CN104254617A - 通过单分子杂交和操作进行的dna检测和定量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于检测和定量核酸、DNA或RNA的快速方法。具体地，本发明提供基于物理和电子处理的用于检测和定量特异核酸分子存在的方法。本发明的方法特别适用于检测染色体异常分布或基因表达分析的多种应用。

Description

通过单分子杂交和操作进行的DNA检测和定量的方法
背景技术
本发明涉及用于检测和定量核酸、DNA或RNA的快速方法。具体地，本发明提供基于物理和电子处理的用于检测和定量特异核酸分子存在的方法。本发明的方法特别适用于检测异常的染色体分布或基因表达分析的多种应用。
对大范围通常利用的生物应用而言，检测和定量核酸序列是重要的。所述应用包括体外诊断领域，包含临床诊断、在分子生物学领域的研究、高通量药物筛选、兽医诊断、农业遗传学测试、环境测试、食品测试、工业工程监控和保险测试。具体地，证明在生理样本中特异DNA序列的存在构成目前诊断方法发展的主线，例如，用于鉴定发展出抗生素抗性的细菌的可能性、基因异常、与遗传修饰相关的癌症风险和病毒感染，例如与HIV或与肝炎病毒相关的感染(参见，例如Zhang等人,Nature,358:591-593,1992；Turner等人,J Bacteriol,176(12):3708-3722,1994；Weston等人,Infection and Immunity.,77(7):2840-2848,2009)。检测和/或定量特定核酸序列对于以下各种应用也是至关重要的，所述应用例如产前诊断、研究基因表达、获得古代DNA、诊断遗传病、检测序列多态性、定量DNA重复、检测病原体、鉴定遗传修饰的生物体等。(参见，例如WO 02/31463；WO 2006/058395；US 5,705,365；US 5,840,487；US 5,858,658；U S 6,453,245；US 7,919,247；Verjat等人,Biotechniques,37(3):476-481,2004；Vural,Afr.J.Biotechnol.,8(20):5163-5168,2009；van der Meide等人,J.Clin.Microbiol.,43(11):5560-5566；2005；Fan等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,105(42):16266-16271,2008；Buehler等人,Methods,50:S15-S18,2010；Clark等人,Genome Res.,11:1594-1602,2001；Vernon等人,BMC Infect Dis,3:12,2003；Piepenburg等人,PLoS Biol.,4(7):e204,2006)。
几种技术已经发展了多年，其都依赖于检测在靶核酸分子和特异标记探针之间的杂交分子。今天，用于检测核酸的最广泛使用的方法基于聚合酶链式反应(PCR)。例如，实时PCR用于放大和同时定量靶DNA分子。
核酸的任何检测和/或定量方法中的关键方面是灵敏度。开发的第一技术需要大样本尺寸。这种问题通过在PCR方法中的扩增步骤得到缓解。因此，基于PCR的方法允许通过扩增靶核酸来检测非常少量的核酸(Haque等人.,BMC Biotechnol.,3:20,2003)。在生物研究中，PCR因此加速了对传染性疾病检测的研究。PCR的医疗应用包括在人体组织中鉴定病毒、细菌和癌细胞。在称为原位(原位点)PCR的步骤中，甚至可以在单个细胞内使用PCR以鉴定特异细胞类型。PCR也可以应用到RNA扩增中，此方法称为逆转录酶PCR(RT-PCR)。RT-PCR类似常规PCR，其具有增加的起始步骤，其中使用称为逆转录酶的酶从RNA靶合成DNA。各种RNA分子，包括核糖体RNA、信使RNA和基因组病毒RNA，已用于RT-PCR中。
然而，到目前为止所有开发方法具有严重缺点。具体地，它们全都使用标记的核苷酸(例如，使用荧光的标记)，因此造成整体成本的剧烈增加。另外，扩增靶序列是费时的、增加错误的可能性并是高度易污染的。
发明内容
根据本发明的方法基于物理技术和电子处理，不同于目前的化学或生物化学方法。其优势是：
1)它不需要在检测和定量之前的PCR步骤；
2)它不使用昂贵的标记核苷酸(用荧光素或一些其它基团标记)。
此外，本发明的方法与沿发夹上全局(电子或光学)检测阻碍的位置相结合，允许对基因组DNA的快速大规模诊断并提供对目前DNA芯片技术的竞争性替代。
本发明涉及用于检测核酸序列的方法，其中与所述核酸序列相对应的变性双链核酸的复性被阻断。
“核酸序列的检测”在本文表示导致直接或间接获得一些关于特异核酸序列存在或不存的信息的所有活动，其包括但不限于检测核酸分子中的特定序列，或检测两个不同核酸分子序列之间的差异。核酸序列的检测可包括所述核酸序列的实际确定，即破译在所述核酸中实际连续的碱基；但是，在大多数实施方式中，可以不测序所述核酸而进行本发明。
本发明基于这样的观察，即变性双链核酸的两条链在适当的条件下将重新杂交。如果在复性步骤期间一些分子结合至所述变性双链核酸的任意链，则重新杂交仅是部分的。本发明人目前已发现，在某些条件下，在重新杂交中这种永久或瞬时的暂停可用于检测变性双链核酸分子中所包含的序列。根据本发明，有可能检测双链核酸分子重新杂交的阻断；与这种阻断相关的物理参数(如，阻断的持续时间，在双链核酸分子上阻断的位置)从而允许确定核酸序列。
因此，本发明涉及用于检测核酸序列的方法，所述方法包括步骤：检测与所述核酸序列相对应的变性双链核酸复性的阻断。
“变性”在本文表示当所述链之间的大部分氢键断裂时发生的双链核酸分子的两条链分离的过程。变性过程产生变性核酸分子，其在本文表示双链核酸分子变性所产生的两条分离的互补链。“复性”在本文指两条分离的互补链通过杂交重新形成双螺旋的过程。如本文所用，“杂交”是核酸的两条或多条互补链之间建立非共价的、序列特异性的相互作用从而形成单个杂交体的过程。
本领域技术人员已知有几种可能性来变性核酸。在一个最优选的方式中，通过向两条链施加物理力将其分开。根据本发明的“物理力”是导致物体经历某种改变的任何影响力，该改变关于其运动、方向或几何构造。本领域技术人员将清楚根据本发明的力与其它物理参数如温度(这是直接的物质属性而不是施加于其上的影响力)不同。根据本发明的物理力包括这样的力如摩擦力、拉力、法向力、空气阻力、作用力、和弹力。最优选地，根据本发明的物理力是拉力。根据本实施方式，所述双链核酸的游离端可被拉开，因此使配对碱基之间的所有键断裂从而打开双链核酸。
因此，在一个实施方式中，本发明的方法涉及用于检测核酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：
·通过向双链核酸分子施加物理力使对应于所述核酸序列的所述双链核酸分子变性；以及
·检测所述双链核酸复性的阻断。
在这种类型的序列检测方法中，为了促进重新配对，安排双链DNA的游离端(即没有附着至支持物的端)在被拉开之前共价或准共价彼此连接是有利的。在一个优选的实施方式中，双链核酸分子是发夹。在本发明的上下文中如果需要图表地表示双链核酸，可能将其比作打开(或关闭)的“拉链”(zip fastener)：双链核酸的变性就是打开拉链，复性是拉上拉链。
本发明人已经观察到，在一定条件下，当分子结合至变性双链核酸分子时，所述分子的复性被阻断。结合的分子可以是对所述变性双链核酸分子上的特异性序列具有亲和性的任何类型的分子，如核酸、蛋白质或小分子。然而，优选使用单链核酸，因为所述单链核酸可以与变性双链核酸链的一条链上的互补序列杂交。只要这种单链核酸长到足以阻断复性过程，它可以是任何长度的。优选地，单链核酸的长度包括在3和50个核苷酸之间；更优选地，在3和45个核苷酸之间，在3和40个核苷酸之间，在3和35个核苷酸之间，在3和30个核苷酸之间，在3和25个核苷酸之间，在3和20个核苷酸之间，在3和15个核苷酸之间，甚至更优选3和12个核苷酸之间。本发明的单链核酸尤其可以是天然的或修饰的DNA或RNA分子。所述单链核酸也可以由修饰的核苷酸构成，如锁核酸(LNA)，它是其中核糖部分修饰有连接2'氧和4'碳的额外桥的核苷酸，或者肽核酸(PNA)，其中骨架由通过肽键连接的重复的N-(2-氨乙基)-甘氨酸单元组成。
在复性之前向变性双链核酸添加单链核酸分子时，重新杂交的阻断表明单链核酸分子序列与双链核酸分子的至少部分序列是互补的。
因此，本发明的方法还涉及用于检测核酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：
1)通过向所述分子施加物理力使双链核酸分子变性；
2)提供与所述核酸序列相对应的单链核酸分子；
3)在所述单链核酸分子存在时使所述双链核酸分子复性；以及
4)检测双链核酸复性的阻断。
本发明适用于任何类型的双链核酸。大多数情况下，双链核酸将是DNA，但应当理解，本发明也适用于单链DNA-单链DNA双链体，完全配对的或者不完全配对的；或可选择地适用于单链DNA-单链RNA双链体，完全配对的或者不完全配对的；或可选择地适用于单链RNA-单链RNA双链体，完全配对的或者不完全配对的。此外，双链体可由获自不同来源样本的两条单链的至少部分重新配对所组成。最后，本发明也适用于仅有单链DNA或仅有单链RNA的二级结构。
在典型的构型中，双链核酸分子可以特异性地锚定在两种固体基质上(如显微镜载玻片、微量移液器、微粒)。末端之一可直接或间接地附到表面，而另一个末端直接或间接附到可移动的表面。在本实施方式中，当移开支持物时拉力施加到双链核酸的两个末端。当拉力高于阈值时，两条链分离而核酸分子变性。施加的拉力优选高于或等于15pN；更优选高于或等于16pN；甚至更优选高于或等于17pN；在非常优选的方面，拉力高于或等于18pN。这种力可随温度、核苷酸类型和缓冲液而变化，但本领域技术人员根据这些参数将很容易调整所述力以获得两条链的分离。另一方面，当拉力下降到低于最小值时，变性双链核酸的两条链可以重新杂交。为获得所述两条链的重新杂交，优选施加小于或等于12pN的拉力；更优选地，其小于或等于11pN；甚至更优选地，其小于或等于10pN。
最优选地，双链核酸是发夹。如本文所用，“发夹”是指这样的双螺旋，其中一条链的5'端通过未配对的环物理连接到另一条链的3'端。所述物理连接可以是共价或非共价的。优选地，所述物理连接是共价键。因此，发夹由双链茎和未配对的环组成。在发夹中，两条链的未参与到环中的端是游离的，因此可被拉开。这导致双链核酸的未配对，从而产生变性双链核酸分子。有可能通过用高于阈值的力拉所述核酸分子的每一末端而完全打开发夹双链核酸分子。当施加到分子的拉力下降到低于最小值时，核酸分子重新杂交并重新形成发夹。杂交至核酸链之一的单链核酸分子的存在导致重新杂交的暂停。因此，检测到这样的暂停表明单链核酸分子包含与至少部分的双链茎相互补的序列。
在这方面，有利的是设计环序列和长度以便发夹在短瞬间之后，如1秒后重新折叠。在现有技术中已经描述了达到这种效果的方法，如在Woodside等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,103(16):6190-6195,2006中。当力从打开降低至测试值时，打开的发夹的延伸因为单链DNA的弹性而变化。发夹重新折叠前的小延迟允许用户确定在与用于检测阻断状态所用力相同的力下发夹的延伸。
特别是，使用发夹使得有可能进行配对和解除配对的循环，从而改善信号/噪音比率。
已知允许双链核酸的游离端连接在一起的技术，一些技术将在以下更详细地描述。
确定阻断在本文意味着确定与阻断相关的物理参数。一个有用的参数是在双链核酸分子上阻断的位置，所述位置对应于单链核酸分子在双链核酸分子上杂交的位置。事实上，本发明人已经发现可精确确定复性中在双链核酸上暂停发生的位置：使用发夹为本领域技术人员提供一种手段，以便确定在变性/复性过程期间的任何时间上发夹两个游离端之间的物理距离。
“游离端”在本文表示没有共价连接到另一条链末端的一条链的端；如上面所解释的，这些游离端中的每个均可以结合至不同的表面。例如，这些表面中的一个可以是可移动的，而另一个可以是静止的。因此，本领域技术人员将很容易地认识到，为测量发夹双链核酸游离端之间的距离，有可能仅简单地测量两个表面之间的距离。
当发夹分子完全变性时这种距离最大(Z高(F打开))，因为那时发夹核酸完全延伸；当所述发夹分子完全复性时，这种距离最小(Z低(F测试))。有利地，在相同力F测试下进行所有长度的比较，以使得单链核酸具有相同的弹性性能。通过使用环关闭中的延迟，有技能的用户可以测量Z高(F测试)。同样地，当复性过程临时性地暂停时可以测量两个游离端之间的距离：如预期地，这种距离z介于Z高和Z低(所有z以F＝F测试进行测量)之间。很清楚地，随着单链核酸序列所互补的序列在发夹分子中的定位变化而距离z变化。如果所述单链核酸和位于靠近发夹游离端的序列相杂交，则自我重新杂交的过程就刚好在重新形成完整发夹之前被阻断；在这种情况下，Z暂停是最小值。另一方面，如果所述单链核酸和靠近未配对环的发夹部分相杂交，复性过程将被阻遏在这样种情况：其中发夹是完全或几乎完全变性的；在这种情况下，Z暂停最大(图1)。
在另一个实施方式中，将一个或更多参考单链核酸杂交至DNA发夹上的已知序列(例如，靠近其基部或靠近其环)，并且相对于所述参考单链核酸的杂交位置来测量探测的单链核酸的杂交位置。
有可能精确地将双链核酸分子中的物理距离与若干碱基相关联。例如，在10pN力下，0.8nm的距离对应于核酸中由两个核苷酸(1bp)所跨越的距离。由单链核酸的弹性给出相对于力的准确校准。因此，通过简单测量双链核酸分子两个游离端(或在所述分子上的任意两个参考位置)之间的距离有可能精确地确定复性在何处被阻断。
因此，在一个实施方式中，本发明由用于检测核酸序列的方法组成，其中对应于待检测序列的双链核酸分子首先通过施加物理力变性，然后在单链核酸存在下重新杂交，以及检测重新杂交中阻断的存在。在一个方面中，当复性过程被阻断时，确定双链分子两端之间的距离。优选地，当分子完全变性时，确定所述分子两端之间的距离。更优选地，比较两个距离并确定阻断的位置。更优选地，测量在完全延伸的环和参考杂交位置之间的距离，并用其确定阻断的位置。甚至更优选地，测量两个参考杂交位置之间的距离，并用其确定阻断的位置。
除了其在分子上的位置，与复性阻断相关的最有用的参数是复性被阻断期间的时间长短(本文称为复性暂停的持续时间)。事实上，有可能测量重新杂交被阻断期间的时间长短。例如，本领域技术人员可以确定以下期间的时间长短：其间双链核酸的两端之间距离为如上所定义的z，即中间值在Z高和Z低之间。
阻断的持续时间取决于两条序列之间的互补程度。互补性越高，两分子之间建立的键的数目越多，并且因此持续时间越长。还清楚的是，阻断时间将取决于两条序列之间互补性区域的长度。区域越长，两分子之间建立的键的数目越多，因此持续时间越长。因此容易想到，在某些条件下复性暂停的持续时间将几乎是永久的。特别是，当单链核酸包含多于20个，优选多于25个，甚至更优选多于30个能够与变性双链核酸杂交的核苷酸时，即使当向所述双链核酸施加的力降低到F测试时，单链核酸仍然与双链发夹杂交(许多分钟)，从而防止所述双链发夹的自己重新杂交。在这样的情况下，使用酶去除单链核酸分子可能是有利的。因此，去除所述单链核酸分子使得可能进行配对和解除配对的循环，从而改善信号/噪音比。作为合适的酶的实例，可以举出例如解旋酶，包括UvrD解旋酶、大肠杆菌UvrD解旋酶、Tte-UvrD解旋酶、T7 Gp4解旋酶、RecBCD解旋酶、DnaB解旋酶、MCM解旋酶、Rep解旋酶、RecQ解旋酶、PcrA解旋酶、T4 UvsW解旋酶、SV40大T抗原解旋酶、疱疹病毒解旋酶、酵母Sgsl解旋酶、DEAH_ATP依赖的解旋酶和乳头状瘤病毒解旋酶E1蛋白及其同源物。优选地，使用T4 UvsW解旋酶。
暂停的持续时间也可随着反应条件变化。所述持续时间将随着温度的升高而降低。同样，缓冲条件也可以调节暂停的持续时间：例如，镁、甜菜碱和氯化四甲铵(以摩尔浓度使用的TMAC)增加阻断时间。与GC相比，这些化合物更加加强AT配对，从而减少这些配对之间强度的差异。然而，当温度和缓冲液固定时，暂停的持续时间将仅取决于拉动变性双链核酸的力以及其与单链核酸的互补性。
因此，在一个具体方面，本发明的方法包括以下步骤：
·通过向所述双链核酸分子施加物理力使与所述核酸序列相对应的所述双链核酸分子变性；
·提供单链核酸分子；
·在所述单链核酸分子存在下使所述双链核酸分子复性；以及
·检测所述双链核酸分子复性的阻断；以及
·确定暂停的持续时间。
鉴于现有技术的方法全都使用荧光核苷酸，但本发明的方法只涉及核酸分子延伸的机械检测。因此，本发明的方法不受与现有技术方法相关的任何弊端所困。
在优选的方面中，检测所述双链核酸分子复性的阻断包括确定双链核酸分子上阻断的位置，如上所述。
在这个具体实施方式中，根据本发明的方法可用于诊断目的，从而允许特别是测序与寻找的异常相对应的核酸的变异区。
然而，基于观察到的寡核苷酸和DNA序列之间的错配导致更短暂的杂交，有可能提供一种简化的技术。在第一方面，利用上述任何方法使发夹双链核酸分子的复性被单链核酸阻断，并确定阻断的持续时间。在优选的方面中，该值和参考值进行比较。在另一优选的方面，所述参考值对应于如通过上述任何方法所确定的通过参考单链核酸所观察到的暂停长度。
出于诊断目的，如寻找基因组DNA中的突变，所述技术可以以两种方式实施：
1)在溶液中用寡核苷酸探测含有被寻找的突变的基因组DNA所形成的发夹。
2)通过在溶液中以固定大小的单链DNA片段存在的基因组DNA来探测发夹，所述发夹包含具有被寻找突变的序列。这将是显而易见的，即如果分析的目标只是找到这种序列中特异性序列或可能突变的存在，则把该序列置于发夹环中提供一种非常简单的检测方案。如果寡核苷酸在环中杂交，则寡核苷酸完全阻止发夹重新折叠，从而导致非常大的延伸改变，因此可以轻易检测到所述延伸改变，如下文所述。
鉴于现有技术的方法须使用荧光或放射性核苷酸来标记探针，而本方法仅依赖机械检测核酸分子延伸。此外，不需要检测前的扩增步骤。因此，本发明的方法允许检测在一整群核酸分子内的一个单一分子。因为用本发明的方法可获得单分子分辨率，可以检测每个携带特异序列的分子。因此，本发明使得本领域技术人员能够计数携带所述序列的核酸分子的数目。本发明的方法允许简单和精确地定量在整群核酸分子中的特异核酸序列。
因此，在本发明的另一方面提供定量样本中含有特异序列的一个种类(species)的双链核酸分子的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过向双链核酸分子施加物理力使在样本中的所述双链核酸分子变性；
b)提供与所述序列相对应的单链核酸分子；
c)在所述单链核酸分子存在时使步骤a)的所述变性双链核酸分子复性；以及
d)检测在其中复性被阻断的双链核酸分子；以及
e)计数步骤d)的双链核酸分子。
待定量的核酸种类(species)是含有所述特异序列的核酸分子的群。因此，它们与其它核酸分子的不同之处在于它们含有这种特异序列。虽然这些分子都具有这种序列，它们可以相同或可以不相同。在某些实施方式中，本领域技术人员可优选测量在所述特定序列之外不相同的核酸种类的数量；例如，可令人感兴趣的是本领域技术人员测量G1细胞周期蛋白转录物CLN1和CLN2的数量，所述CLN1和CLN2在出芽酵母细胞进入细胞周期时表达。在一些其它实施方式中，可更优选的定量一群相同的核酸分子，例如，由差异剪接所得的基因的不同亚型。这可以通过仔细选择所述特异序列来容易地实现：在可公开获得的序列数据库(例如，Genbank)的帮助下，本领域技术人员知道如何设计与上述情况中的一个或其它相对应的序列，而无须在此进一步详述。
也可能使用一个以上的单链核酸，所述一个或更多个单链核酸能够与在变性双链核酸分子上的一个或更多个不同序列进行杂交。
当使用一个以上单链核酸分子时，有利地是所述一个或更多个单链核酸对应于一个或更多个不同的序列。在这种情况下，可以同时或相继地将所述单链核酸分子加至变性双链核酸分子中。所述不同的单链核酸可在不同位置阻断所述变性双链核酸的复性。基于每个单链核酸序列与所述双链核酸序列的相似程度，重新杂交期间的阻断数量和位置限定出独特的指纹。因此，指纹是阻断的模式，其在所述变性双链核酸分子复性阶段期间作为一个或更多个单链核酸与双链核酸分子相杂交的结果被观察到。这种指纹可用于在DNA样本中鉴定和计数各种双链分子。
所建议的方法学不需要使用荧光标记的探针，并提供额外的位置信息(超出仅仅的探针杂交)。例如，使用这种方法可以比较地检查成千上万的个体文库片段。将具有类似指纹的cDNA分成群集，从而其提供关于表达基因数目以及基因相对表达水平的信息。
因此，在一个具体实施方式中，本发明的方法涉及用于定量在样本中的含有一个或更多个特异序列的一个种类的双链核酸分子的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过向双链核酸分子施加物理力使在样本中的所述双链核酸分子变性；
b)提供与所述一个或更多个序列相对应的一个或更多个单链核酸分子；
c)在所述单链核酸分子存在时使步骤a)的所述变性双链核酸分子复性；
d)检测在其中复性被所述一个或更多个单链核酸分子阻断的双链核酸分子；以及
e)计数步骤d)的分子。
优选地，在步骤b)提供至少2种单链分子；更优选地，至少3种；又更优选地，至少5种；甚至更优选地，至少10种；最优选地至少15种。
本发明的样本是任何类型的样本，其可含有所需核酸种类(species)，如，例如反应混合物。其也可以是，例如生物样本。“生物样本”可以是可含有生物有机体的任何样本，如，例如细菌、病毒、植物、酵母等。根据本发明的“生物样本”还涉及可从生物有机体获得的样本，如获自细菌、病毒、植物、酵母等的细胞提取物。具体地，生物样本可以是取自受试者的任何样本，如血清样本、血浆样本、尿液样本、血液样本、淋巴样本、或活检样本。这样的样本必须允许定量染色体序列。用于定量基因组序列的优选生物样本，包括样本如血液样本、血浆样本、淋巴样本、或活检样本。优选地，所述生物样本是血液样本。实际上，可以通过完全无害的血液采集从孕妇获得这种血液样本，从而因此允许，例如胎儿非整倍体的非侵入性诊断。另外，可以使用来自癌症患者的血液样本，例如用于通过本发明的方法来表征液体肿瘤。
当癌症是实体癌症时，本文所用的“生物样本”还包括待测患者的实体癌症样本。这样的实体癌症样本允许技术人员通过本发明的方法进行所需核酸水平的测量。在一些情况下，根据本发明的方法可进一步包括从患者取出实体癌症样本的预备步骤。“实体癌症样本”指肿瘤组织样本。即使在癌性患者中，肿瘤位点的组织仍然包含非肿瘤健康组织。因此，“癌症样本”应当限制为取自患者的肿瘤组织。所述“癌症样本”可以是活检样本或取自手术切除治疗的样本。根据一方面，来自患者的样本是癌细胞或癌组织。
根据本发明的样本可仅含有待定量种类的核酸，但其也可含有其它分子。在优选的实施方式中，所述样本含有其它种类的核酸分子。根据这种实施方式，本发明还涉及用于定量含有不同种类核酸分子的样本中一个种类含有特异序列的核酸分子的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过向双链核酸分子施加物理力使在样本中的所述双链核酸分子变性；
b)提供与所述特异序列相对应的单链核酸分子；
c)在所述单链核酸分子存在时，使步骤a)的所述变性双链核酸分子复性；
d)检测在其中复性被阻断的双链核酸分子；以及
e)计数步骤d)的双链核酸分子。
如上所述，还可能使用与一个或更多个序列相对应的一个或更多个单链核酸分子，从而允许确定特异指纹。在这种实施方式中，本发明的方法基于定量显示这种指纹的双链分子。因此，根据这种实施方式，本发明还涉及用于定量含有不同种类核酸分子的样本中含有一个或更多个特异序列的一个种类的核酸分子的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过向双链核酸分子施加物理力使在样本中的所述双链核酸分子变性；
b)提供与所述一个或更多个序列相对应的一个或更多个单链核酸分子；
c)在所述单链核酸分子存在时使步骤a)的所述变性双链核酸分子复性；
d)检测在其中复性被所述一个或更多个单链核酸分子所阻断的双链核酸分子；以及
e)计数步骤d)的分子。
优选地，在步骤b)提供至少2种单链分子；更优选地，至少3种；又更优选地，至少5种；甚至更优选地，至少10种；最优选地至少15种。
因此，每当需要定量核酸序列时可使用本发明。应用包括体外诊断领域，包括临床诊断、分子生物学领域的研究、高通量药物筛选、兽医诊断、农业遗传学测试、环境试验、食品测试、工业过程监测、生物安全、法医和保险领域测试。体外诊断和临床诊断涉及分析由身体提取的核酸样本以便检测疾病或病症的存在、其发展阶段和/或严重性、以及患者对治疗的反应。在高通量药物筛选和开发中，将核酸类似地用于其它试剂，例如抗原、抗体、受体等，以便分析在高样本数量设置中生物系统在暴露至化合物文库时的反应，鉴定药物先导物。兽医诊断和农业遗传学测试涉及来自非人类动物或植物物品种的样本，其类似体外诊断，并提供农业遗传产品和加工过程的质量控制方法。在环境测试中分析表明环境介质如土壤、水、空气等污染的生物体及其毒素。食品测试包括定量生物体如细菌、真菌等作为质量控制的方法。在工业过程监控中，检测和/或定量核酸以便表示生产过程的合适控制和/或如果过程失控则生成信号。在保险测试中生物体和/或其毒素在筛选测试中鉴定以确定客户的风险类别或帮助审批候选人。已经有核酸的检测和/或定量的其它各种应用，并且正在不断地开发新应用。
这些应用之一是基因表达的分析。许多用于分析基因表达的方法已经描述在本领域中。然而，最常用的方法，例如RT-PCR和DNA-微阵列使用昂贵的荧光核苷酸。此外，为获得所需的灵敏度必需进行之前的PCR扩增。通过比较，本发明提供不需扩增或荧光核苷酸的在单分子水平上测量基因表达的方法。
因此，在第一个实施方式中，本发明涉及用于测量样本中基因表达的方法。“基因表达”在本文中指所述基因的转录，即通过RNA聚合酶从基因DNA模板合成信使RNA(mRNA)分子；本文所用的“测量基因的表达”意为测量与所述基因相对应的特异mRNA的量。
因此，根据本实施方式，通过上述定量方法之一来测量与所述基因相对应的所述mRNA的量。
对技术人员将是显而易见，有利地在双链核酸分子上进行所述定量方法。优选地，在第一步骤中通过RNA转录物的复制来获得双链核酸分子。因此，根据本实施方式，本发明提供用于测量在样本中基因表达的方法，其包括以下步骤：
a)通过复制存在于样本中的RNA分子来合成双链核酸分子，以及
b)通过上述方法之一定量与所述基因相对应的mRNA分子种类。
已知一些酶，其使用单链RNA为模板以生成双链核酸。例如，可通过RNA依赖性RNA聚合酶的作用来获得双链RNA分子。优选地，所述转录物首先通过逆转录酶逆转录成cDNA。技术人员将认识到逆转录具有几个优点。例如，其可以从已锚定到固体表面上的聚-T寡核苷酸启动。此外，可以将所得的RNA/cDNA杂合体先用RNA酶处理，然后用DNA聚合酶处理，从而导致RNA部分降解以及新的互补DNA链合成。有利地，发夹序列被连接在cDNA链的游离端，并且发夹序列可以用作新DNA链合成的引物。
在另一实施方式中，本发明涉及用于确定染色体异常的方法。“染色体异常”在本文中指染色体的非典型数目或在一条或更多条染色体中的结构异常。染色体的非典型数目被称为“非整倍体”：因而其是具有少于或多于正常染色体二倍体数目的病状。当个体从染色体对中缺失一条色体(单倍体)或具有多于两条染色体的染色体对时，发生非整倍体。“三体”是非整倍体，其中有特定染色体的三个拷贝而不是正常的两个拷贝。“染色体中结构异常”在本文中意为影响部分染色体拷贝数的事件，例如缺失、易位、重复、成环等。
在细胞分裂期间当全部或部分染色体没有正确分离时，这样的染色体异常发生。例如，当在肿瘤发生中癌性细胞进展时，其积累染色体异常，例如缺失、易位，得到或失去整条染色体。这些染色体异常被认为是与癌性表型的获得相关联并且对每种癌症类型特异。癌症越晚期则染色体异常的数目越多。因此，检测这种染色体异常通常提供关于肿瘤侵袭性和患者预后的很多信息。
在本实施方式中，本发明因而提供用于检测来自受试者的生物样本中特定染色体部分的异常分布的方法。更具体地，所述方法包括以下步骤：
a)通过上述方法之一来定量所述特定染色体部分的水平；
b)通过上述方法来定量另一染色体部分的水平；
c)计算在a)中获得的水平与在b)中获得的水平之间的比率；以及
d)确定所述特定染色体部分是否异常分布。
如上所述，癌细胞在肿瘤发生的不同阶段进展时积累染色体异常。因此，染色体在肿瘤细胞中异常分布的检测是所述肿瘤侵袭性的指征：染色体部分异常分布得越多，则肿瘤侵袭越强。
根据优选实施方案，因此本发明的受试者是患癌症的患者。在本实施方式中，本发明提供用于在患癌症患者的癌症样本中诊断癌症侵袭性的方法，所述方法包括以下步骤：
a)定量在所述患者癌症样本中第一特定染色体部分的水平；
b)定量在所述患者癌症样本中第二染色体部分的水平；
c)计算在a)中获得的水平与在b)中获得的水平之间的比率；
d)确定所述特定染色体部分是否异常分布；以及
e)如果所述染色体部分是异常分布，则诊断为侵袭性。
根据本发明的“染色体部分”指整个染色体或染色体的重要片段。例如，中度唐氏综合症已与部分三体21q22.2→qter相关联。因此，本发明提供一种方法，其用于定量疑似异常分布的染色体部分(步骤a)的染色体部分)并将此定量与参考染色体部分之一相比较。因此，根据本发明的“参考染色体部分”是已知的非异常分布的染色体部分。在本发明的本实施方式中，步骤b)的染色体部分为参考染色体部分。
当然，重要的是选择用于定量步骤a)和b)的染色体部分的序列以使得所述序列对于对应的染色体部分是特异的。本领域技术人员将容易地认识到需要的信息可获自可公开获得的序列数据库，例如Genbank。
通过稀有切点的限制性酶消化第一染色体从而方便地获得双链核酸分子的群。如本领域技术人员所知，稀有切点的限制性酶是在基因组中识别非常稀有地存在的序列的限制性酶，例如识别序列含有7或8个碱基。这种罕见切点酶的实例包括Sfi I、Xma I、Asc I、AsiS I(同裂酶Sgf I)、Not I(同裂酶CciN I)、Sbf I(同裂酶Sse8387 I、Sda I)、Fse I、Pac I等。所有这些酶都是商业上可获得的。在第二步骤中，将因此获得的限制性片段通过常见的6碱基限制性酶，如EcoRI、BamHI、XhoI等进行消化。随后，所得线性双链片段可以被转化成发夹。已知允许双链的游离端连接在一起的技术，并且一些将在下文中进一步详述。
胎儿非整倍体通常是在父母生殖细胞系中减数分裂期间染色体分离缺陷的结果。虽然胎儿非整倍体不像其它影响1000出生者中9个的出生缺陷一样常见，其检测仍然提供了相当大的技术挑战。
母体血液中含有游离的母方DNA和游离的胎儿DNA，所述胎儿DNA作为细胞死亡、剪切等的结果结束在血液中(Herzenberg等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:1453-1455,1979；Bianchi等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:3279-3283,1990)。已知无细胞的胎儿DNA仅代表母体血浆中存在的DNA的3-6％(Lo等人，Am J HumGenet,62:768-775,1998)。已描述了用于从母体血液诊断胎儿非整倍体的方法；然而，这些方法需要遗传材料的扩增步骤或使用鸟枪法测序，其是使用基于之前PCR富集的方法(Lo,BJOG,116:152-157,2009；Fan等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,105(42):16266-16271,2008；Chiu等人,BMJ,342:c7401,2011 doi:10.1136/bmj.c7401)，因此这些方法易受潜在偏见的影响。
在另一优选的实施方式中，因而所述受试者是孕妇。根据本实施方式，本发明提供用于从所述孕妇的血液样本中诊断胎儿非整倍体的方法，其包括：
a)定量在所述血液样本中第一特定染色体部分的水平；
b)定量在所述血液样本中第二染色体部分的水平；
c)计算在a)中获得的水平与在b)中获得的水平之间的比率；
d)确定所述特定染色体部分是否异常分布；以及
e)如果所述染色体部分是异常分布，则诊断为胎儿非整倍体。
优选地，所述特定染色体部分是疑似在胎儿中异常分布的染色体部分。有利地，第二染色体部分是参考染色体部分，即不受异常分布影响的染色体部分；因此，所述第二染色体部分优选为在胎儿细胞中的二体。
可通过本发明的方法来确定的优选的胎儿染色体非整倍体和伴发疾病或病症包括：特纳综合症(性染色体单体性)、克氏综合症(XXY性染色体)、三X综合症(XXX性染色体)、唐氏综合症(21三体)、爱德华兹综合症(18三体)或帕陶(Patau)综合症(13三体)。已知针对15染色体的单亲二体症(uniparenteraldisomy)为普拉德-威利(Prader-Willi)综合症。如果待检测这样的单亲二体症，则还必须以对其是否为母方或父方遗传加以区分的方式来分析DNA。本文所用的非平衡易位包括，优选为非平衡的罗伯逊三体rob(13q；14q)。可通过本发明的方法优选地确定的其它结构畸变包括4q缺失(Wolf-Hirschhorn(无对应中译文)综合症)、5q-缺失(猫叫(cri du chat)综合症)或微缺失综合症，特别是17ql 1.2缺失(史密斯-马盖尼斯(Smith-Magenis)综合症)或22ql 1.2缺失(狄乔治(DiGeorge)综合症)。
在优选的实施方式中，在步骤a)和b)中使用的序列是对胎儿DNA特异的序列。例如，所述序列对应于来自父亲遗传的等位基因。在另一个实施方式中，序列对胎儿和母方DNA都不特异。然而，因为血液中存在的DNA的10％是胎儿来源的，三体应导致1.05的步骤c)的比率。对应每个染色体，需要大约100万个小珠探测(通过扫描样本)平均2×104个序列，其中约2×103个是胎儿来源的。预计的统计(计算)误差将是大约1％，其允许对诊断而言足够大的S/N。
本发明方法的实现已成为可能，特别是通过设计用于在单分子水平探测实时核酸相互作用的装置的存在。这种装置描述于，例如美国专利No.7,052,650和No.7,244,391。其中描述的设备使用磁阱来向微米尺寸的超顺磁性珠施加皮牛顿尺度的力。简要地说，所述设备包括光学显微镜、磁体和PC。双链核酸分子的一端在多个点上被锚定至静止元件，如表面，并且另一端被锚定至可移动的表面，在这种情况下所述可移动的表面是磁珠。提供磁体以便作用于珠。特别是，磁体可用于拉动小珠离开表面。然而，本发明方法的实施并不限于上述设备。任何允许完全延伸然后重新折叠双链核酸分子并在同一时间同时监测所述分子的延伸的装置可用来实现本发明的方法。例如，可使用光镊(optical tweezer)；然而它们需要事先进行力的校准，并且不容易进行并行化以便用于高通量测量。其它缺点是缺乏核酸的总扭转控制(total torsional control)以及可能的通过聚焦激光进行的溶液局部加热，其可改变杂交条件。
双链核酸在充足小珠(例如，链霉亲和素包被的小珠)的溶液中孵育数分钟，双链核酸通过其标记(例如生物素)端之一结合至小珠。如果之后使用光镊进行操作，那么小珠可以是透明的，或者如果使用磁阱或镊子进行操作，那么小珠可以是磁性的。
将组装的小珠-核酸注射至流体室，其表面已被处理过，这样以便结合分子的另一标记端(例如抗地高辛包被的表面结合至核酸的地高辛标记端)。因此，小珠经由核酸发夹锚定至表面，参见图1a。然后，通过本领域技术人员已知的各种手段监测小珠到表面的距离：例如，其在相机图像上的衍射环可用来推导其距离，或者当以隐失模式(evanescent mode)照亮时它们散射(或通过荧光发射)的光强度可以用来测量其距离。或者，(使用磁传感器，如GMR或Hall传感器)可以测量它们所产生的磁场从而推导它们到锚定表面上的传感器的距离。
为将牵拉将小珠锚定至表面的核酸分子，各种技术已被描述。可以使用聚焦激光束的光来捕获(trap)靠近聚焦点的透明珠。通过相对于锚定表面的相对光束平移(translation)，可以向栓系分子施加力(典型的光镊实验)。施加的力与小珠从其平衡位置的位移(displacement)成比例，为了对栓系分子施加恒定的力，需要捕获束上的反馈环路。
为在小珠上施加恒定力，已描述使用通过环绕小珠的流动所产生的流体动力阻力(hydrodynamic drag)，但它通常产生低的空间精确度(>100nm)。优选的实施方式使用磁阱来拉动通过如上所述的核酸发夹来锚定到表面上的超顺磁性珠。在此构型中，放置在样本之上的小磁体用于在锚定的小珠上施加恒定的力，其位置可以以<1nm的精确度来确定(取决于拉力和归因于流体动力阻力的损耗)。
在每一个情况下，注意到可以通过用大于约16pN的力拉动小珠来机械地完全打开栓系发夹。分子上的拉力降低至约11pN之下时允许发夹自发地重新拉上拉链(拉开拉链的转换尽管滞后但是可逆的)。如果在打开拉链阶段期间，溶液中一些分子(例如蛋白质或DNA、RNA、LNA或PNA的互补寡核苷酸)已结合至伸展开的单链核酸，当力降低到11pN之下时这些分子将阻断重新拉上发夹。因此，分析原理是两种力之间的切换：大者F打开用于打开发夹以及较小者F测试用于允许重新拉上拉链以及测量在瞬时阻断时分子的延伸。在完全延伸和阻断部分之间，阻断位置和序列以线性关系相关联。对于最佳的精确度，优选地在测试力F测试下测量完全延伸。这通过设计这样的发夹环来实现，即一旦力从F打开降低到F测 试，发夹环瞬间就重新折叠。
可以使用本领域中已知的任一技术将核酸附至表面或支持物。实质上，核酸直接锚定至支持物如微珠，其涉及所述表面的官能化，例如通过使用链霉亲和素、COOH基团等对所述表面进行包被，以便能够与核酸官能化的末端进行作用。
在一般情况下，这样的方法必须官能化核酸，尤其在3'和5'端，也就是说在其上接枝合适的化学基团。此外，优选通过环连接分子的另两个游离端以防止链在操作结束时解离，从而如果适当时可以重复后者。为了这个目的，可以采用不同的程序。
最简单的是使用合成的寡核苷酸用两个不同的官能团(例如，生物素和胺)对双链核酸末端之一进行官能化，其允许锚定到两个不同的预处理表面。使用部分配对的合成核苷酸可以使两条链在其另一端被连接成环的形状。以这种方式，从双链核酸产生配对的单链核酸，即发夹。这种方法的优点在于它能够官能化大核酸片段的异质群(如通过基因或染色体的片段化(fractionation)所获得的)，然后可以对其进行同时分析。在这种情况下，使用两种(或更多)限制性酶将核酸样本片段化，其使得能够获得在其端部具有两种不同的限制性位点的亚群这在所有片段中都是相似的。这使两端能够被差别处理(例如，通过环的形式将在其端部具有适当的限制性位点的一端连接到寡核苷酸)。这种方法的缺点在于两个相邻官能团之间的立体干扰，其可使得难以结合至表面。为了解决这个问题，有利地可在发夹分子每个游离端添加碱基的“间隔”序列，然后向碱基“间隔”序列的末端加入官能团；两个间隔序列是非互补的，为每一个官能团提供足够的空间来结合至其专门的表面。更有利的是，设计每一个间隔序列的序列以便在本发明的测序方法中使用已知序列的单链测序引物。可以用分子生物学中任何常用方法向双链核酸分子添加环和/或间隔。这些方法是本领域技术人员众所周知的，因此没有必要在此详述。
至于实际的锚定技术，有许多这种技术并且它们源自用于将大分子(蛋白质、DNA等)锚定至的商业上可获得的预处理表面的技术。大多数这些技术已被开发用于免疫学测试以及将蛋白(免疫球蛋白)连接至表面，所述表面携带能够与蛋白羧基(-COOH)或氨基(-NH2)端反应的基团(-COOH、-NH2、-OH等)。
可以通过分子5'端的游离磷酸直接完成核酸的共价锚定，其中游离磷酸与仲胺(由斯特拉斯堡的Polylabo销售的Covalink-NH表面)反应形成共价键。也可以用氨基将DNA官能化，然后如同处理蛋白质一样进行处理。
也有链霉亲和素包被的表面(Dynal小珠等)，其许可链霉亲和素和生物素化DNA分子之间的准共价锚定。最后，通过将直接针对地高辛的抗体接枝到表面上(通过上面提到的方法)，用地高辛官能化的核酸可以锚定于此表面。这仅仅代表许多可能的锚定技术中的一个示例。
在附着与锚定技术当中还应该提到的是，例如在专利EP 152 886所描述的技术，其使用酶偶联用于将DNA附着到固体支持物如纤维素上。
专利EP 146 815也描述了各种将DNA附着到支持物上的方法。
相似地，专利申请WO 92/16659建议使用聚合物来附着DNA的方法。
当然，核酸可以直接附着至支持物，但必要时，特别是考虑到限制表面的影响时，核酸可以附着至肽或其他性质的惰性臂的末端，例如在欧洲专利EP 329 198中描述的。
下面的实施例将带出本发明的其它特征和优点。
附图说明
图1：检测在重新杂交期间寡核苷酸诱导的阻断。(a)具有在茎上预先安置的靶的发夹构建设计。(b)在83 bp发夹上两个寡核苷酸(SEQ ID NO.1:5'-ACAGCCAGC-3'、SEQ ID NO.2:5'-ATGACAATCAG-3')杂交引发的障碍实例(参见方法)。左侧(panel)：在F打开＝17.8pN(橙色)和F测试＝11.4pN(蓝色；参见在顶部的力轨迹)记录的实验轨迹。观察到五个不同延伸水平从上到下对应于：(i)在F打开处打开的发夹、(ⅱ)在F测试处打开的发夹、(ⅲ)被第一寡核苷酸阻断的部分退火的发夹、(ⅳ)被第二寡核苷酸阻断的部分退火的发夹和(v)折叠的发夹。黑色曲线对应于平均1秒的原始数据。右侧(panel)：阻断(ii)-(iv)的直方图。黑色曲线代表在F测试处重新杂交时在发夹的给定延伸中每个循环的阻断数的直方图；其中在碱基对上的ΔΖ＝Z阻断-Z闭合获自在单一发夹上～23个力循环。数据的高斯拟合(Gaussian fits)显示为红色。这些拟合的方差(σ～1nm)定义设备的分辨率。在发夹上的39.60bp和28.66bp处观察到阻碍Z阻断1和Z阻断2，这与40bp和29bp处的预期位置(以绿色显示)很好地吻合。
图2：通过杂交的序列鉴定。通过2种不同寡核苷酸(标记为寡核苷酸1和2)鉴定3种不同发夹(标记为分子1、2、3)(参见方法)。左侧：在发夹打开-闭合循环过程中记录的实验轨迹。为显示对应的阻断，将寡核苷酸1和2相继加入溶液中：寡核苷酸1杂交在分子2和3上，而寡核苷酸2杂交在分子1和2上。右侧：寡核苷酸1(桔色)和2(蓝色)在每个分子上阻断的直方图，所述分子的完全延伸是灰色阴影。
图3：照相机视野显示许多小珠通过单发夹附着至玻璃表面。通过使用来自亮红LED的平行照明经由显微镜可看到这些。围绕小珠的小衍射环用来测量其垂直位置。
图4：显示发夹设计的方案。
图5：用于从mRNA生成cDNA发夹结构的方案。
实施例
方法
DNA发夹构建
如图4所示，通过连接3个分离的合成寡核苷酸(Eurogentec and IntegratedDNA科技)来构建短DNA发夹(在图1和图2中83bp，或在图2中179bp)。在第一步，通过加热至95℃持续5分钟，然后快速冷却至80℃，接着每10秒缓慢降低0.7℃直至4℃，使得在dH2O中的寡核苷酸(oligo)A-1(SEQ ID NO.3:5'-生物素-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTTTTT TTG GAT TCG CGG GTC TCT-3')和寡核苷酸A-2(SEQ ID NO.4:5'-AACCGT CCT TTA CTT GTC ATG CGC TCT AAT CTC TGG GCA TCT GGC TATGAT GTT GAT GGA ACT GAC CAA ACG TCG GTG GG-3')退火至互补的寡核苷酸A-3(SEQ ID NO.5:5'-磷酸化AGG AAG AGA CCC GCG AAT CCC CCA CCGACG TTT GGT CAG TT-3')。使用NucleoSpin Extract II试剂盒(Clontech)来清洗这些退火产物，即标记的部分A。对于对应于83 bp发夹的中间部分的寡核苷酸B-1(SEQ ID NO.6:5'-磷酸化的-TCC TGA TTG TCA TCG GCT GGC TGT TCG GTTAGT TTC GAA GAC TT-3')和寡核苷酸B-2(SEQ ID NO.7:5'-磷酸化的-GCG AAAGTC TTC GAA ACT AAC CGA ACA GCC AGC CGA TGA CAA TC-3')，或者对应于179 bp发夹的中间部分的寡核苷酸B'-1(SEQ ID NO.8:5'-磷酸化的-TCC TCGTGC GTG AGC GAG CGC GGT CGG TCG GTC GGT AGC GAG CGC GTG CGTGCG TGC GTG GGC TGG CTG GCT GGC TCG GTC GGT CGT GCG TGC GGTCGG TGG CTG GCT AGC GAG CGA GCG AGC GGG CTG GCT GAA GACTT-3')和寡核苷酸B'-2(SEQ ID NO.9:5'-磷酸化的-GCG AAA GTC TTC AGCCAG CCC GCT CGC TCG CTC GCT AGC CAG CCA CCG ACC GCA CGC ACGACC GAC CGA GCC AGC CAG CCA GCC CAC GCA CGC ACG CAC GCG CTCGCT ACC GAC CGA CCG ACC GCG CTC GCT CAC GCA CG-3')，重复退火和清洗步骤。这些退火产物是标记的部分B或B'或B"。通过在25℃中在1×T4连接酶反应缓冲液中使用T4连接酶(5U/μΙ,Fermentas)持续1.5小时，我们将部分A、部分B(或部分B'、B")连接至寡核苷酸C(SEQ ID NO.10:5'-磷酸化的-TCG CGCCTG ATC GTC CAC TTT TTT TTT AGT GGA CGA TCA GGC-3')，其是发夹的环，然后通过加热至65℃持续20分钟来停止反应。使用NucleoSpin Extract II试剂盒来清洗连接混合物。最后，在具有1mM地高辛-dUTP(Roche)的1×NEB2缓冲液中使用克列诺酶(Klenow)(3→5'外切)(New England Biolabs)在37℃持续15分钟进行填充反应，由此加入地高辛标记，然后通过加热至75℃持续20分钟来停止反应。再次使用NucleoSpin Extract II试剂盒来清洗发夹产物。
对1241bp发夹(图2)的制备方法描述在Manosas等人(Nat.Chem.Biol.5:904-912,2009)。
单分子分析
在一端用地高辛标记、而在另一端用生物素标记的构建发夹被附着至显微镜流体室的玻璃表面，所述玻璃表面预先使用抗-地高辛进行包被并使用牛血清白蛋白(BSA)进行钝化，所述构建的发夹还吸附至使用链霉亲和素(DYNAL MyOne)包被的1μm超顺磁性珠。小磁体用于拉动附着在小珠上的单一DNA分子。使用CCD照相机在31Hz获得分子延伸Z(t)。平均经过1秒的原始数据，达到～1nm的分辨率，同时伸展力F以10％的精确度测量。数据收集过程中，我们从垂直位置轨迹Z(t)减去粘至表面的参考小珠的垂直位置(Zref)，这有利于减少设置漂移。对于每一个打开/关闭循环，我们采用Z关闭(F测试)的高斯拟合的中心(<Z关闭>)作为关闭发夹的参考位置(延伸0nm)。类似的高斯拟合用于确定在一个Z打开(F测试)和Z阻断(F测试)循环的平均位置。误差线代表s.e.m。
对于图2中的杂交鉴定，分子1是1214bp发夹，分子2是83bp发夹，以及分子3是179bp发夹，而寡核苷酸1是SEQ ID NO.11:5'-GAAGAGACCC-3'和寡核苷酸2是SEQ ID NO.12:5'-CAGCCGATGAC-3'。
结果
检测在发夹重新拉上拉链的途径中的障碍
在目前的方法中，DNA发夹在一端通过地高辛(Dig)-抗-地高辛键附着至盖玻片，在另一端通过生物素-链霉亲和素键附着至磁性珠。可以以各种方式来生成所述DNA发夹。例如，通过将基因组DNA片段在其一端连接至DNA环并在其另一端连接至使用生物素和地高辛标记的DNA叉结构(图1a)。或者，可从在聚-T包被的小珠上俘获mRNA并反转录后获得的cDNA来生成这种发夹(图5)。
样本附近的小磁体用于对栓系小珠施加垂直力。小珠至表面的距离(即，发夹的端至端的距离)可以从小珠的图像实时推导出(Gosse&Croquette,Biop ys.J.,82:3314-3329,2002)。或者，可以使用渐逝场照明(evanescent field illumination)从经由小珠分散的光强度来推断出小珠至表面的距离。虽然设置类似于使用光镊进行的DNA拉开拉链实验(Brower-Toland等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:1960-1965,2002)，使用磁阱通过在许多分子同时应用相同力允许高度并行(Gosse&Croquette,Biophys.J.,82:3314-3329,2002；Strick等,Science,271:1835-1837,1996)。
我们调节力来周期性地打开和关闭在溶液中的DNA发夹(Essevaz-Roulet等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:11935-11940,1997)，溶液含有互补于部分发夹的寡核苷酸。在图1b中，通过施加力F打开(>15pN)来周期性地展开83bp发夹，以及通过减少力至F测试(～10pN)来重新拉合上发夹。在展开或打开状态，在溶液中的两种不同的寡核苷酸可以杂交至在发夹上的其各自的互补序列。其瞬时阻断在低力下的发夹的重新折叠，这很容易观察到，因为在发夹的延伸中在其重新折叠的时间过程中的两次暂停。
这种测量方案提供两件有价值的信息：沿发夹阻断的位置和存在期。一个碱基对的打开导致在发夹延伸上约0.85纳米的改变。我们的设备目前具有的分辨率(～1nm)，我们可因此记录具有约一个核苷酸精确度的阻断位置。应注意发夹的打开和关闭状态之间的切换提供对慢实验漂移不敏感的差分延展测量。此外，只要所施加力保持恒定，所施加力的精确值不是非常重要的。
关于阻断的存在期，其涉及到杂合体的稳定性，我们发现其取决于应用的拉力、互补寡核苷酸的尺寸以及在寡核苷酸和发夹之间的错配的存在与定位(数据未示出)。
通过杂交指纹或单循环连接进行的序列鉴定
在给定样本中对所期望的DNA的鉴定是在许多情况下的相关问题，例如检测基因突变、基因复制、mRNA表达模式等。这种鉴定问题使用本方案非常容易。其需要在DNA发夹样本上检测使用一组选择的短(～10nt)寡核苷酸获得的给定的杂交指纹。这可以通过在存在一个或几个探针寡核苷酸时在发夹的重新杂交期间对阻断进行测试来实现。如图2所示，可通过两种不同寡核苷酸的杂交来实现三种不同DNA序列的鉴定。应当注意到因为我们可以检测杂合体的确切位置，没有必要如通常所做的按顺序测试每个探针。人们可以鉴定几个选择的探针沿发夹的阻断位置，并使用这种杂交模式，而不是仅仅鉴定作为DNA序列指纹的杂交存在。

Claims (21)

1.一种用于定量样本中含有特异核酸序列的一个种类的双链核酸分子的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过向双链核酸分子施加物理力使在样本中的所述双链核酸分子变性；
b)提供与所述序列相对应的单链核酸分子；
c)在所述单链核酸分子存在时使步骤a)的所述变性双链核酸分子复性；
d)检测在其中复性被阻断的双链核酸分子；以及
e)计数步骤d)的双链核酸分子。
2.一种用于定量样本中含有一个或更多个特异序列的一个种类的双链核酸分子的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过向双链核酸分子施加物理力使在样本中的所述双链核酸分子变性；
b)提供与所述一个或更多个序列相对应的一个或更多个单链核酸分子；
c)在所述单链核酸分子存在时使步骤a)的所述变性双链核酸分子复性；以及
d)检测在其中复性被所述一个或更多个单链核酸分子所阻断的双链核酸分子；以及
e)计数步骤d)的双链核酸分子。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述双链核酸分子是发夹。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中双链核酸的一条链的至少一个碱基直接或间接地附着至表面，并且其中双链核酸的另一条链的至少一个碱基附着至可移动的表面。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在步骤a)中通过移开支持物使双链核酸变性。
6.根据权利要求5所述的方法，其中通过移开支持物向双链分子施加物理力，所述物理力高于或等于15pN，优选地高于或等于17pN，更优选地高于或等于18pN。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在步骤c)中通过将支持物合在一起使变性双链核酸复性。
8.根据权利要求7所述的方法，其中通过使支持物合在一起将施加至双链分子的力降低至小于或等于12pN，优选地小于或等于11pN，更优选地小于或等于10pN。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中双链核酸未附着至支持物的末端彼此共价或非共价地连接。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中重复步骤a)至d)若干次(以便积累测量并提高信号/噪音比率)。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中步骤d)的检测包括测量附着至支持物的双链核酸分子的两末端之间的距离(z)。
12.根据权利要求11所述的方法，当所述双链核酸分子变性时，所述方法包括测量附着至支持物的双链核酸分子的两末端之间的距离(z高)的进一步的步骤。
13.根据权利要求12所述的方法，其进一步包括以下步骤：
a)比较z和z高，以及
b)确定阻断的位置。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其包括测量阻断的持续时间的进一步的步骤。
15.根据权利要求14所述的方法，其包括将阻断的持续时间与参考值进行比较的进一步的步骤。
16.一种用于测量样本中基因表达的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过复制在样本中存在的RNA分子来合成双链核酸分子，以及
b)通过权利要求1-15中任一项所述的方法来定量与所述基因相对应的mRNA分子种类。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述双链核酸分子通过反转录合成。
18.根据权利要求16或17中任一项所述的方法，其中从锚定至固体表面的聚T寡核苷酸起始反转录。
19.一种用于在来自受试者的生物样本中检测特定染色体部分的异常分布的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过权利要求1至15中任一项所述的方法来定量所述特定染色体部分的水平；
b)通过权利要求1-15中任一项所述的方法来定量其他染色体部分的水平；
c)计算在a)中获得的水平与在b)中获得的水平之间的比率；以及
d)确定所述特定染色体部分是否异常分布。
20.一种用于在患癌症患者的癌症样本中诊断癌症侵袭性的方法，所述方法包括以下步骤：
a)根据权利要求19所述的方法来确定所述特定染色体部分是否在所述患者的癌症样本中异常分布；以及
b)如果所述染色体部分是异常分布，则诊断为侵袭性。
21.一种用于从所述孕妇的血液样本中诊断胎儿非整倍体的方法，所述方法包括：
a)根据权利要求19所述的方法来确定特定染色体部分是否在所述血液样本中异常分布；以及
b)如果所述染色体部分是异常分布，则诊断为胎儿非整倍体。
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