JP6169603B2 - 単一分子のハイブリダイゼーションおよび操作によるｄｎａの検出および定量法 - Google Patents

単一分子のハイブリダイゼーションおよび操作によるｄｎａの検出および定量法 Download PDF

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Description

発明の背景
緒論
本発明は、核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡの検出および定量のための迅速な方法に関する。具体的には、本発明は、特定の核酸分子の存在を検出および定量するための、物理的および電気的処理に基づく方法を提供する。本発明の方法は特に、異常な染色体分布の検出または遺伝子発現分析といった多様な適用に有用である。
核酸配列の検出および定量は、広範な慣用の生物学的適用に重要である。適用には、臨床診断、分子生物学分野の研究、ハイスループット薬物スクリーニング、獣医学的診断、農学的遺伝子検査、環境検査、食品検査、工業プロセスの監視および保険テストを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ診断の分野が含まれる。特に、生理学的サンプルにおける特定のＤＮＡ配列の存在の証明は、現在、例えば、抗生物質耐性を生じる細菌の確率、遺伝子異常、遺伝子改変に関連する癌のリスク、およびＨＩＶまたは肝炎ウイルスに関連する感染などのウイルス感染を同定するための診断方法の開発の第一線をなす（例えば、Zhang et al., Nature, 358: 591-593, 1992; Turner et al., J Bacteriol, 176(12):3708-3722, 1994; Weston et al., Infection and Immunity., 77(7):2840-2848, 2009参照）。特定の核酸配列の検出および／または定量はまた、出生前診断、遺伝子発現の研究、古代ＤＮＡの入手、遺伝病の診断、配列多型の検出、ＤＮＡリピートの定量、病原体の検出、遺伝子改変生物の同定なども多様な適用にも重要である（例えば、ＷＯ０２／３１４６３；ＷＯ２００６／０５８３９５；ＵＳ５，７０５，３６５；ＵＳ５，８４０，４８７；ＵＳ５，８５８，６５８；ＵＳ６，４５３，２４５；ＵＳ７，９１９，２４７; Verjat et al., Biotechniques, 37(3): 476-481, 2004; Vural, Air. J. Biotechnol., 8(20): 5163-5168, 2009; van der Meide et al., J. Clin. Microbiol., 43(11): 5560-5566; 2005; Fan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105(42): 16266-16271, 2008; Buehler et al., Methods, 50: S15-S18, 2010; Clark et al., Genome Res., 11: 1594-1602, 2001; Vernon et al., BMC Infect Dis, 3: 12, 2003; Piepenburg et al., PLoS Biol., 4(7): e204, 2006参照）。
総て標的核酸分子と特異的標識プローブの間のハイブリッド分子の検出に頼るいくつかの技術が何年にもわたって開発されてきた。今日、核酸を検出するために最も広く用いられている方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づいている。例えば、リアルタイムＰＣＲは、標的ＤＮＡ分子を増幅すると同時に定量するために使用される。
何であれ核酸の検出および／または定量方法に重要な側面は感受性である。開発された最初の技術は、大きなサンプルサイズを必要とした。この問題は、ＰＣＲ法における増幅工程によって軽減された。従って、ＰＣＲに基づく方法は、標的核酸を増幅することによって極めて少量の核酸の検出を可能とした(Haque et al., BMC Biotechnol., 3: 20, 2003)。従って、生物学的研究では、ＰＣＲは伝染病の検査に関する研究を加速化した。ＰＣＲの医学的適用は、ヒト組織においてウイルス、細菌、および癌細胞を同定することを含む。ＰＣＲは、特定の細胞種を同定するために、ｉｎ ｓｉｔｕ（ｉｎ−ｓｉｔｅ）ＰＣＲと呼ばれる手法において、単一の細胞内で使用することさえできる。ＰＣＲはまた、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）と呼ばれるプロセスであるＲＮＡの増幅にも適用することができる。ＲＴ−ＰＣＲは定型のＰＣＲと同様であるが、逆転写酵素と呼ばれる酵素を用いてＲＮＡ標的からＤＮＡが合成される初期工程が加わる。リボソームＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡおよびゲノムウイルスＲＮＡを含む多様なＲＮＡ分子がＲＴ−ＰＣＲに使用されてきた。
しかしながら、これまでに開発された方法には総て、重大な欠点がある。特に、これらの方法では総て、標識ヌクレオチド（例えば、蛍光標識）を使用するので、全体的なコストが著しく高くなる。さらに、標的配列の増幅には時間がかかり、エラーの確率が増え、極めてコンタミネーションを受けやすい。
物理的技術および電気的処理に基づく本発明による方法は、化学的または生化学的である現行のアプローチとは異なる。その利点は、
１）検出および定量前にＰＣＲ工程を必要としないこと
２）高価な標識ヌクレオチド（蛍光団または他のいくつかの基のいずれかによる）を使用しないこと
である。
さらに、本発明の方法と、ヘアピン上の障害の位置のグローバル（電気的または光学的）検出は、ゲノムＤＮＡの迅速の迅速大規模診断を可能とし、現行のＤＮＡチップ技術に対する競合的代替となる。
本発明は、核酸配列の検出のための方法に関し、前記核酸配列に相当する変性二本鎖核酸の復元が遮断される。
「核酸配列の検出」とは、本明細書では、限定されるものではないが、核酸分子内の特定の配列の検出または２つの異なる核酸分子の配列間の違いの検出を含む、特定の核酸配列の有無に関する何らかの情報の取得に直接的または間接的につながるあらゆる活性を意味する。核酸配列の検出は、前記核酸の配列の実際の決定、すなわち、前記核酸内の実際の塩基の連なりの解読を含み得るが、ほとんどの実施態様では、本発明は、前記核酸の配列決定を行わずに実施可能である。
本発明は、変性した二本鎖核酸の二鎖が適当な条件下で再ハイブリダイズするという所見に基づく。もし、復元工程の際に一部の分子が前記変性した二本鎖核酸の鎖に結合すれば、再ハイブリダイゼーションは部分的でしかなくなる。本発明者らは、今般、ある特定の条件下で、再ハイブリダイゼーション中のこの恒久的または一時的停止が、変性した二本鎖核酸分子に含まれる配列を検出するために使用可能であることを見出した。本発明によれば、二本鎖核酸分子の再ハイブリダイゼーションの遮断を検出することができ、その後、この遮断に関連する物理的パラメーター（例えば、遮断の持続時間、二本鎖核酸分子上の遮断の位置）が核酸の配列の決定を可能とする。
よって、本発明は、核酸配列の検出のための方法であって、前記核酸配列に相当する変性した二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程を含んでなる方法に関する。
「変性」とは、本明細書では、二本鎖間の水素結合の大部分が切れた際に起こる前記二本鎖核酸分子の二本鎖の分離のプロセスを意味する。変性プロセスにより変性した核酸分子が得られ、この変性した核酸分子とは本明細書では、二本鎖核酸分子の変性から生じる２本の分離した相補鎖を意味する。「復元」とは、本明細書では、２本の分離した相補鎖がハイブリダイゼーションを介して二本鎖に再形成するプロセスを意味する。本明細書で用いる場合、「ハイブリダイゼーション」は、核酸の２以上の相補鎖間の非共有結合的、配列特異的相互作用を確立して単一のハイブリッドとするプロセスである。
核酸を変性させるために当業者に公知の可能性がいくつかある。最も好ましい様式では、２本の鎖を、それらに物理的力をかけることによって分離する。本発明による「物理的力」は、ある物体にその移動、方向または幾何学的構成のいずれかに関して特定の変化を受けさせる任意の作用である。本発明による力が、例えば、温度（それに対して発揮される作用以上のものの直接的特性である）などの他の物理的パラメーターとは異なるということが当業者には明らかであろう。本発明による物理的力は、摩擦、張力、垂直力、空気抵抗力、付加力、および弾力などの力を含んでなる。最も好ましくは、本発明による物理的力は張力である。この実施態様によれば、前記二本鎖核酸の遊離末端を引き離して、対合塩基間の総ての結合を破断し、二本鎖核酸を開くことができる。
よって、一つの実施態様では、本発明の方法は、核酸配列の検出のための方法であって、
・前記核酸配列に相当する二本鎖核酸分子を、前記分子に物理的力をかけることによって変性させる工程、および
・二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程
を含んでなる方法に関する。
このタイプの配列検出法では、再対合を助けるために、引き離す前に、二本鎖ＤＮＡの遊離末端（すなわち、支持体に結合されていない末端）が互いに共有結合的にまたは擬共有結合的に連結されるようにしておくことが遊離である。好ましい実施態様では、二本鎖核酸分子はヘアピンである。本発明に関して二本鎖核酸を図示することが望まれる場合には、開いた（または閉じた）「ジップファスナー」に模することができ、二本鎖核酸の変性はジップが開いた状態であり、復元は再び閉じた状態である。
本発明者らは、ある特定の条件下で、ある分子が変性した二本鎖核酸分子に結合すると、前記分子の復元が遮断されることを見出した。この結合分子は、前記変性した二本鎖核酸分子、例えば、核酸、タンパク質または小分子上の特定の配列に親和性を有するいずれのタイプの分子であってもよい。しかしながら、一本鎖核酸を使用することが好ましく、これは、前記一本鎖核酸は変性した二本鎖核酸の一方の鎖上の相補配列とハイブリダイズすることができるためである。この一本鎖核酸は、復元プロセスを遮断するのに十分な長さである限り、いずれの長さであってもよい。優先的には、一本鎖核酸の長さは、３〜５０ヌクレオチドの間、より優先的には３〜４５ヌクレオチドの間、３〜４０ヌクレオチドの間、３〜３５ヌクレオチドの間、３〜３０ヌクレオチドの間、３〜２５ヌクレオチドの間、３〜２０ヌクレオチドの間、３〜１５の間、いっそうより優先的には３〜１２の間から構成される。本発明の一本鎖核酸は、特に、天然または修飾型のいずれかのＤＮＡまたＲＮＡ分子であり得る。前記一本鎖核酸はまた、例えば、リボース部分が２’酸素および４’炭素をつなぐ付加的架橋で修飾されているヌクレオチドであるロックド核酸（ＬＮＡ）、または主鎖がペプチド結合で連結されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位の繰り返しから構成されるペプチド核酸（ＰＮＡ）などの修飾ヌクレオチドから作製されてよい。
一本鎖核酸分子を復元前に変性した二本鎖核酸に加えた場合、再ハイブリダイゼーションの遮断は、その一本鎖核酸分子の配列が二本鎖核酸分子の配列の少なくとも一部に相補的であることを示す。
よって、本発明の方法はまた、核酸配列の検出のための方法であって、
１）二本鎖核酸分子を、前記分子に物理的力をかけることによって変性させる工程；
２）前記核酸配列に相当する一本鎖核酸分子を準備する工程；
３）前記二本鎖核酸分子を前記一本鎖核酸分子の存在下で復元する工程；および
４）前記二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程
を含んでなる方法に関する。
本発明は、いずれのタイプの二本鎖核酸にも当てはまる。最も多くの場合、二本鎖核酸はＤＮＡであるが、本発明は、完全に対合したもしくは対合の不完全な一本鎖ＤＮＡ−一本鎖ＤＮＡの二重鎖、あるいはまた完全に対合したもしくは対合の不完全な一本鎖ＤＮＡ−一本鎖ＲＮＡの二重鎖、あるいはまた完全に対合したもしくは対合の不完全な一本鎖ＲＮＡ−一本鎖ＲＮＡの二重鎖にも当てはまると理解される。さらに、この二重鎖は、起源の異なるサンプルから得られた２本の単鎖の少なくとも部分的再対合からなってもよい。最後に、本発明はまた、単独の一本鎖ＤＮＡまたは単独の一本鎖ＲＮＡの二次構造にも当てはまる。
典型的な構成では、二本鎖核酸分子は、２つの固体基質（例えば、顕微鏡スライド、マイクロピペット、微粒子）に特異的に固定することができる。一方の末端を表面に直接的または間接的に固定し、他方の末端を可動表面に直接的または間接的に固定することができる。この実施態様では、これらの支持体を遠ざけると、二本鎖核酸の両末端に張力がかけられる。張力が閾値よりも大きいと、２本の鎖は分離され、核酸分子は変性される。かけられる張力は優先的には１５ｐＮ以上であり、より優先的には１６ｐＮ以上であり、いっそうより優先的には１７ｐＮ以上であり、極めて好ましい側面では、１８ｐＮ以上である。この力は、温度、ヌクレオチドタイプおよびバッファーによって代わり得るが、当業者ならば、２本の鎖の分離を得るためにこれらのパラメーターに対して前記の力を容易に適合させることができる。他方、張力が最小値よりも小さくなれば、変性された二本鎖核酸の２本の鎖は再ハイブリダイズすることができる。前記２本の鎖の再ハイブリダイゼーションを得るためには、１２ｐＮ以下の張力が優先的にかけられ、より優先的には、１１ｐＮ以下であり、より優先的には１０ｐＮ以下である。
最も好ましくは、二本鎖核酸はヘアピンである。本明細書で用いる場合、「ヘアピン」とは、一方の鎖の５’末端が他方の鎖の３’末端に不対合ループによって物理的に連結されている二重らせんを意味する。前記の物理的連結は、共有結合または非共有結合のいずれであってもよい。優先的には、前記物理的連結は共有結合である。よって、ヘアピンは、二本鎖ステムと、不対合の一本鎖ループからなる。ヘアピンにおいて、ループに関与していない２本の鎖の末端は遊離しており、従って引き離すことができる。その結果、二本鎖核酸の対合解除が起こり、変性した二本鎖核酸分子が生じる。閾値より大きな力で前記核酸分子の欠く末端を引っ張ることによって、ヘアピン二本鎖核酸分子を完全に開くことができる。この分子にかけられる張力が最小値よりも小さくなると、核酸分子は再ハイブリダイズしてヘアピンを再形成する。核酸鎖の一方にハイブリダイズした一本鎖核酸分子が存在すると、再ハイブリダイゼーションの停止が起こる。従って、このような停止の検出は、一本鎖核酸分子が二本鎖ステムの少なくとも一部に相補的な配列を含んでなることを示す。
この点で、ヘアピンが短い期間、例えば１秒の後にリフォールディングするようなループの配列および長さを設計することが有利である。この効果に対する方法は従来技術、例えば、Woodside et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103(16): 6190-6195, 2006に記載されている。この力を開状態から試験値まで小さくすると、開いたヘアピンの伸長は一本鎖ＤＮＡの弾性のために変動する。このヘアピンのリフォールドまでの小さな遅延により、ユーザーは、遮断状態を検出するために使用したものと同じ力でヘアピン伸長を測定することが可能となる。
ヘアピンを使用すれば、特に、対合と対合解除のサイクルを行うこと、従って、シグナル／ノイズ比を改善することが可能となる。
二本鎖核酸の遊離末端を互いに連結させる技術は公知であり、いくつかを以下にさらに詳しく記載する。
遮断の決定とは、本明細書では、遮断に関連する物理的パラメーターの決定を意味する。１つの有用なパラメーターは二本鎖核酸分子上の遮断の位置であり、この位置は二本鎖核酸分子上の一本鎖核酸分子のハイブリダイゼーション位置に相当する。実際に、本発明者らは、復元の停止が起こる二本鎖核酸上の位置が正確に決定可能であることを見出し、ヘアピンの使用は、当業者に変性／復元プロセス中の任意の時点でヘアピンの２つの遊離末端間の物理的距離を測定する手段を与える。
「遊離末端」とは、本明細書では、もう一方の鎖の末端に共有結合的に連結されていない一方の鎖の末端を意味し、上述したように、これらの遊離末端はそれぞれ異なる表面に結合させることができる。例えば、これらの表面の一方は可動であり得、他方は不動であり得る。従って当業者は、ヘアピン二本鎖核酸の遊離末端間の距離を測定するために、単にその２つの表面間の距離を測定すればよいということを容易に理解するであろう。
この距離は、ヘアピン核酸はその後完全に伸長されるため、ヘアピン分子が完全に変性された際に最大（ｚｈｉｇｈ（Ｆｏｐｅｎ）となり、ヘアピン分子が完全に復元された際に最小（ｚｌｏｗ（Ｆｔｅｓｔ））となる。長さの比較は総て、一本鎖核酸が同じ弾性特性を有するように同じ力Ｆｔｅｓｔで行うことが有利である。ループが閉じる時間の遅れを用いて当業者は、Ｚｈｉｇｈ（Ｆｔｅｓｔ）を測定することができる。同様に、復元プロセスが一時的に停止された場合の２つの遊離末端間の距離を測定することができ、予想されるように、この距離ｚはｚｈｉｇｈとｚｌｏｗの間を含む（ｚは総てＦ＝Ｆｔｅｓｔで測定される）。距離ｚは、一本鎖核酸の配列が相補的な配列のヘアピン分子における位置によって異なることがすぐに明らかになる。前記一本鎖核酸がヘアピンの遊離末端付近に位置する配列とハイブリダイズすれば、自己再ハイブリダイゼーションプロセスは、完全なヘアピンが再形成される前に遮断され、この場合にｚｐａｕｓｅは最小となる。他方、前記一本鎖核酸がヘアピンの、不対合ループに近い部分とハイブリダイズすれば、復元プロセスは、ヘアピンが完全にまたはほぼ完全に変性された状態で停止され、この場合にｚｐａｕｓｅは最大となる（図１）。
別の実施態様では、１以上の参照一本鎖核酸をＤＮＡヘアピン上の既知配列（例えば、その基部付近またはそのループ付近）とハイブリダイズさせ、前記参照一本鎖核酸のハイブリダイゼーション位置に対して、プローブした一本鎖核酸のハイブリダイゼーションの位置を測定する。
二本鎖核酸分子における物理的距離と塩基数は正確に相関させることができる。例えば、距離０．８ｎｍは、１０ｐＮの力の下で、核酸において２つのヌクレオチドにわたる距離（１ｂｐ）に相当する。
力に対する正確な較正は、一本鎖核酸の弾性により与えられる。従って、二本鎖核酸分子の２つの遊離末端（または分子上の任意の２つ参照位置）の間の距離を単に測定することにより、復元が遮断された場所を正確に決定することができる。
よって、一つの実施態様では、本発明は、核酸の配列を検出するための方法からなり、この場合、決定する配列に相当する二本鎖核酸分子をまず、物理的力をかけることによって変性させ、次に、一本鎖核酸の存在下で再ハイブリダイズさせ、再ハイブリダイゼーションの遮断の存在を検出する。一つの側面において、二本鎖分子の２つの末端間の距離は、復元プロセスが遮断された際に決定される。優先的には、前記分子の２つの末端間の距離は、分子が完全に変性された際に決定される。より優先的には、完全に伸長されたループと参照ハイブリダイゼーション位置の間の距離が測定され、遮断の位置を決定するために使用される。いっそうより優先的には、２つの参照ハイブリダイゼーション位置の間の距離が測定され、遮断の位置を決定するために使用される。
分子上のその位置の他、復元の遮断に関連する最も有用なパラメーターは、復元が遮断されている時間（本明細書では復元停止の持続時間と呼ばれる）である。実際に、再ハイブリダイゼーションが遮断されている時間を測定することが可能である。例えば、当業者ならば、二本鎖核酸の２つの末端間の距離が上記で定義されたようなｚ、すなわち、ｚｈｉｇｈとｚｌｏｗの間を含む中間値である時間を決定することができる。
遮断の持続時間は、２配列間の相補性の程度に依存する。相補性が高いほど、２分子間で確立される結合の数が増え、従って、持続時間が長くなる。また、遮断時間は２つの配列の間の相補性の領域の長さに依存することも明らかである。領域が長いほど、２分子間で確立される結合の数が増え、従って、持続時間が長くなる。従って、ある特定の条件下では復元停止の持続時間がほぼ恒久的となるであろうことが容易に想像できる。特に、一本鎖核酸が変性した二本鎖核酸とハイブリダイズ可能な２０を超える、好ましくは２５を超える、いっそうより好ましくは３０を超えるヌクレオチドを含んでなる場合には、その一本鎖核酸は、前記二本鎖核酸にかけられる力がＦｔｅｓｔまで小さくしても二本鎖ヘアピンとハイブリダイズしたままとなり(何分も）、従って、前記二本鎖ヘアピンの自己再ハイブリダイゼーションを妨げる。このような場合、一本鎖核酸分子の放出ために酵素を使用することが有利であり得る。従って、前記一本鎖核酸分子の放出は、対合と対合解除のサイクルを行うこと、従って、シグナル／ノイズ比を改善することが可能とする。好適な酵素の例としては、例えば、ＵｖｒＤヘリカーゼ、大腸菌(E. coli)ＵｖｒＤヘリカーゼ、Ｔｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼ、Ｔ７ Ｇｐ４ヘリカーゼ、ＲｅｃＢＣＤヘリカーゼ、ＤｎａＢヘリカーゼ、ＭＣＭヘリカーゼ、Ｒｅｐヘリカーゼ、ＲｅｃＱヘリカーゼ、ＰｃｒＡヘリカーゼ、Ｔ４ ＵｖｓＷヘリカーゼ、ＳＶ４０ラージＴ抗原ヘリカーゼ、ヘルペスウイルスヘリカーゼ、酵母Ｓｇｓ１ヘリカーゼ、ＤＥＡＨ＿ＡＴＰ依存性ヘリカーゼおよび乳頭腫ウイルスヘリカーゼＥ１タンパク質、ならびにそれらの同族体を含むヘリカーゼが挙げられる。好ましくは、Ｔ４ ＵｖｓＷヘリカーゼが使用される。
停止の持続時間はまた、反応条件によって異なり得る。前記持続時間は、温度が高くなるほど短くなる。同様に、バッファー条件も停止の持続時間を変調することができ、例えば、マグネシウム、ベタインおよび塩化テトラメチルアンモニウム（モル濃度で使用されるＴＭＡＣ）は遮断時間を延長する。これらの化合物はＧＣ対よりもＡＴ対を強めるので、これらの対の間の強度の違いを小さくする。しかしながら、温度およびバッファーが固定された場合、停止の持続時間は、変性された二本鎖核酸上の引っ張り力および一本鎖核酸とのその相補性に依存するだけである。
よって、特定の一つの側面では、本発明の方法は、
・前記核酸配列に相当する前記二本鎖核酸分子を、前記分子に物理的力をかけることによって変性させる工程、
・一本鎖核酸分子を準備する工程、
・二本鎖核酸分子を前記一本鎖核酸分子の存在下で復元する工程、
・前記二本鎖核酸分子の復元の遮断を検出する工程、および
・停止の持続時間を決定する工程
を含んでなる。
従来技術の方法は総て蛍光ヌクレオチドを使用するが、本発明の方法は核酸分子伸長の機械的検出を含むだけである。従って、本発明の方法は、従来技術の方法に伴ういずれの欠点も被らない。
好ましい側面では、前記二本鎖核酸分子の復元の遮断の検出は、上記のように二本鎖核酸分子上の遮断の位置を決定することを含む。
この特定の実施態様では、本発明による方法は、特に、探している異常に相当する核酸の可変領域の配列決定を可能とするよう診断目的で使用され得る。
しかしながら、オリゴヌクレオチドとＤＮＡ配列の間のミスマッチがはるかに短命なハイブリダイゼーションをもたらすという所見に基づく簡単な技術を提供することが可能である。第１の側面では、ヘアピン二本鎖核酸分子の復元は、上記の方法のいずれかにより、一本鎖核酸によって遮断され、遮断の持続時間が決定される。好ましい側面では、この値が参照値と比較される。さらに好ましい側面では、この参照値は、上記の方法のいずれかにより決定されるような、参照一本鎖核酸で見られる停止の長さに相当する。
例えば、ゲノムＤＮＡにおいて突然変異を探す診断目的で、この技術は２通りの方法で実施することができる。
１）探す突然変異を含んでなるゲノムＤＮＡで形成されたヘアピンを溶液中のオリゴヌクレオチドをプロービングする。
２）探す突然変異を有する配列を含有するヘアピンを、サイズが固定された一本鎖ＤＮＡ断片として溶液中に存在しているゲノムＤＮＡによりプロービングする。アッセイの目的が特定の配列またはこのような配列中にあり得る突然変異の存在を見つけることだけである場合には、この配列をヘアピンのループ内に置けば、極めて簡単な検出スキームが得られることがすぐに明らかになる。オリゴがループ内でハイブリダイズすれば、それはヘアピンのリフォールディングを完全に妨げて極めて大きな伸長変化をもたらし、これは下記のように容易に検出することができる。
従来技術の方法はプローブを蛍光または放射性ヌクレオチドで標識することを必要とするが、本方法は核酸分子伸長の機械的検出に頼るだけである。さらに、検出前に増幅工程を必要としない。よって、本発明の方法は、核酸分子の全集団の中で１つの単一分子の検出を可能とする。本発明の方法で得ることのできる単一分子分解能のために、特定の配列を有する各分子が検出できる。よって、本発明は、当業者が前記配列を有する核酸分子の数を数えることを可能とする。本方法は、核酸分子の全集団中の特定の核酸配列の簡単かつ正確な定量を可能とする。
従って、本発明のもう１つの側面は、サンプルにおいて特定の核酸配列を含んでなる二本鎖核酸分子種を定量するための方法であって、
ａ）サンプル中の前記二本鎖核酸分子を、前記分子に物理的力をかけることによって変性させる工程；
ｂ）前記配列に相当する一本鎖核酸分子を準備する工程；
ｃ）工程ａ）の前記変性二本鎖核酸分子を、前記一本鎖核酸分子の存在下で復元する工程；
ｄ）復元が遮断された二本鎖核酸分子を検出する工程；および
ｅ）工程ｄ）の二本鎖核酸分子を数える工程
を含んでなる方法を提供する。
定量される核酸種は、前記特定の配列を含んでなる核酸分子の集団である。それらは、この特定の配列を含む他の核酸分子とは異なる。これらの分子は総てこの配列を共有するが、それ以外の点では同一であっても同一でなくてもよい。特定の実施態様では、当業者には、前記特定の配列外が異なる核酸種の量を測定することが好ましい場合があり、例えば、当業者には、出芽酵母細胞が細胞周期に入る際に発現されるＧ１サイクリン転写産物ＣＬＮ１およびＣＬＮ２の両方の量を測定することに関心が持たれる場合がある。いくつかの他の実施態様では、同一の核酸分子の集団、例えば、差次的スプライシングから生じる遺伝子の異なるアイソフォームを定量することがより好ましい場合がある。これは前記特定の配列を注意深く選択することによって容易に達成することができ、当業者ならば、公開配列データベース（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ）の助けで上記の状態の一方または他方に相当する配列をどのように設計すればよいかを知っており、これを本明細書でさらに詳説する必要はない。
また、１以上の一本鎖核酸を使用することもでき、前記１以上の一本鎖核酸は、変性した二本鎖核酸分子上の１以上の異なる配列にハイブリダイズすることができる。
２以上の一本鎖核酸分子を使用する場合、前記１以上の一本鎖核酸は１以上の異なる配列に相当することが有利である。その場合、前記一本鎖核酸分子は、変性した二本鎖核酸分子に同時または逐次に加えることができる。前記種々の一本鎖核酸は、異なる位置で前記変性二本鎖核酸の復元を遮断することができる。再ハイブリダイゼーション中の遮断の数と位置は、各一本鎖核酸配列の、前記二本鎖核酸の配列に対する類似性の程度に基づき、ユニークなフィンガープリントを定義する。従って、フィンガープリントは、前記変性二本鎖核酸分子の復元期の間に１以上の一本鎖核酸が二本鎖核酸分子とハイブリダイズする結果として見られる遮断のパターンである。このフィンガープリントは、ＤＮＡサンプル中の種々の二本鎖分子を同定および計数するために使用可能である。
提案される方法論は蛍光標識プローブの使用を必要とせず、付加的位置情報（単なるプローブのハイブリダイゼーションを超える）を提供する。例えば、このアプローチを使用据えれば、数十万の個々のライブラリー断片を比較検討することができる。類似のフィンガープリントを有するｃＤＮＡをクラスターに分類し、これは発現された遺伝子の数およびそれらの相対的発現レベルに関する情報を与える。
よって、特定の一つの実施態様では、本発明の方法は、サンプルにおいて１以上の特定の配列を含んでなる二本鎖核酸分子種を定量するための方法であって、
ａ）サンプル中の前記二本鎖核酸分子を、前記分子に物理的力をかけることによって変性させる工程；
ｂ）前記１以上の配列に相当する1以上の一本鎖核酸分子を準備する工程；
ｃ）工程ａ）の前記変性二本鎖核酸分子を、前記一本鎖核酸分子の存在下で復元する工程；
ｄ）前記一本鎖核酸分子によって復元が遮断された二本鎖核酸分子を検出する工程；および
ｅ）工程ｄ）の分子を数える工程
を含んでなる方法を提供する。
好ましくは、工程ｂ）において少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、さらにより好ましくは少なくとも５つ、いっそうより好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは少なくとも１５の一本鎖分子が準備される。
本発明のサンプルは、例えば反応混合物などの、所望の核酸種を含有し得る任意のタイプのサンプルである。本サンプルはまた、例えば、生体サンプルであってもよい。「生体サンプル」は、例えば、細菌、ウイルス、植物、酵母などのような生物を含有し得る任意のサンプルであってよい。本発明による「生体サンプル」はまた、特に、細菌、ウイルス、植物、酵母などから得られた細胞抽出物など、生物から得られ得るサンプルも意味する。生体サンプルは、血清サンプル、血漿サンプル、尿サンプル、血液サンプル、リンパサンプルまたは生検など、被験体から採取されるいずれのサンプルであってもよい。このようなサンプルは、染色体配列の定量を可能とするにちがいない。ゲノム配列の定量のために好ましい生体サンプルには、血液サンプル、血漿サンプル、リンパサンプルまたは生検サンプルなどのサンプルが含まれる。好ましくは、生体サンプルは血液サンプルである。実際に、このような血液サンプルは、妊婦からの完全に無害な採血によって得ることができるので、例えば、胎児異数性の非侵襲的診断を可能とする。また、血液サンプルは癌患者からも使用可能であり、例えば、本発明の方法によって液性腫瘍を同定するために使用することができる。
本明細書において用いる「生体サンプル」はまた、癌が固形癌である場合には、検査する患者の固形癌サンプルを含む。このような固形癌サンプルは、当業者が本発明の方法によって所望の核酸のレベルの測定を実施することを可能等する。いくつかの場合、本発明による方法は、患者から固形癌サンプルを採取する予備工程をさらに含んでなり得る。「固形癌サンプル」とは、腫瘍組織サンプルを意味する。癌患者であっても、腫瘍部位である組織もやはり非腫瘍性の健常組織を含んでなる。従って、「癌サンプル」とは、患者から採取した腫瘍組織に限定されなければならない。前記「癌サンプル」とは、生検サンプルまたは外科的切除療法から採取されたサンプルであり得る。一つの側面によれば、患者からのサンプルは、癌細胞または癌組織である。
本発明によるサンプルは、定量される核酸種のみを含有してもよいが、他の分子も含有してよい。好ましい実施態様では、サンプルは他の核酸分子種を含有する。この実施態様によれば、本発明はさらに、異なる核酸分子種を含有するサンプルにおいて特定の配列を含んでなる核酸分子種を定量するための方法であって、
ａ）サンプル中の前記二本鎖核酸分子を、前記分子に物理的力をかけることによって変性させる工程；
ｂ）前記特定の配列に相当する一本鎖核酸分子を準備する工程；
ｃ）工程ａ）の前記変性二本鎖核酸分子を、前記一本鎖核酸分子の存在下で復元する工程；
ｄ）復元が遮断された二本鎖核酸分子を検出する工程；および
ｅ）工程ｄ）の分子を数える工程
を含んでなる方法に関する。
上記で説明したように、１以上の配列に相当する１以上の一本鎖核酸分子を使用することも可能であり、従って、特定のフィンガープリントの決定が可能である。この実施態様では、本発明の方法は、このフィンガープリントを示す二本鎖分子の定量に基づく。従って、この実施態様によれば、本発明は、異なる核酸分子種を含有するサンプルにおいて１以上の特定の配列を含んでなる核酸分子種を定量するための方法であって、
ａ）サンプル中の前記二本鎖核酸分子を、前記分子に物理的力をかけることによって変性させる工程；
ｂ）前記１以上の配列に相当する１以上の一本鎖核酸分子を準備する工程；
ｃ）工程ａ）の前記変性二本鎖核酸分子を、前記一本鎖核酸分子の存在下で復元する工程；
ｄ）前記１以上の一本鎖核酸分子によって復元が遮断された二本鎖核酸分子を検出する工程；および
ｆ）工程ｄ）の分子を数える工程
を含んでなる方法に関する。
好ましくは、工程ｂ）において少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、さらにより好ましくは少なくとも５つ、いっそうより好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは少なくとも１５の一本鎖分子が準備される。
従って、本発明は、核酸配列を定量する必要のあるあらゆる場合に使用可能である。適用には、臨床診断、分子生物学分野の研究、ハイスループット薬物スクリーニング、獣医学的診断、農学的遺伝子検査、環境検査、食品検査、工業プロセスの監視、バイオセキュリティー、法医学および保険テストを含むｉｎ ｖｉｔｒｏ診断の分野が含まれる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断および臨床診断は、疾患または病態の存在、その進行および／または重篤度のステージ、および処置に対する患者の奏功性を検出するための身体から採取した核酸サンプルの分析に関連する。ハイスループット薬物スクリーニングおよび開発では、核酸は、薬物リードを同定するために高サンプル数設定で化合物のライブラリーに曝した際に生物系の応答を分析するために、抗原、抗体、受容体などの他の薬剤と同様に使用される。獣医学的診断および農学的遺伝子検査は、農学的遺伝子産物およびプロセスの品質管理の手段を提供するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断と同様の非ヒト動物または植物種由来のサンプルを含む。環境検査では、環境媒体、例えば、土壌、水、大気などの汚染を示す生物およびそれらの毒素が分析される。食品検査は、品質管理手段としての生物、例えば、細菌、真菌などの定量を含む。工業プロセス監視では、製造プロセスの適正な管理を示すため、および／またはこのようなプロセスが管理から外れた場合に信号を発するために、核酸が検出され、かつ／または定量される。保険検査では、クライエントのリスクカテゴリーを決定するため、または候補の認定を助けるためのスクリーニング試験で生物および／またはそれらの毒素が同定される。核酸の検出および／または定量には様々な他の適用があり、新たな適用が絶えず開発されている。
これらの適用の１つが、遺伝子発現の分析である。当技術分野では遺伝子発現を分析する多くの方法が記載されている。しかしながら、ＲＴ−ＰＣＲおよびＤＮＡ−マイクロアレイなどの最も慣用されている方法は、高価である場合がある蛍光ヌクレオチドを使用する。さらに、所望の感受性を得るためには事前のＰＣＲ増幅が要される。これに比べて、本発明は、増幅または蛍光ヌクレオチドを必要とせずに、単一分子のレベルでの遺伝子発現を測定するための方法を提供する。
よって、第１の実施態様では、本発明は、サンプルにおける遺伝子の発現を測定するための方法に関する。「遺伝子の発現」とは、本明細書では、前記遺伝子の転写、すなわち、遺伝子ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡポリメラーゼによるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子の合成を意味し、本明細書で用いる「遺伝子の発現を測定する」とは、前記遺伝子に相当する特定のｍＲＮＡ分子の量を測定することを意味する。
従って、この実施態様によれば、前記遺伝子に相当する前記ｍＲＮＡの量は、上記の定量方法の１つによって測定される。
当業者には、前記定量方法は有利には二本鎖核酸分子に対して実施されることがすぐに明らかとなろう。好ましくは、第１の工程で、ＲＮＡ転写産物の複製により二本鎖核酸分子が得られる。よって、この実施態様によれば、本発明は、サンプルにおいて遺伝子の発現を測定するための方法であって、
ａ）前記サンプル中に存在するＲＮＡ分子の複製によって二本鎖核酸分子を合成する工程、および
ｂ）上記の方法の１つによって前記遺伝子に相当するｍＲＮＡ分子種を定量する工程
を含んでなる方法を提供する。
一本鎖ＲＮＡを鋳型として用いて二本鎖核酸を生成するいくつかの酵素が知られている。例えば、二本鎖ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの作用によって得ることができる。好ましくは、前記転写産物は、まず、逆転写酵素によってｃＤＮＡへと逆転写される。当業者ならば、逆転写がいくつかの利点を有することが理解できるであろう。例えば、逆転写は、固相表面にすでに固定されているポリＴオリゴヌクレオチドから開始可能である。さらに、生じたＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドをまずＲＮアーゼで、次にＤＮＡポリメラーゼで処理して、ＲＮＡ部分の分解と新たな相補的ＤＮＡ鎖の合成をもたらすことができる。有利には、ヘアピン配列は、ｃＤＮＡ鎖の遊離末端で連結され、新たなＤＮＡ鎖の合成のためのプライマーとして使用することができる。
別の実施態様では、本発明は、染色体異常を決定するための方法に関する。「染色体異常」とは、本明細書では、非定型数の染色体または１以上の染色体における構造的異常を意味する。非定型数の染色体は「異数性」と呼ばれる、異数性は、正常な２倍体数より少ないまたは多い染色体を有する状態である。異数性は、個体が１対からいずれか１本の染色体を欠いている（モノソミー）かまたは１対に２本を超える染色体を有する場合に起こる。「トリソミー」は、特定の染色体が通常２本のところ３コピー存在する異数性である。「染色体の構造的異常」とは、本明細書では、例えば、欠失、転座、倍加、環化などの、染色体の一部に影響を及ぼす事象を意味する。
このような染色体異常は、細胞分裂中に、染色体の全体または一部が適切に分離できない場合に起こる。例えば、癌性細胞が発癌へと進行するにつれ、それらの細胞は欠失、転座、染色体全体の増加または減少などの染色体異常を蓄積する。これらの染色体異常は癌表現型の獲得に結びついていると思われ、各癌タイプに特異的である。癌が進行するほど染色体異常の数は増える。従って、このような染色体異常を検出すれば、通常、腫瘍悪性度および患者の予後に関して極めて多くの情報が得られる。
よって、この実施態様では、本発明は、被験体由来の生体サンプルにおいて特定の染色体部分の異常な分布を検出するための方法を提供する。より具体的には、前記方法は、
ａ）上記の方法の１つによって前記特定の染色体部分のレベルを定量する工程、
ｂ）上記の方法の１つによって別の染色体部分のレベルを定量する工程、
ｃ）ａ）で得られたレベルとｂ）で得られたレベルの間の比を計算する工程、および
ｄ）前記特定の染色体部分が異常な分布を示すかどうかを決定する工程
を含んでなる。
上記で説明したように、癌細胞は、発癌の種々のステージへ進行するにつれ、染色体異常を蓄積する。従って、腫瘍細胞における染色体の異常な分布の検出は前記腫瘍の悪性度の指標となり、染色体部分の異常な分布が多いほど、腫瘍の悪性度が高い。
よって、好ましい実施態様によれば、本発明の主題は、癌患者である。この実施態様では、本発明は、癌患者の癌サンプルにおいて癌の悪性度を診断するための方法であって、
ａ）前記患者の癌サンプルにおいて第１の特定の染色体部分のレベルを定量する工程、
ｂ）前記患者の癌サンプルにおいて第２の染色体部分のレベルを定量する工程、
ｃ）ａ）で得られたレベルとｂ）で得られたレベルの間の比を計算する工程、
ｄ）前記特定の染色体部分が異常な分布を示すかどうかを決定する工程、および
ｅ）前記染色体部分が異常な分布を示す場合に悪性度を診断する工程
を含んでなる方法を提供する。
本発明によれば、「染色体部分」とは、染色体全体または染色体の有意な断片を意味する。例えば、軽度ダウン症候群は、部分的トリソミー２１ｑ２２．２→ｑｔｅｒに関連している。よって、本発明は、異常な分布の疑いのある染色体部分（工程ａの染色体部分）を定量し、この定量値を参照染色体部分の定量値と比較するための方法を提供する。よって、本発明によれば、「参照染色体部分」とは、異常な分布を示さないことが知られている染色体部分である。本発明の好ましい実施態様では、工程ｂ）の染色体部分は、参照染色体部分である。
当然のことながら、工程ａ）およびｂ）の染色体部分を定量するための配列は、対応する染色体部分に特異的であるように選択されることが重要である。当業者ならば、必要な情報はＧｅｎｂａｎｋなどの公開配列データベースから得ることができることが容易に理解できるであろう。
二本鎖核酸分子の集団は有利には、まず、染色体をレアカッター制限酵素により消化することによって得られる。当業者に知られているように、レアカッター制限酵素は、ゲノムに稀にしか存在しない認識配列、例えば、７または８塩基を含んでなる認識配列を有する制限酵素である。このようなレアカッター酵素の例としては、ＳｆｉＩ、Ｘｍａ Ｉ、Ａｓｃ Ｉ、ＡｓｉＳ Ｉ（イソ制限酵素Ｓｇｆ Ｉ）、Ｎｏｔ Ｉ（イソ制限酵素ＣｃＮ Ｉ）、Ｓｂｆ Ｉ（イソ制限酵素Ｓｓｅ８３８７ Ｉ、Ｓｄａ Ｉ）、Ｆｓｅ Ｉ、Ｐａｃ Ｉなどが挙げられる。これらの酵素は総て市販されている。第２段階において、このようにして得られた制限断片をＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩなどの通常の６塩基制限酵素で消化する。次に、得られた直鎖二本鎖断片をヘアピンへ変換することができる。二本鎖の遊離末端を互いに連結させる技術は公知であり、いくつかを以下にさらに詳しく記載する。
胎児の異数性は通常、親の生殖細胞系の減数分裂中の染色体の分離不全の結果である。胎児異数性は他の出生血管ほど多くはなく、１０００件の出産のうち９件に影響を及ぼすが、その検出は相当な技術的挑戦となる。
母胎の血液は、遊離した母胎のＤＮＡと遊離した胎児のＤＮＡを含有し、前記の胎児ＤＮＡは細胞死、剪断などの結果として最後は血液となる(Herzenberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 1453-1455, 1979; Bianchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3279-3283, 1990)。無細胞胎児ＤＮＡは、母胎の血漿中に存在するＤＮＡの３〜６％に過ぎないことが知られている(Lo et al., Am J Hum Genet, 62: 768-775, 1998)。母胎の血液から胎児の異数性を診断するための方法は記載されているが、これらの方法は、遺伝物質の増幅の工程またはショットガンシーケンシング（事前にＰＣＲに基づく富化を伴う方法）の使用を必要とし(Lo, BJOG, 116: 152-157, 2009; Fan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105(42): 16266-16271, 2008; Chiu et al., BMJ, 342: c7401, 2011 doi: 10.1 136/bmj.c7401)、従って、全体的バイアスを生じやすい。
別の好ましい実施態様では、前記対象は妊婦である。この実施態様によれば、本発明は、前記妊婦の血液サンプルから胎児の異数性を診断するための方法であって、
ａ）前記血液サンプルにおいて第１の特定の染色体部分のレベルを定量する工程、
ｂ）前記血液サンプルにおいて第２の染色体部分のレベルを定量する工程、
ｃ）ａ）で得られたレベルとｂ）で得られたレベルの間の比を計算する工程、
ｄ）前記特定の染色体部分が異常な分布を示すかどうかを決定する工程、および
ｅ）前記染色体部分が異常な分布を示す場合に胎児の異数性を診断する工程
を含んでなる方法を提供する。
好ましくは、前記特定の染色体部分は、胎児において異常な分布染色体部分である。有利には、第２の染色体部分は、参照染色体部分、すなわち、異常な分布によって影響を受けていない染色体部分であり、従って、前記第２の染色体部分は、好ましくは胎児細胞において二染色体性である。
本発明の方法によって決定可能な好ましい胎児染色体異数性および随伴する疾患または障害としては、ターナー症候群（性染色体モノソミー）、クラインフェルター症候群（ＸＸＹ性染色体）、トリプル−Ｘ症候群（ＸＸＸ性染色体）、ダウン症候群（トリソミー２１）、エドワーズ症候群（トリソミー１８）またはパトウ症候群（トリソミー１３）が含まれる。片親性ダイソミーは、第１５染色体に関してプラダー・ウィリー症候群として知られる。このような片親性ダイソミーを検出する場合、ＤＮＡはまた、それが母方遺伝のもの父方遺伝のものか識別する方法で分析しなければならない。本明細書で使用する場合、不平衡転座とは、好ましくは、不平衡ロバートソントリソミーｒｏｂ（１３ｑ；１４ｑ）を包含する。本発明の方法によって好ましく決定できる他の構造異常としては、４ｑ−欠失（ヴルフ・ヒルシュホルン症候群）、５ｑ−欠失（猫鳴き症候群(cri du chat syndrome))
または微小欠失症候群、特に、１７ｑ１１．２欠失（スミス・マゲニス症候群）または２２ｑ１１．２欠失（ディジョージ症候群）が含まれる。
好ましい実施態様では、工程ａ）およびｂ）で用いる配列は、胎児ＤＮＡに特異的な配列である。例えば、前記配列は、父親から受け継がれた対立遺伝子に相当する。別の実施態様では、いずれの配列も胎児または母胎ＤＮＡに特異的でない。しかしながら、血中に存在するＤＮＡの１０％は胎児起源であるので、トリソミーのために工程ｃ）の比率が１．０５とあるはずである。各染色体について平均２×１０４配列（そのうち約２×１０３配列胎児起源と考えられる）に相当する約１００万個のビーズがプロービングされなければならない（サンプルのスキャンによる）。予想される統計（計数）エラーは約１％であり、診断のために十分大きいＳ／Ｎが見込める。
本発明の方法の実施は、特に、単一分子のレベルでリアルタイム核酸互作用をプロービングするように設計されたデバイスの存在によって可能となった。このようなデバイスは、例えば、米国特許第７，０５２，６５０号および同第７，２４４，３９１合に記載されている。本明細書に記載の装置では、ミクロンサイズの超常磁性ビーズにピコニュートン規模の力をかけるために磁気トラップを使用する。簡単に述べれば、前記装置は、光学顕微鏡、磁石およびＰＣを含んでなる。二本鎖核酸分子の一方の末端が静止部材、例えば、表面に複数の点で固定され、他方の末端は可動表面、この場合には磁性ビーズに固定される。このビーズに作用する磁石を設ける。特に、これらの磁石は前記表面からビーズを引き離すために使用することができる。しかしながら、本発明の方法の実施は、上記の装置に限定されない。本発明の方法を実施するためには、一分子の二本鎖核酸を完全に伸長し、次いでリフォールディングし、同時に前記分子の伸長をモニタリングすることを可能とするいずれのデバイスも使用可能である。例えば、光ピンセットが使用可能であるが、それらは事前の力の較正を必要とし、ハイスループット測定のための並列化が容易ではない。さらなる欠点は、核酸の全体的なねじれの制御ができないこと、および集束レーザーにより溶液が局所的に加熱される可能性があり、ハイブリダイゼーション条件を変化させるおそれがあることである。
二本鎖核酸を、その一方の標識（例えば、ビオチン）末端で結合する適当なビーズ（例えば、ストレプトアビジンでコーティングされたもの）の溶液中で数分間インキュベートする。これらのビーズは、後に光ピンセットが操作に使用される場合には透明であり得、または磁気トラップもしくは磁気ピンセットを操作に使用する場合には磁性であり得る。
ビーズ−核酸アセンブリは流体チャンバー中に注入され、その流体チャンバーの表面は、分子の他方の標識末端と結合するような処理が施されている（例えば、核酸のＤｉｇ標識末端と結合するように抗Ｄｉｇでコーティングされた表面）。従って、これらのビーズは、核酸ヘアピンを介して表面に固定される（図１ａ参照）。次に、前記ビーズと前記表面の距離が当業者に公知の様々な手段でモニタリングされるが、例えば、カメラでのそれらの画像の回折リングを用いてそれらの距離を導き出すこともできるし、またはエバネッセントモードで照射を行う場合には、それらが散乱する（もしくは蛍光により発する）光強度を用いてそれらの距離を測定することができる。あるいは、それらが生じる磁場を測定して（ＧＭＲまたはＨａｌｌセンサなどの磁気センサを使用）、固定表面上のセンサまでのそれらの距離を導き出すことができる。
ビーズを固定する核酸分子を表面に引き寄せるため、種々の技術が記載されている。集束レーザービームの光を用いれば、焦点付近の透明ビーズを捕捉することができる。固定表面に対する光線の相対的並進により、つなぎ止めている分子に力をかけることができる（典型的な光ピンセットアッセイ）。かけられている力はその平衡位置からのビーズの移動に比例し、つなぎ止めている分子に一定の力をかけるには、トラッピングビームにフィードバックループを必要とする。
ビーズに一定の力をかけるためには、ビーズ周囲の流れによって生じる流体力学的抵抗の使用が記載されているが、通常、それから得られる空間精度は低い（＞１００ｎｍ）。好ましい実施態様は、上記のように、核酸ヘアピンによって表面に固定された超常磁性ビーズを引き寄せるために磁気トラップを使用する。この構成では、サンプル上に配置した小さな磁石を用いて、固定されたビーズに一定の力をかけるが、その位置は＜１ｎｍの精度で決定することができる（引張力および流体力学的抵抗による散逸による）。
どの場合においても、つなぎ止めているヘアピンが約１６ｐＮより大きな力でビーズを引き寄せることによって機械的に完全に開くことができることを注記しておく。分子にかける張力を約１１ｐＮより小さくすると、ヘアピンに自発的に再閉させることができる（開状態の移行はヒステリシス的ではあるが可逆的である）。もし、開状態の際に、伸長した一本鎖核酸に、溶液中の一部の分子（例えば、タンパク質、またはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡもしくはＰＮＡの相補的オリゴヌクレオチド）が結合していれば、力が１１ｐＮよりも小さくなった場合に、これらの分子はヘアピンの再閉を遮断する。従って、このアッセイの原理は２つの力の間の切り替えであり、大きい方のＦｏｐｅｎはヘアピンを開き、小さい方のＦｔｅｓｔは、再閉させ、一時的遮断の際の分子の伸長を測定するために用いられる。遮断位置は、完全伸長と遮断状態の間の直線関係により、配列に関連づける。精度を最も良くするためには、完全伸長は、好ましくは、テスト張力Ｆｔｅｓｔで測定する。これは、力がＦｏｐｅｎからＦｔｅｓｔへと小さくなったところで、一瞬でリフォールディングされるようにヘアピンループを設計することによって達成される。
核酸を表面または支持体に結合させるためには、当技術分野で公知のいずれの技術を用いてもよい。本質的に、核酸は、例えばマイクロビーズなどの支持体に直接的に固定され、支持体は、例えば核酸の官能基化末端と反応することができるストレプトアビジン、ＣＯＯＨ基などでコーティングすることによるなど、この表面の官能基化を含む。
このような方法では一般に、核酸の、特に３’および５’末端の官能基化、すなわち、適当な化学基をそれらにグラフトすることが必要となる。さらに、操作の終了時に鎖が解離するのを防ぎ、適切な場合、後者を繰り返すことができるように、分子の他の２つの遊離末端をループにより連結することが好ましい。この目的で、様々な手順を採用することができる。
最も単純なのは、合成オリゴヌクレオチドを用いて二本鎖核酸の一方の末端を２種類の異なる官能基（例えば、ビオチンとアミン）で官能基化することであり、これにより２つの異なる前処理面への固定が可能となる。この２本の鎖の他方の末端は、部分的に対合したループの形態の合成ヌクレオチドを用いて連結することができる。このようにして、対合した一本鎖核酸、すなわちヘアピンが二本鎖核酸から生成される。この方法の利点は、大きな核酸断片の異種集団（遺伝子または染色体の分画で得られるような）を官能基化し、次に同時に分析できる能力にある。この場合、核酸サンプルは２種類の（またはそれを越える）制限酵素を用いて分画され、その酵素は、断片全体は類似している、その末端に２種類の異なる制限部位を有する部分集団を得ることを可能にする。これにより、二末端に異なる処理を施すことができる（例えば、一方の末端を、その末端に適当な制限部位を有するループの形態のオリゴヌクレオチドに連結することによる）。この方法の欠点は２つの隣接する官能基間の立体的障害にあり、これにより表面への結合が困難となる場合がある。この問題を解決するために、ヘアピン分子の各遊離末端に塩基の「スペーサー」配列を付加し、次にその末端に官能基を付加し、２つのスペーサー配列は非相補的であり、各官能基に、その専用の表面に結合する十分なスペースを提供することが有利であり得る。さらに有利には、各スペーサー配列の配列が、既知配列の一本鎖シークエンシングプライマーを本発明の配列決定法において使用するために設計される。二本鎖核酸分子へのループおよび／またはスペーサーの付加は、分子生物学で慣用されている任意の方法を用いて行うことができる。これらの方法は当業者に周知であり、従ってここでは詳細に記載する必要はない。
実際の固定技術については、多数あり、それらは高分子（タンパク質、ＤＮＡなど）を市販の前処理表面に固定するための技術から派生したものである。これらの技術の大部分は免疫学的検査のために開発されたものであり、タンパク質（免疫グロブリン）を、タンパク質のカルボキシル（−ＣＯＯＨ）末端またはアミン（−ＮＨ２）末端と反応できる基（−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＯＨなど）を有する表面に連結させる。
核酸の共有結合による固定は、直接的に、分子の５’末端の遊離のリン酸基を介して行うことができ、それは第二級アミン（ストラスブールのＰｏｌｙｌａｂｏにより市販されているＣｏｖａｌｉｎｋ−ＮＨ表面）と反応して共有結合を形成する。また、ＤＮＡをアミン基で官能基化し、次にタンパク質と同様に処理することも可能である。
ストレプトアビジンでコーティングした表面（Ｄｙｎａｌビーズなど）もあり、ストレプトアビジンとビオチン化ＤＮＡ分子との間の擬共有結合的固定を可能にする。最後に、ジゴキシゲニンに対する抗体を表面にグラフトすることにより（上述の方法による）、ジゴキシゲニンで官能基化された核酸がそこに固定され得る。これは多くの潜在的な固定技術の一例にすぎない。
結合および固定技術としては、例えば、欧州特許第１５２８８６号に記載の、セルロースなどの固相支持体へのＤＮＡの結合のために酵素的カップリングを用いる技術も挙げておくべきである。
また、欧州特許第１４６８１５号は、支持体へのＤＮＡの結合の種々の方法を記載している。
同様に、特許出願ＷＯ９２／１６６５９は、ＤＮＡを結合させるためにポリマーを使用する方法を提案している。
当然ながら、核酸は支持体に直接結合させてもよいが、必要であれば、特に表面の作用を限定することを目的に、例えば、欧州特許３２９１９８号に記載されているように、核酸をペプチドまたは他の種の不活性アームの末端に結合させてもよい。
以下の実施例は、本発明のその他の特徴および利点を明らかにすることを明らかにすることを可能にするであろう。
再ハイブリダイゼーションの際のオリゴヌクレオチドにより誘発される遮断の検出。（ａ）ステムに標的を予め導入したヘアピン構築設計、（ｂ）８３ｂｐヘアピンへの２つのオリゴヌクレオチド（配列番号１：5’-ACAGCCAGC-3’、配列番号２：5’-ATGACAATCAG-3’）のハイブリダイゼーションによる障害の例（方法参照）。左のパネル：Ｆｏｐｅｎ＝１７．８ｐＮ（橙）およびＦｔｅｓｔ＝１１．４ｐＮ（青；上の力のトレースを参照）において記録された実験トレース。上から下に、（ｉ）Ｆｏｐｅｎにおいて開いたヘアピン、（ｉｉ）Ｆｔｅｓｔにおいて開いたヘアピン、（ｉｉｉ）第１のオリゴによって遮断された部分的にアニーリングしたヘアピン、（ｉｖ）第２のオリゴによって遮断された部分的にアニーリングしたヘアピンおよび（ｖ）フォールディングされたヘアピンに相当する５つの異なる伸長レベルが見られる。黒い曲線は生データの１秒平均に相当する。右のパネル：遮断（ｉｉ）〜（ｉｖ）のヒストグラム。黒い曲線は、Ｆｔｅｓｔにおける再ハイブリダイゼーション時のヘアピンの所与の伸長における１サイクル当たりの遮断数のヒストグラムを表す：ΔΖ＝Ｚｂｌｏｃｋ−Ｚｃｌｏｓｅ（単一のヘアピンに対して約２３回の力のサイクルから得られた塩基対）。これらのデータに対するガウス関数フィットを赤で示す。これらのフィットの変数（σ〜１ｎｍ）は、装置の分解能を定義する。障害Ｚｂｌｏｃｋ１およびＺｂｌｏｃｋ２はヘアピン上の３９．６０ｂｐおよび２８．６６ｂｐに見られ、予測された位置４０ｂｐおよび２９ｂｐとよく一致していた（緑で示す）。 ハイブリダイゼーションによる配列同定。３つの異なるヘアピン（分子１、２、３として示す）を２つの異なるオリゴ（オリゴ１および２として示す）により同定した（方法参照）。左のパネル：ヘアピン開閉サイクルの間に記録された実験トレース。対応する遮断を示すために、オリゴ１および２を溶液に順次加えたところ、オリゴ１は分子２および３にハイブリダイズし、オリゴ２は分子１および２にハイブリダイズした。右のパネル：各分子上のオリゴ１（橙）および２（青）からの遮断のヒストグラム（分子の完全伸長はグレーの斜線で示す）。 単一のヘアピンによってガラス表面に結合された多数のビーズを示すカメラの視野。これらはブライトレッドＬＥＤからの平行照射を用いた顕微鏡によって可視化する。ビーズ周囲の小さな回折リングを用いてそれらの垂直位置を測定する。 ヘアピン設計を示すスキーム。 ｍＲＮＡからｃＤＮＡヘアピン構造を作製するスキーム。
方法
ＤＮＡヘアピンの構築
短いＤＮＡヘアピン（図１および２では８３ｂｐ、または図２では１７９ｂｐ）を、図４に示されるように、３つの独立した合成オリゴヌクレオチド（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を連結することによって構築した。第一段階で、オリゴＡ−１（配列番号３：5’-ビオチン-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTG GAT TCG CGG GTC TCT-3’）およびオリゴＡ−２（配列番号４：5’-AAC CGT CCT TTA CTT GTC ATG CGC TCT AAT CTC TGG GCA TCT GGC TAT GAT GTT GAT GGA ACT GAC CAA ACG TCG GTG GG-3’）を、ｄＨ２Ｏ中、５分間９５℃に加熱した後に８０℃に急冷し、その後、４℃になるまで１０秒ごとに０．７℃の徐冷を行うことにより、相補的オリゴＡ−３（配列番号５：5’-リン酸化-AGG AAG AGA CCC GCG AAT CCC CCA CCG ACG TTT GGT CAG TT-3’）にアニーリングした。これらのアニーリング産物（部分Ａと表記）をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で精製した。本発明者らは、このアニーリングおよび精製手順を、８３ｂｐヘアピンの中間セクションに相当する、オリゴＢ−１（配列番号６：5’-リン酸化-TCC TGA TTG TCA TCG GCT GGC TGT TCG GTT AGT TTC GAA GAC TT-3’）およびオリゴＢ−２（配列番号７：5’-リン酸化-GCG AAA GTC TTC GAA ACT AAC CGA ACA GCC AGC CGA TGA CAA TC-3’）、または１７９ｂｐヘアピンの中間セクションに相当する、オリゴＢ’−１（配列番号８：5’-リン酸化-TCC TCG TGC GTG AGC GAG CGC GGT CGG TCG GTC GGT AGC GAG CGC GTG CGT GCG TGC GTG GGC TGG CTG GCT GGC TCG GTC GGT CGT GCG TGC GGT CGG TGG CTG GCT AGC GAG CGA GCG AGC GGG CTG GCT GAA GAC TT-3’）およびオリゴＢ’−２（配列番号９：5’-リン酸化-GCG AAA GTC TTC AGC CAG CCC GCT CGC TCG CTC GCT AGC CAG CCA CCG ACC GCA CGC ACG ACC GAC CGA GCC AGC CAG CCA GCC CAC GCA CGC ACG CAC GCG CTC GCT ACC GAC CGA CCG ACC GCG CTC GCT CAC GCA CG-3’）に対して繰り返した。これらのアニーリング産物を部分ＢまたはＢ’またはＢ”と表記する。本発明者らは部分Ａ、部分Ｂ（または部分Ｂ’、Ｂ”）を、ヘアピンのループであるオリゴＣ（配列番号１０：5’-リン酸化-TCG CGC CTG ATC GTC CAC TTT TTT TTT AGT GGA CGA TCA GGC-3’）と、２５℃、１×Ｔ４リガーゼ反応バッファー中で１．５時間、Ｔ４リガーゼ（５Ｕ／μｌ，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて連結し、その後、２０分間６５℃に加熱することによって反応を停止させた。この連結混合物を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩキットを用いて精製した。最後に、３７℃で１５分、１ｍＭジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）を含む１×ＮＥＢ２バッファー中、クレノウ（３→５’エキソ−）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いるフィルイン反応によってジゴキシゲニン標識を付加し、２０分間７５℃に加熱することによって停止させた。このヘアピン産物を再びＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩキットを用いて精製した。
１２４１ｂｐのヘアピン（図２）の作製方法はManosas et al. (Nat. Chem. Biol. 5: 904-912, 2009)に記載されている。
単一分子アッセイ
構築されたヘアピン（一方の末端がジゴキシゲニンで、他方の末端がビオチンで標識されている）を、予め抗ジゴキシゲニンでコーティングされウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で表面保護された顕微鏡フローチャンバーのガラス表面およびストレプトアビジンでコーティングされた１μｍ超常磁性ビーズ（ＤＹＮＡＬ ＭｙＯｎｅ）に結合させた。ビーズと結合した単一のＤＮＡ分子を引き寄せるために小さな磁石を用いた。分子の伸長Ｚ（ｔ）の取得は、３１ＨｚにてＣＣＤカメラを用いて行った。生データは１秒の平均を取り、約１ｎｍの分解能を達成し、一方、伸長力Ｆは１０％の精度で測定する。データ収集の際、本発明者らは、垂直位置トレースＺ（ｔ）から表面に固着した参照ビーズの垂直位置（Ｚｒｅｆ）を差し引き、セットアップドリフトを軽減する助けとする。開／閉サイクルごとに、本発明者らは、閉じたヘアピン（伸長０ｎｍ）の参照値としてのＺｃｌｏｓｅ（Ｆｔｅｓｔ）に対するガウス関数フィットの中心（＜Ｚｃｌｏｓｅ＞）を取る。同様のガウス関数フィットを用いて、１サイクルのＺｏｐｅｎ（Ｆｔｅｓｔ）およびＺｂｌｏｃｋ（Ｆｔｅｓｔ）における平均位置も決定する。エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．を表す。
図２のハイブリダイゼーション同定については、分子１は１２１４ｂｐのヘアピンであり、分子２は８３ｂｐのヘアピンであり、分子３は１７９ｂｐのヘアピンであり、オリゴ１は配列番号１１：5’-GAAGAGACCC-3’であり、オリゴ２は配列番号１２：5’-CAGCCGATGAC-3’である。
結果
ヘアピンの再閉経路における障害の検出
本アプローチでは、ＤＮＡヘアピンの一方の末端をジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）−抗Ｄｉｇ結合を介してカバーガラスに結合させ、他方の末端をビオチン−ストレプトアビジン結合を介して磁性ビーズに結合させる。このＤＮＡヘアピンは種々の方法で作製することができる。例えば、ヘアピンは、ゲノムＤＮＡ断片の一方の末端をＤＮＡループと連結し、その他方の末端を、ビオチンおよびＤｉｇで標識したＤＮＡフォーク構造と連結することによって形成することができる（図１ａ）。あるいは、このヘアピンは、ｍＲＮＡをポリＴコーティングビーズに捕捉して逆転写した後に得られたｃＤＮＡから作製することもできる（図５）。
つなぎ止められたビーズに垂直力をかけるためには、サンプル近傍の小さな磁石を用いる。ビーズと表面の距離（すなわち、ヘアピンの末端から末端までの距離）は、ビーズの画像からリアルタイムで導き出すことができる(Gosse & Croquette, Biophys. J., 82: 3314-3329, 2002)。あるいは、この距離は、エバネッセント場照射を用い、ビーズによって散乱された光の強度から導き出すこともできる。セットアップは光ピンセットを用いて実施するＤＮＡ開放試験(Brower-Toland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 1960-1965, 2002)と同様であるが、磁気捕捉の使用は、多くの分子に同時に同じ力をかけることにより高度の並行化を可能とする(Gosse & Croquette, Biophys. J., 82: 3314-3329, 2002; Strick et al., Science, 271: 1835-1837, 1996)。
本発明者らは、ヘアピンのあるセクションに相補的なオリゴヌクレオチドを含有する溶液中でＤＮＡヘアピンを周期的に開閉させるための力を調整する(Essevaz-Roulet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 11935-11940, 1997)。図１ｂでは、８３ｂｐのヘアピンが周期的に、力Ｆｏｐｅｎ（＞１５ｐＮ）をかけることによってフォールディングが解かれ、力をＦｔｅｓｔ（約１０ｐＮ）に小さくすることによって再閉される。フォールディングが解かれた、または開かれた状態では、溶液中の２つの異なるオリゴヌクレオチドは、ヘアピン上のそれらの個々の相補配列にハイブリダイズすることができる。これらのオリゴヌクレオチドは、小さな力でヘアピンのリフォールディングを一時的に遮断し、これらは、そのリフォールディングの経時的推移の中でヘアピン伸長に２回の停止として容易に観察できる。
この測定スキームは、ヘアピン上の遮断の位置および寿命という２つの価値ある情報を提供する。一塩基対が開くことで、ヘアピン伸長には約０．８５ｎｍの差ができる。従って、本発明者らの装置の現在の分解能（約１ｎｍ）では、本発明者らは、ヌクレオチド約１個の精度で遮断の一を記録することができる。ヘアピンの開状態と閉状態の切り替えにより、緩慢な実験ドリフトに感受しない差次的伸長測定値が得られることに留意されたい。さらに、かけられた力の正確な値は、それが一定を維持する限り、重要でない。
ハイブリッドの安定性に関連する遮断寿命に関して、本発明者らは、それがかけられた張力、相補性オリゴヌクレオチドの大きさ、およびオリゴヌクレオチドとヘアピンの間のミスマッチの存在と場所に依存することを見出した（データは示されていない）。
ハイブリダイゼーションフィンガープリントまたは単回ライゲーションによる配列同定
所与のサンプルにおける目的ＤＮＡの同定は、遺伝子突然変異、遺伝子重複、ｍＲＮＡ発現パターンの検出などの多くの状況で関連する問題である。本スキームを使用すれば、この同定問題は極めて簡単である。本スキームは、ＤＮＡヘアピンサンプル上の、選択され短い（約１０ｎｔ）オリゴヌクレオチドのセットを用いて得られた所与のハイブリダイゼーションフィンガープリントの検出を必要とする。これは、１つまたはいくつかのプローブオリゴヌクレオチドの存在下で、ヘアピンの再ハイブリダイゼーション中の遮断を調べることによって行うことができる。図２に示されるように、３つの異なるＤＮＡ配列の同定は、２つの異なるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって行うことができる。ハイブリッドの正確な位置を検出することができるので、通常行われているように各プローブを順次調べていく必要は無いといことに留意されたい。むしろ、いくつかの選択されたプローブの、ヘアピン上の遮断位置を同定し、このハイブリダイゼーションパターンを、稀なハイブリッドの存在の代わりにＤＮＡ配列のフィンガープリントとして使用することができる。

Claims (21)

  1. サンプルにおいて特定の核酸配列を含んでなる二本鎖核酸分子種を定量するための方法であって、
    ａ）サンプル中の前記二本鎖核酸分子を、前記分子に張力をかけることによって変性させる工程であって、前記二本鎖核酸分子がヘアピンであり、前記二本鎖核酸の一方の鎖の少なくとも１個の塩基が直接的または間接的に支持体に結合され、前記二本鎖核酸の他方の鎖の少なくとも１個の塩基が可動支持体に結合されている、工程；
    ｂ）前記配列に相当する一本鎖核酸分子を準備する工程；
    ｃ）工程ａ）の前記変性二本鎖核酸分子を、前記一本鎖核酸分子の存在下で復元する工程；
    ｄ）復元が遮断された二本鎖核酸分子を検出する工程であって、該検出が、前記二本鎖核酸分子の、支持体に結合されている二末端間の距離（ｚ）を測定することを含んでなる、工程；および
    ｅ）工程ｄ）の二本鎖核酸分子を数える工程
    を含んでなる、方法。
  2. サンプルにおいて１以上の特定の配列を含んでなる二本鎖核酸分子種を定量するための方法であって、
    ａ）サンプル中の前記二本鎖核酸分子を、前記分子に張力をかけることによって変性させる工程であって、前記二本鎖核酸分子がヘアピンであり、前記二本鎖核酸の一方の鎖の少なくとも１個の塩基が直接的または間接的に支持体に結合され、前記二本鎖核酸の他方の鎖の少なくとも１個の塩基が可動支持体に結合されている、工程；
    ｂ）前記１以上の配列に相当する１以上の一本鎖核酸分子を準備する工程；
    ｃ）工程ａ）の前記変性二本鎖核酸分子を、前記一本鎖核酸分子の存在下で復元する工程；
    ｄ）前記１以上の一本鎖核酸分子によって復元が遮断された二本鎖核酸分子を検出する工程であって、該検出が、前記二本鎖核酸分子の、支持体に結合されている二末端間の距離（ｚ）を測定することを含んでなる、工程；および
    ｅ）工程ｄ）の二本鎖核酸分子を数える工程
    を含んでなる、方法。
  3. 前記二本鎖核酸が、工程ａ）において、複数の支持体を引き離すことによって変性される、請求項１または２に記載の方法。
  4. 複数の支持体を引き離すことによって、前記二本鎖分子に１５ｐＮ以上の張力がかけられる、請求項３に記載の方法。
  5. 複数の支持体を引き離すことによって、前記二本鎖分子に１７ｐＮ以上の張力がかけられる、請求項３に記載の方法。
  6. 複数の支持体を引き離すことによって、前記二本鎖分子に１８ｐＮ以上の張力がかけられる、請求項３に記載の方法。
  7. 前記変性二本鎖核酸が、工程ｃ）において、前記複数の支持体を一緒にすることによって復元される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記二本鎖分子にかけられる張力が、前記複数の支持体を一緒にすることによって１２ｐＮ以下に低減される、請求項７に記載の方法。
  9. 前記二本鎖分子にかけられる張力が、前記複数の支持体を一緒にすることによって１１ｐＮ以下に低減される、請求項７に記載の方法。
  10. 前記二本鎖分子にかけられる張力が、前記複数の支持体を一緒にすることによって１０ｐＮ以下に低減される、請求項７に記載の方法。
  11. 工程ａ）〜ｄ）が数回繰り返される（測定値を蓄積し、シグナル／ノイズ比を高めるために）、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記二本鎖核酸分子が変性された際に、前記二本鎖核酸分子の、支持体に結合されている二末端間の距離（ｚｈｉｇｈ）を測定するさらなる工程を含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. ａ）ｚとｚｈｉｇｈを比較する工程、および
    ｂ）遮断の位置を決定する工程
    をさらに含んでなる、請求項１２に記載の方法。
  14. 遮断の持続時間を測定するさらなる工程を含んでなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 遮断の持続時間を参照値と比較するさらなる工程を含んでなる、請求項１４に記載の方法。
  16. サンプルにおいて遺伝子の発現を測定するための方法であって、
    ａ）前記サンプル中に存在するＲＮＡ分子の複製によって二本鎖核酸分子を合成する工程、および
    ｂ）請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法によって前記遺伝子に相当するｍＲＮＡ分子種を定量する工程
    を含んでなる、方法。
  17. 前記二本鎖核酸分子が逆転写によって合成される、請求項１６に記載の方法。
  18. 逆転写が固相支持体に固定されたポリＴオリゴヌクレオチドから開始される、請求項１６または１７に記載の方法。
  19. 被験体由来の生体サンプルにおいて特定の染色体部分の異常な分布を検出するための方法であって、
    ａ）請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法によって前記特定の染色体部分のレベルを定量する工程、
    ｂ）請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法によって別の染色体部分のレベルを定量する工程、
    ｃ）ａ）で得られたレベルとｂ）で得られたレベルの間の比を計算する工程、および
    ｄ）前記特定の染色体部分が異常な分布を示すかどうかを決定する工程
    を含んでなる、方法。
  20. 癌患者の癌サンプルにおいて癌の悪性度の診断を補助するための方法であって、
    ａ）請求項１９に記載の方法に従って、前記患者の癌サンプルにおいて特定の染色体部分が異常な分布を示すかどうかを決定する工程を含んでなり、
    前記染色体部分が異常な分布を示す場合は、前記癌が悪性であることが示される、方法。
  21. 妊婦の血液サンプルから胎児の異数性の診断を補助するための方法であって、
    ａ）請求項１９に記載の方法に従って、前記血液サンプルにおいて特定の染色体部分が異常な分布を示すかどうかを決定する工程を含んでなり、
    前記染色体部分が異常な分布を示す場合は、胎児の異数性の存在が示される、方法。
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2390350A1 (en) 2010-05-27 2011-11-30 Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) Method of DNA sequencing by polymerisation
EP2390351A1 (en) 2010-05-27 2011-11-30 Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) Method of DNA sequencing by hybridisation
CN107771222B (zh) 2015-05-07 2019-06-04 巴黎科学与文学联大-拉丁区 使用力诱导的链侵入原位形成发夹
EP3090803B1 (en) 2015-05-07 2019-08-07 Paris Sciences et Lettres - Quartier Latin Improved device for the analysis of nucleic acid molecules
US20160376584A1 (en) * 2015-06-29 2016-12-29 Genesis DNA Inc. Method and apparatus for dual solid phase nucleic acid synthesis
CN106650310B (zh) * 2017-01-09 2019-01-29 上海集爱遗传与不育诊疗中心 一种鉴别染色体平衡易位携带胚胎和正常胚胎的方法
EP3950957A1 (en) 2017-08-08 2022-02-09 Depixus In vitro isolation and enrichment of nucleic acids using site-specific nucleases
CA3120176A1 (en) 2018-11-16 2020-05-22 Depixus Optimization of in vitro isolation of nucleic acids using site-specific nucleases
IL283866B2 (en) 2018-12-12 2023-02-01 Depixus Nucleic acid enrichment method using site-specific nuclei, which appear by capture
US11555871B2 (en) 2019-12-31 2023-01-17 Industrial Technology Research Institute Method of detecting biological sample
EP4160199A1 (en) 2021-10-04 2023-04-05 Depixus Apparatus for biomolecule analysis with a well and a cavity below the well
CN117385002A (zh) * 2023-09-14 2024-01-12 中山大学 一种基于恒力模式下单分子力谱测量的核酸检测方法

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE48140T1 (de) 1981-04-17 1989-12-15 Univ Yale Modifizierte nukleotide und verfahren zu ihrer herstellung und anwendung.
IL73577A (en) 1983-12-12 1989-10-31 Miles Lab Method and reagent system for detecting dna or rna sequences in a test medium containing single stranded dna or rna using antibodies to intercalation complexes with double stranded nucleic acid
CA1223222A (en) 1984-02-22 1987-06-23 Nanibhushan Dattagupta Immobilized nucleic acid-containing probes
EP0530357B1 (en) 1991-03-21 1995-11-15 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Element and method for nucleic acid amplification and detection using adhered probes
DE69330750T2 (de) 1992-03-04 2002-07-04 Univ California Vergleichende genomhybridisierung
US5457027A (en) 1993-05-05 1995-10-10 Becton, Dickinson And Company Internal controls for isothermal nucleic acid amplification reactions
AT401270B (de) 1994-09-26 1996-07-25 Immuno Ag Verfahren zur quantifizierung von genomischer dna
US5705365A (en) 1995-06-07 1998-01-06 Gen-Probe Incorporated Kits for determining pre-amplification levels of a nucleic acid target sequence from post-amplification levels of product
US5871697A (en) 1995-10-24 1999-02-16 Curagen Corporation Method and apparatus for identifying, classifying, or quantifying DNA sequences in a sample without sequencing
US7244391B2 (en) 1997-03-28 2007-07-17 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Apparatus and method for the manipulation and testing of molecules, and in particular of DNA
US7052650B2 (en) 1997-03-28 2006-05-30 Center National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Apparatus and method for the manipulation and testing of molecules, and in particular of DNA
WO2002031463A2 (en) 2000-08-31 2002-04-18 Motorola, Inc. High density column and row addressable electrode arrays
EP2180064A3 (en) 2000-10-18 2010-08-11 Pharmasset, Inc. Multiplex quantification of nucleic acids in diseased cells
JP2008507952A (ja) * 2004-03-05 2008-03-21 リサーチ ファウンデーション オブ ステイト ユニヴァーシティー オブ ニューヨーク 情報依存性分子モーターとしてのｒｎａポリメラーゼの使用
GB0426188D0 (en) 2004-11-30 2004-12-29 Leuven K U Res & Dev DNA repeats
JP2011036150A (ja) * 2009-08-07 2011-02-24 Olympus Corp 標的核酸分子の定量方法及び標的核酸分子定量キット
EP2390351A1 (en) * 2010-05-27 2011-11-30 Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) Method of DNA sequencing by hybridisation

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