CN101027413B - 用于监测生物的基因组dna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了在DNA扩增的波形表征法(waveform‑profilingmethod)中用于改进的用途的新的SGP引物。在一个实施方案中，在DNA扩增法中使用SGP引物导致几种不同产物的指数扩增。在另一个实施方案中，本发明的方法还包括新的时间减半的延伸(half‑timeelongation)步骤。在另一个实施方案中，可通过解链温度分析检测不同的产物。可组合本发明的引物和方法以确定样品中的生物。

Description

用于监测生物的基因组DNA的方法
本发明要求2004年7月28日提交的美国临时申请系列号601591596的利益，该申请在此全文引用作为参考。
发明背景
发明领域
本发明涉及基于生物的基因组信息对生物进行快速检测和分类的改进方法。
相关背景领域
在生物技术学领域，存在对各种样品(例如环境的和医学的)中的生物例如细菌和病毒的快速检测和/或分类的需要。例如，细菌的快速检测，和随后种和/或株系的分类，是为例如地方供水、医院或食品加工厂提供质量保证所必需的；即，就污染性生物的存在筛查各种样品，包括但不限于空气、灰尘、水、血液、组织、植物、食品等的样品，和在由公众消费、暴露和/或使用前或在被公众使用的过程中对污染性生物进行分类可以是必需的。本发明通过改进用于在样品中检测和分类生物(例如，细菌或病毒)的方法来实现这些目的。
用于检测和/或分类生物的标准的微生物学方法，例如培养和革兰氏染色或其他生物化学性质的检测，是不精确的并且通常不能区分不同的生物，更不用说生物的不同株系。用于检测和/或分类生物的更精确的方法基于生物的基因组DNA。这些方法已从繁重和常规的方法，例如northern印迹法和RT-PCR进展至切缘DNA微阵列分析(cuttingedge DNA microarray analysis)。一个这样的熟知的检测和/或分类的方法是聚合酶链式反应(PCR)。
通过两个分离的和不同(第一和第二)的引物进行PCR，各引物分别和双链基因组DNA的两个模板(即，链)中的任一模板上发现的核苷酸序列互补。因为两个引物的序列基于两个基因组DNA模板的序列，因此两个引物结合并围绕双链基因组DNA的单一和隔离的基因座。使用这样的引物对的PCR导致双链基因组DNA的指数扩增，所述双链基因组DNA和由与两个引物互补的核苷酸序列围绕的基因组的单一和隔离的基因座相同，所述基因座的侧翼为在一个基因组DNA模板的3’末端上的第一引物结合位置和在另一个基因组DNA模板的3’末端上的第二引物结合位置。
因为PCR指数扩增DNA，所以其可用于检测少量的基因组材料。然而，因为PCR需要和该基因组材料的序列特异性互补的引物，所述序列是已知的并围绕目的基因座，因此其限制在于其只能用于已知的生物的检测和分类。换句话说，要求研究人员在检测生物的任何尝试之前知道或猜测生物的分类(即，使用的合适的引物对)。除了有关与分析中所用的两个引物互补的序列的信息外，PCR的另一个限制是PCR不能使研究人员获得关于扩增的DNA的序列信息。
为克服一些PCR的限制，发展了波型表征(waveform profiling)的方法(参见，例如，日本专利申请公开号2003-334082和2003-180351中描述的波型表征的方法)。波型表征法提供了分析和表征基因组材料(例如分离自生物例如细菌的DNA)的方法而无需研究人员在检测之前知道或猜测生物的分类。简而言之，波型表征通常使用多拷贝的独特引物和使用基因组DNA的两条变性的链作为模板来线性地扩增几种不同的单链核酸多聚体来分析生物的基因组DNA，所述单链核酸多聚体形成高级结构例如，三链体、四链体等。因为使用生物的基因组DNA作为模板，因此所得的单链核酸多聚体将是独特的并且包含对于生物是独特的序列。因此，单链核酸多聚体将形成基于对于该生物是独特的序列的高级结构。因此，这些独特的高级结构的检测法，其可通过使用可检测剂例如荧光插入剂进行，可对生物进行分类。
通常使用特征在于其结构和长度的单一模式产生性波形引物产生几个不同的单链核酸多聚体。波形引物通常由两个部分即非特异性稳定性部分和特异性部分构成。如下所述，非特异性稳定性部分可帮助指导高级结构的形成。相反地，特异性部分指导波形引物特异性地结合和其自身序列互补的序列。波型引物的长度(例如，长度为8-30个碱基)通常是至关重要的，因为其使得引物的特异性部分能够沿着基因组DNA模板的长度方向特异性地结合几个分开的引物结合位置，即，和波形引物互补的序列。波形引物沿着各单链基因组DNA模板对几个引物结合位置的结合允许几种不同的单链核酸多聚体的产生，该多聚体的产生对于该方法是至关重要的。
除了使用波型引物外，这些波型表征的方法也使用几个循环的线性扩增来提供几种不同的单链核酸多聚体的各多聚体的多拷贝；从而，在线性扩增的第一循环之前向包含目的基因组DNA的溶液中加入许多拷贝的波形引物。线性扩增的一个循环包括下列步骤：1)变性，即，提供允许双链DNA变性成分开的或单个的单链(例如，双链基因组DNA的各拷贝变性成2个单链基因组DNA模板)的条件；2)退火，即提供允许互补的单链DNA相互结合(即，波形引物对各单链基因组DNA模板上的几个分开的引物结合位点的退火)的条件；和3)延伸，即，提供允许引物序列通过模板DNA的区域的DNA聚合酶指导的延伸，(例如，几种不同的单链核酸多聚体沿着各基因组DNA模板从与引物结合位置结合的几个波形引物的各引物延伸)。
在线性扩增的一个循环中，增加基因组DNA的温度(例如，至95-98℃)以将基因组DNA的各拷贝变性成两条单链基因组DNA模板。随后降低温度(例如，至25℃)以允许波形引物沿着各变性基因组DNA模板结合几个分开的引物结合位置。循环的最后步骤，使用聚合酶例如Taq聚合酶在大约72℃下进行来自各结合的波形引物的几种不同单链核酸多聚体的延伸。在该最终的步骤之后，重复循环。在下一轮变性步骤期间，将几种不同的核酸多聚体从基因组DNA模板变性并变成单链核酸多聚体，其中各单链核酸多聚体具有5′-至-3′的核苷酸序列，该核苷酸序列包含单链核酸多聚体从其延伸的波形引物的核苷酸序列和之后的和结合波形引物的基因组DNA序列的下游的基因组DNA模板区域序列互补的不同的核酸序列。因为各单链核酸多聚体在其5′末端包含波型引物的序列，因此各单链核酸多聚体也包含波形引物的非特异性稳定性部分。波形引物的非特异性稳定性部分通常指导各单链核酸多聚体形成高级结构和在随后的扩增循环中阻止新延伸的单链核酸多聚体结合任何波形引物。
作为波形引物的非特异性稳定性部分的结果，单链核酸多聚体在随后的扩增循环中不被用作模板，因而扩增的各循环是线性的。换句话说，扩增的各循环只产生单拷贝的几种不同的单链核酸多聚体中的每种单链核酸多聚体，所述核酸多聚体包含对于生物是独特性的序列，即，和基因组DNA模板的序列互补的、结合引物结合位置的波形引物的下游的序列。因此，和PCR相反，波形表征法通常不导致几种不同单链核酸多聚体(包含对于生物是独特的序列)的指数扩增。
各单链核酸多聚体包含和基因组DNA模板的序列互补、位于结合引物结合位置的波形引物的下游的碱基序列，因此可比较和区分存在于不同基因组DNA的多个位置上的碱基序列的差异。如上所述，几种不同单链核酸多聚体的各多聚体的多个拷贝相互之间将相互作用形成高级结构，即，包含一个或多个单链的不同核酸多聚体的复合物(例如，三链体和四链体)。高级核酸结构，依赖于单链核酸多聚体的碱基序列，即基于生物的独特的基因组信息，将具有不同的稳定性并在不同的解链温度(Tm)下解离。
波形表征通常需要确定和记录使用特定的生物的基因组DNA作为模板产生的各种不同高级结构的解链温度(Tm)；这可通过使用嵌入高级DNA结构的荧光剂即插入剂来实现。通过增加样品的温度可解离由波形表征法产生的高级DNA结构。当高级DNA结构离解时，插入这些高级结构的荧光剂也将分离。解链温度分析将荧光强度的变化率(通过这些高级结构的离解获得的)作为不断增加的温度的函数作图并产生了对于生物的基因组DNA和所用的波形引物是独特的波形，即观察和记录在不同Tm处的高级DNA的离解，以产生生物例如细菌的各物种(或株系)的特征“波形谱”。因此，波形表征法可用于获得各生物的独特的波形特征谱，且随后的解链温度分析可用于检测独特的波形特征谱和区分分离自第一生物的基因组DNA和分离自第二生物的基因组DNA。
本领域技术人员将认识到，在进行产生波形特征谱的波形表征法之前，必须获得包含生物的样品和必须从包含该生物的样品中提取和分离基因组DNA。样品的采集和基因组DNA的提取和分离的方法在本领域内是熟知的。
因为上述方法(涉及波形表征)依赖于线性扩增，使用该方法的其中一个困难是需要大量的来自待检测和/或分类的特定生物(例如，细菌)的基因组DNA的起始量。结果只有当生物以大量(例如，106或更多生物)存在于给定的样品中时才可使用波形表征法检测和分类生物，但对检测和/或分类非常少量的生物无效。
因此，通常不使用波形表征法检测和/或分类以少量存在于样品中的生物，例如采自处于污染之初的供水或水源。尽管PCR可解决需要大量起始样品的波形表征法的限制(因为PCR导致基因组DNA的指数扩增并允许少量存在的生物的检测)，但在本领域已知，使用从PCR扩增产生的DNA的互补双链片段产生的波形特征谱不足以对特定的基因组序列进行分类(参见，例如，″Goodbye DNA Chip，HelloGenopattern for 21st Century，″由Adgene Co.，Ltd.出版和发行)。换句话说，现有技术明确地教导，使用标准的PCR产物的解链温度(Tm)分析不可能比较、区分和分类基因组材料(来自生物的不同种或株系)。
本发明为上述波形表征法提供了克服要求生物以大量存在于样品中以进行检测和分类的需要的改进。特别是，本发明提供了新的改进，即改造和提升波形表征法以使PCR的改进形式可被整合。本领域技术人员认识到，即使生物以少量存在，例如存在于甚至在供水或水源的污染之初的样品中的生物的量，对波形表征法的本改进将允许生物的检测和分类。
发明概述
本发明的一个目的是提供检测和分类可能以少量存在的生物的方法，这样可准确地提供关于例如供水的早期安全和质量保证。这样，本发明提供了改进的方法，此处统称为单基因组表征法(SingleGenome Profiling)(SGP)。
SGP需要使用用于扩增几种不同“SGP核酸多聚体”的引物(“SGP引物”)。SGP引物的特征在于其长度和沿着基因组DNA特异性地结合几个分开的位置的能力。因为SGP引物不包含非特异性稳定性部分，因此SGP核酸多聚体(从结合至例如单链基因组DNA模板上的几个分开的SGP引物结合位置的本发明的SGP引物延伸的)在随后的扩增反应中自由结合SGP引物。因为SGP引物可沿着单链SGP核酸多聚体特异性地结合互补核苷酸序列，因此SGP引物也充当正向和反向引物(在PCR的改进形式，即，“mPCR”中)以允许几种不同的“SGP-SGP核酸多聚体”的扩增，所述SGP-SGP核酸多聚体各包含和基因组DNA的几个区域中的一个区域的序列(由引物结合位置围绕的区域)相同的核苷酸序列，即，各SGP-SGP核酸多聚体序列在其5′末端具有SGP引物的序列，且在其3′末端具有SGP引物的反向互补序列。因此，包含SGP引物的核苷酸序列和SGP引物的反向互补序列的几种不同SGP-SGP核酸多聚体的扩增以指数(非线性)方式发生，从而使得，即使生物以少量存在，也能够使用本发明检测和分类生物的基因组DNA。本领域技术人员将认识到，在对基于RNA的基因组(例如，逆转录病毒的基因组)实施本发明中，应当在开始进行SGP和相关的mPCR循环之前进行逆转录反应。
本发明也提供了和最终的扩增循环关联的“时间减半的延伸步骤(half-time elongation step)”。在本发明中，和最终的扩增循环相关的延伸步骤的时间长度包括时间的减少(优选地时间长度的减少为大约40-60％；更优选地时间长度的减少大约为50％)，导致最终的扩增步骤中的时间减半的延伸步骤。因为没有足够的时间进行从SGP引物至该SGP引物的反向互补序列的核酸多聚体的延伸，该时间减半的延伸步骤通常将消除许多SGP-SGP核酸多聚体的指数扩增。因此，可在时间减半的步骤中从SGP-SGP核酸多聚体产生SGP核酸多聚体的缩短的形式(“缩短的SGP核酸多聚体”)。本领域技术人员将认识到，通过使用PCR的改进形式即mPCR进行几个循环的指数扩增后进行时间减半的延伸步骤，将产生缩短的SGP核酸多聚体的各多聚体的许多拷贝。此外，在随后的变性步骤期间，缩短的SGP核酸多聚体将变成单链。最终，缩短的单链SGP核酸多聚体形成在使用mPCR实施本发明中检测到的高级结构。
本发明也提供了用于改进的方法的引物，和用于制备这些引物的方法，以及使用指数扩增和减少波形表征方法的可变性的方法。在一个实施方案中，本发明的SGP引物具有SEQ ID NO：51所示的核苷酸序列。在另一个实施方案中，本发明的SGP引物具有SEQ ID NO：52所示的核苷酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供了波形表征的改进的方法，所述改进包括使用SGP引物。本领域技术人员将认识到，SGP引物的使用将实现mPCR。这样，本发明涉及指数扩增DNA的方法，该方法包括将DNA和第一混合物混合以形成扩增混合物，其中所述第一混合物包含多拷贝的SGP引物和合适浓度的其他扩增试剂；使扩增混合物变性，进行第一时间长度；使扩增混合物退火，进行第二时间长度；延伸扩增混合物，进行第三时间长度；和重复变性、退火以及延伸至少一次。在一些实施方案中，所述改进还包括时间减半的延伸步骤。在其他实施方案中，SGP引物具有选自SEQ ID NO：51所示的核苷酸序列和SEQ DDNO：51所示的核苷酸序列的核苷酸序列。在另一个实施方案中，该方法还包括在任一步骤中加入可检测的试剂的步骤。
本发明的改进的波形表征法可用于检测，例如确定生物在样品中的不存在或存在。因此，本发明提供了确定样品中的生物的方法，该方法包括步骤：获取样品；提取样品；将第一混合物导入样品以形成扩增混合物，其中所述第一混合物包含多拷贝的SGP引物和合适浓度的其他扩增试剂；在第一温度下使扩增混合物变性，进行第一时间长度；在第二温度下使扩增混合物退火，进行第二时间长度；在第三温度下延伸扩增混合物，进行第三时间长度；重复变性、退火和延伸至少一次；重复变性和退火的步骤；在第四温度下延伸扩增混合物，进行等于第三时间长度的大约40-60％的第四时间长度(时间减半的延伸)；通过冷却扩增混合物使高级结构形成；和检测高级结构的不存在或存在，其中高级结构的存在确定生物的存在。在本发明的一个实施方案中，第四温度保持第四时间长度，其大约为第三时间长度的50％。在另一个实施方案中，包括全时长延伸的步骤的重复次数是20-50次，例如，20-25、26-29、30-40、41-50次。在本发明的一个实施方案中，在允许高级结构的形成之前重复时间减半的延伸步骤一次或多次。此外，生物存在的确定可确定生物的分类。在一些实施方案中，第三和第四温度是相同的温度。此外，本发明提供了确定样品中的生物的方法，该方法还包括在任何步骤中加入可检测的试剂的步骤。本发明的方法中的检测步骤可包括进行解链温度分析。
附图概述
图1：描述波形表征法和单基因组表征法的步骤和由其产生的核酸多聚体的流程图。
图2：假设的基因组DNA的核苷酸序列。
图3：图2的基因组DNA变性成两个单链基因组DNA模板，假设的引物退火至各变性的单链基因组DNA模板上的引物结合位置，箭头表示SGP引物序列通过各基因组DNA的区域的延伸，其中SGP核酸多聚体可产生自所述各基因组DNA的区域。
图4：要使用图3的基因组DNA和引物产生的各SGP核酸多聚体的序列。
图5：在图4的SGP核酸多聚体的mPCR扩增后产生的各SGP-SGP核酸多聚体的序列。
图6：在图5的SGP-SGP核酸多聚体接受时间减半的延伸步骤后产生的SGP-SGP核酸多聚体的序列(未用下划线标示的)和缩短的SGP核酸多聚体的序列(下划线标示的)。
图7：使用SGP引物DJB7(图7A)或SGP引物DJB8(图7B)产生4种不同细菌基因组DNA靶(泳道1-8)和人基因组DNA靶(泳道9和10)的SGP-SGP核酸多聚体的不同模式(泳道1-10)。
发明详述
本发明提供了对确定和/或分类生物的现有技术方法的改进。在本发明中，不必提供包含大量生物的样品。特别地，本发明提供了对波形表征的方法的改进。对波形表征法的改进包括实施PCR的改进形式即DNA的指数扩增的改进的引物。对波形表征法的改进也包括扩增法中的时间减半的延伸步骤，该步骤允许从通过PCR的改进形式(即，mPCR)形成的核酸多聚体的亚群产生成组的缩短的单链核酸多聚体。即使该生物以少量存在，例如存在于供水的污染之初的样品中的生物的量，对波形表征法的改进也允许进行生物的检测和/或分类。因此本发明提供了改进的波形表征法，该方法将有助于提供涉及许多可受到生物污染的源(例如，环境的和医学的)的质量保证，所述源包括，但不限于，空气、尘埃、水、血液、组织、植物和食品。本领域技术人员将认识到和单个基因组的检测相反，本发明涉及单个基因组的部分的扩增，或少数基因组的扩增；在单个基因组的部分或少数几种基因组的扩增之后进行检测。
通过提供对波形表征法的改进，即使生物以少量数目存在，单基因组表征(SGP)允许分析和表征来自生物的基因组DNA。这些改进包括新的引物，(“SGP引物”)和聚合酶链式反应的改进形式(mPCR)。SGP额外地提供了最终的“时间减半的延伸步骤”。这些改进允许SGP(即，使用SGP引物、mPCR和时间减半的延伸步骤的方法)导致各具有5′-至-3′的核苷酸序列的不同的核酸多聚体(“SGP核酸多聚体”)的产生，所述序列包含SGP引物的序列和之后的和基因组DNA模板的几个不同的区域中的一个区域互补的序列。特别地，SGP使用产生的SGP核酸多聚体、SGP引物和mPCR指数地扩增各具有5′-至-3′的核苷酸序列的“SGP-SGP核酸多聚体”，所述核苷酸序列包含SGP引物的序列、和基因组DNA模板的几个分开的区域中的一个区域的序列相同的序列、之后的SGP引物的反向互补序列。在SGP-SGP核酸多聚体的指数扩增后，SGP可引入新的时间减半的延伸步骤以产生可形成高级结构的SGP核酸多聚体的缩短的形式，即，“缩短的SGP核酸多聚体”。因为生物的基因组DNA用作起始模板，SGP核酸多聚体和SGP-SGP核酸多聚体将包含对于生物是特异性的序列。出于相同的理由，并且因为在时间减半的延伸步骤中使用所得的SGP-SGP核酸多聚体产生缩短的SGP核酸多聚体，所以单链缩短的SGP核酸多聚体将包含生物独特性的序列。这样，单链缩短的SGP核酸多聚体形成基于对于生物是独特的序列的高级结构。因此，通过单链缩短的核酸多聚体形成的成组的高级结构对于生物是独特的。因此，形成的不同高级结构的检测使得能够对生物进行检测和/或分类；该检测可通过使用例如荧光插入剂来完成。
A.单基因组表征法的改进的PCR(mPCR)
许多SGP核酸多聚体，和从而，许多SGP-SGP核酸多聚体和缩短的SGP核酸多聚体可使用本发明的改进的PCR(mPCR)产生。因为这些多聚体中的每一个源于SGP引物并在其5’末端包含SGP引物，因此在SGP中的mPCR的第一个循环之前必须向包含目的基因组DNA的溶液中加入许多拷贝的SGP引物。本领域技术人员将认识到，mPCR的材料(例如，扩增试剂)和条件与熟知的PCR的扩增试剂和条件相似。例如，除了许多拷贝的引物对和DNA模板外，向PCR加入的扩增试剂例如聚合酶、dNTP反应缓冲液等的合适浓度对于本领域技术人员来说是熟知的，插入剂的合适浓度对于本领域技术人员来说也是熟知的。可容易地由本领域技术人员确定应当在mPCR的第一个循环之前加入的扩增试剂例如SGP引物、核苷酸(即，dNTP)、DNA聚合酶、反应缓冲液和/或镁的浓度和量。
SGP能够分析以极其少量存在的生物的基因组DNA，因为其包括mPCR的步骤。在本发明的一个实施方案中，单个生物的基因组DNA可为足以进行检测的量的缩短的单链核酸多聚体和关联的高级结构提供了源模板。这是因为SGP的mPCR步骤通过SGP引物以和常规PCR有些相似的方式结合和扩增某些SGP核酸多聚体的能力导致SGP-SGP核酸多聚体的指数扩增。然而，和常规的PCR相比存在两个显著的差异。首先，mPCR步骤只使用一个引物，即SGP引物，其能够同时用作正向和反向引物。相反地，常规PCR使用两个不同的引物：(1)正向引物，和(2)具有不同于正向引物序列的序列的反向引物。
第二，尽管常规PCR使用两个引物扩增基因组DNA的单一区域，但mPCR使用一个引物扩增基因组DNA的几个不同的区域，所述各区域由和SGP引物同一的序列和与SGP引物互补的序列，即“SGP引物结合位置”围绕。SGP中的mPCR扩增基因组DNA的几个不同区域的能力归功于能够用作正向和反向引物的一个SGP引物的使用。SGP引物的该特征是其长度的函数，该特征允许两个关键事件发生：(1)SGP引物对各单链基因组DNA模板上的几个分开的SGP引物结合位置的结合，和(2)SGP引物对SGP核酸多聚体(由mPCR的至少一个循环产生的)的结合，所述SGP核酸多聚体具有5′-至-3′核苷酸序列，所述序列包含SGP引物序列和其不同的核苷酸序列内的SGP引物的反向互补序列。SGP核酸多聚体内的反向互补序列的存在和SGP引物的随后结合允许几个不同的双链SGP-SGP核酸多聚体的PCR样(即，mPCR)指数扩增，即，双链基因组DNA的几个不同的由SGP引物结合位置围绕的区域的指数扩增。
下面详细描述的SGP引物和波形引物共有一些相似的特性，后者在例如日本专利申请公开号2003-334082和2003-180351中进行了详细描述。SGP引物对SGP是必需的，且其特征在于其长度。SGP引物的长度是至关重要的，因为引物的减少的长度允许引物沿各单链基因组DNA模板特异性地结合几个分开的位置，以及因为减少的长度也允许SGP核酸多聚体将具有5′-至-3′的序列的增加的概率，所述序列在其不同的核苷酸序列内包含SGP引物序列的反向互补序列。
SGP引物的特点允许其用于SGP方法，以在第一循环后的mPCR的各循环期间导致来自某些SGP核酸多聚体的SGP-SGP核酸多聚体的指数，即非线性扩增。SGP中的mPCR的第一循环由下列步骤组成：1)将各拷贝的基因组DNA变性成两条单链基因组DNA模板，2)使SGP引物对各单链基因组DNA模板上的几个分开的SGP引物结合位置退火，和3)从结合至各单链基因组DNA模板上的分开的SGP引物结合位置的几个SGP引物的各引物延伸SGP核酸多聚体，其中各SGP核酸多聚体具有5′-至-3′的核苷酸序列，所述序列包含结合的SGP引物(所述SGP核酸多聚体从其延伸)，之后包含和结合的SGP引物下游的基因组DNA模板的序列互补的不同的核苷酸序列。
本领域技术人员将认识到，延伸步骤的“全时长”持续时间决定了SGP核酸多聚体的长度，因此，一个循环内产生的SGP核酸多聚体可具有不同的核苷酸序列，但可以是大致相同的长度。例如，假定设计SGP引物以使其沿各单链基因组DNA模板对103个位置退火，且假定将延伸步骤的时限调整至产生长度大约为1kb的SGP核酸多聚体，SGP的一个循环将导致每模板103个不同的SGP核酸多聚体，其各将在长度上为大约1kb。当然，如果SGP引物结合位置(引物对其退火的位置)中的一个位置离基因组模板的3’末端少于1kb，那么从结合在该位置上的SGP引物的延伸将产生少于1kb的SGP核酸多聚体。此外，如果SGP引物结合位置(例如，位置“B”)在另一个SGP引物结合位置(例如，位置“A”)的下游1kb之内，那么从结合在位置A的SGP引物将会产生少于1kb的SGP核酸多聚体。
在SGP中，可重复mPCR的循环超过1次，例如10-100次。在各循环的变性步骤期间，SGP核酸多聚体将变成单链，即，SGP核酸多聚体将不再结合基因组模板。在SGP中，在以后的mPCR的循环中的退火步骤期间，具有5′-至-3′核苷酸序列(其在其不同的核苷酸序列内包含SGP引物的反向互补序列)的某些SGP核酸多聚体保持易被SGP引物结合(即这些SGP核苷酸多聚体不形成高级结构)，是至关重要的。SGP核酸多聚体作为高级结构的部分的结合或对SGP引物的结合依赖于几个因素，例如退火温度、SGP核酸多聚体和SGP引物的长度以及反应混合物中的SGP核酸多聚体和SGP引物的浓度。因此，通过例如增加SGP引物的浓度操控mPCR的退火步骤，可有助于阻止包含SGP核酸多聚体的高级结构的形成。然而，尽管调节这些熟知的因素可有助于实施本发明，但该调节不是绝对必需的，因为SGP核酸多聚体稳定性的因素在SGP引物的设计中得到解决。如下面指出的，设计不具有非特异性稳定性部分的SGP引物，从而，SGP核酸多聚体(各在其5’末端具有SGP引物的序列)，将是不稳定的，即将倾向于容易地结合引物。因此，某些SGP核酸多聚体在任何高级结构形成之前将优先地结合SGP引物，所述SGP核酸多聚体具有5′-至-3′序列，该序列包含SGP引物序列和之后的在其不同的核苷酸序列内的SGP引物序列的反向互补序列。
SGP引物对某些SGP核酸多聚体的结合使在第一循环后进行SGPmPCR扩增循环，所述SGP核酸多聚体具有5′-至-3′序列，所述序列包含SGP引物序列和之后的其不同的核苷酸序列内的SGP引物序列的反向互补序列。SGP引物结合SGP核酸多聚体上的其互补序列促进了产生SGP-SGP核酸多聚体的PCR样反应，所述SGP-SGP核酸多聚体各具有核苷酸序列，所述核苷酸序列包含和基因组DNA模板的几个分开的区域中的一个区域的序列同一的序列，所述区域在其5’末端由和SGP引物同一的5′-至-3′序列以及在3′末端由为SGP引物的反向互补序列的5′-至-3′序列侧翼连接。因此，因为各SGP-SGP核酸多聚体在其3′末端具有和SGP引物互补的5′-至-3′序列，所以在随后的mPCR循环的退火步骤中在高级结构形成前，各SGP-SGP核酸多聚体也将由SGP引物结合。
本领域技术人员将认识到，尽管所有SGP核酸多聚体将在5’末端包含SGP引物序列；但只有一定百分比的SGP核酸多聚体也将在其5′-至-3′的不同的核苷酸序列内包含SGP引物序列的反向互补序列。某些参与SGP-SGP核酸扩增的SGP核酸多聚体的百分比依赖于几个容易确定的因素，例如用于mPCR的“全时长延伸步骤”的“全时长”长度和SGP引物的设计。例如，潜在的SGP核酸多聚体可具有在离5′末端大约750碱基(0.75kb)的下游的SGP引物序列的反向互补序列。在本例子中，如上假定mPCR的全时长延伸步骤设定为产生1kb SGP核酸多聚体，那么随后的mPCR循环将开始该750碱基(0.75kb)区域，即双链SGP-SGP核酸多聚体的指数扩增，所述双链SGP-SGP核酸多聚体具有双链基因组DNA的区域(原始1kb SGP核酸多聚体来源于其)的部分的相同序列。任何其他单链SGP核酸多聚体的该指数扩增也将在基因组的其他位置上发生，所述单链SGP核酸多聚体在其5′末端的1kb下游内具有包含SGP核酸多聚体的反向互补序列的5′-至-3′序列。因此，增加全时长延伸时间将增加SGP核酸多聚体在其核酸序列中包含一个或多个SGP引物结合位置的概率。反之也是如此；减少全时长延伸时间将减少SGP核酸多聚体在其下游序列内包含一个或多个SGP引物结合位置的概率。
通过设计引物也可控制在其序列内包含SGP引物结合位置的SGP核酸多聚体的百分比，在下面提供其更详细的描述，这样，例如100个中有1个(即，10-2)SGP核酸多聚体在序列内包含SGP引物结合位置。在这样的例子中，并如上假定SGP引物可沿各单链基因组模板对103个位置退火，那么对于各生物将产生2×103种不同的SGP核酸多聚体(即，对于每生物为，每模板1×103SGP核酸多聚体×2模板)，且将扩增大约20个不同的SGP-SGP核酸多聚体。当然，反向互补序列相对于引物最初结合的位置的定位将决定呈指数扩增的各SGP-SGP核酸多聚体的长度。此外，和任何PCR样方法一样，本发明的SGP-SGP核酸的指数扩增贯穿mPCR循环，所述循环包括变性(导致可获得的用于对SGP引物退火的单链SGP-SGP核酸多聚体)、SGP引物的退火(建立下一轮的延伸)和延伸(产生在下一轮扩增中被扩增的双链SGP-SGP核酸多聚体)。
B.时间减半的延伸步骤
如上面所指出的，在SGP中用作波形表征法的最终目的的波形分析需要代表基因组的独特性的几个不同的单链核酸多聚体的存在；将这些核酸多聚体和插入剂一起形成可随后被检测的高级结构。
在SGP中，直至1)通过使用全时长延伸步骤的mPCR的几个循环已完成SGP-SGP核酸多聚体的指数扩增和2)通过时间减半的延伸步骤的引入从SGP-SGP核酸多聚体产生单链缩短的SGP核酸多聚体后，才形成可检测的高级结构。在单链缩短的SGP核酸多聚体产生之前，SGP-SGP核酸多聚体将是双链的并且可通过常规方法，例如，使用溴化乙锭染色的凝胶电泳、解链温度分析等检测。然而，为产生高级结构，本发明允许将扩增的“时间减半的”循环引入mPCR法(在足够的mPCR循环已产生指数扩增的多聚体的足够拷贝例如106至107个拷贝后)以产生各缩短的SGP核酸多聚体的几个拷贝。换句话说，通过将该mPCR循环的延伸步骤的时间减少例如40-60％，从SGP-SGP核酸多聚体产生的核酸多聚体的亚群在长度上减少，即，缩短的SGP核酸多聚体。因为缩短的SGP核酸多聚体将不再在该多聚体的3’末端包含引物的反向互补序列，因此缩短的SGP核酸多聚体可以不被指数扩增；即，其保持单链且将因此形成可被检测的高级结构。
应当指出，不包含和SGP引物的反向互补序列同一的5′-至3′序列的SGP核酸多聚体(即，非缩短的SGP核酸多聚体)，在mPCR扩增的任何循环中将不结合引物，因而，也可形成高级结构。然而，如下所解释的，一个时间减半的延伸步骤产生各缩短的不同单链SGP核酸多聚体的几个拷贝(因为其产生自指数扩增的SGP-SGP核酸多聚体)。相反地，不具有包含SGP引物结合位置的序列的SGP核酸多聚体只从相对少的起始量的基因组DNA线性扩增。因此，和缩短的SGP核酸多聚体对高级结构的贡献相比，这些SGP核酸多聚体对高级结构的形成的贡献可忽略不计。
SGP中产生的高级结构将主要包含由时间减半的延伸步骤的引入产生的缩短的SGP核酸多聚体。例如，如上假定SGP引物可对例如各单链基因组模板上的大约103个位置退火，那么来自第一循环的SGP核酸多聚体的总数可以是，例如，每拷贝的基因组DNA(即，每生物)大约2×103个SGP核酸多聚体。也如上再次假定，设计引物以使100个SGP核酸多聚体中有1个具有在其序列内包含SGP结合位置的序列，那么大约20个SGP-SGP核酸多聚体，其各自和基因组DNA模板的几个不同区域中的一个区域(由SGP引物结合位置围绕的)同一，将通过mPCR指数扩增，产生相对大量拷贝的SGP-SGP核酸多聚体(当从单个基因组DNA起始时，在22-24个mPCR循环后产生大约106-107个拷贝)。指数扩增的SGP-SGP核酸多聚体的数目，和由其所产生的缩短的SGP核酸多聚体的数目，随着扩增循环进行将使通过线性扩增持续产生的SGP核酸多聚体的数目增加减缓。
本领域技术人员将认识到，由SGP产生的SGP-SGP核酸多聚体的潜在总数与基因组大小和引物的长度相关。因此在扩增的第一循环中产生的优选的SGP核酸多聚体数目可确定为在时间减半的延伸步骤中能够产生缩短的SGP核酸多聚体的SGP-SGP核酸多聚体的想要的数目(即，可获得的用于高级结构形成的缩短的SGP核酸多聚体的想要数目)的函数。该确定将有助于设计本发明的SGP，下面更详细地对所述确定进行描述。
在确定可获得的用于高级结构的形成的缩短的SGP核酸多聚体的想要的数目时，本领域技术人员将认识到，只有由mPCR指数扩增的SGP-SGP核酸多聚体的亚群用于产生缩短的SGP核酸多聚体；该亚群包含在时间减半的延伸步骤中不能完全延伸的更长的SGP-SGP核酸多聚体。因为由mPCR指数扩增的SGP-SGP核酸多聚体的序列在3′末端包含引物的反向互补序列的核苷酸序列，从而全时长延伸步骤是完成该亚群的SGP-SGP核酸多聚体的延伸所必需的，并且时间减半的延伸步骤导致缩短的SGP核酸多聚体，即在3′末端不包含引物的反向互补序列的核酸多聚体。另一方面，由mPCR指数扩增的一些SGP-SGP核酸多聚体远短于这些更长的SGP-SGP核酸多聚体。这些SGP-SGP核酸多聚体(其在时间减半的延伸步骤中分配的时间内完全延伸)将持续地在mPCR的任何随后的循环中呈指数扩增；如下所述，这些SGP-SGP核酸多聚体通常将不成为高级结构的部分。假如SGP引物的反向互补序列在通过mPCR进行指数扩增的SGP-SGP核酸多聚体的长度内随机定位，时间减半的延伸步骤的引入将导致大约一半的SGP-SGP核酸多聚体被用于产生缩短的SGP核酸多聚体。
大约50％的指数扩增的SGP-SGP核酸多聚体在由时间减半的延伸步骤延伸的部分内将不包含SGP引物结合位置，从而将参与产生缩短的SGP核酸多聚体。因为缩短的SGP核酸多聚体将不包含能够结合SGP引物以进行进一步mPCR循环的序列，因此其将形成高级结构。另外的大约50％的由mPCR指数扩增的SGP-SGP核酸多聚体将仍包含SGP引物结合位置。此外，因为产生双链SGP-SGP核酸多聚体的SGP-SGP核酸多聚体和互补序列的退火是稳定的并倾向于快速发生，因此在高级结构的形成中通常不使用SGP-SGP核酸多聚体。
例如，假定长度为9个碱基的SGP引物可对7,000个位置退火，且所得的SGP核酸多聚体在长度上可延伸至2,000个碱基，那么1.4×107个碱基的基因组DNA，即长度例如为2×109的碱基的单链基因组DNA模板的1/142将拷贝为SGP核酸多聚体。在SGP中，这7,000个核酸多聚体中的大约50至70个将包含SGP引物结合位置(如上假定，设计SGP引物以使100个SGP核酸多聚体中大约有1个包含SGP引物结合位置)。这些大约50至70个SGP核酸多聚体将有效地产生在SGP的mPCR期间指数扩增的SGP-SGP核酸多聚体。在22-24个mPCR的循环后和在时间减半的延伸步骤后，预期大约25-35个不同的可形成高级结构的缩短的SGP核酸多聚体的几个拷贝(例如，106-107)由指数扩增的SGP-SGP核酸多聚体产生。因此，时间减半的延伸步骤不仅产生用于形成高级结构的缩短的SGP核酸多聚体，还区分不同长度的SGP-SGP核酸多聚体。
作为其他例子，假定在SGP中的全时长mPCR循环中呈指数扩增的几种SGP-SGP多聚体中，SGP-SGP核酸多聚体为1kb、0.8kb、0.6kb、0.4kb和0.2kb；也假定这些重复的mPCR循环中的延伸步骤的时限正好足以延伸1kb多聚体。在随后的“时间减半的”延伸步骤期间，所产生的多聚体将分别为大约0.5kb、0.5kb、0.5kb、0.4kb和0.2kb。随着该mPCR循环进行，以及DNA的新延伸的多聚体从其各自互补模板链变性，前三个所列的多聚体(即，长度为0.5kb的多聚体，拷贝自为原始更长(1kb、0.8kb和0.6kb)的单链模板链的多聚体)将不在其3’末端具有引物序列的反向互补序列，且其长度都是大致相同(即，0.5kb)。可获得这些单链缩短的SGP核酸多聚体以形成波形特征谱的产生所必需的高级结构。然而，从0.4kb和0.2kb的模板链延伸的多聚体将是全长，即，在这些拷贝的3′末端上存在引物序列的反向互补序列，随后的PCR扩增循环将持续地产生SGP-SGP核酸多聚体，这样其将不能有效地参与高级结构的形成。
C.检测单基因组特征谱
因为将指数扩增，即mPCR，用于SGP方法，因此不要求有大量的目的基因组DNA拷贝。例如，假定(非SGP)波形引物可沿各单链基因组DNA模板结合103个位置，则(因为其他波形表征法通常需要以至少106个生物来进行，如上所述)每线性扩增的循环产生的核酸多聚体的总数大约为2×109(每生物每基因组DNA模板103个核酸多聚体×2个基因组×106个生物)。在其他波形表征法中，可重复线性扩增循环，例如22-24次(即，产生22-24套2×103不同的单链)。相反地，本发明的实施方案中的一个涉及下列事实，即如果在扩增过程的开始在样品中只存在单拷贝的基因组序列(假定有效的提取)，则用SGP法可有效地完成波形表征。在始于一个基因组拷贝的mPCR扩增的几个循环(例如，22-24个循环)之后，由SGP引物结合位置围绕的基因组DNA的各不同区域，即各不同的SGP-SGP核酸，将以106至107倍的量级(即，将存在大约106至107个拷贝)拷贝。优于其他波形表征法的该改进允许在使用SGP方法对例如细菌在样品中的存在进行检测和分类中具有高得多的灵敏性。
因为缩短的SGP核酸多聚体来源于和由SGP引物结合位置围绕的基因组DNA的区域同一的SGP-SGP核酸多聚体，因此，缩短的SGP核酸多聚体将包含被检测的生物的独特的序列差异。在SGP中，在时间减半的延伸步骤中产生的几种单链缩短的SGP核酸多聚体的各多聚体的拷贝将相互作用以形成高级结构，即，包含一些缩短的SGP核酸多聚体的复合物。依赖于缩短的单链的碱基序列，即基于生物的独特的基因组信息，高级结构将具有不同的稳定性和在不同的解链温度(Tm)下离解。可确定和记录来源于生物的高级结构的Tm；这可通过使用嵌入高级DNA结构的荧光试剂即插入剂来完成。因此，SGP可用于通过波形特征谱分析来检测、比较和区分不同生物的基因组DNA，即检测和记录高级结构的离解。
通过增加样品的温度离解特定样品的高级结构。随着高级结构离解，嵌入这些高级结构的荧光剂也分离。将通过这些高级结构的离解获得的荧光强度的变化率作为不断增加的温度的函数作图产生了对于生物的基因组DNA是独特的波形，即观察和记录不同解链温度(Tm)下的高级DNA结构以产生特征性波形特征谱。显示生物在样品中的存在的波形特征谱称为阳性波形特征谱；在无生物存在于样品中的情况下，产生阴性波形特征谱。
在本发明的一些实施方案中，合适的(阳性)波形谱的存在表示生物在样品中的存在。在其他实施方案中，特征性波形谱表示生物的特定种(或株系)，例如细菌的种或株系。因此，SGP法可通过使用波形表征的方法利用插入剂获得各生物的独特波形谱，来区分来自第一生物的基因组DNA和来自第二生物的基因组。
如上所述，SGP的mPCR步骤包括多个扩增循环；即，多个下列步骤的循环：1)使各基因组DNA变性成基因组DNA模板，2)使SGP引物沿着各基因组DNA模板对几个分开的SGP引物结合位置和前面产生的SGP核酸多聚体以及SGP-SGP核酸多聚体退火，和3)从对SGP引物结合位置退火的各引物延伸SGP和SGP-SGP核酸多聚体。特别地，在扩增的一个循环期间，将样品的温度增加(例如，至95-98℃)以使任何双链核酸多聚体(包括基因组DNA)变性。然后降低温度(例如，至25℃)以使SGP引物对任何可获得的SGP引物结合位置退火。循环中的最后步骤，使用例如，Taq聚合酶，在大约72℃下从引物延伸SGP和SGP-SGP核酸多聚体。最后，在扩增的最后循环中的一个循环中，将延伸步骤的时间长度减少例如40-60％(例如，50％)，以产生缩短的SGP核酸多聚体。本发明可包括包含额外的时间减半的延伸步骤的额外循环以产生更精确和/或牢靠(robust)的波形谱；这此循环可在整合被包含以扩增产物(例如，本发明的SGP-SGP核酸多聚体)的额外的全时长延伸步骤的额外循环之后进行。
本领域技术人员将知道使用能够重复循环步骤的装置或仪器，所述循环步骤包括扩增方法中的变性、退火和延伸步骤所必需的温度变化；这些仪器包括但不限于，本领域已知的PCR仪和“GenopatternAnalyzer GP1000”仪(Adgene)。生产能够进行本发明中必需的mPCR循环步骤的仪器的其他公司包括，但不限于，Perkin-Elmer(Wellesley，MA)、Applied Biosystems(Foster City，CA)或MJResearch(Waltham，MA)。这些仪器能够改变不同步骤的时限(timing)和持续时间，在所述步骤中改变和重设温度，从而这些仪器可用于产生全时长延伸步骤和本发明的必需的时间减半的延伸步骤。此外，本领域技术人员可使用另外的材料协助使用GSP检测生物的基因组DNA的不同方面，包括但不限于用于提取的反应物试剂盒(其中有几种是本领域已知的；例如，Xtrana技术学，例如Xtra Amp提取系统(XtranaInc.，Broomfield，CO))；解释通过波形表征产生的结果的分析软件(例如，Adgene生产的GenoMaster)；和引物设计支持工具(例如用于其他波形表征方法的“Design Support Tool for Genopattern Primer”和GenoSequenceAnalyzer软件，两者由Adgene生产)。本领域技术人员可调整这些软件和/或工具的参数和/或方案以用于SGP。
D.单基因组表征引物
使用本领域熟知的方法设计SGP引物，以使其沿各单链基因组DNA模板结合几个分开的位置。在本发明的一个实施方案中，使用SGP引物检测来自生物例如细菌和病毒的任何基因组DNA的存在。在本发明的另一个实施方案中，特制SGP引物以用于检测特定的生物，例如细菌的特定的种或株系。本领域技术人员通过考虑基因组DNA的长度和序列可确定SGP引物的长度和序列，所述SGP引物用于一般性地检测细菌的基因组DNA，或检测细菌的特定的种或株系的基因组DNA。本领域技术人员将就其基因组DNA的序列调查细菌的几个种并推导能够检测大部分或所有这些种的引物的序列；该类型的引物有时称为“通用”引物。通用SGP引物，和对于特定的种或株系是特异性的SGP引物，在由本领域技术人员进行的直接的实验性试验之后确定。
本领域技术人员将认识到，SGP引物的长度和其沿着基因组DNA模板结合几个SGP引物结合位置即互补序列的能力呈反相关，即引物越短，引物沿着基因组DNA模板结合的分开的SGP引物结合位置的数目将越多。相反地，引物越长，引物沿着基因组DNA模板结合的分开的SGP引物结合位置的数目将越少。此外，涉及引物长度的相同分析也用于SGP引物的互补序列和SGP引物的反向互补序列在沿着基因组DNA模板长度的预定距离(即，SGP核酸多聚体的预定的最大长度)内出现的概率。因此，引物越短，SGP引物结合位置的反向互补序列在SGP引物结合位置下游的预定距离内存在的可能性越大。通过包含全时长延伸步骤的时间长度确定预定距离，且当引物结合位置的反向互补序列存在于预定距离内时，指数扩增将发生。除了SGP引物的短长度外，受引物的序列影响的和/或与其相关的参数，例如引物的解链温度、引物的G/C含量、GC封条、引物自身互补性等，在引物的设计中起着重要作用。使用这些参数设计引物已成为本领域的常规方法(一般参见，例如，Burpo(2001)″Acritical review of PCR primer designalgorithms and cross-hybridization case study，″，可在″Computational Molecular Biology″课程材料，Stanford University(cmgm.stanford.edu/biochem218/Projects％202001/Burpo.pdf)中获得)。
因此，本领域技术人员通过考虑基因组DNA的长度和序列以及引物的想要的长度和特异性能够设计合适的SGP引物。在本发明的一个实施方案中，设计SGP引物使之以预先确定的频率和各单链基因组DNA模板结合。在本发明的另一个实施方案中，设计SGP引物使该引物也可以预先确定的频率在SGP核酸多聚体的指数扩增中用作正向和反向引物。
本领域技术人员也可期望涉及其他波形表征法和波形引物的产生的材料和软件程序(可从例如Adgene商购获得)作为设计用于SGP的引物(包括“通用”引物，和用于检测例如细菌的特定种和株系的引物)的辅助材料。然而，本领域技术人员将认识到，对于设计引物，需要改进涉及其他波形表征法的技术和参数以产生在SGP中正确发挥功能的引物。例如其他波形表征法使用包含特异性部分和非特异性稳定性部分的引物；本发明的SGP引物不包含非特异性稳定性部分。此外，本领域技术人员认识到SGP引物沿单链基因组DNA模板结合更多数目(当和其他波形表征法中的引物相比时)的结合位置是必需的，至少部分因为只有部分SGP核酸多聚体将具有在引物结合位置下游的预定距离内包含引物的反向互补序列的序列，即，只有部分将进行指数扩增并产生SGP-SGP核酸多聚体。此外，只有部分(例如，大约50％)进行指数扩增的SGP-SGP核酸多聚体将在时间减半的延伸步骤中产生缩短的SGP核酸多聚体。
设计用于SGP的引物使之比用于其他波形表征法的引物(或用于标准PCR的引物)更短(更少的碱基)，因为随着引物长度减少产生SGP-SGP核酸多聚体的概率增加。因为该原因，本领域技术人员可设计长度比经建议/推荐用于其他波形表征法的引物更短的引物。例如，Adgene提供了“A Method for Comparison and Identification of DNAsand RNAs by Pattern Analysis：Genopattern Method”的图4中的波形引物(可从Adgene商购获得)的例子。该波形引物包含11个碱基的非特异性稳定性部分和8个碱基的特异性部分。本领域技术人员通过排除非特异性部分可设计用于SGP的引物，且其也可将总的SGP引物中的碱基的数目减少至少于Adgene的波形引物的特异性部分中的碱基数目的数目。例如，可设计用于SGP的长度为6或7个碱基的引物。在其中特定波形引物的特异性部分包含更多碱基的另一个实施方案中，对应的SGP引物的设计也可包含更多的碱基。
可通过SGP方法检测的细菌是已为其设计了通用波形引物的细菌；这些引物在本领域是已知的并且用于检测副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、索氏志贺氏菌(Shigella sonnei)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。其他引物，其中几个可用于区分细菌的单个种和株系，也可从Adgene商购获得以用于其他波形表征法。如上面所指出的，本领域技术人员可改变引物的设计，或改变设计引物的方法，以产生用于基于已知的波形引物的SGP引物。此外，本领域技术人员可通过分析目的生物的基因组材料和通过进行一系列直接的实验性试验来为未曾为其设计波形引物的生物(例如，其它细菌和病毒)设计合适的SGP引物。
本领域技术人员将承认SGP在检测样品例如水样品中的适用性。用于分离生物和由此分离生物的基因组的方法，将依赖于样品，且在本领域是已和的。一经分离可能的基因组DNA，可使用SGP法检测基因组DNA的存在，从而，检测生物的存在。在某些情况下，例如，当样品，例如水样品，应当是灭菌或相对不含污染物时，这些检测法足以检测由生物造成的污染。当需要对生物进行分类时，可使用其他和更特异性的SGP引物。
实施例
此处讨论本发明的实施方案。在实施例1中建立了本发明的一个实施方案的基础，即用于检测污染性生物在样品中不存在或存在的系统的基础。本发明的应用见于实施例2中。本领域技术人员将认识到这样的系统在提供各种样品的质量保证中的用途，例如检测细菌在供水中的不存在或存在。同样，本领域技术人员认识到，本发明可用于分析不同样品中基因和其他长度的核苷酸的不存在或存在。例如，本领域技术人员可使用本发明检测样品中的炭疽和对其进行分类，所述样品是供气的过滤物或是血液，或检测和分类包被在各种食品上的病毒。本发明不应当被解释为限定于下面描述的特定的实施例的范围内。
实施例1
包括改进的PCR(mPCR)和时间减半的延伸步骤的单一基因组表
征(SGP)法
下面提供的实施例和图表是提供以帮助本领域技术人员理解本发明和描述此处所述的改进的理论构建(construction)。图1是描述波形表征法(包括SGP法(图1A))的第一循环和比较SGP法(图1B)和其他波形表征法(图1C)的随后的循环的结果的流程图。应当指出，该流程图显示使用了待检测的一个拷贝的基因组。然而，如上所述，只有使用SGP法，该量的基因组才可满足可检测的高级结构的形成。
为进一步演示本发明，在实施例1.1和实施例1.2中分别提供了假定的引物序列和假定的基因组序列以演示足够短的引物如何能够沿各单链基因组DNA模板的长度结合几个分开的引物结合位置。然后，实施例1.3指导本领域技术人员完成此处描述的SGP方法，提供了在SGP法的各步骤之后预期的各核酸多聚体的序列，和帮助描述本发明的改进。此处提供的实施例不应当被解释或理解为限定本发明的范围。
实施例1.1：假定的引物序列
在此处提供的模型中，引物是5′-AGC-3′。
实施例1.2：假定的基因组序列
通过使用计算机程序产生以随机顺序和频率包含4种DNA核苷酸碱基(腺嘌呤“A”、鸟嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”和胞嘧啶“C”)的1001bp基因组序列(其两条链分别示于SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2)。改变该假定的、随机产生的序列的少数碱基以获得更清楚地演示SGP方法的序列。双链基因组DNA的各单链基因组DNA模板的序列显示于图2。一个单链基因组DNA模板的序列以5′-至-3′显示，由对应于核苷酸碱基的大写字母显示，并示为SEQ ID NO：1；互补的单链基因组DNA模板以3′-至-5′显示，由对应于核苷酸碱基的小写字母显示，并示为SEQ ID NO：2。各基因组DNA模板上的粗体字母显示实施例1.1的假定的引物预期退火的位置，即引物结合位置。图2中被括弧包括的区域表示被引物结合位置围绕的假定的基因组DNA的几个分开的区域，各区域将以SGP-SGP核酸多聚体的形式指数扩增(参见，例如，图5)。
实施例1.3：包含改进的PCR和时间减半的延伸步骤的SGP方法。
实施例1.1的引物预期沿着实施例1.2的基因组DNA对各引物结合位置退火。mPCR的第一循环始于将基因组DNA变性成两个基因组DNA模板，该步骤在大约95-98℃下进行大约2分钟。变性之后进行引物对各单链基因组DNA模板上的几个分开的互补位置即引物结合位置退火。退火在大约25℃下发生大约2分钟。在引物已对各单链基因组DNA模板上的几个分开的互补位置退火后，聚合酶，例如，Taq聚合酶，延伸不同的核酸多聚体，即SGP核酸多聚体，延伸始于引物的3’末端并以5′-至-3′的方向延伸。延伸在大约72℃下发生大约2分钟，这样，在该假定的mPCR的第一循环中，产生了大约21个碱基或更少碱基的SGP核酸多聚体。
使用实施例1.1和1.2的假定的引物和基因组DNA序列的mPCR的第一循环例示于图3和4中。图3显示假定的基因组DNA序列(也描述于图2中)为两个变性的单链DNA模板。其中一个单链DNA模板的序列在图3A中以5′-至-3′描述并由大写字母表示(SEQ ID NO：1)，而互补单链DNA模板的序列在图3B中以3′-至-5′描述并由小写字母表示(SEQ ID NO：2)。同样，粗体字母显示预期的引物退火位置。预期在扩增的第一循环期间从其产生SGP核酸多聚体的基因组DNA的区域在各基因组DNA模板下方通过1)字母(对应于在各引物结合位置下方的假定的引物序列，以描述引物对引物结合位置的结合)、2)箭头(描述SGP核酸多聚体的延伸方向)和3)断面线(显示延伸的SGP核酸多聚体的预期长度)显示。预期在扩增的第一循环后从各基因组DNA模板产生的SGP核酸多聚体的序列列于图4。如所显示的，一些SGP核酸多聚体的序列包含SGP引物结合位置(由粗体标示的序列表示)。
在扩增的第二和随后的循环中变性步骤期间，具有包含SGP引物结合位置(如图4中所示)的序列的SGP核酸多聚体将从各基因组模板分离，且将参与随后的退火和延伸步骤，即，其将不形成高级结构。因此，在第二和随后的扩增循环中，除了图4中所示的核酸多聚体外，还合成和扩增图5中所示的成组的SGP-SGP核酸多聚体。
本领域技术人员将容易地认识到，图5中所示的各序列，即各SGP-SGP核酸多聚体序列，与由引物结合位置围绕的，即，由SGP引物序列和该SGP引物序列的反向互补序列围绕的基因组DNA模板的几个区域(如图2中用括号描述的)中的一个同一。本领域技术人员也将认识到，扩增的随后的循环将导致图5中所列的序列的指数加倍。大约22-24个循环后，将从一个拷贝的基因组产生图5中所列的各个不同的SGP-SGP核酸多聚体的大约106至107个拷贝。
在几个，例如22-24个包括全时长延伸步骤的mPCR循环后，加入“时间减半的”延伸步骤，这样图5中所列的SGP-SGP核酸多聚体中的一些的3’末端将因延伸时间减少而不被拷贝。“时间减半的”延伸步骤可为前面全时长延伸步骤中所用时间长度的大约40-60％，例如上面所用延伸步骤的时间长度的50％。
在本实施例中，时间减半的步骤期间的延伸在大约72℃下发生大约1分钟。这样的延伸时间允许大约10个碱基对的聚合。这样，只有来源于具有下列序列(如图5中所列的)中的一个序列的SGP-SGP核酸多聚体的核酸多聚体将被完全延伸，这样其将包含引物结合位置：3′-tcga-5′(示为SEQ ID NO：36)、3′-tcgcccccga-5′(示为SEQ IDNO：37)、5′-AGCT-3′(示为SEQ ID NO：40)或5′-AGCGGGGGCT-3′(示为SEQ ID NO：41)。这些SGP-SGP核酸多聚体将不参与高级结构的形成。
相反地，在时间减半的延伸步骤中，从具有下列序列(如图5中所列的)中的一个序列的SGP-SGP核酸多聚体拷贝的核酸多聚体将是缩短的SGP核酸多聚体，即其将不具有包含引物结合位置的序列，所述引物结合位置是：3′-tcgggtttcccggaagccga-5′(示为SEQ IDNO：35)、3′-tcggctactacggaacga-5′(示为SEQ ID NO：38)、5′-AGCCCAAAGGGCCTTCGGCT-3′(示为SEQ ID NO：39)或5′-AGCCGATGATGCCTTGCT-3′(示为SEQ ID NO：42)。在时间减半的延伸步骤后，SGP-SGP核酸多聚体和预期来源于列于图5的SGP-SGP核酸多聚体的缩短的SGP核酸多聚体的序列列于图6。缩短的SGP核酸多聚体，即，不具有SGP引物结合位置且将参与高级结构的形成的核酸多聚体在图6中以下划线标示且具有如下序列：5′-AGCCCAAAGG-3′(示为SEQ ID NO：43)、5′-AGCCGATGAT-3′(示为SEQ ID NO：46)、3′-cggaagccga-5′(示为SEQ ID NO：47)和3′-tacggaacga-5′(示为SEQ ID NO：50)。
随后的mPCR循环(包含替代全时长延伸步骤的时间减半的延伸步骤)产生单链缩短的SGP核酸多聚体，所述多聚体没有互补链，因而其将形成高级结构。可通过进行Tm分析(波形表征)检测这些高级结构。相反地，更短的SGP-SGP核酸多聚体，例如，5′-AGCT-3′，将在具有时间减半的延伸步骤的mPCR期间完全延伸。因此，因为在时间减半的延伸步骤期间将总是形成完全互补的SGP-SGP核酸多聚体，这些较短的SGP-SGP核酸多聚体将结合其互补核酸多聚体从而将不参与高级结构的形成。
实施例2
设计和使用SGP引物
设计SGP引物以产生获自ATCC(Manassas，VA)的基因组DNA的不同的波形谱；受试基因组DNA来自4种紧密相关的细菌：大肠杆菌(ATCC #10798D)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)(ATCC#13047D)、肠沙门氏菌(Salmonella enterica)(ATCC #700720D)和斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)(ATCC #33672D)。通过计算大肠杆菌基因组内将产生SGP核酸多聚体的SGP引物结合位点的数目来选择特异性SGP引物序列。
实施例2.1：设计SGP引物
根据两个理由选择长度为8个核苷酸的SGP引物。首先，如果随机地使用所有4种核苷酸(即，A、T、G、C)产生8个碱基长的SGP引物，则存在65,536种可能的序列组合。因此，推断8bp的任一SGP引物将在每65,536个碱基中的一个位置上结合其完全互补的序列。第二，大肠杆菌基因组大约为5百万个碱基，因此长度为8个碱基对的SGP引物将假定地结合基因组上的76个位置。
确定另外的限制以使通过单个SGP引物进行的SGP核酸多聚体的延伸和SGP-SGP核酸多聚体的扩增最大化。例如，设计SGP引物，考虑大肠杆菌基因组上由SGP引物结合位置围绕的不同区域应当在5,000个碱基内发生并且以正确的方向产生SGP-SGP核酸多聚体。对于可能的SGP引物，使用由NIH提供的BLAST(Basic Local AlignmentSearch Tool)程序确定大肠杆菌基因组(示于GenBank，目录号U00096)上的实际的SGP引物结合位置的数目。该程序报告了大肠杆菌内为引物结合位点的位置。也可通过熟知的参数限制引物设计，例如通过排除可和自身杂交的任何引物来防止引物二聚体的形成。
实施例2.2：使用SGP引物
8个候选SGP引物中，2个对所有四种受试细菌产生扩增的SGP-SGP核酸多聚体。两个引物的序列为5′-GCGAGGAT-3′(DJB7；示为SEQ ID NO：51)和5′-GGCACTGC-3′(DJB8；示为SEQ ID NO：52)。Blast结果预测DBJ7将在5个在5,000个碱基内具有引物结合位置和反向引物互补序列结合位置的位点上和大肠杆菌基因组杂交，而DBJ8将在10个这样的位点上和大肠杆菌基因组杂交。使用DJB7或DJB8引物的实验在不同的反应条件下，通过使用1％的凝胶电泳，用溴化乙锭染色来比较扩增的SGP-SGP核酸多聚体的大小和数目。最初，使用5μM DJB8引物(5′-GGCACTGC-3′)和1xTakara PCR缓冲液、300nM各dNTP、2.5mM MgCl2、2.5个单位的Takara聚合酶(所有都可从TakaraMirus Bio，Madison，WI商购获得)和100ng或250ng DNA进行扩增(即，一个或多个循环的变性、退火和延伸)。进行30个循环：在94℃下变性30秒，在25℃下退火30秒和在72℃下延伸30秒，以从四种细菌DNA的各DNA和从人DNA(作为对照；Promega #G3041)产生双链SGP-SGP核酸多聚体。
使用上述条件、DJB7或DJB8和不同细菌基因组的波形表征法产生不同大小的扩增的双链SGP-SGP核酸多聚体，即对于各细菌菌种是特异性的单一模式(数据未显示)。此外，当使用两种引物中任一引物时，未检测到从人基因组DNA(Promega，Madison，WI)扩增的SGP-SGP核酸多聚体(数据未显示)。该结果证明可使用SGP引物检测和区分不同的细菌DNA，也可用其区分细菌DNA和人DNA。
最优化使用两种SGP引物中的一种引物和细菌DNA模板(包括作为对照的人基因组DNA)的SGP-SGP核酸多聚体的扩增。使用8碱基SGP引物成功地进行扩增的几个关键参数是1)低退火温度，2)引物的高浓度，和3)高扩增循环次数。最终的最适宜条件确定为1xTakaraPCR缓冲液、300nM各dNTP、5.0mM MgCl2、5.0μM SGP引物、2.5个单位的Takara聚合酶和1ng模板DNA；最适宜循环条件确定为40个循环：94℃下变性1分钟，25℃退火1分钟，和72℃下延伸1分钟。
使用DJB7或DJB8(分别为图7A和图7B)的扩增产生双链SGP-SGP核酸多聚体的不同模式，所述模式可用于区分相互之间不同的细菌DNA和/或区分细菌DNA和人DNA。数据证明本发明的SGP引物可用于本发明的波型表征法以产生扩增的DNA的不同模式，这些不同模式的检测可用于生物的检测和/或分类，即使该生物以少量存在。
也可通过监测荧光变化来检测双链SGP-SGP核酸多聚体的不同模式，所述荧光变化是由于嵌入性染料(例如，SYBRGreen)响应增加的温度而释放造成的，即，使用本发明的SGP引物和本发明的SGP方法产生的波型特征谱可通过解链温度分析来检测。此外，本领域技术人员将认识到可整合时间减半的延伸步骤以使由SGP-SGP核酸多聚体产生的缩短的SGP核酸多聚体可形成高级结构，所述高级结构也可通过解链温度分析来检测。
序列表
<110>Canon U.S.Life Sciences，Inc.
<120>用于监测生物的基因组DNA的方法
<130>3400-151
<150>US 60/591,596
<151>2004-07-28
<160>52
<170>PatentIn version 3.3
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<211>1001
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<223>假定的电联DNA模板
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cgcagccgac agcaactatc tgaacgagcg agggccatca agcctggcat atcgtcaggt 120
caccacgtgg gtgcaatgcg cgtcactctc ttccaccctt gtgtaataat tgtacaaaca 180
tccactgttc tctcagagaa catatgtccc cggcgctcta agtaacaccg gcaaaatttt 240
tgaagcccaa agggccttcg gctgccaact ctcggaggat cgccgttcaa ccgccggtag 300
agacagtata caaattatac agagtcctat ggcaggattg ttctccagta tgcaaccgtg 360
aggcacgcca gaagcagtct gtctttcctg ggacgtgaat ttgctttgat tgcatgctca 420
gtacgcgagg cttctccgca agattcacaa aagcaacgcg gtttgccaac gtagggattg 480
agaccaaatc ccatcggtaa ttgaggcaaa gattccgcca gccatggtaa attacccttc 540
tacctgggga gctagcgatt gcgtggacaa agcgcatgtg cgagcggacg ttgggcagtc 600
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caatttcttt atattgttag ggattccccg tactctcctt tcaggggcct aaggaccctt 720
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ttacgttggt gctgatcagt ttatactccg ctgtgaccat cgttaagtat accaccggct 840
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<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP核酸多聚体
<400>24
agcatgcaat caa 13
<210>25
<211>14
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP核酸多聚体
<400>25
agcctcgcgt actg 14
<210>26
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP核酸多聚体
<400>26
agctccccag gtagaagggt a 21
<210>27
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP核酸多聚体
<400>27
agcccccgct acctctttct g 21
<210>28
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP核酸多聚体
<400>28
agcaccaacg taatac taca t 21
<210>29
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP核酸多聚体
<400>29
agcggagtat aaactgatc 19
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<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP核酸多聚体
<400>30
agccggtggt atacttaacg a 21
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<211>11
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP核酸多聚体
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agcgcggagt t 11
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<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP核酸多聚体
<400>32
agccataagt cccccata 18
<210>33
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP核酸多聚体
<400>33
agcaccccgg acaggtggtg g 21
<210>34
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP核酸多聚体
<400>34
agcaaggcat catcggctga a 21
<210>35
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的SGP-SGP核酸多聚体
<400>35
agccgaaggc cctttgggct 20
<210>36
<211>4
<212>DNA
<213>人工的
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<223>来自SEQ ID NO：2的SGP-SGP核酸多聚体
<400>36
agct 4
<210>37
<211>10
<212>DNA
<213>人工的
<220>
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<400>37
agcccccgct 10
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<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的SGP-SGP核酸多聚体
<400>38
agcaaggcat catcggct 18
<210>39
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP-SGP核酸多聚体
<400>39
agcccaaagg gccttcggct 20
<210>40
<211>4
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP-SGP核酸多聚体
<400>40
agct 4
<210>41
<211>10
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP-SGP核酸多聚体
<400>41
agcgggggct 10
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<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP-SGP核酸多聚体
<400>42
agccgatgat gccttgct 18
<210>43
<211>10
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的缩短的SGP核酸多聚体
<400>43
agcccaaagg 10
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<211>4
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的SGP-SGP核酸多聚体
<400>44
agct 4
<210>45
<211>10
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的SGP-SGP核酸多聚体
<400>45
agcgggggct 10
<210>46
<211>10
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：2的缩短的SGP核酸多聚体
<400>46
agccgatgat 10
<210>47
<211>10
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的缩短的SGP核酸多聚体
<400>47
agccgaaggc 10
<210>48
<211>4
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP-SGP核酸多聚体
<400>48
agct 4
<210>49
<211>10
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的SGP-SGP核酸多聚体
<400>49
agcccccgct 10
<210>50
<211>10
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自SEQ ID NO：1的缩短的SGP核酸多聚体
<400>50
agcaaggcat 10
<210>51
<211>8
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>SGP引物DJB7
<400>51
gcgaggat 8
<210>52
<211>8
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>SGP引物DJB8
<400>52
ggcactgc 8

Claims (17)

1.非疾病诊断目的的指数扩增DNA的方法，所述方法包括；
(a)形成含所述DNA、多拷贝的单基因组表征法(SGP)引物和适当浓度的其他扩增试剂的聚合酶链式反应扩增混合物，其中所述SGP引物与所述DNA上的多个位置结合，其中所述SGP引物是选自SEQ ID NO：51所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：52所示的核苷酸序列的核苷酸序列，且充当正向引物和反向引物；
(b)以第一时间长度变性所述扩增混合物；
(c)以第二时间长度退火所述扩增混合物；
(d)以第三时间长度延伸所述扩增混合物；
(e)重复步骤(b)-(d)10-100个循环；
(f)重复步骤(b)和(c)；以及
(g)以第四时间长度延伸所述扩增混合物，所述第四时间长度是第三时间长度的40％-60％，以此步骤消除扩增产物的指数扩增并使扩增产物为缩短的形式的。
2.权利要求1的方法，其中所述方法还包括步骤：
(h)通过冷却扩增反应混合物，形成高级结构，所述高级结构是三链体或四链体。
3.权利要求1的方法，其中步骤(e)中的循环次数是20-50次。
4.权利要求3的方法，其中步骤(e)中的循环次数是30-40次。
5.权利要求1的方法，其中第四时间长度是第三时间长度的50％。
6.权利要求2的方法，其中所述方法还包含在步骤(h)之前重复1次或多次步骤(f)-(g)的步骤。
7.权利要求1的方法，所述方法还包括检测至少一种扩增的产物的步骤。
8.权利要求7的方法，所述方法还包括加入可检测的试剂的步骤。
9.权利要求8的方法，其中所述检测的步骤包括进行解链温度分析。
10.非疾病诊断目的的确定样品中是否存在大肠杆菌、阴沟肠杆菌、肠沙门氏菌或斯氏普罗威登斯菌的方法，所述方法包括步骤：
(a)获取样品；
(b)从样品提取DNA；
(c)形成含所述DNA、多拷贝的单基因组表征法(SGP)引物和合适浓度的其他扩增试剂的聚合酶链式反应扩增混合物，其中所述SGP引物与所述DNA上的多个位置结合，其中所述SGP引物是选自SEQ ID NO：51所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：52所示的核苷酸序列的核苷酸序列，且充当正向引物和反向引物；
(d)以第一时间长度变性所述扩增混合物；
(e)以第二时间长度退火所述扩增混合物；
(f)以第三时间长度延伸所述扩增混合物；
(g)重复步骤(b)-(f)10-100个循环；
(h)重复步骤(b)和(e)；
(i)以第四时间长度延伸所述扩增混合物，所述第四时间长度是第三时间长度的40％-60％，以此步骤消除扩增产物的指数扩增并使扩增产物为缩短的形式的；
(j)通过冷却扩增反应混合物以使缩短形式的扩增产物形成高级结构，所述高级结构是三链体或四链体；
(k)检测三链体或四链体的存在与否，由其中所述三链体或四链体的存在确定生物的存在。
11.权利要求10的方法，其中所述第四时间长度为第三时间长度的50％。
12.权利要求10的方法，其中步骤(g)中的循环次数为20-50次。
13.权利要求12的方法，其中步骤(g)中的循环次数为30-40次。
14.权利要求10的方法，其中所述方法还包含在步骤(j)之前重复1次或多次步骤(h)-(i)。
15.权利要求10的方法，其中步骤(f)和(i)的延伸采用相同的温度。
16.权利要求10的方法，所述方法还包括加入可检测的试剂的步骤。
17.权利要求16的方法，其中所述检测的步骤包括进行解链温度分析。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8119352B2 (en) * 2006-06-20 2012-02-21 Cepheld Multi-stage amplification reactions by control of sequence replication times
GB201812192D0 (en) 2018-07-26 2018-09-12 Ttp Plc Variable temperature reactor, heater and control circuit for the same

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA929319B (en) * 1991-12-11 1993-05-24 Igen Inc Method for exponential amplification of nucleic acid by a single unpaired primer.
EP0695366A4 (en) 1993-04-16 1999-07-28 F B Investments Pty Ltd METHOD FOR RANDOM AMPLIFICATION OF POLYMORPHIC DNA
US5942443A (en) 1996-06-28 1999-08-24 Caliper Technologies Corporation High throughput screening assay systems in microscale fluidic devices
GB9608644D0 (en) 1996-04-26 1996-07-03 Scient Genarics Ltd Nucleic acid manipulation
WO1998000231A1 (en) 1996-06-28 1998-01-08 Caliper Technologies Corporation High-throughput screening assay systems in microscale fluidic devices
US5779868A (en) 1996-06-28 1998-07-14 Caliper Technologies Corporation Electropipettor and compensation means for electrophoretic bias
WO1998000705A1 (en) 1996-06-28 1998-01-08 Caliper Technologies Corporation Electropipettor and compensation means for electrophoretic bias
US5800690A (en) 1996-07-03 1998-09-01 Caliper Technologies Corporation Variable control of electroosmotic and/or electrophoretic forces within a fluid-containing structure via electrical forces
US6447727B1 (en) 1996-11-19 2002-09-10 Caliper Technologies Corp. Microfluidic systems
US6465257B1 (en) 1996-11-19 2002-10-15 Caliper Technologies Corp. Microfluidic systems
US6391622B1 (en) 1997-04-04 2002-05-21 Caliper Technologies Corp. Closed-loop biochemical analyzers
US5882465A (en) 1997-06-18 1999-03-16 Caliper Technologies Corp. Method of manufacturing microfluidic devices
US5876675A (en) 1997-08-05 1999-03-02 Caliper Technologies Corp. Microfluidic devices and systems
US5989402A (en) 1997-08-29 1999-11-23 Caliper Technologies Corp. Controller/detector interfaces for microfluidic systems
AUPO882497A0 (en) * 1997-08-29 1997-09-18 Grains Research & Development Corporation A method of genotyping
US5965410A (en) 1997-09-02 1999-10-12 Caliper Technologies Corp. Electrical current for controlling fluid parameters in microchannels
US6012902A (en) 1997-09-25 2000-01-11 Caliper Technologies Corp. Micropump
ATE386044T1 (de) 1997-12-06 2008-03-15 Invitrogen Corp Isolierung von nukleinsäuren
US6914137B2 (en) 1997-12-06 2005-07-05 Dna Research Innovations Limited Isolation of nucleic acids
WO1999058664A1 (en) 1998-05-14 1999-11-18 Whitehead Institute For Biomedical Research Solid phase technique for selectively isolating nucleic acids
US6306590B1 (en) 1998-06-08 2001-10-23 Caliper Technologies Corp. Microfluidic matrix localization apparatus and methods
US6132685A (en) 1998-08-10 2000-10-17 Caliper Technologies Corporation High throughput microfluidic systems and methods
US6416642B1 (en) 1999-01-21 2002-07-09 Caliper Technologies Corp. Method and apparatus for continuous liquid flow in microscale channels using pressure injection, wicking, and electrokinetic injection
US6171850B1 (en) 1999-03-08 2001-01-09 Caliper Technologies Corp. Integrated devices and systems for performing temperature controlled reactions and analyses
US6500323B1 (en) 1999-03-26 2002-12-31 Caliper Technologies Corp. Methods and software for designing microfluidic devices
GB9915398D0 (en) 1999-07-02 1999-09-01 Baker Matthew J Magnetic particles
AU6068300A (en) 1999-07-06 2001-01-22 Caliper Technologies Corporation Microfluidic systems and methods for determining modulator kinetics
US6613581B1 (en) 1999-08-26 2003-09-02 Caliper Technologies Corp. Microfluidic analytic detection assays, devices, and integrated systems
WO2001017797A1 (en) 1999-09-10 2001-03-15 Caliper Technologies Corp. Microfabrication methods and devices
US6556923B2 (en) 2000-01-26 2003-04-29 Caliper Technologies Corp. Software for high throughput microfluidic systems
US20040241651A1 (en) * 2000-04-07 2004-12-02 Alexander Olek Detection of single nucleotide polymorphisms (snp's) and cytosine-methylations
JP4331379B2 (ja) 2000-04-25 2009-09-16 タイテック株式会社 遺伝子型による生物の同定方法
WO2002010373A2 (en) 2000-07-31 2002-02-07 Applera Corporation Apparatus and method for specific release of captured extension products
ATE448875T1 (de) 2000-09-14 2009-12-15 Caliper Life Sciences Inc Mikrofluidische vorrichtungen und methoden um temperatur-vermittelte reaktionen durchzuführen
WO2002046398A2 (en) 2000-11-06 2002-06-13 The University Of Houston System Nucleic acid separation using immobilized metal affinity chromatography
JP2002291500A (ja) 2001-03-29 2002-10-08 Adgene Co Ltd 核酸溶解曲線及び核酸解離曲線を用いた核酸変異検出法
WO2002083952A1 (en) 2001-04-12 2002-10-24 Caliper Technologies Corp. Systems and methods for high throughput genetic analysis
US6852524B2 (en) 2001-04-27 2005-02-08 Canon Kabushiki Kaisha Probe carrier, probe fixing carrier and method of manufacturing the same
JP2002325581A (ja) 2001-04-27 2002-11-12 Adgene Co Ltd 核酸溶解曲線及び核酸解離曲線を用いた未知あるいは既知核酸変異検出法及び表示法
US20030096268A1 (en) 2001-07-06 2003-05-22 Michael Weiner Method for isolation of independent, parallel chemical micro-reactions using a porous filter
JP2003083965A (ja) 2001-09-10 2003-03-19 Adgene Co Ltd 蛋白・核酸解析用チップ
JP2003093075A (ja) 2001-09-26 2003-04-02 Adgene Co Ltd 電気抵抗を利用した核酸変異検出法
JP2003180374A (ja) 2001-10-12 2003-07-02 Adgene Co Ltd 核酸溶解曲線を応用した核酸変異検出法
JP2003180351A (ja) 2001-12-13 2003-07-02 Adgene Co Ltd 核酸高次構造誘導を用いた核酸変異検出法
JP2003274959A (ja) 2002-03-22 2003-09-30 Adgene Co Ltd ポリメラーゼ連鎖反応を応用した非特異核酸増幅法
JP2003334082A (ja) 2002-05-17 2003-11-25 Adgene Co Ltd 波形生成プライマー、該プライマーを使用した核酸増幅方法及び核酸同定方法
JP2004041191A (ja) 2002-05-21 2004-02-12 Adgene Co Ltd 核酸同定方法
WO2003097828A1 (en) 2002-05-21 2003-11-27 Adgene Co., Ltd. Method of identifying nucleic acid
JP2004057202A (ja) 2002-06-05 2004-02-26 Ryoshoku Kenkyukai Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓの迅速検出法
JP2004185583A (ja) 2002-12-05 2004-07-02 Adgene Co Ltd 核酸同定用波形解析データの提供システム
JP2004236651A (ja) 2003-02-07 2004-08-26 Adgene Co Ltd 核酸解離曲線の波形を解析ソフトウエアで解析して核酸を同定する方法
US20040197780A1 (en) 2003-04-02 2004-10-07 Agencourt Bioscience Corporation Method for isolating nucleic acids
WO2004104196A1 (ja) 2003-05-20 2004-12-02 G & G Science Co., Ltd. 緩衝剤組成物
JP2004361310A (ja) 2003-06-06 2004-12-24 Yokogawa Electric Corp 波形測定装置
EP1649056A1 (en) 2003-07-02 2006-04-26 Caliper Life Sciences, Inc. Methods for amplifying and detecting nucleic acids in microfluidic devices under continuous and non-continuous flow conditions.
WO2005005664A1 (ja) 2003-07-15 2005-01-20 G & G Science Co., Ltd. 核酸の検出方法および同定方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Gan Wang et al..RAPD(arbitrary primer) PCR is more sensitive than multilocus enzyme electrophoresis for distinguishing related bacterial strains.Nucleic Acids Research21 25.1993,21(25),5930-5933. *
Jose Arnau et al..The use of RAPD markers in the genetic analysis of the plantpathogenic fungus Cladosporium fulvum.Current Genetics25.1994,438-444. *
Michael F. Antolin et al..Intensive Linkage Mapping in a Wasp (Bracon hebetor) and a Mosquito (Aedes aegypti) With Single-Strand Conformation Polymorphism Analysis of Random Amplified Polymorphic DNA Markers.Genetics143.1996,1431727-1738. *
P. DESCHEEMAEKER et al..Evaluation of Arbitrarily Primed PCR Analysis and Pulsed-Field Gel Electrophoresis of Large Genomic DNA Fragments for Identification of Enterococci Important in Human Medicine.INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY47 2.1997,47(2),555-561. *

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