EP1268856A2 - Detektion von snp's und cytosin-methylierungen - Google Patents

Detektion von snp's und cytosin-methylierungen

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Publication number
EP1268856A2
EP1268856A2 EP01923891A EP01923891A EP1268856A2 EP 1268856 A2 EP1268856 A2 EP 1268856A2 EP 01923891 A EP01923891 A EP 01923891A EP 01923891 A EP01923891 A EP 01923891A EP 1268856 A2 EP1268856 A2 EP 1268856A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
single nucleotide
nucleotide polymorphisms
oligonucleotides
genomic dna
detection
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01923891A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Alexander Olek
Christian Piepenbrock
Kurt Berlin
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Epigenomics AG
Original Assignee
Epigenomics AG
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Filing date
Publication date
Application filed by Epigenomics AG filed Critical Epigenomics AG
Publication of EP1268856A2 publication Critical patent/EP1268856A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
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    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention describes a representative set of oligonucleotides or PNA (peptide nucleic acid) oligomers which are particularly suitable for simultaneously detecting SNPs (single nucleotide polymorphisms) and cytosine methylations in genomic DNA samples to distinguish cell types. and a method used.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • cytosine methylations in genomic DNA samples to distinguish cell types.
  • the human genome project the first sequencing of the human genome, will be completed in the next few years. This project will make it possible to identify all of the approximately 100,000 genes. Sequence information opens up undreamt-of possibilities for elucidating gene functions. This in turn opens up the possibility of doing pharmacogenetics and pharmacogenomics.
  • Pharmacogenetics and pharmacogenomics target the use of drugs depending on a genotype. The aim is to increase the effectiveness of medication.
  • the necessary intermediate step is the determination of the position lymorphisms and genotypes associated with a particular response. Therefore, increasingly efficient genotyping methods are required.
  • Microsatellites are highly polymorphic, i.e. they have a variety of alleles. They are characterized in that a repetitive sequence element with a different number of repetitions for different alleles is franked by conserved sequences. There is an average of one microsatellite marker per million bases. A map of 5,000 positioned microsatellite markers has been published by CEPH. Microsatellites are genotyped by determining the size of a PCR product with primers of the conserved, flanking sequence. The fluorescence-labeled PCR products are separated on gels.
  • SNP markers There are comparatively few described SNP markers. A card with 300,000 SNP markers is currently being developed by the SNP consortium and will be publicly available. Once the SNP markers have been identified, they can be assigned to genomic positions. The goal is to map 150,000 SNP markers by 2001 (Mashall, E. (1999); Science, 284, 406-407). There are a handful of genotyping methods for SNPS. Some are based on the separation of products on gels, such as the oligonucleotide ligase assay (OLA). It is therefore more suitable for medium throughput. Others rely on pure hybridization, which, however, does not have the same stringency. DNA arrays (DNA chips) are suitable for the analysis of a large number of SNPs in a limited number of individuals.
  • OVA oligonucleotide ligase assay
  • MALDI Matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry
  • MALDI has revolutionized the analysis of biomolecules (Karas, M. & Hillenkamp, F. Anal. Che. 60, 2299-2301 (1988)).
  • MALDI has been used in various variants for the analysis of DNA. The variants range from primer extension to sequencing (Liu, Y.-H., et al. Rapid Comraun. Mass Spectrom. 9, 735-743 (1,995); Ch'ang, L.-Y., et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 9, 772-774 (1995); Little, DP, et al. J. Mol. Med.
  • 5-methylcytosine The most frequently covalently modified base in the DNA of eukaryotic cells is 5-methylcytosine. For example, it plays a role in the regulation of transcription, in genetic imprinting and in tumorigenesis. The identification of 5-methylcytosine as a component of genetic information is therefore of considerable interest. However, 5-methylcytosine positions cannot be identified by sequencing since 5-methylcytosine has the same base pairing behavior as cytosine. In addition, in the case of PCR amplification, the epigenetic information which the 5-methylcytosines carry is completely lost.
  • the state of the art in terms of sensitivity is defined by a method which includes the DNA to be examined in an agarose matrix, thereby preventing the diffusion and renaturation of the DNA (bisulfite only reacts on single-stranded DNA) and all precipitation and purification steps replaced by rapid dialysis (Olek, A. et al., Nucl. Acids. Res. 1996, 24, 5064-5066).
  • This method individual cells can be examined, which illustrates the potential of the method.
  • only individual regions up to approximately 3000 base pairs in length have so far been investigated; global examination of cells for thousands of possible methylation analyzes is not possible.
  • this method too, cannot reliably analyze very small fragments from small sample quantities. Despite the diffusion protection, these are lost through the matrix.
  • Fluorescent-labeled probes have been used in many cases for scanning an immobilized DNA array.
  • the simple attachment of Cy3 and Cy5 dyes to the 5 'OH of the respective probe is particularly suitable for fluorescent labels.
  • the fluorescence of the hybridized probes is detected, for example, using a confocal microscope.
  • the dyes Cy3 and Cy5, among many others, are commercially available. task
  • the present invention is intended to provide a set of oligonucleotides or PNA oligomers and a method which are particularly suitable for the simultaneous detection of SNPs (single nucleotide polymorphisms) and cytosine methylations in genomic DNA samples.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • cytosine methylations in genomic DNA samples.
  • the task is therefore solved by a set of oligonucleotides or PNA (peptide nucleic acid) oligomers for the detection of single nucleotide polymorphisms (SNPs, single nucleotide polymorphisms) and for the detection of the cytosine methylation state in chemically pretreated genomic DNA, the base sequences being selected are from SEQ-ID: 1 to SEQ-ID: 382046.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • the set according to the invention includes both the base sequences with the SEQ-ID: 1 to SEQ-ID: 382046 itself and / or those by extending, shortening or changing the sequences mentioned with the SEQ-ID: 1 to SEQ-ID : 382046 contains.
  • the sentence according to the invention can thus be composed according to the invention from unchanged sequences and / or sequences modified in the manner according to the invention.
  • the present invention describes a set of oligomer probes (oligonucleotides and / or PNA oligomers) for the detection of single nucleotide polymorphisms and / or the cytosine methylation state in chemically pretreated genomic DNA, which is particularly preferably at least 10 of the listed oligonucleotide or PNA
  • the set of oligomer probes for the detection of single nucleotide polymorphisms and / or the cytosine methylation state in chemically pretreated genomic DNA comprises at least 100
  • Oligonucleotide or PNA sequences selected from the sequences SEQ-ID: 1 to SEQ-ID: 382046, or at least 100 PNA oligomers or oligonucleotide sequences, which in turn comprise the sequences listed there, namely the sequences SEQ-ID: 1 to SEQ ID: 382046.
  • the set of oligonucleotides for the detection of single nucleotide polymorphisms and the cytosine methylation state in the chemically pretreated genomic DNA is particularly preferably characterized in that the majority of the base sequences at the 5 'end and / or at the 3' end are each extended by a further base, the bases can be A, T or C.
  • the set of oligonucleotides for the detection of single nucleotide polymorphisms and the cytosine methylation state in the chemically pretreated genomic DNA is particularly preferably once again characterized in that the base sequences at the 5 'end and / or at the 3' end are in each case extended by a further base , where the bases can be A, T or G.
  • the set of oligonucleotides for the detection of single nucleotide polymorphisms and the cytosine methylation state in the chemically pretreated genomic DNA is preferably characterized in that the base sequence sequences at the 5 'end and / or at the 3' end are in each case extended by at least two further bases, where the bases can be A, T or C.
  • the set of oligonucleotides for the detection of individual nucleotide polymorphisms and the cytosine methylation state in the chemically pretreated genomic DNA is preferably characterized in that the majority of the base sequences at the 5 'end and / or at the 3' end are each extended by at least two further bases are present, wherein the bases can be A, T or G.
  • the set of PNA (peptide nucleic acid) oligomers for the detection of single nucleotide polymorphisms and the cytosine methylation state in the chemically pretreated genomic DNA is particularly preferably characterized in that at the 5 'end and / or at the 3' end of the oligomer a nucleobase is omitted.
  • Detection of individual nucleotide polymorphisms and the cytosine methylation state in the chemically pretreated genomic DNA is preferably characterized in that at least two nucleobases are omitted at the 5 'end and / or at the 3' end of the oligomer.
  • a representative set of oligonucleotides and / or PNA oligomers comprising oligomers and / or oligonucleotides according to the sequences SEQ-ID: 1 to SEQ-ID: 382046, is intended for the detection of cytosine methylations and single nucleotide polymorphisms in genomic DNA to differentiate between Cell types or tissues or used to study cell differentiation.
  • the following procedural steps are carried out one after the other:
  • a genomic DNA sample is chemically treated in such a way that at the 5 'position, unmethylated cytosine bases in uracil, Thy or another base which is similar to the cytosine in terms of hybridization behavior are converted.
  • the genomic DNA to be analyzed is preferably obtained from conventional sources for DNA, such as. B. cell lines, blood, sputum, stool, urine, brain spinal fluid, paraffin-embedded tissue, histological slides and all possible combinations thereof.
  • the amplification is carried out by means of the polymerase chain reaction (PCR), a thermostable DNA polymerase being used.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a second process step more than ten different fragments are amplified from the chemically pretreated genomic DNA, each of which is less than 2000 base pairs long, using synthetic oligonucleotides as primers.
  • the oligonucleotides or PNA oligomers are bound to a solid phase at defined locations.
  • oligonucleotides and / or PNA- Oligomer sequences arranged on a flat solid phase in the form of a rectangular or hexagonal grid.
  • the solid phase surface preferably consists of silicon, glass, polystyrene, aluminum, steel, iron, copper, nickel, silver or gold.
  • the amplicates are hybridized to a set of oligonucleotides or PNA oligomers which comprise at least 10 of the above-mentioned sequences, namely the sequences SEQ-ID: 1 to SEQ-ID: 382046.
  • the amplification of several DNA sections is carried out in one reaction vessel.
  • the base sequences of the set of oligonucleotides according to the invention are mostly at the 5 'end and / or at the 3' end in each case by a further one Base extends forward, whereby the bases can be either A, T or G.
  • the base sequences of the set of oligonucleotides according to the invention are mostly at the 5 'end and / or at the 3' end each extended by at least two further bases, where the bases can be either A, T or C.
  • the base sequences of the set of oligonucleotides according to the invention for the detection of individual nucleotide polymorphisms and of the cytosine methylation state are mostly at the 5 'end and / or at the 3' end in each case by at least two further bases extended, whereby the bases can be either A, T or G.
  • a set of PNA oligomers from the above-mentioned base sequences is used, a nucleobase being omitted at the 5 'end and / or at the 3' end of the oligomer.
  • a set of PNA oligomers from the above-mentioned base sequences is used, at least two nucleobases being omitted at the 5 'end and / or at the 3' end of the oligomer.
  • At least 10 of the above-mentioned oligonucleotide or PNA sequences are used to detect the cytosine methylation state, or at least 10 PNA oligomers or oligonucleotide sequences which in turn comprise the sequences mentioned above, namely the sequences SEQ-ID: 1 to SEQ-ID: 382046.
  • At least 100 of the above-mentioned oligonucleotide or PNA sequences are used to detect the cytosine methylation state, or at least 100 PNA oligomer or oligonucleotide sequences which in turn comprise the sequences mentioned above, namely the sequences SEQ-ID: 1 to SEQ-ID: 382046.
  • At least one primer is bound to a solid phase.
  • different amplificates are arranged on the solid phase in the form of a rectangular or hexagonal grid.
  • the solid phase surface preferably consists of silicon, glass, polystyrene aluminum, steel, iron, copper, nickel, silver or gold.
  • the hybridized amplificates are detected.
  • the labels attached to the amplificates can be identified at any position on the solid phase at which an oligonucleotide sequence is located.
  • the labels of the amplified products are fluorescent labels.
  • the labels of the amplificates are radionuclides.
  • the amplificates carry removable mass markings which are detected in a mass spectrometer.
  • the amplified products, fragments of the amplified products or probes complementary to the amplified products are detected in the mass spectrometer.
  • the fragments generated have a single positive or negative net charge in the mass spectrometer for better detectability.
  • the set of oligonucleotides and / or PNA oligomers according to the invention is preferably used for diagnosis and / or Predict adverse events for patients or individuals.
  • the set of oligonucleotides and / or PNA oligomers according to the invention is preferably used for the diagnosis and / or prognosis of adverse events for patients or individuals, these adverse events belonging to at least one of the following categories: adverse drug effects; Cancers; CNS malfunction, damage or illness; aggressive symptoms or behavioral disorders; clinical, psychological and social consequences of brain injuries; psychotic disorders and personality disorders; Dementia and / or associated syndromes; cardiovascular disease, malfunction and damage; Malfunction, damage or disease of the gastrointestinal tract; Malfunction, damage or disease of the respiratory system; Injury, inflammation, infection, immunity and / or convalescence; Malfunction, damage or illness of the body as a deviation in the development process; Malfunction, damage or disease of the skin, muscles, connective tissue or bones; endocrine and metabolic dysfunction, injury or illness; Headache or sexual malfunction.
  • the set of oligonucleotides and / or PNA oligomers according to the invention is preferably used to differentiate between cell types or tissues or to investigate cell differentiation.
  • the invention furthermore relates to a kit which contains at least 10 oligonucleotides or PNA oligomers and primers for the preparation of the amplificates and instructions for carrying out the method.
  • Preferred according to the invention is a set of oligonucleotides for the detection of single nucleotide polymorphisms (SNPs, single nucleotide polymorphisms) and the cytosine methylation state in chemically pretreated genomic DNA, where the base sequences are mostly at the 5 'end and / or at the 3' end another base is extended, the bases can be either A, T or C.
  • a set of oligonucleotides is preferred for the detection of single nucleotide polymorphisms (SNPs, single nucleotide polymorphisms) and the cytosine methylation state in chemically pretreated genomic DNA, where the base sequences are mostly one more at the 5 'end and / or at the 3' end
  • the base is extended, and the bases can be either A, T or G.
  • a set of oligonucleotides for the detection of single nucleotide polymorphisms is preferred according to the invention
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • cytosine methylation state in chemically pretreated genomic DNA, where the majority of the base sequences at the 5 'end and / or at the 3' end are each extended by at least two additional bases, the bases being either A, Can be T or C.
  • Preferred according to the invention is a set of oligonucleotides for the detection of single nucleotide polymorphisms (SNPs, single nucleotide polymorphisms) and the cytosine methylation state in chemically pretreated genomic DNA, where the base sequences are mostly at the 5 'end and / or at the 3' end in each case by at least two further bases are present in an extended manner, whereby the bases can be either A, T or G.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • cytosine methylation state in chemically pretreated genomic DNA
  • Oligomers for the detection of single nucleotide polymorphisms (SNPs, single nucleotide polymorphisms) and the cytosine methylation state in chemically pretreated genomic DNA, where a nucleobase is omitted at the 5 'end and / or at the 3' end of the oligomer.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • cytosine methylation state in chemically pretreated genomic DNA, where a nucleobase is omitted at the 5 'end and / or at the 3' end of the oligomer.
  • Preferred according to the invention is a set of PNA (peptide nucleic acid) oligomers for the detection of single nucleotide polymorphisms (SNPs, single nucleotide polymorphisms) and the cytosine methylation state in chemically pretreated genomic DNA, where in each case at the 5 'and / or at the 3' end of the Oligomers at least two nucleobases are omitted.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • a set of oligomer probes for detecting the cytosine methylation state and / or single nucleotide polymorphisms in chemically pretreated genomic DNA, comprising at least 10 of the above-mentioned oligonucleotide or PNA sequences, is preferred.
  • Preferred according to the invention is a set of oligomer probes (oligonucleotides and / or PNA oligomers) for the detection of the cytosine methylation state and / or of single nucleotide polymorphisms in chemically pretreated genomic DNA, comprising at least 100 of the above-mentioned oligonucleotide or PNA sequences.
  • the present invention also relates to a method for analyzing a representative set of cytosine methylations and single nucleotide polymorphisms in genomic DNA samples to distinguish cell types.
  • a method for analyzing a representative set of cytosine methylations and single nucleotide polymorphisms in genomic DNA samples to distinguish cell types.
  • chemical treatment at the 5-position unmethylated cytosine bases is converted into uracil, thymidine or another base which is not similar to cytosine in terms of hybridization behavior.
  • the amplificates are hybridized to a set of oligonucleotides or PNA oligomers, comprising at least 10 of the above
  • the non-hybridized amplificates are removed.
  • the hybridized amplificates are detected.
  • the chemical treatment is carried out by means of a solution of a bisulfite, bisulfite or disulfite.
  • the amplification is carried out by means of the polymerase chain reaction (PCR). It is preferred according to the invention that the oligonucleotides or PNA oligomers are bound to a solid phase at defined locations.
  • PCR polymerase chain reaction
  • oligonucleotides and / or PNA oligomer sequences are arranged on a flat solid phase in the form of a rectangular or hexagonal grid.
  • markings attached to the amplifiers can be identified at any position of the solid phase at which an oligonucleotide sequence is located.
  • At least one primer is bound to a solid phase during the amplification.
  • different amplificates are arranged on the solid phase in the form of a rectangular or hexagonal grid.
  • the labels of the amplified products are fluorescent labels.
  • the labels of the amplificates are radionuclides.
  • the amplificates carry removable mass markings which are detected in a mass spectrometer.
  • the amplificates, fragments of the amplificates or probes complementary to the amplificates are detected in the mass spectrometer. It is preferred according to the invention that the fragments generated have a single positive or negative net charge for better detectability in the mass spectrometer.
  • the detection is carried out and visualized using matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry (MALDI) or using electrospray mass spectrometry (ESI).
  • MALDI matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry
  • ESI electrospray mass spectrometry
  • the polymerases are heat-resistant DNA polymerases.
  • the amplification of several DNA sections is carried out in one reaction vessel.
  • the solid phase surface consists of silicon, glass, polystyrene, aluminum, steel, iron, copper, nickel, silver or gold.
  • the genomic DNA was obtained from a DNA sample, sources of DNA e.g. B. cell lines, blood, sputu, stool, urine, brain spinal fluid, paraffin-embedded tissue, histological slides and all possible combinations thereof.
  • sources of DNA e.g. B. cell lines, blood, sputu, stool, urine, brain spinal fluid, paraffin-embedded tissue, histological slides and all possible combinations thereof.
  • the invention also relates to the use of a set of at least 10 of the above-mentioned oligonucleotides and / or PNA oligomers, selected from the sequences SEQ-ID: 1 to SEQ-ID: 382046, or of at least 10 oligomers or oligonucleotides which comprise the above sequences include, for the diagnosis and / or prognosis of adverse events for patients or individuals.
  • oligonucleotides and / or PNA oligomers selected from the sequences SEQ ID: 1 to SEQ ID: 382046, or else at least 10 oligomers or oligonucleotides which comprise the above sequences include, for the diagnosis and / or prognosis of adverse events for patients or individuals, these adverse events belonging to at least one of the following categories: adverse drug effects, cancer; CNS malfunction, damage or illness; aggressive symptoms or behavioral disorders; clinical, psychological and social consequences of brain injuries, psychotic disorders and personality disorders; Dementia and / or associated syndromes; cardiovascular disease, malfunction and
  • a set of at least 10 of the above-mentioned oligonucleotides and / or PNA oligomers selected from the sequences SEQ-ID: 1 to SEQ-ID: 382046, or of at least 10 oligomers or oligonucleotides which meet the above mentioned sequences include, to differentiate between cell types or tissues or to study cell differentiation.
  • the present invention also relates to a kit containing at least 10 of the above-mentioned oligonucleotides and / or PNA oligomers, selected from the sequences SEQ-ID: 1 to SEQ-ID: 382046, or of at least 10 oligomers or oligonucleotides which comprise the above sequences include, and primers for the preparation of the amplificates and instructions for performing the method according to the invention.
  • sequence listing with the sequences SEQ-ID: 1 to SEQ-ID: 382046 is enclosed with the international application in electronically readable form and is part of this application.

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Abstract

Beschrieben wird ein Satz von Oligonukleotiden oder PNA-Oligomeren und ein Verfahren, das sich zur Detektion von Cytosin-Methylierungen und SNPs in genomischen DNA-Proben eignet. Dieses Verfahren dient der Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wie Erkrankungen.

Description

Detektion von SNPs und Cytosin-Methylierungen
Die vorliegende Erfindung beschreibt einen repräsentati- ven Satz von Oligonukleotiden oder PNA (Peptide Nucleic Acid) Oligomeren, welche sich zum gleichzeitigen Detek- tieren von SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) und Cytosin-Methylierungen in genomischen DNA-Proben zur Unterscheidung von Zelltypen besonders eignet, sowie ein ver- wendetes Verfahren.
Die nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebenen sind die Gene selbst, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit hoher Wahrscheinlichkeit mit Ausmaß und Charakter der Methylierung der Gene bzw. des Genoms korrelierbar . Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem veränderten Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms.
Stand der Technik
Das Humangenomprojekt, die Erstsequenzierung des menschlichen Genoms, wird in den nächsten Jahren abgeschlossen werden. Durch dieses Projekt wird es möglich werden, alle etwa 100.000 Gene zu identifizieren. Die Sequenzinforma- tion öffnet ungeahnte Möglichkeiten für die Aufklärung der Genfunktionen. Dies wiederum eröffnet die Möglichkeit Pharmakogenetik und Pharmakogenomik zu betreiben. Die Pharmakogenetik und Pharmakogenomik zielt auf den Einsatz von Medikamenten in Abhängigkeit eines Genotypen. Dadurch soll die Effektivität von Medikamenten gesteigert werden. Der notwendige Zwischenschritt ist die Bestimmung der Po- lymorphismen und Genotypen, die mit einem bestimmten Ansprechen assoziiert sind. Verlangt werden deshalb immer effizientere Genotypisierungsmethoden.
Derzeit gibt es zwei Kategorien von polymorphen Markern, die zur Genotypisierung eingesetzt werden, Mikrosatelli- ten und Single Nucleotide Poly orphisms (SNPs) . Mikrosa- telliten sind hoch polymorph, d.h. sie haben ein Vielzahl von Allelen. Sie sind dadurch charakterisiert, dass ein repetitives Sequenzelement, mit einer unterschiedlichen Anzahl Wiederholungen für unterschiedliche Allele, von konservierten Sequenzen frankiert ist. Durchschnittlich gibt es einen Mikrosatellitenmarker pro 1 Million Basen. Eine Karte von 5.000 positionierten Mikrosatellitenmar- kern wurde von CEPH publiziert. Mikrosatelliten werden durch die Größenbestimmung von Produkten einer PCR mit Primern der konservierten, flankierenden Sequenz genoty- pisiert. Die Fluoreszenz markierten PCR Produkte werden auf Gelen aufgetrennt.
Es gibt vergleichsweise wenige beschriebene SNP Marker. Eine Karte mit 300.000 SNP Markern wird derzeit vom SNP Konsortium entwickelt und wird öffentlich zugänglich sein. Sind die SNP Marker identifiziert, können sie geno- mischen Positionen zugeordnet werden. Es ist angestrebt, 150.000 SNP Marker bis zum Jahr 2001 zu kartieren (Mashall, E. (1999); Science, 284, 406-407). Es gibt eine Handvoll Genotypisierungsmethoden für SNPS. Einige basieren auf der Auftrennung von Produkten auf Gelen, wie der oligonucleotide ligase assay (OLA) . Er eignet sich daher eher für den mittleren Durchsatz. Andere vertrauen auf reine Hybridisierung, die jedoch nicht die gleiche Strin- genz hat. DNA Arrays (DNA chip) eignen sich für die Analyse einer großen Anzahl SNPs in einer beschränkten An- zahl von Individuen. Bis jetzt sind Beispiele gezeigt worden, in denen 1.500 SNPs auf einem DNA Chip genotypi- siert wurden. Die wirkliche Stärke von DNA Chips liegt in Ansätzen, wie der Resequenzierung und der Expressionsanalyse. Ansätze weiche Primerverlängerung anwenden sind gezeigt worden (Head, S. R. et al., (1999); Mol Cell Pro- bes, 13(2), 81-87). Diese haben den Vorteil, wenn mit fluoreszenzmarkierten Terminatorbasen gearbeitet wird, dass die Resultate mit einem einfachen ELISA Lesegerät gesammelt werden können.
Es gibt einige SNP Genotypisierungsmethoden, die Mas- senspektrometrie zur Analyse verwenden. Diese haben den wesentlichen Vorteil, dass die allelspezifischen Produkte eine physische Darstellung der Produkte sind und nicht ein z. B. fluoreszierendes Signal, dass indirekt dem Pro- dukt zugeordnet wird.
Die Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of- flight Massenspektrometrie (MALDI) hat die Analytik von Biomolekülen revolutioniert (Karas, M. & Hillenkamp, F. Anal. Che . 60, 2299-2301 (1988)). MALDI ist in verschiedenen Varianten zur Analyse von DNA eingesetzt worden. Die Varianten reichen von primer extension bis Sequenzierung (Liu, Y.-H., et al. Rapid Comraun . Mass Spectrom. 9, 735-743 (1 995); Ch'ang, L.-Y., et al . Rapid Commun. Mass Spectrom. 9, 772-774 (1995); Little, D.P., et al. J. Mol. Med. 75, 745-750 (1997); Haff, L. & Smirnov, I.P. Genome Res. 7, 378-388 (1997), Fei, Z., Ono, T. & Smith, L.M. Nucieic Acids Res. 26, 2827-2828 (1998); Ross, P., Hall, L., Smirnov, 1. & Haff, L. Nature Biotech. 16, 1347-1351 (1998); Ross, P.L., Lee, K. & Belgrader, P. Anal. Chem. 69, 4197-4202 (1997); Griffin, T.J., Tang, W. & Smith, L.M. Nature Biotech. 15, 1368-1372 (1997)). Der größte Nachteil all dieser Methoden ist, dass alle eine gründliche Aufreinigung der Produkte vor der MALDI Analyse be- dingen. Spin column Aufreinigung oder der Einsatz von magnetic bead technology oder reversed-phase Aufreinigung sind notwendig.
Die Analyse von DNA im MALDI ist stark abhängig vom La- dungszustand des Produktes. Eine 100-fache Verbesserung der Empfindlichkeit in der MALDI Analyse kann dadurch erzielt werden, dass der Ladungszustand auf dem zu analysierenden Produkt so kontrolliert wird, dass nur eine einzige positive oder negative Überschussladung vorhanden ist. So modifizierte Produkte sind auch wesentlich weniger anfällig auf die Ausbildung von Addukten (z.B. mit Na und K, Gut, I.G. and Beck, S. (1 995) Nucleic Acids Res., 23, 1367-1373; Gut, I.G., Jeffery, W.A., Pappin, D.J.C. and Beck, S. Rapid Commun. Mass Spectrom., 11, 43-50 (1997)). Ein SNP Genotypisierungsverfahren, welches von diesen Bedingungen Gebrauch macht, mit dem Namen "GOOD Assay" wurde kürzlich vorgestellt (Sauer, S. et al., Nucleic Acids Research, Methods online, 2000, 28, el 3).
Die am häufigsten in der DNA eukaryotischer Zellen kova- lent modifizierte Base ist 5-Methylcytosin. Sie spielt beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR- Amplifikation die epigenetische Information, welche die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.
Eine relativ neue und die mittlerweile am häufigsten angewandte Methode zur 4 Untersuchung von DNA auf 5- Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von
Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5- Methylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewan- delt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden kann, jetzt durch "normale" molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur an einzelsträngiger DNA) verhindert und alle Fällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek, A. et al., Nucl. Acids. Res. 1996, 24, 5064-5066) . Mit dieser Methode können einzelne Zellen un- tersucht werden, was das Potential der Methode veranschaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausenden von möglichen Methylierungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren.
Eine Übersicht über die weiteren bekannten Möglichkeiten, 5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Ü- bersichtsartikel entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255. Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Zechnigk, M. et al . , Eur. J. Hum. Gen. 1997, 5, 94-98) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifiziert und entweder komplett sequenziert (Olek, A. und Walter, J., Nat . Genet . 1997, 17, 275-276) oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine "PrimerExtension-Reaktion" (Gonzalgo, M. L. und Jones, P. A., Nucl. Acids Res. 1997, 25, 2529-2531, WO-A 95/00669) oder einen Enzymschnitt (Xiong, Z. und Laird, P. W., Nucl. Acids. Res. 1997, 25, 2532-2534) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO-A 99/28498).
Weitere Publikationen die sich mit der Anwendung der Bisulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei einzelnen Genen befassen, sind: Xiong, Z. und Laird, P. W. (1997), Nucl. Acids Res. 25, 2532; Gonzalgo, M. L. und Jones, P. A. (1997), Nucl. Acids Res. 25, 2529; Grigg, S. und
Clark, S. (1994), Bioassays 16, 431; Zeschnik, M. et al . (1997), Human Molecular Genetics 6, 387; Teil, R. et al . (1994), Nucl. Acids Res. 22, 695; Martin, V. et al. (1 995), Gene 157, 261 WO-A 97/46705 und WO-A 95/15373.
Eine Übersicht über den Stand der Technik in der Oligomer Array Herstellung lässt sich aus einer im Januar 1999 erschienen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999) und der dort zitierten Literatur entnehmen.
Für die Abtastung eines immobilisierten DNA-Arrays sind vielfach fluoreszent markierte Sonden verwendet worden. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5 ' -OH der jeweiligen Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden erfolgt beispielsweise über ein Konfokalmikroskop. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen anderen, kommerziell erhältlich. Aufgabenstellung
Die vorliegende Erfindung soll einen Satz von Oligonukle- otiden oder PNA-Oligomeren und ein Verfahren bereitstellen, welche sich zum gleichzeitigen Detektieren von SNPs (single nucleotide polymorphisms) und Cytosin- Methylierungen in genomischen DNA-Proben besonders eignen.
Beschreibung
Die Aufgabe wird also durch einen Satz von Oligonukleoti- den oder PNA (Peptide Nucleic Acid) Oligomeren zur Detek- tion von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs, single nucleotide polymorphisms) und zur Detektion des Cytosin- Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter genomischer DNA gelöst, wobei die Basensequenzen ausgewählt sind aus SEQ-ID: 1 bis SEQ-ID: 382046.
Es ist ferner erfindungsgemäß, dass der erfindungsgemäße Satz sowohl die Basensequenzen mit der SEQ-ID: 1 bis SEQ- ID: 382046 selbst und/oder die durch Verlängerung, Verkürzung oder Veränderung der genannten Sequenzen mit der SEQ-ID: 1 bis SEQ-ID: 382046 enthält. Der erfindungsgemäße Satz kann sich erfindungsgemäß also aus unveränderten Sequenzen und/oder in erfindungsgemäßer Weise veränderten Sequenzen zusammensetzen.
Die vorliegende Erfindung beschreibt einen Satz von Oli- gomersonden (Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren) zur Detektion von Single Nucleotide Polymorphismen und/oder des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter genomischer DNA, der besonders bevorzugt mindestens 10 der aufgeführten Oligonukleotid oder PNA
Sequenzen ausgewählt aus den Sequenzen SEQ-ID: 1 bis SEQ- ID: 382046 umfasst, oder aber mindestens 10 PNA-Oligomer oder Oligonukleotidsequenzen, die wiederum die dort aufgelisteten Sequenzen umfassen, nämlich die Sequenzen SEQ- ID: 1 bis SEQ-ID: 382046.
In einer weiteren Variante des Verfahrens umfasst der Satz von Oligomersonden (Oligonukleotiden und/oder PNA- Oligomeren) zur Detektion von Single Nucleotid Poly- morphismen und/oder des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter genomischer DNA mindestens 100
Oligonukleotid oder PNA Sequenzen, ausgewählt aus den Sequenzen SEQ-ID: 1 bis SEQ-ID: 382046, oder aber mindestens 100 PNA-Oligomere oder Oligonukleotidsequenzen, die wiederum die dort aufgelisteten Sequenzen umfassen, näm- lieh die Sequenzen SEQ-ID: 1 bis SEQ-ID: 382046.
Besonders bevorzugt ist der Satz von Oligonukleotiden zur Detektion von Einzelnukleotidpolymorphismen und des Cytosin-Methylierungszustandes in der chemisch vorbehandelten genomischen DNA dadurch gekennzeichnet, dass die Basensequenzen mehrheitlich am 5 ' -Ende und/oder am 3 ' -Ende jeweils um eine weitere Base verlängert vorliegen, wobei die Basen A, T oder C sein können.
Besonders bevorzugt ist der Satz von Oligonukleotiden zur Detektion von Einzelnukleotidpolymorphismen und des Cytosin-Methylierungszustandes in der chemisch vorbehandelten genomischen DNA wiederum dadurch gekennzeichnet, dass die Basensequenzen mehrheitlich am 5 ' -Ende und/oder am 3 ' - Ende jeweils um eine weitere Base verlängert vorliegen, wobei die Basen A, T oder G sein können.
Bevorzugt ist der Satz von Oligonukleotiden zur Detektion von Einzelnukleotidpolymorphismen und des Cytosin- Methylierungszustandes in der chemisch vorbehandelten genomischen DNA dadurch gekennzeichnet, dass die Basense- quenzen mehrheitlich am 5 ' -Ende und/oder am 3 ' -Ende jeweils um mindestens zwei weitere Base verlängert vorliegen, wobei die Basen A, T oder C sein können.
Bevorzugt ist der Satz von Oligonukleotiden zur Detektion von Einzelnukleotidpolymorphismen und des Cytosin- Methylierungszustandes in der chemisch vorbehandelten genomischen DNA dadurch gekennzeichnet, dass die Basensequenzen mehrheitlich am 5 ' -Ende und/oder am 3 ' -Ende je- weils um mindestens zwei weitere Base verlängert vorliegen, wobei die Basen A, T oder G sein können.
Der Satz von PNA (Peptide Nucleic Acid) Oligomeren zur Detektion von Einzelnukleotidpolymorphismen und des Cyto- sin-Methylierungszustandes in der chemisch vorbehandelten genomischen DNA ist besonders bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass jeweils am 5 ' -Ende und/oder am 3 ' -Ende des Oligomers eine Nukleobase weggelassen wird.
Der Satz von PNA (Peptide Nucleic Acid) Oligomeren zur
Detektion von Einzelnukleotidpolymorphismen und des Cytosin-Methylierungszustandes in der chemisch vorbehandelten genomischen DNA ist vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass jeweils am 5 ' -Ende und/oder am 3 ' -Ende des Oligomers mindestens zwei Nukleobasen weggelassen werden.
Ein repräsentativer Satz von Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren, umfassend Oligomere und/oder Oligonukleo- tide gemäß den Sequenzen SEQ-ID: 1 bis SEQ-ID: 382046, soll zur Detektion von Cytosin-Methylierungen und Einzelnukleotidpolymorphismen in genomischer DNA zur Unterscheidung von Zelltypen oder Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung verwendet werden. Dazu werden die folgenden Verfahrensschritte nacheinander ausge- führt: Im ersten Verfahrensschritt wird eine genomische DNA Probe derart chemisch behandelt, dass an der 5' -Position un- methylierte Cytosinbasen in Uracil, Thy in oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähn- liehe Base verwandelt werden.
Die zu analysierende genomische DNA wird bevorzugt aus üblichen Quellen für DNA erhalten, wie z. B. Zelllinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks- Flüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, histologi- sche Objektträger und alle möglichen Kombinationen hiervon.
Bevorzugt wird dazu die oben beschriebene Behandlung ge- nomischer DNA mit Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) und anschließender alkalischer Hydrolyse verwendet, die zu einer Umwandlung nicht methylierter Cytosin-Nukleobasen in Uracil führt.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens führt man die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durch, wobei eine thermostabile DNA-Polymerase verwendet wird.
In einem zweiten Verfahrensschritt werden aus der chemisch vorbehandelten genomischen DNA mehr als zehn unterschiedliche Fragmente amplifiziert, die jeweils weniger als 2000 Basenpaare lang sind unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide als Primer.
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens sind die Oligonukleotide oder PNA-Oligomere an definierten Stellen an eine Festphase gebunden.
In einer wiederum bevorzugten Variante des Verfahrens sind unterschiedliche Oligonukleotid und/oder PNA- Oligomersequenzen auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet.
Die Festphasenoberfläche besteht bevorzugt aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold.
Im dritten Verfahrensschritt hybridisiert man die Ampli- fikate an einen Satz von Oligonukleotiden oder PNA- Oligomeren, die mindestens 10 der oben genannten Sequenzen umfassen, nämlich die Sequenzen SEQ-ID: 1 bis SEQ-ID: 382046.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens führt man die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten in einem Reaktionsgefäß durch.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens liegen die Basensequenzen des erfindungsgemäßen Satzes von Oligo- nukleotiden, nämlich die Sequenzen SEQ-ID: 1 bis SEQ-ID: 382046, mehrheitlich am 5 ' -Ende und/oder am 3 ' -Ende jeweils um eine weitere Base verlängert vor, wobei die Basen entweder A, T oder G sein können.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens liegen die Basensequenzen des erfindungsgemäßen Satzes von Oligonukleotiden mehrheitlich am 5 ' -Ende und/oder am 3 ' -Ende jeweils um mindestens zwei weitere Base verlängert vor, wobei die Basen entweder A, T oder C sein können.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens liegen die Basensequenzen des erfindungsgemäßen Satzes von Oligonukleotiden zur Detektion von Einzelnukleotidpolymorphismen und des Cytosin-Methylierungszustandes mehrheitlich am 5 ' -Ende und/oder am 3 ' -Ende jeweils um mindestens zwei weitere Basen verlängert vor, wobei die Basen entweder A, T oder G sein können.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens wird ein Satz von PNA-Oligomeren aus den oben genannten Basensequenzen verwendet, wobei jeweils am 5 ' -Ende und/oder am 3 ' -Ende des Oligomers eine Nukleobase weggelassen wird.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens wird ein Satz von PNA-Oligomeren aus den oben genannten Basensequenzen verwendet, wobei jeweils am 5 ' -Ende und/oder am 3 ' -Ende des Oligomers mindestens zwei Nukleobasen weggelassen werden.
In einer weiteren bevorzugten Variante des Verfahrens werden mindestens 10 der oben genannten Oligonukleotid oder PNA Sequenzen, nämlich ausgewählt aus den Sequenzen SEQ-ID: 1 bis SEQ-ID: 382046, zur Detektion des Cytosin- Methylierungszustandes verwendet, oder aber mindestens 10 PNA-Oligomer oder Oligonukleotidsequenzen, die wiederum die oben genannten Sequenzen umfassen, nämlich die Sequenzen SEQ-ID: 1 bis SEQ-ID: 382046.
In einer weiteren bevorzugten Variante des Verfahrens werden mindestens 100 der oben genannten Oligonukleotid oder PNA Sequenzen, nämlich ausgewählt aus den Sequenzen SEQ-ID: 1 bis SEQ-ID: 382046, zur Detektion des Cytosin- Methylierungszustandes verwendet, oder aber mindestens 100 PNA-Oligomer oder Oligonukleotidsequenzen, die wie- derum die oben genannten Sequenzen umfassen, nämlich die Sequenzen SEQ-ID: 1 bis SEQ-ID: 382046.
In einer wiederum bevorzugten Variante des Verfahrens ist mindestens ein Primer an eine Festphase gebunden. In einer erneut bevorzugten Variante des Verfahrens sind unterschiedliche Amplifikate auf der Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet.
Die Festphasenoberfläche besteht bevorzugt aus Silizium, Glas, Polystyrol Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold.
Im letzten Schritt des Verfahrens detektiert man die hybridisierten Amplifikate. Die an den Amplifikaten angebrachten Markierungen sind an jeder Position der Festphase identifizierbar, an der sich eine Oligonukleotidse- quenz befindet.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens sind die Markierungen der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens sind die Markierungen der Amplifikate Radionuklide.
In einer weiteren bevorzugten Variante des Verfahrens tragen die Amplifikate ablösbare Massenmarkierungen, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden.
In einer wiederum bevorzugten Variante des Verfahrens werden die Amplifikate, Fragmente der Amplifikate oder zu den Amplifikaten komplementäre Sonden im Massenspektrometer nachgewiesen.
In einer erneut bevorzugten Variante des Verfahrens weisen die erzeugten Fragmente im Massenspektrometer zur besseren Detektierbarkeit eine einzelne positive oder negative Nettoladung auf.
Der erfindungsgemäße Satz von Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren dient bevorzugt zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen.
Vorzugsweise wird der erfindungsgemäße Satz von Oligo- nukleotiden und/oder PNA-Oligomeren zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen verwendet, wobei diese nachteiligen Ereignisse mindestens einer der folgenden Kategorien angehören: unerwünschte Arzneimittelwirkungen; Krebserkrankungen; CNS- Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit; aggressive Symptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische und soziale Konsequenzen von Gehirnverletzungen; psychotische Störungen und Persönlichkeitsstörungen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung o- der Krankheit des gastrointestinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Kör- pers als Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder sexuelle Fehlfunktion.
Vorzugsweise wird der erfindungsgemäße Satz von Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren zur Unterscheidung von Zelltypen oder Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung verwendet.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Kit, das mindestens 10 Oligonukleotide oder PNA-Oligomere und Primer zur Herstellung der Amplifikate sowie eine Anleitung zur Durchführung des Verfahrens enthält. Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein Satz von Oligonukleotiden zur Detektion von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs, single nucleotide polymorphisms) und des Cytosin- Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter genomi- scher DNA , wo die Basensequenzen mehrheitlich am 5 ' -Ende und/oder am 3 ' -Ende jeweils um eine weitere Base verlängert vorliegen, wobei die Basen entweder A, T oder C sein können.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein Satz von Oligonukleotiden zur Detektion von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs, single nucleotide polymorphisms) und des Cytosin- Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter genomischer DNA, wo die Basensequenzen mehrheitlich am 5 ' -Ende und/oder am 3 ' -Ende jeweils um eine weitere Base verlängert vorliegen, wobei die Basen entweder A, T oder G sein können.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein Satz von Oligonukleoti- den zur Detektion von Einzelnukleotidpolymorphismen
(SNPs, single nucleotide polymorphisms) und des Cytosin- Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter genomischer DNA, wo die Basensequenzen mehrheitlich am 5 ' -Ende und/oder am 3 ' -Ende jeweils um mindestens zwei weitere Basen verlängert vorliegen, wobei die Basen entweder A, T oder C sein können.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein Satz von Oligonukleotiden zur Detektion von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs, single nucleotide polymorphisms) und des Cytosin- Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter genomischer DNA , wo die Basensequenzen mehrheitlich am 5 ' -Ende und/oder am 3 ' -Ende jeweils um mindestens zwei weitere Basen verlängert vorliegen, wobei die Basen entweder A, T oder G sein können. Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein Satz von PNA (Peptide
Nucleic Acid) Oligomeren zur Detektion von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs, Single nucleotide polymorphisms) und des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbe- handelter genomischer DNA , wo jeweils am 5 ' -Ende und/oder am 3 ' -Ende des Oligomers eine Nukleobase weggelassen wird.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein Satz von PNA (Peptide Nucleic Acid) Oligomeren zur Detektion von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs, single nucleotide polymorphisms) und des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter genomischer DNA, wo jeweils am 5 ' - und/oder am 3 ' -Ende des Oligomers mindestens zwei Nukleobasen wegge- lassen werden.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein Satz von Oligomersonden (Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere) zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes und/oder von Single Nucleotide Polymorphismen in chemisch vorbehandelter genomischer DNA, umfassend mindestens 10 der oben genannten Oligonukleotid oder PNA Sequenzen.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein Satz von Oligomersonden (Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere) zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes und/oder von Single Nucleotide Polymorphismen in chemisch vorbehandelter genomischer DNA, umfassend mindestens 100 der oben nachstehend genannten Oligonukleotid oder PNA Sequenzen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist zudem ein Verfahren zur Analyse eines repräsentativen Satzes von Cyto- sin-Methylierungen und Single Nucleotide Polymorphismen in genomischen DNA-Proben zur Unterscheidung von Zellty- pen. Im ersten Schritt des Verfahrens wandelt man in einer genomischen DNA Probe durch chemische Behandlung an der 5- Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil, Thymidin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cy- tosin unähnliche Base um.
Im zweiten Schritt des Verfahrens amplifiziert man aus dieser chemisch behandelten genomischen DNA mehr als zehn unterschiedliche Fragmente, die jeweils weniger als 2000 Basenpaare lang sind unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide als Primer.
Im dritten Schritt des Verfahrens hybridisiert man die Amplifikate an einen Satz von Oligonukleotiden oder PNA- Oligomeren, umfassend mindestens 10 der oben genannten
Sequenzen ausgewählt aus den Sequenzen SEQ-ID: 1 bis SEQ- ID: 382046 oder aber Sequenzen, welche in der oben beschriebenen Weise verlängert, verkürzt oder verändert wurden.
Im vierten Verfahrensschritt entfernt man die nicht hybridisierten Amplifikate.
Im letzten Verfahrensschritt detektiert man die hybridi- sierten Amplifikate.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass man die chemische Behandlung mittels einer Lösung eines Bisulfits, Hydrogensulfits oder Disulfits durchfuhrt.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt wird. Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass die Oligonukleotide oder PNA-Oligomere an definierten Stellen an eine Festphase gebunden sind.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass unterschiedliche Oligonukleotid und/oder PNA-Oligomersequenzen auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass an den Amplifika- ten angebrachte Markierungen an jeder Position der Festphase, an der sich eine Oligonukleotidsequenz befindet, identifizierbar sind.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass bei der Amplifika- tion mindestens ein Primer an eine Festphase gebunden ist .
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass unterschiedliche Amplifikate auf der Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass die Markierungen der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen sind.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass die Markierungen der Amplifikate Radionuklide sind.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass die Amplifikate ablösbare Massenmarkierungen tragen, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass die Amplifikate, Fragmente der Amplifikate oder zu den Amplifikaten kom- plementäre Sonden im Massenspektrometer nachgewiesen werden. Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass zur besseren De- tektierbarkeit im Massenspektrometer die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass man die Detektion mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchführt und visualisiert.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass die Polymerasen hitzebeständige DNA-Polymerasen sind.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten in einem Reaktionsgefäß durchfuhrt wird.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass die Festphasenoberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass die genomische DNA aus einer DNA-Probe erhalten wurde, wobei Quellen für DNA z. B. Zelllinien, Blut, Sputu , Stuhl, Urin, Gehirn- Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, histologische Objektträger und alle möglichen Kombinationen hiervon umfasst.
Gegenstand der Erfindung ist zudem die Verwendung eines Satzes von mindestens 10 der oben genannten Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere, ausgewählt aus den Sequenzen SEQ-ID: 1 bis SEQ-ID: 382046, oder aber von mindestens 10 Oligomeren oder Oligonukleotiden, welche die oben genannten Sequenzen umfassen, zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen. Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Verwendung eines Satzes von mindestens 10 der oben genannten Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere, ausgewählt aus den Sequenzen SEQ- ID: 1 bis SEQ-ID: 382046, oder aber von mindestens 10 O- ligomeren oder Oligonukleotiden, welche die oben genannten Sequenzen umfassen, zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse mindestens einer folgenden Kategorien angehören: unerwünschte Arzneimittel- Wirkungen', Krebserkrankungen; CNS-Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit; aggressive Symptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische und soziale Konsequenzen von Gehirnverletzungen, psychotische Störungen und Persönlichkeitsstörungen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit, Fehlfunktion und
Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des gastrointestinalen Traktes, Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abweichung im
Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder sexuelle Fehl- funktion.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist zudem die Verwendung eines Satzes von mindestens 10 der oben genannten Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere, ausgewählt aus den Sequenzen SEQ-ID: 1 bis SEQ-ID: 382046, oder aber von mindestens 10 Oligomeren oder Oligonukleotiden, welche die oben genannten Sequenzen umfassen, zur Unterscheidung von Zelltypen oder Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist zudem ein Kit, enthaltend mindestens 10 der oben genannten Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere, ausgewählt aus den Sequenzen SEQ-ID: 1 bis SEQ-ID: 382046, oder aber von mindestens 10 Oligomeren oder Oligonukleotiden, welche die oben genannten Sequenzen umfassen, und Primer zur Herstellung der Amplifikate sowie eine Anleitung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Das Sequenzprotokoll mi t den Sequenzen SEQ-ID: 1 bis SEQ- ID: 382046 liegt der Interna tionalen Anmeldung in elektronisch lesbarer Form bei und ist Bestandteil dieser Anmeldung.

Claims

Patentansprüche
1. Satz von Oligonukleotiden oder PNA (Peptide Nucleic Acid) Oligomeren zur Detektion von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs, single nucleotide polymorphisms) und zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter genomischer DNA, ausgewählt aus den Basensequenzen SEQ-ID: 1 bis SEQ-ID: 382046.
2. Satz von Oligonukleotiden zur Detektion von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs, single nucleotide polymorphisms) und des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter genomischer DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Basensequenzen mehrheitlich am 5 ' -Ende und/oder am 3 ' -Ende jeweils um eine weitere Base verlängert vorliegen, wobei die Basen entweder A, T oder C sein können.
3. Satz von Oligonukleotiden zur Detektion von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs, single nucleotide polymorphisms) und des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter genomischer DNA nach An- spruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Basensequenzen mehrheitlich am 5 '-Ende und/oder am 3 ' -Ende jeweils um eine weitere Base verlängert vorliegen, wobei die Basen entweder A, T oder G sein können.
4. Satz von Oligonukleotiden zur Detektion von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs, single nucleotide polymorphisms) und des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter genomischer DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Basense- quenzen mehrheitlich am 5 '-Ende und/oder am 3 '-Ende jeweils um mindestens zwei weitere Basen verlängert vorliegen, wobei die Basen entweder A, T oder C sein können.
5. Satz von Oligonukleotiden zur Detektion von Einzel- nukleotidpolymorphismen (SNPs, single nucleotide polymorphisms) und des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter genomischer DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Basensequenzen mehrheitlich am 5 '-Ende und/oder am 3 ' -Ende jeweils um mindestens zwei weitere Basen verlängert vorliegen, wobei die Basen entweder A, T oder G sein können.
6. Satz von PNA (Peptide Nucleic Acid) Oligomeren zur Detektion von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs, single nucleotide polymorphisms) und des Cytosin- Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter genomischer DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass jeweils am 5 ' - und/oder am 3 ' -Ende des Oli- gomers eine Nukleobase weggelassen wird.
7. Satz von PNA (Peptide Nucleic Acid) Oligomeren zur Detektion von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs, single nucleotide polymorphisms) und des Cytosin- Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter genomischer DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass jeweils am 5 ' - und/oder am 3 ' -Ende des Oligomers mindestens zwei Nukleobasen weggelassen werden.
8. Satz von Oligomersonden (Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere) zur Detektion des Cytosin- Methylierungszustandes und/oder von Single Nucleotide Polymorphismen in chemisch vorbehandelter genomischer DNA, umfassend mindestens 10 der Oligonukleotid oder PNA Sequenzen der Ansprüche 1 bis 7.
9. Satz von Oligomersonden (Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere) zur Detektion des Cytosin- Methylierungszustandes und/oder von Single Nucleotide Polymorphismen in chemisch vorbehandelter genomischer DNA, umfassend mindestens 100 der Oligonukleotid oder PNA Sequenzen der Ansprüche 1 bis 7.
10. Verfahren zur Analyse eines repräsentativen Satzes von Cytosin-Methylierungen und Single Nucleotide Polymorphismen in genomischen DNA-Proben zur Unterscheidung von Zelltypen, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte ausführt:
a) in einer genomischen DNA Probe wandelt man durch chemische Behandlung an der 5-Position unmethy- lierte Cytosinbasen in Uracil, Thymidin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base um;
b) aus dieser chemisch behandelten genomischen DNA amplifiziert man mehr als zehn unterschiedliche Fragmente, die jeweils weniger als 2000 Basenpaare lang sind unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide als Primer;
c) man hybridisiert die Amplifikate an einen Satz von Oligonukleotiden oder PNA-Oligomeren, umfassend mindestens 10 Sequenzen der Ansprüche 1 bis 9;
d) man entfernt die nicht hybridisierten Amplifikate ;
e) man detektiert die hybridisierten Amplifikate.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man die chemische Behandlung mittels einer Lösung eines Bisulfits, Hydrogensulfits oder Disulfits durchfuhrt .
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11 dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation mittels der Polyme- rasekettenreaktion (PCR) durchgeführt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12 dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotide oder PNA- Oligomere an definierten Stellen an eine Festphase gebunden sind.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass unterschiedliche Oligonukleotid und/oder PNA- OligomerSequenzen auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass an den Amplifikaten angebrachte Markierungen an jeder Position der Festphase, an der sich eine Oligonukleotidsequenz befindet, identifi- zierbar sind.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Amplifikation mindestens ein Primer an eine Festphase gebunden ist.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass unterschiedliche Amplifikate auf der Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen sind.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen der Amplifikate Radionuklide sind.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikate ablösbare Massenmarkierungen tragen, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 17 dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikate, Fragmente der
Amplifikate oder zu den Amplifikaten komplementäre Sonden im Massenspektrometer nachgewiesen werden.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 21 dadurch gekennzeichnet, dass zur besseren Detektierbarkeit im
Massenspektrometer die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen.
23. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 20 bis 22 dadurch gekennzeichnet, dass man die Detektion mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchfuhrt und visuali- siert .
24. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei die Polymerasen hitzebeständige DNA-Polymerasen sind.
25. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation von meh- reren DNA-Abschnitten in einem Reaktionsgefäß durchführt wird.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17 dadurch gekennzeichnet, dass die Festphasenoberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 26, wobei die genomische DNA aus einer DNA-Probe erhalten wurde, wobei Quellen für DNA z. B. Zelllinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, histologische Objektträger und alle möglichen Kombinationen hiervon umfasst.
28. Verwendung eines Satzes von Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen.
29. Verwendung eines Satzes von Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren gemäss Anspruch 28 zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patien- ten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse mindestens einer folgenden Kategorien angehören: unerwünschte Arzneimittelwirkungen; Krebserkrankungen; CNS-Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit; aggressive Symptome oder Verhaltensstörungen; klini- sehe, psychologische und soziale Konsequenzen von Gehirnverletzungen; psychotische Störungen und Persönlichkeitsstörungen; Demenz und/oder assoziierte Syn- drome; kardiovaskuläre Krankheit, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des gastrointestinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des AtmungsSystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder sexuelle Fehlfunktion.
30. Verwendung eines Satzes von Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur
Unterscheidung von Zeiltypen oder Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung.
31. Kit, enthaltend mindestens 10 Oligonukleotide oder PNA-Oligomere gemäss Anspruch 1 und Primer zur Herstellung der Amplifikate sowie eine Anleitung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 10 bis 27.
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