DE10119468A1

DE10119468A1 - Mikroarray-Verfahren zur Anreicherung von DNA-Fragmenten aus komplexen Mischungen

Info

Publication number: DE10119468A1
Application number: DE10119468A
Authority: DE
Inventors: Erik Leu; Juergen Distler
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2001-04-12
Filing date: 2001-04-12
Publication date: 2002-10-24
Also published as: WO2002083943A2; EP1379700A2; US20050009020A1; WO2002083943A3

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur selektiven Anreicherung von DNA-Abschnitten, die aus verschiedenen Geweben durch komplexe Amplifikationen erhalten werden und gewünschte Sequenzeigenschaften haben. Diese Eigenschaften der DNA-Fragmente, vor allem das Vorhandensein von 5-Methylcytosinen, sind durch Hybridisierung auf DNA-Microarrays identifizierbar. Die Anreicherung der gewünschten DNA-Fragemente erfolgt durch mehrmalige Wiederholung der Arbeitsschritte (Hybridisierung, Dehybridisierung und Reamplifikation). Die Amplifikate werden abschließend hinsichtlich ihrer Sequenz analysiert.

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur selektiven Anreicherung von DNA-Abschnitten mit gewünsch ten Sequenzeigenschaften aus komplexen DNA-Mischungen, die durch Amplifikationen hergestellt wurden. Diese durch die vorliegende Erfindung erhaltenen angereicherten DNA- Fragmente können dann durch Standardverfahren eingehender analysiert werden.

Stand der Technik

Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine Methode, mit der im Prinzip jede DNA selektiv amplifiziert werden kann. Diese Methode beinhaltet den Gebrauch eines Satzes von meist zwei Oligonukleotiden mit vorbestimmter Se quenz, den sogenannten Primern, die an zu ihnen komple mentäre DNA Stränge hybridisieren und die Grenzen für die zu amplifizierende Sequenz definieren.

Die Oligonukleotide initiieren die DNA Synthese, die durch eine thermostabile DNA Polymerase katalysiert wird. In jeder Runde der Synthese erfolgt typischerweise ein Schmelz- und ein Reannelierungsschritt. Dies erlaubt es, eine gegebene DNA Sequenz um mehrere Größenordnungen in weniger als einer Stunde zu amplifizieren.

Durch die Einfachheit und Reproduzierbarkeit dieser Reak tionen hat die PCR eine weite Akzeptanz erreicht. Zum Beispiel wird die PCR für die Diagnose ererbter Fehlfunk tionen und bei Verdacht auf Erkrankungen verwendet.

Es sind auch PCR Reaktionen bekannt, die mehr als zwei verschiedene Primer einsetzen. Meist dienen sie zur Amplifikation mehrerer, ebenfalls wenigstens zum großen Teil in ihrer Basensequenz bekannter Fragmente gleichzei tig in einem Gefäß. Auch in diesem Fall binden die einge setzten Primer spezifisch an bestimmte Abschnitte der Templat DNA. Man spricht in solchen Fällen von "Multip lex-PCR", meist hat sie nur zum Ziel, mehrere spezifische Fragmente gleichzeitig amplifizieren zu können und so Ma terial und experimentellen Aufwand einzusparen.

Oft wird jedoch auch eine Amplifikation einer gegebenen Probe durchgeführt, einfach um das Material für eine nachfolgende Untersuchung zu vermehren. Die zu untersu chende Probe wird in diesem Fall zunächst amplifiziert, entweder ausgehend von genomischer DNA oder RNA. Meist ist es erforderlich, mindestens einen der Primer zu mar kieren, z. B. mit einem Fluorenzenzfarbstoff, um das Fragment in nachfolgenden Experimenten identifizieren zu können.

Diese amplifizierte DNA wird für die Identifikation von Mutationen und Polymorphismen benutzt. Als analytische Methode dafür kommt z. B. die Primer Extension Reaktion, Sequenzierung nach Sanger oder z. B. Restriktionsverdaus und nachfolgende Untersuchung auf z. B. Agarosegelen in Frage und Hybridisierung auf DNA Microarrays.

Während die Untersuchung von Proben-DNA mit Primeroligo nukleotiden vorbestimmter Sequenz Stand der Technik ist, fehlt ein Verfahren, das die Reinigung und Identifikation von DNA-Fragmenten mit gewünschten Sequenzeigenschaften aus komplexen Mischungen von DNA-Molekülen ermöglicht, wie sie durch Multiplex PCR oder Random PCR Reaktionen erhalten werden.

Komplexe PCR-Amplifikationen, z. B. "whole genome ampli fications" (Random PCR), werden zur simultanen Verviel fältigung einer Vielzahl von Fragmenten aus DNA-Proben genutzt. Die erhaltenen, hochdiversen Fragmente können unter anderem für Genotypisierungen, Mutationsanalyse und verwandte Themenbereiche genutzt werden.

Eine Übersicht über den Stand der Technik in der Oligomer Array Herstellung läßt sich aus einer im Januar 1999 er schienenen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Ge netics Supplement, Volume 21, January 1999), der dort zi tierten Literatur und dem US-Patent 5994065 über Methoden zur Herstellung von festen Trägern für Zielmoleküle wie Oligonukleotide entnehmen. Neben Desoxyribonucleic Acids (DNA) können auch Peptide Nucleic Acids (PNA) oder Locked Nucleic Acids (LNA) auf der Oberfläche von Oligomer- Arrays fixiert werden.

Peptide Nucleic Acids (PNA) (Nielsen, P. E., Buchardt, O., Egholm, M. and Berg, R. H. 1993. Peptide nucleic acids. US Patent. 5,539,082; Buchardt, O., Egholm, M., Berg, R. H. and Nielsen, P. E. 1993. Peptide nucleic acids and their potential applications in biotechnology. Trends in Bio technology, 11: 384-386) haben ein ungeladenes Rückgrat, welches gleichzeitig chemisch sehr stark von der gängigen Zucker-Phosphat Struktur des Rückgrats in Nukleinsäuren abweicht. Das Rückgrat einer PNA hat eine Amidsequenz an stelle des Zucker-Phosphat Rückgrats gewöhnlicher DNA. PNA hybridisiert sehr gut mit DNA komplementärer Sequenz. Die Schmelztemperatur eines PNA/DNA-Hybrids ist höher als die des entsprechenden DNA/DNA-Hybrids und die Abhängig keit der Hybridisierung von Puffersalzen ist relativ ge ring.

Locked Nucleic Acids (LNA) (Nielson et al. (1997 J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 3423); Koshkin et al. (1998 Tetrahedron Letters 39, 4381); Singh & Wengel (1998 Chem. Commun. 1247); Singh et al. (1998 Chem. Commun. 455) ha ben eingebaute "interne Brücken". Die Synthese von LNA und ihre Eigenschaften wurden von zahlreichen Autoren be schrieben. So wie PNA weist LNA eine größere thermische Stabilität bei der Paarung mit DNA auf, als herkömmliche DNA/DNA Hybride.

5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt bei spielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkripti on, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Inte resse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5- Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR- Amplifikation die epigenetische Information, welche die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.

Eine relativ neue und die mittlerweile am häufigsten an gewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5- Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5- Methylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umge wandelt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unter schieden werden kann, jetzt durch "normale" molekularbio logische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin bei spielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann. Alle diese Tech niken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausge nutzt wird.

Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu unter suchende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit rea giert nur an einzelsträngiger DNA) verhindert und alle Fällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and im proved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15; 24(24): 5064-6). Mit dieser Methode können einzelne Zellen untersucht wer den, was das Potential der Methode veranschaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine globale Untersu chung von Zellen auf Tausenden von möglichen Methylie rungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus gerin gen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren.

Eine Übersicht über die weiteren bekannten Möglichkeiten, 5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Ü bersichtsartikel entnommen werden: Rein T, DePamphilis ML, Zorbas H. Identifying 5-methylcytosine and related modifications in DNA genomes. Nucleic Acids Res. 1998 May 15; 26(10): 2255-64.

Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler W, Hor sthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic me thylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Ge net. 1997 Mar-Apr; 5(2): 94-8) nur in der Forschung ange wendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifziert und entweder komplett sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet. 1997 Nov; 17(3): 275-6) oder einzelne Cytosin- Positionen durch eine "Primer-Extension-Reaktion" (Gon zalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15; 25(12): 2529-31, WO-Patent 9500669) oder einen Enzymschnitt (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15; 25(12): 2532-4) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung auf DNA- Microarrays beschrieben worden (Olek et al., WO 99 28498).

Zur Analyse der PCR-Produkte können diese z. B. mit einer Fluoreszenz-Markierung oder radioaktiven Markierung ver sehen werden. Diese Markierungen können entweder an den Primern oder an den Nukleotiden angebracht werden. Beson ders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist das einfa che Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'-Ende der jeweiligen Primer. Ferner kommen als Fluoreszenzfarbstof fe 6-Carboxyfluoreszin (FAM), Hexachlor-6- carboxyfluoreszin (HEX), 6-Carboxy-x-rhodamin (ROX) oder Tetrachlor-6-carboxyfluoreszin (TET) in Frage.

Wie gezeigt, ist es gegenwärtig üblich, zur Identifizie rung von Cytosin-Methylierungen die Proben-DNA mit Bisul fit zu behandeln und nachfolgend zur Identifikation Pri meroligonukleotide bekannter Sequenz einzusetzen. Es fehlt jedoch ein Verfahren, zur selektiven Anreicherung von DNA-Abschnitten aus komplexen DNA-Molekül-Mischungen.

Aufgabenstellung

Es soll ein Verfahren bereitgestellt werden, dass es er möglicht, DNA-Fragmente, die aus verschiedenen Geweben durch PCR-Reaktionen erhalten wurden und eine gewünschte Sequenzeigenschaft haben, effizient anzureichern. Die An reicherung der gewünschten DNA-Fragmente soll durch Hybridisierung, Dehybridisierung und Reamplifikation der dehybridisierten DNA-Fragmente erfolgen, wobei die Anrei cherung des gewünschten DNA-Fragments durch mehrmalige Wiederholung der Arbeitsschritte (Hybridisierung, De hybridisierung und Reamplifikation) erfolgen soll. Der Vorteil des Verfahrens soll darin liegen, dass unbekannte DNA-Fragmente identifiziert werden können, die durch kom plexe Amplifikationen (Multiplex und Random PCR) erzeugt wurden, bei denen die verwendeten Primer bekannt, jedoch die erzeugte DNA-Fragment-Mischung unbekannt ist. Die ge wünschten Eigenschaften der gesuchten DNA-Fragmente, vor allem das Vorhandensein von 5-Methylcytosinen, sollen durch Hybridisierung, in erster Linie auf Oligonukleotid- Microarrays, identifizierbar sein.

Beschreibung

Beschrieben wird ein Verfahren zur selektiven Anreiche rung einzelner spezifischer PCR-Fragmente aus komplexen Fragmentmischungen, die durch komplexe PCR- Amplifikationen erzeugt wurden. Die Anreicherung der Fragmente basiert auf deren individuellen Hybridisierung seigenschaften, die bevorzugt mit Oligonukleotid-Arrays analysiert werden. Im Einzelnen besteht das Verfahren aus folgenden Schritten:

1. Die DNA Abschnitte werden durch Amplifikationsverfah ren, die komplexe Amplifikatmischungen erzeugen, vorzugs weise in Gegenwart einer thermostabilen DNA-Polymerase, hergestellt und gleichzeitig markiert. Bevorzugt werden die Fragmente hierbei durch Multiplex-PCR-Reaktionen oder in Random-PCR-Reaktionen erzeugt.
Die Markierungen der Amplifikationsprodukte für die fol genden Hybridisierungsexperimente können bevorzugt durch die Verwendung von Primer-Oligonukleotiden in der PCR- Reaktion erfolgen, die vorzugsweise mit Fluoreszenzfarb stoffen mit unterschiedlichem Emissionsspektrum (z. B. Cy3, Cy5, FAM, HEX, TET oder ROX) oder mit Fluoreszenz farbstoff-Kombinationen im Falle von Energietransfer- Fluoreszenzfarbstoff markiert sind.
Die Markierungen der Primer-Oligonukleotide können bevor zugt auch mit Radionukliden oder vorzugsweise mit ablös baren Massenmarkierungen durchgeführt werden, die in ei nem Massenspektrometer nachgewiesen werden. Bevorzugt können auch zur Markierung Moleküle verwendet werden, die erst in einer weiteren chemischen Reaktion ein Signal er zeugen.
Die Markierungen der PCR-Produkte können vorzugsweise auch durch fluoreszenz- oder radionukleotid-markierte DNA-Nukleotidbausteine erfolgen, die in den PCR- Reaktionen eingesetzt werden.
Die benötigten Nukleinsäuren, die als Templat für die PCR-Reaktionen dienen, werden bevorzugt aus einer genomi schen DNA-Probe erhalten, wobei Quellen für DNA z. B. Zelllinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn- Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin einbettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologische Präpara te und alle möglichen Kombinationen hiervon umfassen.
Diese Nukleinsäuren können bevorzugt chemisch behandelt werden.
Die chemische Behandlung umfasst vorzugsweise das Einbet ten der DNA in Agarose und nachfolgend bevorzugt die Um setzung der Nukleinsäureprobe mit einer Bisufitlösung (= Disulfit, Hydrogensulfit), wobei 5-Methylcytosin unverän dert bleibt und Cytosin in Uracil oder eine andere im Ba senpaarungsverhalten dem Uracil ähnliche Base umgewandelt wird. Bei der chemischen Behandlung kann auch bevorzugt ein die DNA-Duplex denaturierendes Reagenz und/oder ein Radikalfänger eingesetzt werden.
Als Templat für eine RT-PCR können auch RNA-Präparationen unterschiedlicher Zellen und Gewebe z. B. Zelllinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks- Flüssigkeit, in Paraffin einbettetes Gewebe, beispiels weise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prosta ta, Lunge, Brust oder Leber, histologische Präparate und alle Kombinationen hiervon dienen, die mit reverser Transkription in DNA umgewandelt werden.
Die Fragmente können alternativ zu der schon beschriebe nen Vorgehensweise bevorzugt auch nach der PCR- Amplifikation, durch bekannte molekularbiologische Ver fahren markiert werden.
2. Die komplexe Mischung markierter DNA-Fragmenten, die durch eine, unter Punkt 1 beschriebene, komplexe PCR- Amplifikation erzeugt wurden, wird bevorzugt auf Oligo mer-Arrays (Screening-Arrays) hybridisiert, die unter schiedliche Oligonukleotide, PNA-Oligomere oder LNA- Oligomere tragen.
Die Oligonukleotide, PNA-Oligomere oder LNA-Oligomere sind vorzugsweise auf der Festphase in Form eines recht winkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet.
Die an den Amplifikaten angebrachten Markierungen sind vorzugsweise an jeder Position der Festphase identifi zierbar, an der sich eine Oligonukleotidsequenz befindet, sofern an dieser Position eine Hybridisierung stattfand.
3. Für die Anreicherung gewünschter DNA-Fragmente werden zunächst, die durch ein Hybridisierungsereignis mit Oli gonukleotiden auf dem Oligomer-Array reversibel gebunde nen DNA-Fragmente, durch einen Dehybridisierungsschritt abgelöst.
In einem bevorzugten Verfahren wird die Dehybridisierung des gesamten Oligomer-Arrays nicht in einem Schritt durchgeführt, sondern es werden ausgewählte Teilbereiche des Oligomer-Arrays getrennten Dehybridisierungsschritten unterzogen.
Die so gewonnenen PCR-Fragmente dienen als Templat für eine zweite PCR-Reaktion, die mit den Reaktionsbedingun gen der ersten PCR-Reaktion durchgeführt wird, die die ursprüngliche komplexe Mischung von DNA-Fragmenten er zeugte.
4. Für die Anreicherung gewünschter DNA-Fragmente werden folgende weiteren Verfahrensschritte durchgeführt:
- 1. 4.1 Die Amplifikate dieser zweiten PCR-Reaktion werden auf einen neuen Oligomer-Array (Identifikationsarray) hybridisiert. Dieser Identifikationsarray trägt Oligo nukleotide, PNA-Oligomere oder LNA-Oligomere die mit der ursprünglichen Fragmentmischung in gewünschter Weise hybridisierten. Die Anzahl der Oligonukleotide, PNA- Oligomere oder LNA-Oligomere auf dem Identifikationsarray ist im Vergleich zum Screening-Array signifikant gerin ger.
- 2. 4.2 Die durch ein Hybridisierungsereignis mit Oligonukle otiden auf dem Identifikation-Array reversibel gebundenen DNA-Fragmente, werden durch einen Dehybridisie rungsschritt abgelöst.
- 3. 4.3 Wurden in der zweiten PCR-Amplifikation noch zu viele DNA-Fragmente erzeugt, so werden die Verfahrensschritte 4.1 und 4.2 mehrmals, bevorzugt 2 bis 5 Male wiederholt. Beispielsweise sind die dehybridisierten Fragmente Templat einer dritten PCR-Reaktion. Die Reaktionsbedin gungen auch dieser PCR sind identisch mit den Bedingungen der ersten PCR-Amplifikation. In diesen Wiederholungs schritten, können a) identische Identifikations-Arrays verwendet werden, b) Identifikations-Arrays mit einer re duzierten Anzahl gebundener Oligonukleotide verwendet werden oder c) schrittweise selektivere Bedingungen für die Dehybridisierung (siehe 4.2) gewählt werden.
5. Die Amplifikate der letzten PCR können, bei entspre chend geringer Komplexität der unterschiedlichen Amplifi kate, nun mit bekannten molekularbiologischen Verfahren (z. B. Klonierung und DNA-Sequenzierung) identifiziert werden.

Mit diesem Verfahren ist es möglich, DNA-Fragmente mit gewünschten Sequenzeigenschaften anzureichern (DNA- und RNA-Targetidentifizierung), wenn immer diese durch Hybri disierung identifizierbar sind. Es eignet sich daher be vorzugt zur Anreicherung von DNA-Fragmenten, die an defi nierten CpG-Positionen Methylierungsunterschiede zeigen. Mit diesem Verfahren können auch DNA-Fragmente angerei chert werden, die definierte SNPs tragen. Wird RNA als Templat für die erste PCR verwendet, können z. B. DNA- Fragmente aus Genen, die selektiv in bestimmten Geweben transkribiert werden, angereichert werden.

Gleichzeitig kann dieses Verfahren für den Aufbau eines Screening-Assays angewandt werden, der es ermöglicht Zielorte für pharmazeutische Wirkstoffe zu identifizie ren, die z. B. in die DNA-Methylierung oder die RNA- Transkription eingreifen.

Die Identifizierung von Genen, die diagnostisch relevant sind für die nachfolgenden Erkrankungen ist entscheidend für die Bestimmung von Zielorten für pharmazeutische Wirkstoffe und die Entwicklung neuer Medikamente gegen Krebserkrankungen; CNS-Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit; Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psychotische Störungen und Persönlichkeitsstörungen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des gastroin testinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krank heit des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infekti on, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krank heit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabolische Fehlfunktion, Schädi gung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder sexuelle Fehl funktion.

Das Verfahren wird bevorzugt verwendet zur Unterscheidung von Zelltypen oder Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung:

Beispiel 1 Herstellung einer komplexen Mischung von DNA- Fragmenten durch PCR-Amplifikation für eine DNA- Methylierungsanalyse

Im ersten Schritt wird genomische DNA aus gesundem Kon trollgewebe und einer Tumorprobe mit dem DNA Extraction Kit (Stratagene, La Colla, USA) isoliert und unter Ver wendung von Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) derart behandelt, dass alle nicht an der 5-Position der Base me thylierten Cytosine so verändert werden, dass eine hin sichtlich dem Basenpaarungsverhalten unterschiedliche Ba se entsteht, während die in 5-Position methylierten Cyto sine unverändert bleiben. Wird für die Reaktion Bisulfit verwendet, so findet an den nicht methylierten Cytosinba sen eine Addition statt. Zudem müssen ein denaturierendes Reagenz oder Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger zuge gen sein. Eine anschließende alkalische Hydrolyse führt dann zur Umwandlung von nichtmethylierten Cytosin- Nukleobasen in Uracil. Diese umgewandelte DNA dient dazu, methylierte Cytosine nachzuweisen.

Im zweiten Verfahrensschritt verdünnt man die behandelte DNA-Probe mit Wasser oder einer wässrigen Lösung. Bevor zugt wird anschliessend eine Desulfonierung der DNA (10- 30 min. 90-100°C) bei alkalischem pH-Wert durchgeführt.

Im dritten Schritt des Verfahrens werden DNA-Fragmente in einer Polymerasekettenreaktion mit einer hitzebeständigen DNA-Polymerase amplifiziert. Im vorliegenden Fall wird eine komplexe Mischung von markierten DNA-Fragmenten der Bisulfit behandelten DNA-Präparationen des Kontrollgewe bes und der Tumorprobe durch PCR hergestellt. Hierfür werden die beiden DNA-Präparationen mit 128 Oligonukleo tid-Primerpaaren, die zur Hälfte mit dem Fluoreszens farbstoff Cy5 markiert sind, in eine PCR-Reaktion einge setzt. In dieser PCR wird eine Mischung von mindestens 64 DNA-Fragmenten mit einer Länge von ca. 200-950 Basenpaare hergestellt. Diese Amplifikate dienen als Probe, die an vorher an eine Festphase gebundene Oligonukleotide (Oli gonukleotid-Array) unter Ausbildung einer Duplexstruktur hybridisieren. Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts beruht auf Cy5 fluoreszensmarkierten Primeroligonukleoti den, die für die Amplifikation verwendet wurden. Nur wenn in der Bisulfit behandelten DNA, z. B. im Sequenzkontext GGATTTAGCGGTAAGTAT, ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt es zu einer Hybridisierungsreaktion der ampli fizierten DNA mit diesem Oligonukleotid. Somit entschei det der Methylierungsstatus des jeweiligen zu untersu chenden Cytosins über das Hybridisierungsprodukt.

Im vierten Schritt des Verfahrens werden die aus den bei den DNA-Präparationen amplifizierten DNA-Fragmente je weils mit einem Oligonukleotid-Array, an den 500-2048 O ligonukleotide gebunden sind, hybridisiert und die Fluo reszenssignale mit einem handelsüblichen Chipscanner (Ge nepix 4000, Axon Instruments) quantitativ analysiert.

Beispiel 2 Identifikation von DNA-Fragmenten mit unter schiedlichem Methylierungsstatus

Oligonukleotide, die nach der Hybridisierung (siehe Bei spiel 1) mit DNA-Fragmenten, amplifiziert aus dem Kon trollgewebe, im Gegensatz zu Amplifikaten aus dem Tumor gewebe, Hybridisierungssignale zeigten, wurden für die Herstellung eines neuen Oligonukleotid-Arrays (Identifi kationsarray) verwendet.

Im Verfahren wurden dann folgende Schritte durchgeführt:

1. Bisulfit behandelte DNA aus dem Kontrollgewebe wird als Templat für eine PCR-Amplifikation verwendet (siehe Bei spiel 1, Punkt 3)
2. Der Identifikationsarray wurde mit den Amplifikaten aus dem Kontrollgewebe hybridisiert und
3. anschließend wurden die durch Hybridisierung am Array gebundenen DNA-Fragmente, durch eine Dehybridisierung des Identifikationsarrays, vorzugsweise durch eine Inkubation mit Wasser bei 75°C, isoliert.
4. Diese DNA-Fragmente wurden in einer PCR-Reaktion mit den gleichen 128 Oligonukleotid-Primerpaaren (siehe Bei spiel 1 Punkt 3) eingesetzt. Die Agarosegelanalyse dieser PCR-Reaktion zeigte eine DNA-Fragmentmischung, die im Vergleich zum Beispiel 1 eine verringerte Komplexität aufwies.
5. Die durch die Dehybridisierung des Identifikationsar rays gewonnen Fragmente dienen als Templat für eine PCR- Reaktion mit den 128 Oligonukleotid-Primerpaaren (siehe Beispiel 1 Punkt 3).
6. Die PCR-Amplifikate aus Punkt 5) werden erneut mit dem Identifikationsarray hybridisiert.

Die Schritte 3-6 wurden so lange wiederholt bis nur noch einzelne DNA-Fragmente bei der Agarosegelanalyse identi fiziert werden konnten. Diese Fragmente konnten dann mit bekannten Verfahren (z. B. Klonierung und Sequenzierung) analysiert werden.

Claims

1. Verfahren zur selektiven Anreicherung einzelner spe zifischer PCR-Fragmente aus komplexen Fragmentmi schungen, dadurch gekennzeichnet, dass die folgenden Schritte ausgeführt werden:

a) die DNA Abschnitte werden durch Amplifikationsver fahren hergestellt, die komplexe Amplifikatmischun gen erzeugen und dabei gleichzeitig markiert;
b) die Amplifikate werden auf Oligomer-Arrays hybri disiert, die unterschiedliche Oligonukleotide tragen;
c) die auf den Oligomer-Arrays hybridisierten PCR- Amplifikate werden von den Oligonukleotiden abgelöst und dienen als Templat für eine erneute PCR- Amplifikation und nachfolgende Hybridisierung ent sprechend den Schritten a) und b);
d) der Schritt c) wird mehrmals wiederholt;
e) die Amplifikate werden identifiziert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Komplexität des Arrays bei jeder Wiederho lung des Schritts c) reduziert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dass die Amplifikate in Schritt c) vom gesamten Array oder von ausgewählten Teilbereichen des Arrays abgelöst werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die PCR-Amplifikationsverfahren in Schritt a) entweder Multiplex-PCR-Reaktionen oder Random-PCR- Reaktionen sind.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) die zu amplifizierenden DNA- Abschnitte chemisch behandelt sind.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) die Nukleinsäureprobe mit einem Reagenz chemisch umgesetzt wird, wobei 5- Methylcytosin unverändert bleibt und Cytosin in Ura cil oder eine andere im Basenverhalten dem Uracil ähnliche Base umgewandelt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Reagenz um ein Bisulfit (= Hydrogensulfit, Disulfit) handelt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5, 6 oder 7 da durch gekennzeichnet, dass die chemische Behandlung nach Einbetten der DNA in Agarose erfolgt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5, 6 oder 7 da durch gekennzeichnet, dass bei der chemischen Behand lung ein die DNA-Duplex denaturierendes Reagenz und/oder ein Radikalfänger zugegen ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) die zu amplifizierenden Abschnitte aus RNA bestehen und mit reverser Transkription in DNA umgewandelt werden.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Oligonukleotiden in Schritt b) und c) um DNA, PNA oder LNA-Oligomere handelt.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) und c) die Fragmente alternativ nach der PCR-Amplifikation oder nach der Reamplifika tion markiert werden.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die PCR-Amplifikationen in Gegenwart einer thermostabilen Polymerase durchgeführt werden.

14. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Markie rungen der Primer-Oligonukleotide oder DNA- Nukleotidbausteine um Fluoreszenzfarbstoffe mit un terschiedlichem Emissionsspektrum (z. B. Cy3, Cy5, FAM, HEX, TET oder ROX) oder um Fluoreszenzfarbstoff- Kombinationen im Falle von Energietransfer- Fluoreszenzfarbstoff markierten Primer- Oligonukleotiden oder DNA-Nukleotidbausteinen han delt.

15. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen Radio nuklide sind.

16. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen ablös bare Massenmarkierungen sind, die in einem Mas senspektrometer nachgewiesen werden.

17. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Markierung Moleküle verwendet werden, die erst in einer weiteren chemi schen Reaktion ein Signal erzeugen.

18. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotide auf einer Festphase in Form eines rechtwinkligen oder he xagonalen Gitters angeordnet sind.

19. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass an den Amplifikaten angebrachte Markierungen an jeder Position der Festpha se, an der sich eine Oligonukleotidsequenz befindet, identifizierbar sind.

20. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei die DNA-Abschnitte oder RNA-Proben, die mit re verser Transkription in DNA umgewandelt werden, aus einer genomischen Probe erhalten wurden, wobei Quel len für DNA oder RNA z. B. Zelllinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Pa raffin einbettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologische Präparate und alle möglichen Kombinationen hiervon umfassen.

21. Verwendung eines Verfahrens nach einem der voranste henden Ansprüche zur Identifizierung von Genen, die diagnostisch relevant sind für Erkrankungen aus einer der folgenden Kategorien: Krebserkrankungen; CNS- Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit; Aggressions symptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psycho logische und soziale Konsequenzen von Gehirnschädi gungen; psychotische Störungen und Persönlichkeits störungen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kar diovaskuläre Krankheit, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des gastroin testinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehl funktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabo lische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopf schmerzen oder sexuelle Fehlfunktion.

22. Verwendung eines Verfahrens nach einem der voranste henden Ansprüche zur Unterscheidung von Zelltypen o der Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferen zierung.