 된다. 일부 구체예에서, 복제된 가닥의 라이브러리는 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 불변 비-축퇴 서열에 상응하는 불변 비-축퇴 단부 서열 옆에 있을 수 있다.
(b) 라이브러리의 증폭
이 방법은 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 공정을 통하여 라이브러리를 증폭시키는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 상기에서 설명된 바와 같이, 불변 비-축퇴 단부 서열의 측면에 복제된 가닥의 라이브러리가 있을 수 있다. 다른 구체예에서, 분자의 라이브러리가 증폭가능하도록 최소한 하나의 어뎁터가 라이브러리의 복제된 가닥의 각 단부에 결찰되어 있을 수 있다. 어뎁터는 상기에서 설명된 바와 같이 보편적 프라이밍 서열, 또는 호모폴리머 서열 예를 들면, poly-G 또는 poly-C를 포함할 수 있다. 당분야에는 적절한 리게이즈(ligase) 효소 및 결찰(ligation) 기술이 잘 공지되어 있다.
일부 구체예에서, 라이브러리 분자의 불변 단부 서열에 상보적인 단일 증폭 프라이머를 이용하여 PCR이 실행될 수 있다. 다른 구체예에서, PCR은 증폭 프라이머 쌍을 이용하여 실시될 수 있다. 모든 구체예에서, 열안정성 DNA 중합효소는 PCR 증폭 공정을 촉매한다. 적절한 열안정성 DNA 중합효소의 비-제한적 예로는 비Taq DNA 중합효소, Pfu DNA 중합효소, Tli (Vent으로도 공지됨) DNA 중합효소, Tfl DNA 중합효소, Tth DNA 중합효소, 이의 변이체, 그리고 이들의 복합체가 포함된다. PCR 공정은 3 단계(가령, 변성(denaturation), 어닐링(annealing), 그리고 연장(extension)) 또는 2 단계 (가령, 변성과 어닐링/연장)로 구성될 수 있다. 어닐링 또는 어닐링/연장 단계의 온도는 증폭 프라이머에 따라 다양해질 수 있다. 즉, 프라이머의 뉴클레오티드 서열, 용융 온도, 및/또는 농도가 된다. 어닐링 또는 어닐링/연장 단계의 온도는 대략 50℃ 내지 대략 75℃ 범위가 될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 어닐링 또는 어닐링/연장 단계의 온도는 대략 70℃가 될 수 있다. PCR 단계 기간도 다양할 수 있다. 변성 단계의 기간은 대략 10초 내지 대략 2분 범위가 될 수 있고, 그리고 어닐링 또는 어닐링/연장 단계의 기간은 대략 15 초 내지 대략 10 분의 범위가 될 수 있다. 사이클의 전체 횟수 또한 표적 핵산의 양과 질에 따라 달라질 수 있을 것이다. 사이클의 횟수는 대략 5회 사이클 내지 대략 50회 사이클, 대략 10회 사이클 내지 대략 30회 사이클, 그리고 좀더 바람직하게는 대략 14회 사이클 내지 대략 20회 사이클 범위가 될 것이다.
라이브러리의 PCR 증폭은 일반적으로 적절한 증폭 완충액 존재하에 실시될 것이다. 라이브러리 증폭 완충액은 pH 변형제, 이가 양이온, 단가 양이온, 그리고 안정화제 예를 들면, 계면활성제 또는 BSA를 포함한다. 적절한 pH 변형제에는 당업제에 공지된, 반응의 pH를 대략 8.0 내지 대략 9.5로 유지시킬 수 있는 것들이 포함된다. 적절한 이가 양이온에는 마그네슘 및/또는 망간이 포함되며, 그리고 적절한 단가 양이온에는 칼륨, 나트륨, 및/또는 리튬이 포함된다. 포함될 수 있는 계면활성제로는 폴리(에틸렌 글리콜)4-논페닐 3-술포프로필 에테르 칼륨 염, 3-[(3- 클로아미도프로필)디메틸아미노]-1-프로판술포네이트, 3-[(3-클로아미도프로필)디메틸아미노]-2-하이드록시-1-프로판술포네이트, Tween 20, 그리고 Nonidet NP40이 포함된다. 증폭 완충액에 포함될 수 있는 다른 물질에는 글리세롤 및/또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다. 증폭 완충액는 dNTP의 필수 혼합물도 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 증폭된 라이브러리가 다운스트림 분석(downstream analyses)을 위해 표지되도록 변형된 뉴클레오티드 존재하에 PCR 증폭이 실행될 수 있다. 변형된 뉴클레오티드의 비-제한적 예로는 형광 표지된 뉴클레오티드, 아미노알릴-dUTP, 브로모-dUTP, 또는 디곡시게닌-표지된 뉴클레오티드 삼인산염이 포함된다.
증폭된 라이브러리에서 제시되는 표적 핵산 비율은 표적 핵산의 형태와 질에 따라 달라질 수 있고, 다를 것이다. 증폭된 라이브러리는 표적 핵산의 최소 대략 50%, 대략 60%, 대략 70%, 대략 80%, 대략 85%, 대략 90%, 대략 95%, 대략 97%, 대략 99%, 또는 대략 99.5%를 제공한다. 증폭 배수(fold)도 표적 핵산에 따라 달라질 수 있다. 증폭 배수는 대략 100-배, 300-배, 대략 1000-배, 대략 10,000-배, 대략 100,000-배, 또는 대략 1,000,000-배가 될 수 있다. 예를 들면, 대략 5 ng 내지 대략 10 ng의 표적 핵산은 대략 5 μg 내지 대략 50 μg의 라이브러리 분자로 증폭될 수 있다. 게다가, 증폭된 라이브러리는 PCR을 통하여 다시 증폭될 수 있다.
이어서 사용전 잔류 증폭 프라이머 및 뉴클레오티드를 제거하기 위하여 증폭된 라이브러리를 정제시킬 수 있다. 핵산 정제 방법 가령, 스핀 컬럼 크로마토그래피 또는 필터 기술이 당분야에 잘 공지되어 있다.
증폭된 라이브러리의 다운스트림 용도는 다양할 수 있다. 증폭된 라이브러리의 비-제한적 용도에는 실시간(real-time) 정량적 PCR, 마이크로어레이 분석, 시퀀싱, 제한 단편 길이 다형성(RFLP) 분석, 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP) 분석, 마이크로새틀레이트(microsatellite) 분석, 짧은 탄덤 반복체(short tandem repeat) (STR) 분석, 비교성 게놈 하이브리드반응(CGH), 형광 in situ 하이브리드 반응 (FISH), 그리고 크로마틴 면역침전법(ChiP)이 포함된다.
( III )표적 핵산 집단을 증폭시키기 위한 키트
본 발명의 추가 측면에는 표적 핵산 집단을 증폭시키기 위한 키트가 포함된다. 키트는 단락 I에서 설명된 것과 같이, 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 그리고 복제 효소(단락 (II)(a)(iii)에서 정의된 바와 같이)를 포함한다.
적절한 구체예에서, 키트내 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 화학식 NmXp, NmZq, 또는 이들의 조합이 포함되고, 여기서 N, X, 그리고 Z는 상기에서 정의된 바와 같은 축퇴 뉴클레오티드이며, m 은 2 내지 13이며, p와 q는 각각 1 내지 11이며, 그리고 이들 두 정수의 총합은 6 내지 14이고, 그리고 최소 두 개 N 잔기는 최소한 하나의 X 또는 Z 잔기에 의해 분리된다. 예시적인 구체예에서, 키트내 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 화학식 NmXp, NmZq, 또는 이들의 조합이 포함되고, 여기서 N, X, 그리고 Z는 상기에서 정의된 바와 같은 축퇴 뉴클레오티드이며, m 은 2 내지 8이며, p와 q는 각각 1 내지 7이며, 그리고 이들 두 정수의 총합 또는 m과 q는 9이고, 그리고 최소 두 개 N 잔기는 최소한 하나의 X 또는 Z 잔기에 의해 분리되고, 그리고 세 개의 연속 N 잔기가 있다. 적절한 구체예에서, X는 D 이고, Y는 K이다. 특별히 바람직한 구체예에서, 키트내 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 다음의 (5'-3') 서열을 가진다: KNNNKNKNK, NKNNKNNKK, 그리고 NNNKNKKNK. 일부 구체예에서, 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머에는 올리고 dT 프라이머가 더 포함된다. 상기 단락 (I)(b)에서 설명된 바와 같이, 키트내 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머에는 각 프라이머의 5' 단부에 불변 비-축퇴 서열이 더 포함될 수 있다.
상기 단락(II)(a)(iii)에서 정의된 바와 같이, 키트는 라이브러리 합성 완충액을 더 포함한다. 키트의 또 다른 선택적 성분은 상기 단락(II)(a)(i)에서 설명된 바와 같이, 표적 핵산을 단편화시키는 것이다. 상기 단락(II)(b)에서 설명된 바와 같이, 키트는 열안정성 DNA 중합효소, 최소한 하나의 증폭 프라이머, 그리고 라이브러리 증폭 완충액을 더 포함한다.
정의
본 발명을 이해하기 위해 다수의 용어를 하기에서 정의한다.
여기에서 사용된 바와 같이, "상보적인 또는 상보성(complementarity)"는 특정 수소 결합을 통하여 최소한 하나의 Watson-Crick 염기 쌍을 형성할 수 있는 능력을 지칭한다. "비-상보적인 또는 비-상보성(non-complementarity)"은 특정 수소 결합을 통하여 최소한 하나의 Watson-Crick 염기 쌍을 형성할 수 없는 것을 지칭한다.
"게놈 DNA"은 진핵 세포, 세균성(eubacterial) 세포, 고세균(archaeal) 세포 또는 바이러스의 핵 또는 기관 (예를 들면, 미토콘드리온, 엽록체 또는 운동핵(kinetoplast))에 자연 발생되는 하나 또는 그 이상의 염색체 폴리머 데옥시리보핵산 분자를 지칭한다. 이들 분자는 DNA로 전사되는 서열 뿐만 아니라 RNA로 전사되지 않는 서열도 포함한다.
여기에서 사용된 바와 같이 하이브리드반응("hybridization")은 또는 두 개 상보적인 단일 가닥 핵산 분자사이의 수소 결합, 또는 염기쌍을 형성하여 이중 가닥의 하이브리드가 형성되는 과정을 지칭한다. 하이브리드 반응의 엄격성("stringency")은 일반적으로 온도 및 이온 강도 조건에 의해 결정된다. 핵산 하이브리드 안정성은 용융 온도(정의된 조건하에서 하이브리드의 50% 변성되는 온도)또는 Tm으로 표현된다. 주어진 하이브리드의 Tm를 평가하기 위하여 식을 유도하였다: 식은 핵산의 G+C 함량, 하이브리드 성질 (예를 들면, DNA:DNA, DNA:RNA, 등), 핵산 프로브의 길이 (예를 들면, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, chapter 9)등을 고려한다. 하이브리드 반응에 기초한 많은 반응, 예를 들면, 중합효소 반응, 증폭 반응, 결찰 반응 등에서, 반응의 온도는 일반적으로 하이브리드 반응의 엄격성을 결정한다.
일반적으로 사용된 바와 같이, "프라이머"는 DNA 복제를 위한 출발점으로 작용하는 자유 3' 하이드록실 기를 가지는 핵산 가닥 또는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
여기에서 사용된 바와 같이, “트란스크립톰(transchptome)”은 하나의 세포 또는 세포군에서 발현되는 모든 RNA 분자 세트로 정의된다. RNA 분자 세트에는 메신져 RNA 및/또는 microRNA 그리고 기타 작은 RNA가 포함된다. 이 용어는 주어진 유기체내 전체 RNA 분자 세트를 지칭하거나 특정 세포 형에 존재하는 RNA 분자의 특정 부분집합을 지칭할 수 있다.
실시예
다음의 실시예들은 본 발명의 다양한 구체예를 설명하기 위해 제공된다. 당업자는 다음의 실시예에서 설명된 기술들은 본 발명을 실시할 때 잘 할 수 있도록 본 발명자들이 발견된 기술을 제시한다는 것을 인지할 것이다. 그러나, 당업자는 본 설명의 견제에서, 설명된 특정 구체예내에서, 그리고 본 발명의 범주 및 사상을 벗어나지 않고 유사한 결과를 얻을 수 있는 많은 변화가 있을 수 있으며, 따라서, 상기 설명 및 하기 실시예에서 제시되는 모든 내용은 설명을 위함이며, 이에 제한을 두고자 함이 아니라는 것을 인지해야 할 것이다.
실시예 1. D9 라이브러리 합성 프라이머의 분석.
WGA 및 WTA 응용에 이용되는 프라이머의 축퇴를 증가시키기 위한 시도에서, 라이브러리 합성 프라이머가 합성되었는데, 이의 준무작위 부위는 아홉 개 D 잔기 (D9)를 포함한다. 프라이머는 또한 불변 (universal) 5' 부위도 포함하였다. 다수의 앰플리콘을 효과적으로 증폭시키는 이와 같은 프라이머의 능력을 표준 라이브러리 합성 프라이머(준무작위 부위는 아홉 개 K 잔기 (K9)가 포함된-예를 들면, Rubicon TRANSPLEX™ 전체 트란스크립톰 증폭 (WTA) 키트, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)의 능력과 비교하였다. qPCR 및 마이크로어레이 분석을 통하여 증폭안된 cDNA와 K9 와 D9 증폭된 cDNA 모두가 비교되었다.
(a) 증폭안된 대조군 cDNA 합성
MMLV-역전사효소 (cat.# M1302; Sigma-Aldrich)에 대한 설명된 과정에 따라 1 μM 올리고 dTi9 프라이머를 이용하여 30㎎의 인간의 간 전체 RNA(cat.# 7960; Ambion, Austin, TX), Universal Human Reference (UHR) total RNA (cat.# 74000; Stratagene, La JoIIa, CA)로부터 단일-가닥 cDNA를 1㎎ total RNA/ 50㎕반응물의 농도로 준비하였다.
(b) D-증폭된 cDNA 합성
1㎍/25㎕의 인간 간 또는 UHR 전체 RNA와 1 μM의 올리고 dT 프라이머 (5'-GTAGGTTGAGGATAGGAGGGTTAGGTI9-S'; SEQ ID NO:1 )를 5분간 70℃에서 항온처리시키고, 얼음위에서 신속하게 냉각시킨 후 바로, 10 unit/㎕ MMLV-역전사효소 (Sigma-Aldrich), 1x PCR 완충액 (cat.# P2192; Sigma-Aldrich), 최종 농도가 3 mM가 되는 염화 마그네슘(cat.# M8787; Sigma-Aldrich), 500 μM dNTPs, 그리고 2.5% (volume) 리보뉴클레아제 저해제(cat.#R2520; Sigma-Aldrich)를 첨가시킨 후 37℃에서 5 분, 42℃에서 45 분, 94℃에서 5 분, 그리고 얼음위에서 신속하게 냉각시켰다.
1 μM의 D9 라이브러리 합성 프라이머 (5'-GTAGGTTGAGGATAGGAGGGTTAGGD9-S'; SEQ ID NO:2), 0.165 units/㎕ JUMPSTART™ Taq DNA 중합효소 (cat.# D3443; Sigma-Aldrich), 0.18unit/㎕ Klenow exo-minus DNA 중합효소 (cat.# 7057Z; USB, Cleveland, OH), 1x PCR 완충액(상기 참고), 5.5 mM 첨가된 염화 마그네슘(상기 참고) 그리고 500 μM dNTP를 이용하여 상보적인 제 2 cDNA 가닥이 합성되었다. 혼합물은 18℃에서 5 분, 25℃에서 5 분, 37℃에서 5 분, 그리고 72℃에서 15 분간 항온처리된다.
0.05 units/㎕ JUMPSTART™ Taq (상기 참고), 1X PCR 완충액 (cat.# D4545, 염화마그네슘 없이, Sigma-AIdrich), 1.5mM 염화마그네슘 (상기 참고), 200μM dNTPs 그리고 2μM 보편적 프라이머 5'-GTAGGTTGAGGATAGGAGGGTTAGG-3' (SEQ ID NO:3)를 이용하여 이중-가닥 cDNA가 합성되었다. 열순환(Thermocycling) 변수는 94℃에서 90 초, 그 다음 94℃에서 30 초, 65℃에서 30 초, 그리고 72℃에서 2분간의 순환 과정을 17회 실시하는 것이다.
(c) K-증폭된 cDNA 합성
Rubicon Transplex™ WTA 키트 (상기 참고)의 과정 및 합성 성분들을 이용하여 0.2㎍ 전체 RNA로부터 증폭된 cDNA가 준비되었다.
(d) RNA 제거 및 cDNA 정제
최종 cDNA/증폭 반응 용적의 1/3의 0.5M EDTA, 최종 cDNA/증폭 반응의 1/3의 1M NaOH을 첨가하고, 65℃에서 15 분간 항온처리시키고, 증폭안된 대조군 cDNA와 증폭된 cDNA에서 전체 RNA 주형이 분해되었고, 반응은 1M Tris HCl, pH 7.4의 최종 cDNA/증폭 반응 용적의 5/6으로 중화시키고, 설명된 것과 같이, GenElute PCR Cleanup 키트(cat.# NA1020; Sigma-Aldrich)를 이용하여 정제시켰다.
(e) 정량적 PCR ( qPCR ) 분석
2X SYBRGreen JUMPSTART™ Taq (cat.# S4438; Sigma-AIdrich)에서 설명된 조건에서 250 nM 인간 프라이머 쌍 (표 7)과 함께 실시간 정량적 PCR에 의해 증폭된 cDNA와 증폭안된 대조군 cDNA가 분석되었다. 순환 조건은 다음과 같다: 94℃ 1.5분간 1회 순환, 94℃에서 30 초; 60℃에서 30 초; 그리고 72℃에서 2.5 분간으로 구성된 30회 순환.
Figure 112010023892278-pct00011
형광이 정해진 한계 수준을 초과하는 동안 각 반응에 대해 PCR 사이클을 나타내는 C(t) 값이 결정된다. 평균 델타 C(t) [ΔC(t)]가 계산되었고, PCR 주형 타입에 대한 개별 ΔC(t) 값으로부터 차감시켰다. 도면 1는 상이한 프라이머 세트에 대한 함수로써 각 cDNA 군의 ΔC(t)Liver- UHR을 나타낸다. 결과에서 D-증폭된 cDNA 및 K-증폭된 cDNA에 대한 인간 간과 UHR cDNA 앰플리콘 농도의 비율(ΔC(t)로 나타냄)에는 증폭안된 전체 RNA내에서 제시된 초기 mRNA 수준의 비율이 상당히 반영되었다는 것을 나타낸다.
(f) 마이크로어래이 분석
Kreatech ULS ™ 시스템(Kreatech Biotechnology, Amsterdam, Netherlands; the labeling was performed by Mogene, LC, NIDUS Center for Scientific Enterprise, 893 North Warson Road, Saint Louis, MO, 63141 )을 이용하여 표적 cDNA가 표지되었다. 마이크로어레이 분석을 위해 정제된 증폭안된 cDNA, D-증폭된 cDNA 그리고 K-증폭된 cDNA가 Mogene, LC에 제공되었다, 이를 위하여, 750 nanograms의 표적이 Agilent Whole Genome Chip (cat.# G4112A; Agilent Technologies, Santa Clara, CA)과 함께 항온처리되었다.
도면 2는 각 어레이 프로브에 인간의 간과 UHR 표적을 나타내는 비율 스팟을 나타낸다. 증폭안된 cDNA 표적의 log2 비율에 대응하여 증폭된 cDNAs 표적의 log2 비율이 플롯되었다. 이 분석에는 배경의 약 5배(>250)의 강도만 포함되었다. 결과에 따르면 D-증폭된 (도면 2A) cDNA와 K-증폭된 (도면 2B) cDNA는 유사한 프로파일을 보유하였다.
실시예 2. 384개의 높은 축퇴 프라이머의 선택.
라이브러리 합성 프라이머의 축퇴를 추가 증가시키기 위하여, N 잔기, 뿐만 아니라 D 또는 K 잔기가 포함되도록 준-무작위 부위를 변형시켰다. N의 증가로 서열 다양성이 증가될 것이며, K 또는 D 잔기에 의한 N의 비연속으로 인하여 프라이머간의 분자내 그리고 분자간 상호작용이 감소될 것이기 때문이다. 표 2에서는 256개의 가능한 K 방해된 N 서열 (1K9로도 불리는 대조군 K9 서열을 포함)을 나열하며, 표 3에서는 256개의 D 방해된 N 서열(1D9로도 불리는 대조군 D9 서열 포함)을 나열하고 있다.
조사될 프라이머 수를 최소화시키고, 그리고 작업가능한 실시예를 제공하기 위한 노력으로의 일환으로, 조사될 프라이머의 수를 384개로 한정시키기로 결정하였다. 1차 한정(cut)은 4개 또는 그 이상 연속 N 잔기가 포함된 임의의 서열을 제거하는 것인데, 4개 또는 그이상의 축퇴 N들이 프라이머 이량체 형성을 위한 실질적인 기회를 제공하는 것으로 가정하였기 때문이다. 이로써 K 또는 D가 끼어든 N의 서열 수를 258에서 208로 감소되었다. 3' 다변성 및 자가 상보성에 근거하여 나머지 16개 프라이머(가령, 208에서 192로)가 제거되었다. 16개 프라이머 중에서, 6개 프라이머는 8개 가망 N1X8 서열로 구성되고, 이때 3' 최대 축퇴는 두 개의 후보 서열이 끝에서 두 번째 위치를 제외한 3' 단부 부근의 N을 보유함으로써 유지되는데, 그 이유는 풀(pool)의 50%는 최종 두 개의 3' 단부 뉴클레오티드에서 자가-상보성이 되기 때문이다. 나머지 10개 서열은 자가-상보성에 근거하여 제거되었다(가령, 대략 중앙의 N에 대해 K/D와 N이 쌍을 이루는 팔린드롬(palindromic)인 축퇴 서열이고; 예를 들면 NKNNNKKNK, NNKKNNNKK, 등). 표 4에서는 후속 스크리닝을 위해 선택된 최종 384개 비연속 N 서열이 나열되어 있다.
Figure 112010023892278-pct00012
Figure 112010023892278-pct00013

Figure 112010023892278-pct00014
Figure 112010023892278-pct00015
Figure 112010023892278-pct00016
Figure 112010023892278-pct00017
Figure 112010023892278-pct00018
Figure 112010023892278-pct00019

실시예 3. 5개의 최상의 비-연속 N 라이브러리 합성 프라이머의 동정.
384개의 비-연속 N 서열을 이용하여 384개 라이브러리 합성 프라이머를 만들었다. 각 프라이머는 불변의 5' 보편 서열 (5'- GTGGTGTGTTGGGTGTGTTTGG-3'; SEQ ID NO:28)과 표 10에 나열된 9-mer 비-연속 N 서열중 하나로 구성된다. 전체 트란스크립톰 증폭 (WTA)에서 이들을 이용하여 프라이머가 스크리닝되었다. WTA 스크리닝 공정이 3단계로 실행되었다. 1) 라이브러리 합성, 2) 라이브러리 증폭, 그리고 3) 유전자 특이적 qPCR.
(a) 라이브러리 합성 및 증폭
각 라이브러리 합성 반응은 2.5㎕의 1.66 ng/㎕ 전체 RNA (간)와 2.5㎕의 5 μM 384개 라이브러리 합성 프라이머 중 하나로 구성된다. 혼합물은 5분간 70℃로 가열되고, 그 다음 얼음위에서 냉각되었다. 각 반응 혼합물에 2.5㎕의 라이브러리 마스터 믹스가 첨가되었다(마스터 믹스(master mix)에는 1.5 mM dNTPs, 3X MMLV 반응 완충액, 24 Units/㎕ MMLV 역전사효소, 그리고 1.2Units/㎕ Klenow exo-minus DNA 중합효소가 포함된다). 반응물은 혼합되어 18℃에서 10분간, 25℃에서 10분간, 37℃에서 30분간, 42℃에서 10분간, 95℃에서 5분간 항온처리되며, 희석시킬 때까지 4℃에서 보관되었다.
70㎕ H2O를 첨가시켜 각 라이브러리 반응 산물를 희석시켰다. 10㎕의 희석된 라이브러리와 10㎕ 2X 증폭 믹스(2X SYBRGreen JUMPSTART™ Taq READYMIX™ 그리고 5 μM의 보편적 프라이머, 5'-GTGGTGTGTTGGGTGTGTTTGG-3'; SEQ ID NO:28)를 혼합함으로써 라이브러리가 증폭되었다. 94℃에서 30초, 70℃에서 5분간의 순환을 WTA 혼합물은 25회 받았다.
(b) qPCR 반응
각 WTA 산물은 180㎕ H2O로 희석시키고, 표 11에서 제시된 “쿨링(culling)" qPCR을 받게 되었다. 이와 같은 qPCR 반응에 이용된 유전자-특이적인 프라이머는 표 12에 나열되어 있다. 각 반응 혼합물에는 10 ㎕ 희석된 WTA 산물 라이브러리와 10㎕ 2X 증폭 믹스(2X SYBRGreen JUMPSTART™ Taq READYMIX™ 및 0.5 μM의 각 유전자-특이적 프라이머)가 포함되어 있다. 혼합물은 94℃에서 2 분, 그 다음 94℃에서 30 초, 60℃에서 30 초, 그리고 72℃에서 30초간 으로 구성된 순환을 40회 받았다. 플레이트는 72℃, 76℃, 80,℃ 그리고 84℃에서 판독되었다(MJ Opticom Monitor 2 thermocycler; MJ Research, Waltham, MA). 형광이 정해진 한계 수준을 초과하는 동안 PCR 순환을 나타내는 Ct 값이 각 반응에서 결정되었다.
Figure 112010023892278-pct00020
Figure 112010023892278-pct00021
제1 qPCR 스크린은 베타 악틴 유전자의 증폭으로 구성된다. 반응은 96-웰 플레이트 4개에서 실시되었다. 플레이트간 변화를 완화시키기 위하여, 각 플레이트의 평균 Ct를 계산하였고, 플레이트상의 각 반응의 델타 Ct (ΔCt)는 Ct(avg)-Ct(반응)으로 결정되었다. 4개 qPCR 플레이트의 데이터를 하나의 표(표 7)로 복합시키고, 델타 Ct로 정리되었다. 표를 정사하면, 명백한 플레이트 편향은 없는 것으로 나타났다(예를 들면, 델타 Ct의 분포가 4개 플레이트간에 통계학적으로 분포된 것으로 나타났다).
Figure 112010023892278-pct00022
Figure 112010023892278-pct00023
Figure 112010023892278-pct00024
Figure 112010023892278-pct00025
Figure 112010023892278-pct00026

상위 96개 WTA 산물 (표 13에서 음영부분)은 단일 플레이트상에서 NM_001799용 프라이머를 이용한 제 2 qPCR 스크린을 받았다. 표 14에서는 각 반응에서의 증폭 효과와 Ct 값을 제시한다. WTA 산물은 최저 Ct부터 최고 Ct로 정렬되었다.
Figure 112010023892278-pct00027
최저 Ct를 가진 48개 WTA 산물(표 14에서 음영부분)은 다시 단일 플레이트상에서 NM_001570-[22348]-01 (스크린 3a)와 인간 B2M 기준 유전자 (스크린 3b)용 프라이머를 이용하여 qPCR 증폭되었다. HB2M 기준 유전자가 특별히 진단성이 아니기 때문에, WTA 산물은 NM_001570-[22348]-01 (표 15)에 대해 최저 Ct에 근거하여 정렬되었다.
Figure 112010023892278-pct00028
최저 Ct를 가진 14개 WTA 산물(표 15에서 음영으로 표시됨) 뿐만 아니라, 1K9 및 1D9 프라이머로 증폭된 산물이 제4 qPCR 스크린 (가령, 스크린 4a-4f)을 받았다. 현재 WGA와 WTA 프라이머가 K9 부위를 포함하고, D9가 K에 대해 축퇴를 증가시키려는 제1 세대 시도였기 때문에 1K9 및 1D9 프라이머는 함께 사용되었다. 예전과 같이, 모든 반응은 단일 96-웰 플레이트에서 실시되었다. 표 16에서는 각 반응의 증폭 효과와 Ct 값을 나타내었다. 16개 비-연속 N 라이브러리 합성 프라이머에서, NM_003234 qPCR에서 높은 Ct와 인간 게놈으로부터 가능한 WTA 앰플리콘의 수가 작은 복합적 이유 또는 이중 하나의 이유로 인하여 5개는 추가 고려에서 누락되었다. 나머지 11개 프라이머는 제4 스크린에 의해 분류되었다. 분류시에, 순위가 각 프라이머에 할당되었다(1=최고 순위, 11은 최저 순위). 각 프라이머 디자인에 대해 생성된 순위들이 합산되었다(표 17). 순위의 합을 분류하여 가장 성공적인 프라이머의 순번이 제공되었다. 공정에서 11개 비-연속 N 프라이머중 9개가 제4 스크린에 대해 증폭가능한 주형을 충분한 양으로 제공하는 유사한 능력을 보유한다는 것이 나타났다.
Figure 112010023892278-pct00029
Figure 112010023892278-pct00030
이 실험들과 병행하여, 384개 프라이머 디자인으로부터 가능한 인간 트란스크립톰 유도된 앰플리콘의 수가 생물정보학적으로 결정되었다. 제 4 qPCR 스크린에서 확인된 9개 서열중 8개의 순위는 인간 트란스크립톰으로부터 생성된 앰플리콘의 수에 따라 정해졌다. (1D9는 qPCR 스크린 3에서 앰플리콘이 유실되었기 때문에 추가 평가에서 누락되었다). 이 분석에서 5개 서열(가령, 11 K4, 15K4, 19K4, 25K4, 그리고 27K4)이 확인되었는데, 각 서열은 인간 트란스크립톰으로부터 대략 백만개 앰플리콘을 만든다.
실시예 4. 예시적 프라이머를 동정하기 위한 추가 스크린.
(a) 분해된 RNA 의 증폭
WTA 공정의 바람직한 측면은 분해된 RNA를 증폭시키는 능력이다. 스크린 4 (표 17)의 상위 9개 비-연속 N 라이브러리 합성 프라이머와 1K9 및 1D9 프라이머를 이용하여 NaOH-절단된 RNA를 증폭시켰다. 간략하게 설명하면, 5㎍ 간의 전체 RNA/20㎕ 물에 20㎕의 0.1 M NaOH를 첨가하였다. 혼합물은 25℃에서 0분 내지 12분간 항온처리되었다. 0분, 1분, 2분, 3분, 4분, 6분, 8분 그리고 12 분에, 2㎕ 방울을 빼내고, 100㎕ 10 mM Tris-HCl, pH 7에서 반응을 억제시켰다. WTA는 상기에서 설명된 것과 유사하게 실행되었다. 라이브러리 합성의 경우: 2㎕ NaOH-절단된 RNA, 5 μM 라이브러리 합성 프라이머 2㎕, 70℃에서 5분간 가열, 4㎕ 2X MMLV 완충액, 10 U/㎕ MMLV, 그리고 1 mM dNTP을 첨가; 42℃에서 15분간 항온처리; 30㎕ H2O로 희석. 증폭의 경우: 희석된 라이브러리 8㎕, 12㎕ 증폭 믹스(2X SYBRGreen JUMPSTART™ Taq READYMIX™ 및 5 μM 보편적 프라이머). 아가로즈 겔 전기영동에 의한 WTA 산물 분석에서 1K9 및 1D9 라이브러리 합성 프라이머를 제외한 모두가 상대적으로 높은 수준의 WTA 앰플리콘을 생산한 것으로 나타났다(도면 3).
(b) WTA 스크린
이상적인 라이브러리 합성 프라이머의 또 다른 바람직한 특징은 프라이머 이량체 형성이 최소이거나 없다는 것이다. 상기 설명된 분해된 RNA 실험에 이용된 11개 비-연속 N 프라이머들이 WTA를 받는데, 단 주형없이 실시되었다. MMLV 리버스 전사효소 또는 MMLV 및 Klenow exo-minus DNA 중합효소 존재하에 라이브러리 합성이 실행되었다. 라이브러리 증폭은 JUMPSTART™ Taq 또는 KLENTAQ(Sigma- Aldrich)으로 촉매되었다. 도면 4에서 MMLV 및 Klenow exo-minus DNA 중합효소의 복합으로 합성 및 JUMPSTART™ Taq DNA 중합효소를 이용한 증폭은 더 높은 수준의 앰플리콘을 제공하는 것으로 나타났다. 더욱이, 이 실험에서, 11개 라이브러리 합성 프라이머 (RNA 주형없는 겔 참고)중 임의의 것에서 프라이머 이량체 형성은 심각한 문제가 안되는 것으로 나타났다.
(c) 최종 선택
바람직한 라이브러리 합성 프라이머는 분자내 및/또는 분자간 프라이머 특이적 상호작용(예를 들면, 프라이머 항체)으로 인한 감응성 손실없이 최대수의 앰플리콘을 제공하는 프라이머일 것이다. 따라서, qPCR 쿨링(culling) 실험, 프라이머 이량체 분석 그리고, 생물정보학적 분석에서 이와 같은 조건들을 만족시키는 5개의 비-연속 N 서열이 나타났다. 즉, 라이브러리 합성에 이용되는 경우, 5개 서열(가령, 11K4, 15K4, 19K4, 25K4, 그리고 27K4)은 모든 qPCR 스크린에 대한 증폭가능한 주형을 제공하는 WTA 산물이 산출되었고, 주형없이 최소량의 프라이머 이량체가 산출되었고, 인간 트란스크립톰으로부터 최소 백만개 WTA 앰플리콘을 생산할 수 있었다.
이들 바람직한 서열중 하나가 라이브러리 합성 프라이머로 이용되기 위해 무작위로 선택될 수 있지만, 서열중 일부 또는 전부의 혼합물이 바람직할 수 있다는 것도 설득력이 있었다. 역으로 이들 일부 또는 전부의 혼합물이 결정적인 프라이머-프라이머 상호작용을 허용할 수 있다. 개별 프라이머 또는 바람직한 프라이머 5개 모두 또는 이의 일부 뿐만 아니라 K9, D9, 또는 N9 서열을 포함하는 프라이머를 이용하여 라이브러리를 합성하는 WTA를 실시함으로써, 이와 같은 가능성에 대해 조사되었다. 고농도의 라이브러리 합성 프라이머를 이용한 라이브러리 합성을 실시하여 잠재적인 결정적 상호작용이 검사되었다. 따라서, 표준 WTA 반응 라이브러리는 10 μM, 2 μM, 0.4 μM 또는 0.08 μM 의 라이브러리 합성 프라이머 존재하에서 실행되었다. 아가로즈 겔 전기영동에 의해 WTA 산물이 분석되었다. 또한, NM_001570 프라이머 (SEQ ID NO:33 및 34)를 이용한 SYBR그린 매개된 qPCR 증폭으로 WTA 산물이 분석되었다.
도면 5에서 볼 수 있는 것과 같이, WTA 산물의 산출은 라이브러리 합성 프라이머의 농도 의존적이다. 또한, 프라이머 이량체의 증거는 고농도의 N9 프라이머에서만 나타났다(N 라인). 각 프라이머/프라이머 조합에 대해 qPCR로부터 델타 Ct를 계산함으로써 프라이머 상호작용의 가능성이 평가되었다. 즉, 10 μM와 2 μM에서, 2 μM와 0.4 μM에서, 그리고 0.4 μM 와 0.08 μM에서 Ct차이가 된다. 네가티브 델타 Ct는 유해한(detrimental) 프라이머-프라이머 상호작용으로 방해되었다. 고농도에서 오로지 15K4 만 중간정도의 유해한 상호작용을 가지며, 15K4와 19K4가 포함된 거의 다른 복합 또한 상당히 유해한 것으로 밝혀졌다. 또한, 19K4 와25K4의 복합 또한 네가티브 상호작용을 보였다.
Figure 112010023892278-pct00031
프라이머 복합이 가질 수 있는 임의의 가망 네가티브 임팩트를 제외하고, 분기(divergent) 서열을 프라임시키는 이들 능력은 개별 서열의 쌍을 형성하는 배열에 의해(pair-wise alignment) 프로브되었다. 5개 비-중단 N은 프라이머 중에서 오버랩 N이 최대 수가 되도록 배열되었다(표 19). 게다가, 모든 가망 쌍을 이루는데 쌍을 이루는 K-N 미스메취(mismatches)도 기록되었다.
Figure 112010023892278-pct00032
Figure 112010023892278-pct00033
이와 같은 분석에서 프라이머 세트내 최대 차이(divergence)는 11K4, 19K4 및 27K4 프라이머를 이용한 것이었다. 따라서, 최소 프라이머 상호작용의 최대 프라이밍 차이는 11K4 (가령, KNNNKNKNK), 19K4 (가령, NKNNKNNKK), 그리고 27K4 (가령, NNNKNKKNK)을 포함하는 프라이머 혼합물에서 발생되었다.
SEQUENCE LISTING <110> SIGMA-ALDRICH CO. WARD, BRIAN HEUERMANN, KENNETH E. <120> DEGENERATE OLIGONUCLEOTIDES AND THEIR USES <130> 47497-129823 <150> US 11/872,272 <151> 2007-10-15 <160> 48 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 1 gtaggttgag gataggaggg ttaggttttt tttttttttt tttt 44 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 2 gtaggttgag gataggaggg ttaggddddd dddd 34 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 3 gtaggttgag gataggaggg ttagg 25 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 4 tgcttagacc cgtagtttcc 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 5 cttgacaaaa tgctgtgttc c 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 6 cgtttaattc tgtggccagg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 7 agccaagtac cccgactacg 20 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 8 tgttaacaat ttgcataaca aaagc 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 9 tgattaattt gcgagactaa ctttg 25 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 10 gtttcgaatc ccaggaatta agc 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 11 cacaatcagc aacaaaatca tcc 23 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 12 gcaaacaaag catgcttcaa 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 13 ttctcccagc tttgagacgt 20 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 14 tatttaaaat gtgggcaaga tatca 25 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 15 tggtgtaaat aaagaccttg ctatc 25 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 16 tttgttactt gctaccctga g 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 17 caaccatcat cttccacagt c 21 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 18 agaccacacc agaaaccctg 20 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 19 gaattttggt ttcttgcttt gg 22 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 20 ccagggttcg aatctcagtc tta 23 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 21 gatttctaaa cttacggccc cac 23 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 22 aaagagtgtc ttgtcttgac ttatc 25 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 23 ttatctgagc ccttaatagt aaatc 25 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 24 aatcaaaagg ccaacagtgg 20 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 25 ttcagtgtta atggagccag g 21 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 26 tctcagagca gagtttgggc 20 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 27 cctgcacttg gacctgacc 19 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 28 gtggtgtgtt gggtgtgttt gg 22 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 29 ctggaacggt gaaggtgaca 20 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 30 aagggacttc ctgtaacaat gca 23 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 31 ctcagttggt gtgcccaaag tttca 25 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 32 tagcagagtt acttctaagg gttc 24 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 33 gatcatcctg aactggaaac c 21 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 34 gcctttctta cagaagctgc caaa 24 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 35 cggcatcttc aaacctccat ga 22 <210> 36 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 36 gcctgccgtg tgaaccatgt gactttgtc 29 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 37 tggacaacct cttggctttt 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 38 taaaatgcca ctccacagca 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 39 ttgaaaatcc agcgtggaca 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 40 tcgagtcatt gcatactgtc 20 <210> 41 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 41 gaaggtgaag gtcggagtc 19 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 42 gaagatggtg atgggatttc 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 43 aggctgctgc cacataaggt 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 44 ccaaggctcc aagcatgaat 20 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 45 caaagtcacc gtcaaggtgt at 22 <210> 46 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 46 ggaacagtct ttccgaagag accaa 25 <210> 47 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 47 cagactaaca acagatttcg ggaat 25 <210> 48 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HOMO SAPIENS <400> 48 gaggaagtga tactccactc tcat 24

Claims (25)

  1. 각 올리고뉴클레오티드는 각각 하기 화학식을 포함하는 복수의 올리고뉴클레오티드:
    화학식 NmXpZq
    여기서:
    N은 아데노신(A), 시티딘(C), 구아노신(G), 그리고 티미딘/우리딘(T/U)로 구성된 군에서 선택된 4-배 축퇴 뉴클레오티드이며;
    X는 B, D, H, 그리고 V로 구성된 군에서 선택된 3-배 축퇴 뉴클레오티드이며, 여기서 B는 C, G, 그리고 T/U로 구성된 군에서 선택되고; D는 A, G 그리고 T/U로 구성된 군에서 선택되고; H는 A, C, 그리고 T/U로 구성된 군에서 선택되고; 그리고 V는 A, C, 그리고 G로 구성된 군에서 선택되고;
    Z는 K, M, R, 그리고 Y로 구성된 군에서 선택되는 2-배 축퇴 뉴클레오티드이고, 여기서 K는 G와 T/U로 구성된 군에서 선택되고; M은 A와 C로 구성된 군에서 선택되고; R은 A 와 G로 구성된 군에서 선택되고; 그리고 Y는 C와 T/U로 구성된 군에서 선택되고; 그리고
    m, p 및 q는 정수이고, m은 0이거나 2 내지 20이며, 그리고 p와 q는 0 내지 20이나 단, 조건은 두 개 정수가 0이 아니거나 m과 q 모두 0인 조건과, N을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 최소 두 개 N 잔기를 가지며, 이때 두 개 N 잔기를 분리시키기 위해 최소 하나의 X 또는 Z 잔기를 가지는 조건이 더 포함된다.
  2. 청구항 1에 있어서, 하나의 정수는 0이고, 올리고뉴클레오티드의 화학식은 NmXp, NmZq, 그리고 XpZq로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 m은 2 내지 8이고, p와 q는 각각 1 내지 8이고, 그리고 이들 두 정수의 총합은 9인 것을 특징으로 하는 복수의 올리고뉴클레오티드.
  3. 청구항 1에 있어서, m과 q 모두 0이며, 올리고뉴클레오티드의 화학식은 Xp, 이며, 여기서 p는 2 내지 20인 것을 특징으로 하는 복수의 올리고뉴클레오티드.
  4. 청구항 1에 있어서, 각 올리고뉴클레오티드에는 5' 단부에 비-축퇴 뉴클레오티드 서열이 더 포함되며, 비-축퇴 서열은 복수의 올리고뉴클레오티드 가운데에서 불변이며, 불변 비-축퇴 서열의 길이는 14개 뉴클레오티드 내지 24개 뉴클레오티드가 되는 것을 특징으로 하는 복수의 올리고뉴클레오티드.
  5. 표적 핵산 집단을 증폭시키는 방법에 있어서,
    (a) 표적 핵산 집단에 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머을 접촉시켜 복수의 핵산-프라이머 이중나선을 형성하는 단계, 여기서 각 올리고뉴클레오티드 프라이머는 화학식 NmXpZq을 포함하며, 여기서:
    N은 아데노신(A), 시티딘(C), 구아노신(G), 그리고 티미딘/우리딘(T/U)로 구성된 군에서 선택된 4-배 축퇴 뉴클레오티드이며;
    X는 B, D, H, 그리고 V로 구성된 군에서 선택된 3-배 축퇴 뉴클레오티드이며, 여기서 B는 C, G, 그리고 T/U로 구성된 군에서 선택되고; D는 A, G 그리고 T/U로 구성된 군에서 선택되고; H는 A, C, 그리고 T/U로 구성된 군에서 선택되고; 그리고 V는 A, C, 그리고 G로 구성된 군에서 선택되고;
    Z는 K, M, R, 그리고 Y로 구성된 군에서 선택되는 2-배 축퇴 뉴클레오티드이고, 여기서 K는 G와 T/U로 구성된 군에서 선택되고; M은 A와 C로 구성된 군에서 선택되고; R은 A 와 G로 구성된 군에서 선택되고; 그리고 Y는 C와 T/U로 구성된 군에서 선택되고; 그리고
    m, p 및 q는 정수이며, m은 0이거나 2 내지 20이며, 그리고 p와 q는 0 내지 20이나, 단 두 개 정수가 0이 아닌 조건과, 그리고 N을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 최소 두 개 N 잔기를 가지며, 이때 두 개 N 잔기를 분리시키기 위해 최소 하나의 X 또는 Z 잔기를 가지는 조건이 더 포함됨;
    (b) 복수의 핵산-프라이머 이중나선을 복제하여 복제된 가닥의 라이브러리가 생성되는 단계, 여기서 복제된 가닥의 양은 단계(a)에서 이용된 표적 핵산의 양을 초과하며, 이는 표적 핵산 집단이 증폭되었음을 나타냄;
    을 포함하는, 표적 핵산 집단을 증폭시키는 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 화학식은 NmXp, NmZq, 그리고 XpZq로 구성된 군에서 선택되고 m은 2 내지 8이고, p와 q는 각각 1 내지 8이고, 그리고 이들 두 정수의 총합은 9인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, N을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 단지 3개의 연속 N 잔기를 보유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 각 올리고뉴클레오티드 프라이머는 서열 KNNNKNKNK, NKNNKNNKK, 그리고 NNNKNKKNK로 구성된 군에서 선택된 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 청구항 5에 있어서, 각 올리고뉴클레오티드 프라이머에는 5' 단부에 비-축퇴 뉴클레오티드 서열이 더 포함되며, 비-축퇴 서열은 복수의 올리고뉴클레오티드 가운데에서 불변이며, 불변 비-축퇴 서열의 길이는 14개 뉴클레오티드 내지 24개 뉴클레오티드가 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 청구항 5에 있어서, 표적 핵산의 복제는 Exo-Minus Klenow DNA 중합효소, Exo-Minus T7 DNA 중합효소, Phi29 DNA 중합효소, Bst DNA 중합효소, Bca 중합효소, Vent DNA 중합효소, 9°Nm DNA 중합효소, MMLV 역전사효소, AMV 역전사효소, HIV 역전사효소, 이들의 변이체, 그리고 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 효소에 의해 촉매되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 청구항 5에 있어서, 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 복제된 가닥의 라이브러리를 증폭시키는 것이 더 포함된 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 증폭은 복제된 가닥 및 프라이머 쌍 말단에 불변 부위에 실질적으로 상호적인 프라이머로 구성된 군에서 선택된 최소 하나의 프라이머를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 청구항 11에 있어서, 증폭된 라이브러리는 중합효소 연쇄 반응 동안 최소한 하나의 변형된 뉴클레오티드의 결합으로 표지되며, 변형된 뉴클레오티드는 형광-표지된 뉴클레오티드, 아미노알릴-dUTP, 브로모-dUTP, 그리고 디곡시게닌(digoxigenin)-표지된 뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 청구항 5에 있어서, 표적 핵산은 기계적 수단, 화학적 수단, 열적 수단 그리고 효소적 수단으로 구성된 군에서 선택된 방법에 의해 단편화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 청구항 11에 있어서, 표적 핵산은 DNA이며, 복제는 Exo-Minus Klenow DNA 중합효소에 의해 촉매되며, 그리고 증폭은 Taq DNA 중합효소에 의해 촉매되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 청구항 11에 있어서, 표적 핵산은 RNA이며, 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머에는 올리고 dT 프라이머가 더 포함되며, 복제는 MMLV 역전사효소 및/또는 Exo-Minus Klenow DNA 중합효소에 의해 촉매되고, 그리고 증폭은 Taq DNA 중합효소에 의해 촉매되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 복제는 올리고 dT 프라이머 및 MMLV 역전사효소를 이용하는 제1 반응과 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 Taq DNA 중합효소를 이용하는 제 2 반응을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 표적 핵산을 증폭시키는 키트에 있어서, 키트는:
    (a) 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 이때 각 올리고뉴클레오티드 프라이머는 화학식 NmXpYq을 포함하며 여기서:
    N은 아데노신(A), 시티딘(C), 구아노신(G), 그리고 티미딘/우리딘(T/U)로 구성된 군에서 선택된 4-배 축퇴 뉴클레오티드이며;
    X는 B, D, H, 그리고 V로 구성된 군에서 선택된 3-배 축퇴 뉴클레오티드이며, 여기서 B는 C, G, 그리고 T/U로 구성된 군에서 선택되고; D는 A, G 그리고 T/U로 구성된 군에서 선택되고; H는 A, C, 그리고 T/U로 구성된 군에서 선택되고; 그리고 V는 A, C, 그리고 G로 구성된 군에서 선택되고;
    Z는 K, M, R, 그리고 Y로 구성된 군에서 선택되는 2-배 축퇴 뉴클레오티드이고, 여기서 K는 G와 T/U로 구성된 군에서 선택되고; M은 A와 C로 구성된 군에서 선택되고; R은 A 와 G로 구성된 군에서 선택되고; 그리고 Y는 C와 T/U로 구성된 군에서 선택되고; 그리고
    m, p 및 q는 정수이며, m은 0이거나 2 내지 20이며, 그리고 p와 q는 0 내지 20이다; 그리고 단, 조건은 두 개 정수가 0이 아닌 조건과, 그리고 N을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 최소 두 개 N 잔기를 가지며, 두 개 N 잔기를 분리시키기 위해 최소 하나의 X 또는 Z 잔기를 가지는 조건이 더 포함됨; 그리고
    (b) 복제 효소를 포함하는, 표적 핵산을 증폭시키는 키트.
  19. 청구항 18에 있어서, 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 화학식은 NmXp, NmZq, 그리고 XpZq로 구성된 군에서 선택되고, m은 2 내지 8이고, p와 q는 각각 1 내지 8이고, 그리고 이들 두 정수의 총합은 9인 것을 특징으로 하는 키트.
  20. 청구항 19에 있어서, N을 포함하는 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 단지 3개의 연속 N 잔기를 보유하는 것을 특징으로 하는 키트.
  21. 청구항 20에 있어서, 각 올리고뉴클레오티드 프라이머는 KNNNKNKNK, NKNNKNNKK, 그리고 NNNKNKKNK로 구성된 군에서 선택된 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 키트.
  22. 청구항 19에 있어서, 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 올리고 dT 프라이머를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  23. 청구항 18에 있어서, 각 올리고뉴클레오티드 프라이머에는 5' 단부에 비-축퇴 뉴클레오티드 서열이 더 포함되며, 비-축퇴 서열은 복수의 올리고뉴클레오티드 가운데에서 불변이며, 불변 비-축퇴 서열의 길이는 14개 뉴클레오티드 내지 24개 뉴클레오티드가 되는 것을 특징으로 하는 키트.
  24. 청구항 18에 있어서, 복제 효소는 Exo-Minus Klenow DNA 중합효소, Exo-Minus T7 DNA 중합효소, Phi29 DNA 중합효소, Bst DNA 중합효소, Bca 중합효소, Vent DNA 중합효소, 9°Nm DNA 중합효소, MMLV 역전사효소, AMV 역전사효소, HIV 역전사효소, 이들의 변이체, 그리고 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
  25. 청구항 18에 있어서, Taq DNA 중합효소, Pfu DNA 중합효소, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 열안정성 DNA 중합효소를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.

KR1020107008170A 2007-10-15 2008-10-15 축퇴 올리고뉴클레오티드 및 이의 용도 KR101587664B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/872,272 2007-10-15
US11/872,272 US20090099040A1 (en) 2007-10-15 2007-10-15 Degenerate oligonucleotides and their uses

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20100074188A KR20100074188A (ko) 2010-07-01
KR101587664B1 true KR101587664B1 (ko) 2016-01-21

Family

ID=40534802

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020107008170A KR101587664B1 (ko) 2007-10-15 2008-10-15 축퇴 올리고뉴클레오티드 및 이의 용도

Country Status (6)

Country Link
US (5) US20090099040A1 (ko)
EP (1) EP2197894B1 (ko)
JP (1) JP5637853B2 (ko)
KR (1) KR101587664B1 (ko)
AU (1) AU2008312614A1 (ko)
WO (1) WO2009052128A1 (ko)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103060924B (zh) * 2011-10-18 2016-04-20 深圳华大基因科技有限公司 微量核酸样本的文库制备方法及其应用
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9567631B2 (en) 2012-12-14 2017-02-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
EP2885418A4 (en) 2012-08-14 2016-03-02 10X Genomics Inc MICROCAPSE COMPOSITIONS AND METHOD THEREFOR
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10584381B2 (en) 2012-08-14 2020-03-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
WO2014124336A2 (en) 2013-02-08 2014-08-14 10X Technologies, Inc. Partitioning and processing of analytes and other species
WO2015020227A1 (ja) 2013-08-09 2015-02-12 日立オートモティブシステムズ株式会社 減衰力調整式緩衝器
JP6726659B2 (ja) 2014-04-10 2020-07-22 １０エックス ジェノミクス， インコーポレイテッド 試薬をカプセル化およびパーティション化するための流体デバイス、システム、および方法、ならびにそれらの応用
CA2953374A1 (en) 2014-06-26 2015-12-30 10X Genomics, Inc. Methods of analyzing nucleic acids from individual cells or cell populations
CN114807307A (zh) 2014-10-29 2022-07-29 10X 基因组学有限公司 用于靶核酸测序的方法和组合物
US9975122B2 (en) 2014-11-05 2018-05-22 10X Genomics, Inc. Instrument systems for integrated sample processing
EP3244992B1 (en) 2015-01-12 2023-03-08 10X Genomics, Inc. Processes for barcoding nucleic acids
EP4286516A3 (en) 2015-02-24 2024-03-06 10X Genomics, Inc. Partition processing methods and systems
KR20170119710A (ko) 2015-02-24 2017-10-27 10엑스 제노믹스, 인크. 표적화된 핵산 서열 커버리지 방법
CN114774529A (zh) * 2015-11-19 2022-07-22 10X基因组学有限公司 可转化标记组合物、方法及结合其的过程
US11371094B2 (en) 2015-11-19 2022-06-28 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid processing using degenerate nucleotides
KR20180081164A (ko) 2015-12-04 2018-07-13 10엑스 제노믹스, 인크. 핵산 분석을 위한 방법 및 조성물
CN111621548A (zh) * 2016-04-26 2020-09-04 序康医疗科技（苏州）有限公司 扩增dna的方法
WO2017197338A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic systems and methods of use
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10011872B1 (en) 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CN110214186B (zh) 2017-01-30 2023-11-24 10X基因组学有限公司 用于基于微滴的单细胞条形编码的方法和系统
CN109526228B (zh) 2017-05-26 2022-11-25 10X基因组学有限公司 转座酶可接近性染色质的单细胞分析
US20180340169A1 (en) 2017-05-26 2018-11-29 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
CN111032882A (zh) * 2017-06-20 2020-04-17 伊鲁米那股份有限公司 解决扩增反应中低效的方法和组合物
WO2019084306A1 (en) * 2017-10-26 2019-05-02 University Of Florida Research Foundation, Inc. METHOD FOR REDUCING GENOMIC COMPLEXITY AND DETECTING POLYMORPHISMS
WO2019099751A1 (en) 2017-11-15 2019-05-23 10X Genomics, Inc. Functionalized gel beads
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
EP3720605A1 (en) * 2017-12-07 2020-10-14 Massachusetts Institute Of Technology Single cell analyses
EP3775271A1 (en) 2018-04-06 2021-02-17 10X Genomics, Inc. Systems and methods for quality control in single cell processing
CN111694961A (zh) * 2020-06-23 2020-09-22 上海观安信息技术股份有限公司 一种用于敏感数据泄露检测的关键词语义分类方法与系统
CN114015751A (zh) * 2021-10-26 2022-02-08 江苏海伯基因科技有限公司 扩增基因组dna的方法、试剂盒及其获得扩增引物的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6497880B1 (en) 1998-12-08 2002-12-24 Stressgen Biotechnologies Corporation Heat shock genes and proteins from Neisseria meningitidis, Candida glabrata and Aspergillus fumigatus
US6562572B1 (en) 2000-09-27 2003-05-13 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods for amplifying nucleic acid sequences
WO2004081225A2 (en) 2003-03-07 2004-09-23 Rubicon Genomics, Inc. Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a dna polymerization process
US20050202490A1 (en) 2004-03-08 2005-09-15 Makarov Vladimir L. Methods and compositions for generating and amplifying DNA libraries for sensitive detection and analysis of DNA methylation

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5498538A (en) * 1990-02-15 1996-03-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Totally synthetic affinity reagents
US6582908B2 (en) * 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
WO1993020096A1 (en) * 1991-05-08 1993-10-14 Stratagene Oligonucleotide libraries useful for producing primers
US5474796A (en) * 1991-09-04 1995-12-12 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface
US5663062A (en) * 1992-04-03 1997-09-02 Stratagene Oligonucleotide libraries useful for producing primers
US5731171A (en) * 1993-07-23 1998-03-24 Arch Development Corp. Sequence independent amplification of DNA
US6802659B2 (en) * 1996-08-07 2004-10-12 Mats Cremon Arrangement for automatic setting of programmable devices and materials therefor
US6124120A (en) * 1997-10-08 2000-09-26 Yale University Multiple displacement amplification
US6821724B1 (en) * 1998-09-17 2004-11-23 Affymetrix, Inc. Methods of genetic analysis using nucleic acid arrays
US6463537B1 (en) * 1999-01-04 2002-10-08 Codex Technologies, Inc. Modified computer motherboard security and identification system
US6792464B2 (en) * 1999-02-18 2004-09-14 Colin Hendrick System for automatic connection to a network
JP3329307B2 (ja) * 1999-03-16 2002-09-30 日本電気株式会社 携帯情報端末装置
JP4403471B2 (ja) * 1999-08-18 2010-01-27 ソニー株式会社 指紋照合装置及び指紋照合方法
US6980175B1 (en) * 2000-06-30 2005-12-27 International Business Machines Corporation Personal smart pointing device
US6379932B1 (en) * 2000-07-17 2002-04-30 Incyte Genomics, Inc. Single primer PCR amplification of RNA
US6910132B1 (en) * 2000-09-15 2005-06-21 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Secure system and method for accessing files in computers using fingerprints
WO2002044399A2 (en) * 2000-11-28 2002-06-06 Rosetta Inpharmatics, Inc. In vitro transcription method for rna amplification
DE10119468A1 (de) * 2001-04-12 2002-10-24 Epigenomics Ag Mikroarray-Verfahren zur Anreicherung von DNA-Fragmenten aus komplexen Mischungen
US6638722B2 (en) * 2001-06-13 2003-10-28 Invitrogen Corporation Method for rapid amplification of DNA
EP1275734A1 (en) * 2001-07-11 2003-01-15 Roche Diagnostics GmbH Method for random cDNA synthesis and amplification
US20030028883A1 (en) * 2001-07-30 2003-02-06 Digeo, Inc. System and method for using user-specific information to configure and enable functions in remote control, broadcast and interactive systems
WO2004081183A2 (en) * 2003-03-07 2004-09-23 Rubicon Genomics, Inc. In vitro dna immortalization and whole genome amplification using libraries generated from randomly fragmented dna
US20040259100A1 (en) * 2003-06-20 2004-12-23 Illumina, Inc. Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping
US20050147976A1 (en) * 2003-12-29 2005-07-07 Xing Su Methods for determining nucleotide sequence information
US20060017962A1 (en) * 2004-07-22 2006-01-26 Burdette Chris A Systems and methods of printer customization using radio frequency devices
US20060104224A1 (en) * 2004-10-13 2006-05-18 Gurminder Singh Wireless access point with fingerprint authentication
US20060121491A1 (en) * 2004-12-02 2006-06-08 Wolber Paul K Partially degenerate oligonucleotide standards and methods for generating the same
US20060180647A1 (en) * 2005-02-11 2006-08-17 Hansen Scott R RFID applications
US20060255127A1 (en) * 2005-05-14 2006-11-16 Woods Michael E System, method, and computer program product for biometric radiofrequency id

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6497880B1 (en) 1998-12-08 2002-12-24 Stressgen Biotechnologies Corporation Heat shock genes and proteins from Neisseria meningitidis, Candida glabrata and Aspergillus fumigatus
US6562572B1 (en) 2000-09-27 2003-05-13 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods for amplifying nucleic acid sequences
WO2004081225A2 (en) 2003-03-07 2004-09-23 Rubicon Genomics, Inc. Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a dna polymerization process
US20050202490A1 (en) 2004-03-08 2005-09-15 Makarov Vladimir L. Methods and compositions for generating and amplifying DNA libraries for sensitive detection and analysis of DNA methylation

Also Published As

Publication number Publication date
AU2008312614A1 (en) 2009-04-23
EP2197894A4 (en) 2011-07-06
KR20100074188A (ko) 2010-07-01
US20200248236A1 (en) 2020-08-06
US20210324449A1 (en) 2021-10-21
WO2009052128A1 (en) 2009-04-23
EP2197894B1 (en) 2013-09-25
JP2011500060A (ja) 2011-01-06
EP2197894A1 (en) 2010-06-23
JP5637853B2 (ja) 2014-12-10
US20150072899A1 (en) 2015-03-12
US20090099040A1 (en) 2009-04-16
US20190300933A1 (en) 2019-10-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101587664B1 (ko) 축퇴 올리고뉴클레오티드 및 이의 용도
JP6574178B2 (ja) リガーゼ支援核酸環状化及び増幅
US10988795B2 (en) Synthesis of double-stranded nucleic acids
JP2022002538A (ja) リガーゼ支援核酸環状化および増幅
JP2023002557A (ja) シングルプライマーからデュアルプライマーのアンプリコンへのスイッチング
US9938568B2 (en) Ligase-assisted nucleic acid circularization and amplification
US20220315972A1 (en) Single primer to dual primer amplicon switching
AU2022294211A1 (en) Methods, compositions, and kits for preparing sequencing library

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200106

Year of fee payment: 5