CN107771222B - 使用力诱导的链侵入原位形成发夹 - Google Patents
使用力诱导的链侵入原位形成发夹 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于核酸测序反应的基底的制备方法。更具体地，本发明提供了一种使用力诱导的链侵入制备发夹的新方法。通过该方法制备的发夹和使用这些发夹的核酸分析方法也是本发明的一部分。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于核酸测序反应的基底的制备方法。更具体地，本发明提供了一种在单分子分析过程中使用的发夹的新制备方法。
背景技术
在很多情况下，可用于进行遗传或表观遗传分析的核酸(通常为DNA或RNA)的量有限的。样品类型包括肿瘤活检、人类学标本和法医标本。通常进行扩增以增加起始材料的量。然而，一些主要的缺点与扩增有关。特别地，表观遗传修饰在整个扩增过程中不是保守的。此外，依据同时分析的不同靶标的数量和序列，扩增显示可变的效率。
本发明人之前已经设计出能够确定核酸序列的单分子分析方法(WO2011/147931；WO 2011/147929)，以及一些相关的应用，包括DNA检测和定量(WO2013/093005)，以及蛋白结合核酸的检测(WO 2014/114687)。根据该方法，单核酸发夹通过拉动其端部而变性，例如采用磁镊。将拉力降低到阈值以下可以使发夹复性。然而，如果所述变性的发夹已经与单链寡核苷酸杂交，则至少瞬时地，复性将被阻断。然后可以通过确定阻断的持续时间和/或位置来解释双链分子的序列。
该方法需要产生发夹，其在一末端附着至比如珠的可移动的表面，另一末端附着至另一表面。目前，使用经典的DNA文库构建技术生产DNA发夹。通常，通过取感兴趣的双链核酸分子，并将合成的寡核苷酸附着至每一末端，以产生所需的结构，而获得这样的DNA发夹结构。这通常使用DNA连接酶进行。除了为样品制备增加成本和时间外，本发明人设计的测序方法目的的这种方法的主要缺点是其导致发夹文库的生产，然后必须将其附着至顺磁珠(在反应期间，或者在随后的步骤中)。此外，为了使用磁阱仪器询问(interrogate)分子，珠必须最终通过发夹分子固定到表面(例如流动池的底部)。
在这种方案中，调整发夹与珠的摩尔比变得至关重要。如果使用太多的发夹，则珠密集地被发夹覆盖，并且这能够导致通过多种发夹将珠附着至表面。这是非常不期望的情况，因为单分子分析方法只能在每个珠通过单发夹附着至表面上时进行，因为多于一个附着点阻止随后的变性步骤期间所需的自由的移动。即使对于确实通过一个发夹附着至表面的珠，与珠上其它部分结合的任何样品DNA也将失去分析，因此浪费有价值的样品材料。另一方面，如果使用太少的发夹，则大多数珠根本不会结合到表面，因为它们在流动池中流动时间的期间的结合概率是低的。
实证结果表明，以上讨论方案中发夹与珠的最佳比例在约100：1至1000：1。虽然在大量起始核酸可用的情况下这不是问题，但是在起始材料有限的这种情况下，能够分析样品中高百分比的DNA分子并且无定量或DNA修饰信息的丢失是至关重要的。
因此，仍然需要一种用于制备适于单分子核酸分析的发夹的方法，同时保持定量精确度。
发明内容
发明人现在已经发现了一种用于构建可用作单分子分析模板的发夹结构的新方法。因此，适合于后续分析的核酸发夹可以直接组装而不使用DNA酶(例如连接酶)，并且以这种方式使得可用于分析的DNA分子的数量最大化。
根据本发明的方法，发夹的组装被分成若干不连续的步骤。使用合成的DNA组分进行初始发夹前体生产步骤，并且至关重要地，不需要感兴趣的DNA样品。因此，它可以作为高度控制的过程批量进行，并且在进行分析本身很久之前进行。只有最终的发夹结构需要添加感兴趣的核酸。
本发明首先提供一种已经结合至两种不同表面的接收核酸分子，其可以提前制造和质量检查。这在成本和时间方面是特别有利的。因此，可以鉴定和丢弃低质量的接收分子，而不会浪费任何感兴趣的核酸的珍贵的分子，而现有技术的方法当然不是如此。在本发明的方法中投入核酸的使用是最佳的，导致最小的样品损失和采用低浓度样品工作的能力。
根据本发明，形成核酸，其中两种多核苷酸通过两种互补单链区域A和A'的杂交结合在一起，并且这些多核苷酸中的每种结合到不同的表面。此外，该核酸的两种多核苷酸中的至少一种含有至少一段单链核酸C。该核酸被命名为HP1(“发夹前体1”)，并且用作感兴趣的核酸的着陆架(landing pad)。通过简单地使两种互补单链区域A和A'杂交，可以容易且可靠地形成这种结构。
根据本发明，感兴趣的核酸提供在HP2核酸(“发夹前体2”)中，其中所述感兴趣的核酸是双链分子，其在一个末端结合于环，另一末端结合与HP1结构中相同的两个互补区域A和A'。此外，两个互补区域A和A'中的至少一个连接至一段单链核酸C'，其中C'与C互补。
本发明人惊奇地发现，当所述HP1核酸变性时，在含有感兴趣的核酸的HP2分子的存在下，形成全新的核酸，其中C和C'杂交，以及HP1的A与HP2的A'杂交，和HP1与A'与HP2的A杂交。因此，形成的新的核酸分子是其端部结合到两种不同表面的发夹。所述端部中的一个包含与HP2的A'杂交的HP1的A，而另一个端部包含HP1的连续区域A'和C，其分别与HP2的连续区域A和C'杂交。由该过程得到的发夹的茎包含感兴趣的核酸。因此，形成的发夹的行为与通过现有技术的方法构建的发夹极其相似。特别地，本发明的发夹适于与现有技术的发夹相同的相同种类的单分子分析，并且在相同条件下(参见例如，WO 2011/147931；WO2011/147929；WO 2013/093005；WO 2014/114687)。
在第一个方面，因此本发明涉及一种制备发夹的方法，所述方法包含以下步骤：
a)提供核酸HP1，所述核酸包含：
·与第一表面结合的第一末端；
·连接至所述第一末端的序列A的单链区域，
·与所述单链区域A杂交的序列A'的单链区域，其中所述单链区域A和所述单链区域A'不共价连接；
·与所述序列A'的单链区域连接的至少一个序列C的单链区域；
·与所述序列C的单链区域连接的第二末端，其中所述第二末端结合到第二表面；
b)提供至少一种核酸HP2，所述核酸包含：
·包含感兴趣的序列的双链区域，
·与所述双链区域的第一末端连接的环，
·具有序列A的单链区域，其连接至所述双链区域的第二末端的第一链，所述序列A的区域连接至序列C'的单链区域，C'与C互补；
·具有序列A'的单链多核苷酸，其连接至所述双链多核苷酸分子的第二末端的第二链，其中序列A和序列A'的单链多核苷酸杂交；
c)在步骤b)的所述核酸HP2存在时，使步骤c)的所述核酸HP1变性；和
d)获得发夹。
如本文所用的“发夹”是指包含与环连接的链内配对区域的核酸分子。如本文所用的“环”是指所述核酸的链的连续核苷酸，其不与所述核酸的相同或另一链的核苷酸通过氢键配对。链内配对的区域通常被称为“茎”，并且可以包含至少1个、优选2个、更优选5个、甚至更优选10个、仍更优选20对碱基。
优选地，获得发夹涉及施加物理力，如，例如对HP1的拉力。更优选地，通过拉开HP1的末端来获得所述拉力。
在一个优选的实施方案中，所述结构HP1的序列A的单链区域连接至序列D的单链区域，所述序列D的单链区域与所述第一表面结合。根据该实施方案，结构HP2的序列A'的单链区域连接至具有序列D'的单链区域，其中D'与D互补。根据该实施方案，所形成的发夹包含第一端部和第二端部，所述第一端部包含与HP2的连续区域A'和D'杂交的连续区域A和D，所述第二端部包含分别与HP2的连续区域A和C'杂交的HP1的连续区域A'和C。
不受理论的束缚，可以假设通过在HP1和HP2之间形成Holliday交叉(Hollidayjunction)，然后拆分(resolution)所述交叉获得新的发夹结构。本文使用的“Holliday交叉”是指由两条几乎相同的DNA分子之间的DNA链互为交换而形成的四向DNA交叉。Holliday交叉一般被认为是同源重组的中心中间体。这些中间体的拆分通常需要各种酶(参见例如，Matos&West，DNA Repair(Amst)，19：176-181，2014)。重要的是，不需要任何酶活性来形成或分解本Holliday交叉。这是特别有利的，因为只要拉力高于1pN，它便使得从HP1和HP2核酸形成发夹的过程是不可逆的。此外，即使不存在施加在珠上的拉力，也可以通过产生HP1分子来确保链侵入是不可逆的，其中所述HP1分子包含例如序列A和A'中的一个或多个错配和/或修饰的碱基。
这种错配或修饰的碱基虽然不足以显著地使HP1的两种组分的结合不稳定，但仍将产生一种有力的屏障，一旦经过该区域，这将阻止相反方向进行的链侵入过程。
形成Holliday交叉的第一步是通过单链侵入双链核酸分子。本发明人已经发现，通过HP1的部分变性诱导HP2对HP1的链侵入。“变性”，本文是指当双链核酸分子的链之间的大多数氢键断裂时发生的所述双链核酸分子的链分离过程。变性过程产生变性的核酸分子，其在本文中是指由双链核酸分子变性产生的两个分离的互补链。变性可以是部分的，即，两条链之间的一些氢键保持完整，或是全部的，其中所有的所述氢键均断裂。“复性”，本文是指两条分离的互补链通过杂交重新形成双螺旋的过程。如本文所用的“杂交”是在两种或多种互补核酸链之间建立非共价的、序列特异性的相互作用成为单个杂交体的过程。
技术人员已知存在使核酸变性的若干种可能性。以最优选的方式，通过将它们经受如例如拉力的物理力来分离两条链。例如，所述双链核酸的游离末端可以被拉开，因此使配对碱基之间的所有键断裂，并打开双链核酸。该实施方案是特别有利的，因为本发明人已经发现在HP1结构上施加小的拉力导致其部分变性，因此诱导HP2的链侵入。
本文所用的“核酸”是指含有通过3'-5'-磷酸二酯键连接的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的单链或双链线性多核苷酸。本发明的核酸特别可以是天然的或修饰的DNA或RNA分子。本文所用的术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”是指由脱氧核糖核苷酸组成的聚合物。本文所用的术语“核糖核酸”和“RNA”是指由核糖核苷酸组成的聚合物。所述单链核酸还可以由修饰的核苷酸制成，如2,6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)、5-甲基dC、锁核酸(LNA)(其是核糖部分采用额外的桥连接2'氧和4'碳而得以修饰的核苷酸)、或者未锁核酸(UNA)，其是在核糖环中没有C2'-C3'键的无环RNA类似物。所述单链核酸还可以包含肽核酸(PNA)，其主链(backbone)由通过肽键连接的重复的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元组成。
根据本发明的核酸可以是双链和/或单链的。双链核酸包含通过氢键以反平行方向配对的两条链，其中一条链上的碱基序列与另一条链上的碱基序列互补。大多数情况下，双链核酸是DNA，但是应当理解，本发明也适合用于完全配对或不完全配对的单链DNA-单链DNA双链体，或者适合用于完全配对或不完全配对的单链DNA-单链RNA双链体，或者适合用于完全配对或不完全配对的单链RNA-单链RNA双链体。此外，双链体可以由来自不同起源的样品获得的两条单链的至少部分重新配对组成。最后，本发明也适合用于单独的单链DNA或单独的单链RNA的二级结构。本发明的单链核酸特别可以是天然的或修饰的DNA或RNA分子。
在一个优选的实施方案中，本发明的核酸含有两个区域，双链区域和单链区域。换言之，在该实施方案中，核酸的一些区域与双链体中它们的互补序列特异性配对，而其它区域不杂交。因此，这样的单链区域与具有互补区域的多核苷酸自由杂交。特别地，如果HP1部分变性，则核酸HP2的单链区域可以与HP1中存在的互补区域自由杂交。
在典型的结构中，核酸HP1特异性地锚定在两种固体表面上(例如显微镜玻片、微量移液管、微粒)，其中一个可以移动。换言之，其中一末端直接地或间接地附着至表面，而另一末端直接地或间接地附着至可移动的表面。在该实施方案中，当表面移开时，拉力被施加在HP1分子的两个末端。当拉力高于阈值时，HP1的双链区域的两条链被分离，并且核酸分子至少部分变性，因此，使得HP2的单链区域发生链侵入。所施加的拉力优选高于或等于3pN；更优选高于或等于4pN；甚至更优选高于或等于5pN；在非常优选的方面，其高于或等于6pN。在优选的实施方案中，施加的拉力不足以完全变性HP1。根据该实施方案，施加的拉力优选低于或等于11pN；更优选低于或等于10pN；甚至更优选低于或等于9pN；在非常优选的方面，其低于或等于8pN。该力可以随着温度、核苷酸类型和缓冲液而变化，但本领域技术人员将容易地根据这些参数调整所述力，以获得两条链的部分分离。
在一个优选的实施方案中，HP1核酸分子在一个末端的多个点锚定至静止元件，例如，一种表面，另一末端锚定至可移动的表面，在这种情况下是磁珠。提供磁体作用于珠上。特别地，磁体可以用于将珠从表面拉开。然而，本发明的方法的实现不限于上述装置。允许完全延伸然后重新折叠双链核酸分子，同时在同时监测所述分子的延长的任何装置可用于实施本发明的方法。例如，可以使用声学或光学镊；然而，它们需要事先进行力的校准(calibration)，并且不容易同时用于高通量测量。光学镊的其它的缺点是缺乏核酸的总扭转对照，以及通过聚焦激光可能局部加热溶液，这可能改变杂交条件。
本领域技术人员显而易见的是，可以提前制备HP1分子。例如，在第一步骤中，可以通过常规的分子生物学技术制备第一核酸分子和第二核酸分子，其中所述第一核酸分子包含序列A的单链区域，所述第二核酸分子包含序列A'的单链区域和至少一个序列C的单链区域，所述序列C的单链区域连接至所述序列A'的单链区域，其中A、A'和C是如上所定义的。然后使互补区域A和A'杂交。在另一个步骤中，HP1的两个末端结合至两个表面，在其上可移动(例如，采用声学、光学或磁性镊)。该结合步骤和杂交步骤可以以任何顺序进行，尽管优选的是使序列A和A'形成双链体，之后在核酸分子的末端结合至表面。序列A和A'可以是任何长度，条件是它们足够长以将HP1的两个多核苷酸保持在一起，而不需要形成共价键。优选地，所述序列各自包含至少30个、更优选35个、甚至更优选40个、仍更优选45个核苷酸。组合区域A'和C和/或组合区域A和D应足够长以抵抗通过拉动发夹的末端产生的最大剪切力。特别地，序列C和C'各自包含至少10个、更优选12个、甚至更优选13个、仍更优选14个、最优选15个核苷酸。同样地，序列D和序列D'各自包含至少8个、更优选10个、甚至更优选11个、仍更优选12个、最优选13个核苷酸。
将核酸HP1在充足的珠(例如链霉亲和素包被的珠)的溶液中孵育数分钟，通过所述核酸HP1标记的(例如生物素)末端之一与珠结合。如果光学镊随后用于操作，珠可以是透明的，或者，如果使用磁阱或镊进行操作，珠可以是磁性的。使用声学珠，关于珠的性质没有限制。
将珠-核酸组件注入到表面已经被处理的流体室中，以便结合分子的另一个标记的末端(例如，采用抗Dig抗体包被的表面，以结合核酸的Dig标记的末端)。因此，珠通过HP1的分子锚定到表面。然后通过本领域技术人员已知的各种手段来监测珠到表面的距离：例如，相机上的它们的图像的衍射环可用于推导出它们的距离，或者当以衰减模式(evanescent mode)照射时，它们散射(或通过荧光发射)的光强度，可用于测量它们的距离。或者，可以测量它们产生的磁场(使用如GMR或霍尔传感器(Hall sensors)的磁传感器)来推导出它们与锚定表面上的传感器的距离。
将锚定珠的核酸分子拉动至表面，已经描述了各种技术。可以使用聚焦激光束的光来捕获焦点附近的透明的珠。通过相对于锚定表面的束的相对平移(translation)，可以在束缚的分子上施加力(典型的光学镊测定)。施加的力与珠距离其平衡位置的位移成比例，在束缚分子上施加恒定的力需要在捕获束上的反馈回路。
为了在珠上施加恒定的力，已经描述了使用通过围绕珠的流动产生的流体动力阻力，但是通常产生低的空间精确度(>100nm)。如上所述的，优选的实施方案是使用磁阱拉动通过核酸发夹锚定至表面的超顺磁珠。在这种结构中，使用放置在样品上方的小磁体在锚定的珠上施加恒定的力，锚定的珠的位置可以以<1nm的精确度确定(依据拉力和由于流体动力阻力引起的耗散)。
为了将核酸附着至表面或支持物上，可以使用本领域已知的任一技术。基本上，核酸直接锚定至支持物上，例如微珠，其涉及该表面的官能化，例如通过采用链霉亲和素、COOH基团等包被，其能够与官能化的核酸末端的反应。
这种方法通常需要使核酸，特别是3'末端和5'末端官能化，也就是将合适的化学基团接枝到它们之上。为此，可采用不同的程序。最简单的是使用合成的寡核苷酸官能化，HP1的每个末端采用两种不同的功能，这允许锚定到两种不同的预处理表面。这样可以对两末端进行不同的处理。例如，可以使用在其5'末端含有生物素的第一合成寡核苷酸来获得第一适配体，然后将其连接到HP1分子的第一末端，因此能够与链霉亲和素包被的表面偶联。同样地，可以使用第二合成寡核苷酸来获得第二适配体，所述适配体含有地高辛标记的核苷酸。然后可以将第二适配体连接到HP1分子的第二末端，因此使得能够偶联到抗Dig抗体偶联表面。有利地，所述抗Dig抗体偶联表面不同于链霉亲和素包被的表面。优选地，珠已经采用链霉亲和素包被，而所述抗Dig抗体偶联表面是在其中注入有珠-核酸复合物的流体室的表面。因此，所得到的HP1分子通过第一末端锚定到珠，并通过另一末端锚定到流动池。该方法的优点在于其能够在生产HP2前体文库期间，单独使大核酸片段的异质群(如通过分馏基因或染色体获得的)官能化。然后这些可以同时进行分析。
这种方法的缺点在于两个相邻的官能团之间的空间干扰，这使得与表面的偶联变得困难。为了解决这个问题，有利的是在发夹分子的每个游离末端添加碱基的“间隔”序列，然后在末端添加官能团；两个间隔序列是非互补的，为每个官能团提供足够的空间来结合其专用表面。此外，所述间隔用于保持核酸进一步远离珠或流动池的表面，因此使静电排斥最小化。更有利地，设计每个间隔序列的序列，以便在本发明的测序方法中使用已知序列的单链测序引物。这些间隔可以是单链或双链或两者的混合物。双链间隔是优选的，因为它们更刚性，这有助于保持发夹远离表面。此外，如果在长双链核酸中出现缺口(即，磷酸二酯骨架中的断裂)，可以保留发夹的功能性，即，这样的缺口的发夹仍可用于以前由发明人开发的方法中的分析目的(参见例如，WO 2011/147931；WO 2011/147929；WO 2013/093005；WO2014/114687)。制备这种间隔并将其添加到HP1中的方法是本领域技术人员所熟知的，因此在此不再赘述。
关于实际的锚定技术，有许多这些技术，它们衍生自将大分子(蛋白、DNA等)锚定在商业可获得的预处理表面上的技术。大多数这些技术已经被开发用于免疫学测试，并且将蛋白(免疫球蛋白)与携带能够与蛋白的羧基(--COOH)或胺(--NH2)末端反应的基团(--COOH、--NH2、--OH等)的表面连接。
核酸的共价锚定可以直接通过分子的5'末端的游离磷酸盐(phosphate)完成，其与仲胺(由Polylabo在Strasbourg销售的Covalink--NH表面)反应形成共价键。也可以采用胺基官能化DNA，然后与蛋白同样的进行。
还采用链霉亲和素(Dynal珠等)包被的表面，其允许链霉亲和素与生物素化的DNA分子之间的准共价(quasi-covalent)锚定。最后，通过针对地高辛的抗体接枝到表面上(通过上述方法)，可以将采用地高辛官能化的核酸锚定在其上。这仅表示许多可能的锚定技术的样品(参见例如，Janissen等人，Nucleic Acids Res.42(18)：e13，2014)。
在附着和锚定技术中，还应当提及例如专利EP 152 886中描述的技术，其使用酶偶联将DNA附着至固体支持物如纤维素上。
专利EP 146 815还描述了将DNA附着至支持物上的各种方法。
类似地，专利申请WO 92/16659提出了使用聚合物附着DNA的方法。
自然地，核酸可以直接附着至支持物上，但是在必要时特别是为了限制表面的影响，核酸可以在肽的惰性臂或其它性质的末端附着，例如专利EP 329 198所描述的。
用于本发明的基底或支持物包括但不限于乳胶珠、葡聚糖珠、聚苯乙烯表面、聚丙烯表面、聚丙烯酰胺凝胶、金表面、玻璃表面和硅片。在某些实施方案中，固体支持物可以包括已经被官能化的惰性基底或基质，例如通过施加中间体材料的层或涂层，中间体材料包括允许共价附着至分子如多核苷酸的反应基团。
在一个优选的实施方案中，用于本发明的基底能够在不连续的位置附着若干独立的HP1分子，以便允许通过本发明的方法同时构建大量发夹，因此，能够同时分析大量的核酸分子。因此，根据该实施方案，可以将多于一种HP1分子，例如至少两种或三种或四种或更多种HP1分子接枝到固体支持物上。例如，有利地，将HP1分子结合到微阵列的每个孔的表面。以这种方式，感兴趣的核酸序列文库可用于本发明的方法中，其中HP1分子与表面结合以制备发夹的文库。这种发夹的文库(其中每种发夹含有特定的核酸序列)适合用于通常在有序阵列如微阵列上进行的应用。通过非限制性示例，这种应用包括杂交分析、基因表达分析、蛋白结合分析、测序、基因分型、核酸甲基化分析等(WO 2011/147931；WO 2011/147929；WO 2013/093005；WO 2014/114687)。在用于下游应用如例如与RNA杂交或使用蛋白的结合研究之前，集群的(clustered)阵列可以被测序。
普通的分子生物学技术可用于通过将环连接至感兴趣的核酸来制备HP2分子。同样地，感兴趣的核酸的另一个端部可以仅使用通常的分子生物学方法连接至区域A和A'。例如，可以合成包含区域A和C'的寡核苷酸，并与另一寡核苷酸杂交，所述其它寡核苷酸具有序列A'。这导致具有单链突出部分(overhang)的双链多核苷酸。然后可以将所述多核苷酸连接至感兴趣的核酸。
根据本发明的感兴趣的核酸可以是任何类型的核酸。感兴趣的核酸可以是合成的或衍生自天然存在的来源，或者可以包括合成的和天然的序列；并且可以包括PCR产物。在该特定实施方案中，所述感兴趣的核酸是单一种类的核酸，即所述核酸的所有分子是相同的。在这种情况下，HP2的所有分子将是相同的，因此通过本发明的方法制备的所有发夹将同样是相同的。
在另一个实施方案中，感兴趣的核酸表示双链核酸分子的群。在这种情况下，例如当使用核酸序列文库(如，例如基因组文库或表达文库)来制备HP2分子时。这产生HP2分子的群，其中每种分子与其它分子不同，因此采用本发明的方法产生独特的发夹的群，其可以通过发明人设计的方法直接分析或测序(WO 2011/147931；WO 2011/147929；WO 2013/093005；WO 2014/114687)。根据该实施方案，感兴趣的核酸分子例如从含有各种其它组分如蛋白、脂质和非模板核酸的生物样品中分离。“生物样品”可以是可以含有生物有机体(如，例如细菌、病毒、植物、酵母等)的任何样品。根据本发明的“生物样品”还指可以从生物有机体获得的样品，如从细菌、病毒、植物、酵母等获得的细胞提取物。感兴趣的核酸的分子可以直接从有机体或从有机体获得的生物样品获得，例如，从血液、尿液、脑脊液、精液、唾液、痰、粪便和组织。任何组织或体液标本可用作在本发明中使用的核酸的来源。感兴趣的核酸的分子也可以从培养的细胞分离，如原代细胞培养物或细胞系。获得模板核酸的细胞或组织可以采用病毒或其它细胞内病原体进行感染。样品也可以是从生物标本、cDNA文库、病毒或基因组DNA提取的总RNA。从生物样品获得的核酸通常被片段化以产生用于分析的合适的片段。在一个实施方案中，来自生物样品的核酸通过声波降解法(sonication)片段化。可以如US 2002/0190663中描述的获得感兴趣的核酸的分子。一般地，核酸可以通过各种技术如Maniatis等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，N.Y.，第280-281页(1982)所描述的那些从生物样品中提取。一般地，个体核酸模板分子可以是约1碱基至约20kb。然后将这些个体分子用于制备如上所述的HP2分子。因此，在该实施方案中，本发明的方法包含使用多种不同的HP2。
在另一方面，本发明提供了用于上述方法的HP1和HP2分子。
本发明还提供了通过本发明的方法获得的发夹。所述发夹包含：
·与第一表面结合的第一末端，
·与所述第一末端连接的第一双链区域，其中所述第一双链区域包括包含区域A的第一链，和包含区域A'的第二链，其中A和A'杂交；
·与所述第一双链区域连接的茎-环区域，其中所述茎包含感兴趣的核酸；
·连接到所述茎-环区域的第二双链区域，其中所述第二双链区域包括包含区域A和区域C'的第一链，和包含区域A'和区域C的第二链，其中区域A和C'分别与区域A'和C杂交；
·与所述第二双链区域连接的第二末端，其中所述第二末端与第二表面结合。
在一个优选的实施方案中，所述第一双链区域包括包含区域A和区域D的第一链，和包含区域A'和区域D'的第二链，其中区域A和D分别与区域A'和D'杂交。
在另一个优选实施方案中，如上所述的，其中一个表面是可移动的表面。
本发明的发夹包含双链茎和不配对的单链环。在发夹中，在环中未占用(engage)的两条链的末端是游离的，因此可以被拉开。这导致双链核酸茎的未配对，因此产生变性的双链核酸分子。通过以高于阈值的力拉动所述核酸分子的每一末端，可以完全打开发夹双链核酸分子。当施加到分子的拉力降低至中间值时，核酸分子自我重新杂交化(self-rehybridise)以重新形成发夹。
在这方面，对环序列和长度进行设计是有利的，使得发夹在短暂瞬时(例如1s)之后重新折叠。在现有技术中已经描述了这种作用的方法，例如，在Woodside等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,103(16):6190-6195,2006)中。当力从打开降低到测试值时，由于单链DNA的弹性(elasticity)，打开的发夹的延长变化。在发夹重新折叠之前的小的延迟，允许使用者以与用于检测阻断状态的力相同的力来确定发夹的延长。
通过本发明的方法形成的发夹可以变性和复性，如通常的发夹结构，并且适合用于所有的图谱(map)和测序实验。例如，如果两个表面中的一个是可移动的表面，则将所述可移动的表面拉离另一表面产生拉力，所述拉力导致发夹分子至少部分变性。事实上，发明人惊奇地发现，与Holliday交叉中发现的互补序列的较短长度相反，互补序列(AC/A'C'和A'/A；或A'C/AC'和A/A')的长度足够长以抵抗表面移动时的剪切力。
因此，在另一个方面，本发明涉及一种感兴趣的核酸的分析方法，所述感兴趣的核酸包含在通过上述任何方法获得的发夹中。
例如，发夹可用于检测感兴趣的核酸。根据该实施方案，当在复性之前将单链核酸分子添加到变性双链核酸中时，重新杂交的阻断表明单链核酸分子的序列与双链核酸分子的序列的至少部分互补。
该单链核酸可以是任何长度的，条件是它足够长以阻断复性过程。优选地，单链核酸的长度将在3至50个核苷酸；更优选地，3至45个核苷酸、3至40个核苷酸、3至35个核苷酸、3至30个核苷酸、3至25个核苷酸，3至20个核苷酸、3至15个核苷酸之间，以及甚至更优选3至12个。本发明的单链核酸特别可以是天然的或修饰的DNA或RNA分子。所述单链核酸还可以由修饰的核苷酸制成，例如2,6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)、5-甲基dC、锁核酸(LNA)(其是核糖部分采用额外的桥连接2'氧和4'碳修饰的核苷酸)，或未锁核酸(UNA)，其是在核糖环中没有C2'-C3'键的无环RNA类似物。所述单链核酸还可以包含肽核酸(PNA)，其中主链(backbone)由通过肽键连接的重复的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元组成。在另一个实施方案中，所述单链核酸还可以在改善结合的oligo(5'或3')末端含有修饰。这些修饰的众所周知的示例包括MGB(小沟结合物)、吖啶(嵌入剂)和ZNA(即拉链DNA，精胺衍生物)。
因此，本发明的方法还涉及一种用于检测所述核酸序列的方法，所述方法包含以下步骤：
a)通过向所述发夹分子施加物理力，使如上所述的发夹分子变性，所述发夹可能包含所述核酸序列；
b)提供单链核酸分子；
c)在所述单链核酸分子存在下使所述发夹分子复性；
d)检测发夹的复性的阻断。
优选地，步骤a)的物理力是拉力，其通过移开支持物而施加。当拉力高于阈值时，双链分离，核酸分子变性。优选地，所施加的拉力高于或等于15pN；更优选高于或等于16pN；甚至更优选高于或等于17pN；在非常优选的方面，其高于或等于18pN。该力可以随着温度、核苷酸类型和缓冲液而变化，但本领域技术人员将容易地根据这些参数调整所述力，以获得双链的分离。另一方面，当拉力降低至最小值以下时，变性的双链核酸的两条链可以重新杂交。为了获得所述两条链的重新杂交，优选地，施加小于或等于12pN的拉力；更优选地，其小于或等于11pN；甚至更优选地，其小于或等于10pN。优选地，所述拉力高于1pN，以防止链侵入的可逆性。或者，当HP1分子包含一个或多个错配时，拉力可以低至0pN，和/或可以在序列A和A'中引入修饰的碱基，其不足以显著地使HP1的两种组分的结合不稳定，但仍将产生一种有力的屏障，一旦经过该区域，这将阻止相反方向进行的链侵入过程。
使用发夹使得这成为可能，即特别是进行配对和取消配对的周期，以及因此提高信号/噪声比。
阻断的确定，本文是指确定与阻断有关的物理参数。这些参数中最有用的是在双链核酸分子上阻断的位置，所述位置对应于单链核酸分子在双链核酸分子上杂交的位置。实际上，本发明人已经发现可以精确地确定出现复性暂停的双链核酸上的位置：发夹的使用为技术人员提供了在变性/复性过程中的任何时间确定发夹的两个游离末端之间的物理距离的手段。
“游离末端”，本文是指一条链的末端，其不与另一条链的端部共价连接；如上解释的，这些游离末端各自结合到不同的表面。特别地，这些表面之一是可移动的，而另一个可以是静止的。因此，技术人员将容易地意识到，为了测量发夹的游离末端之间的距离，可以简单地测量两个表面之间的距离。
当发夹分子完全变性时，这个距离是最大的(Z高(F打开))，因为发夹核酸之后被完全延长；当所述发夹分子完全复性时，它是最小的(Z低(F测试))。有利的是，以相同的力F测试进行所有长度比较，使得单链核酸具有相同的弹性性质。使用环闭合的延迟，技术人员可以测量Z高(F测试)。同样地，可以测量复性过程暂时暂停时，两个游离末端之间的距离：如预期的，该距离z在Z高至Z低之间(所有的z采用F＝F测试测量)。很明显，距离z随着与单链核酸序列互补的序列在发夹分子中的位置而变化。如果所述单链核酸与位于发夹的游离末端附近的序列杂交，则在发夹完全重新形成之前，自我重新杂交过程被阻断；在这种情况下，Z暂停是最小的。另一方面，如果所述单链核酸与未配对的环附近的部分发夹发生杂交，则复性过程将在发夹完全或几乎完全变性的情况下被阻断，在这种情况下，Z暂停是最大的。
可以精确地将双链核酸分子中的物理距离与碱基数目相关联。例如，1nm的距离对应于在10pN力下核酸中由两个核苷酸(1bp)跨越的距离。通过单链核酸的弹性，给出相对于力而言的精确校准。因此，通过简单地测量发夹分子的两个游离末端之间的距离，可以精确地确定复性被阻断的位置。
在一个优选的实施方案中，对所述发夹的复性阻断进行检测，这涉及到如上所述的确定阻断在发夹上的位置。
因此，在一个实施方案中，本发明由一种用于确定核酸序列的方法组成，其中包含待确定序列的发夹分子首先通过施加物理力而变性，然后在单链核酸存在下重新杂交，并且检测重新杂交中阻断的存在。在一个方面，当复性过程被阻断时确定发夹两个末端之间的距离。优选地，当分子完全变性时，确定所述发夹的两个末端之间的距离。甚至更优选地，比较两个距离并确定阻断的位置。
根据该具体实施方案，用于确定核酸序列的方法包含以下步骤：
a)通过移开表面，变性通过上述方法获得的发夹，所述发夹包含所述核酸序列；
b)测量在步骤a)中获得的变性的发夹分子的两个末端之间的距离Z高；
c)将单链核酸分子、引物与步骤a)中获得的所述变性的发夹分子杂交；
d)使步骤c)的所述杂交的单链核酸分子/发夹分子复性；和
e)检测杂交的单链核酸分子/发夹分子的复性的阻断；和
f)确定所述阻断相对于发夹的一个末端的位置，所述确定包含以下步骤：
·测量附着至支持物上的发夹分子的两个末端之间的距离(z)，
·比较z和Z高，和
·确定阻断的位置；
其中所述核酸序列衍生自所述阻断的位置。
在一个具体的实施方案中，对本发明发夹分子中含有的感兴趣的核酸进行测序，这涉及到采用聚合酶来复制所述核酸。例如，聚合酶反应可以在其中一种碱基以非常低的浓度存在的脱氧核苷酸(dNTP)混合物(pool)的存在下进行。在这种情况下，每当聚合酶遇到所述核苷酸的互补时，其暂定直到低浓度核苷酸扩散至位置(Greenleaf和Block，Science，313：801，2006；美国专利号7,556,922)。或者，除了在DNA中发现的正常脱氧核苷酸(dNTP)之外，可以使用双脱氧核苷酸(ddNTP)。并入一个ddNTP导致聚合酶反应停止，因为在所述ddNTP之后不能添加核苷酸。然后可以通过本发明的方法来确定每个暂停或阻断的位置，即通过测量分子的两个游离末端之间的物理距离，因此导致本发明的发夹中含有的核酸序列的鉴定。该方法的其它实施方案可以在WO 2011/147929中找到。
与复性阻断相关的另一个有用的参数是复性被阻断的时间段(本文称为复性的暂停持续时间)。实际上，可以测量重新杂交被阻断的时间段。例如，技术人员可以确定发夹的两个末端之间的距离为如上所定义的z的时间段，即在Z高至Z低的中间值。
因此，在一个具体实施方案中，确定核酸序列的方法包含以下步骤：
·通过对所述发夹施加物理力使包含所述核酸序列的所述发夹分子变性；
·提供单链核酸分子，
·在所述单链核酸分子存在下使发夹分子复性；和
·检测所述发夹的复性的阻断，以及
·确定所述阻断的持续时间。
阻断的持续时间取决于两条序列之间的互补程度。互补性越高，两个分子之间建立的键的数量越多，因此持续时间越长。
在该特定实施方案中，因此，根据本发明的方法可以用于诊断目的。特别地，可以基于观察到单链核酸与感兴趣的序列之间的错配导致短得多的存在的(lived)杂交，从而提供简化的技术。在第一方面，通过上述任何方法，将发夹的复性被单链核酸阻断，并且确定阻断的持续时间。在优选的方面，将该值与参照值进行比较。在另一个优选的方面，参照值对应于通过任何上述方法确定的采用参照单链核酸所观察到的暂停的长度。
在该实施方案中，本发明涉及一种检测特定核酸序列的存在的方法，所述方法包含以下步骤：
a)通过移开表面，变性通过上述方法获得的发夹，所述发夹潜在地包含所述序列；
b)测量在步骤a)中获得的变性的发夹分子的两个末端之间的距离Z高；
c)将单链核酸分子、引物与步骤a)中获得的所述变性的发夹分子杂交；
d)使步骤c)的所述杂交的单链核酸分子/发夹分子复性；和
e)检测杂交的单链核酸分子/发夹分子的复性的阻断；和
f)确定所述阻断相对于发夹的一个末端的位置，所述确定包含以下步骤：
·测量附着至支持物上的发夹分子的两个末端之间的距离(z)，
·比较z和Z高，和
·确定阻断的位置；
g)确定所述阻断的持续时间，
其中所述核酸序列的存在衍生自所述阻断的位置和所述阻断的持续时间。
该方法是特别有用的，因为它能够检测整个核酸分子的群中的单一分子。由于采用本发明的方法获得的单分子分辨率，可以检测携带特定序列的每种分子。因此，本发明使技术人员能够计算携带所述序列的核酸分子的数量。本方法允许在整个核酸分子的群中容易且准确地定量特定核酸序列。
本发明的方法特别适于产生发夹文库，每种发夹包含特定的核酸分子。因此，该方法对于检测感兴趣的序列是特别方便的，例如核酸分子的整个群中(例如在生物样品中)特定的等位基因。在该实施方案中，通过上述方法获得发夹文库，其中所述发夹文库表示核酸的整个群。然后，通过向所述发夹的末端施加拉力，例如通过移开表面，使所述文库的每种发夹变性。提供包含感兴趣的序列的单链核酸分子并使其与变性的发夹分子杂交。然后，在所述单链核酸分子的存在下，通过例如降低施加到末端的拉力来复性发夹。检测到发夹的复性的暂停，并且确定所述暂停的持续时间。根据该实施方案，对于包含其序列与感兴趣序列完全互补的核酸的发夹，将观察到最长的暂停。由于采用本发明的方法获得的单分子分辨率，因此可以检测携带特定序列的每种分子。因此，本发明使技术人员能够计算携带所述序列的核酸分子的数量。在WO 2013/093005中可以找到本方法的另外的实施方案和应用，其用于整个核酸分子的群中容易且准确地定量特定核酸序列的方法。
在另一个实施方案中，本发明的发夹用于检测蛋白与特定序列的结合。根据该实施方案，本发明涉及一种用于确定蛋白与感兴趣的序列的结合的方法，所述序列包含在通过上述方法获得的发夹内，其中所述方法包含阻断发夹的复性的步骤。更具体地，首先通过向所述分子施加物理力如拉力而使发夹变性(例如，通过移开所述发夹末端结合的表面)。然后提供蛋白，以及任选地提供对应于所述序列的单链核酸分子。在通过降低拉力复性发夹之前，允许所述蛋白与感兴趣的序列(作为变性的单链发夹，或作为所述变性的发夹和所述单链核酸分子之间的双链体)结合。检测到发夹的复性的暂停，并且如上所述确定所述暂停的位置。任选地，还确定暂停的持续时间。
本文所用的术语“蛋白”、“多肽”是同义词，并且是指通过肽键共价连接成链的氨基酸的聚合物。蛋白可以有几种功能。“结合蛋白”是能够非共价结合于另一分子的蛋白。结合蛋白可以结合例如DNA分子(DNA结合蛋白)、RNA分子(RNA结合蛋白)和/或蛋白分子(蛋白结合蛋白)。在蛋白结合蛋白的情况中，它可以结合自身(形成多聚体)和/或它可以结合不同的一种或多种蛋白的一种或多种分子。结合蛋白可以具有多于一种类型的结合活性。例如，锌指蛋白具有DNA结合、RNA结合和蛋白结合活性。因此，根据本发明的“核酸结合蛋白”是能够与核酸相互作用的蛋白。因此，根据本发明的“单链核酸结合蛋白”是能够与单链核酸相互作用的蛋白，而根据本发明的“双链核酸结合蛋白”因此是能够与双链核酸相互作用的蛋白。
在本发明方法的第一个实施方案中，用于阻断变性的发夹复性的蛋白是能够结合单链核酸的蛋白。根据该实施方案，本发明的方法因此涉及一种确定蛋白与核酸序列的结合的方法，所述方法包含以下步骤：
·通过对所述分子施加物理力使包含所述序列的所述发夹分子变性；
·提供所述蛋白；
·在所述蛋白存在下使所述发夹分子复性，和
·检测发夹复性的阻断。
有利地，所述方法包含确定阻断的位置的另外的步骤。
在该实施方案中，本发明涉及确定单链核酸结合蛋白与核酸序列的结合的方法，所述方法包含以下步骤：
a)通过移开表面，变性通过上述方法获得的发夹，所述发夹潜在地包含所述序列；
b)测量在步骤a)中获得的变性的发夹分子的两个末端之间的距离Z高；
c)使所述蛋白与步骤a)中获得的所述变性的发夹分子接触；
d)在所述蛋白存在时，使步骤d)的所述发夹分子复性；和
e)检测发夹分子的复性的阻断；和
f)确定所述阻断相对于发夹的一个末端的位置，所述确定包含以下步骤：
·测量附着至支持物上的发夹分子的两个末端之间的距离(z)，
·比较z和Z高，和
·确定阻断的位置；
g)确定所述阻断的持续时间，
其中所述单链核酸结合蛋白与所述核酸序列的结合衍生自所述阻断的位置和所述阻断的持续时间。
在本发明方法的另一个实施方案中，蛋白结合双链核酸。本发明人已经显示，当存在双链核酸结合蛋白时，其能够结合变性的发夹和单链核酸分子之间形成的杂交体。蛋白和核酸杂交体之间的这种相互作用导致阻断持续时间的改变。大多数情况下，这种相互作用导致复性的阻断增加。例如，引物酶将稳定DNA oligo，否则在得以被检测到的足够长时间中，其将不足以稳定地阻断发夹的重新杂交。同样地，DNA聚合酶与用作引物的小寡核苷酸3'末端的结合增加了其稳定性。或者，阻断的持续时间也可以减少。实际上，本发明人已经显示，一些解旋酶的结合触发了所述杂交体的不稳定性，其在较短的阻断时间内进行翻译。
根据该优选实施方案，因此本发明的方法包含以下步骤：
a)通过对所述分子施加物理力来变性包含特定序列的发夹分子；
b)提供所述蛋白和对应于所述核酸序列的单链核酸分子；
c)在所述蛋白和所述单链核酸分子的存在下使所述发夹分子复性；和
d)检测发夹的复性的阻断。
有利地，所述方法包括确定阻断的位置的另外的步骤。
在该实施方案中，本发明涉及一种确定双链核酸结合蛋白与核酸序列的结合的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过移开表面，变性通过上述方法获得的发夹，所述发夹潜在地包含所述序列；
b)测量在步骤a)中获得的变性的发夹分子的两个末端之间的距离Z高；
c)将单链核酸分子与步骤a)中获得的所述变性的发夹分子杂交；
d)使所述蛋白与步骤c)中的所述杂交的单链核酸分子/发夹分子接触；
e)在所述蛋白存在时，使步骤c)的所述杂交的单链核酸分子/发夹分子复性；和
f)检测发夹分子的复性的阻断；和
g)确定所述阻断相对于发夹的一个末端的位置，所述确定包含以下步骤：
·测量附着至支持物上的发夹分子的两个末端之间的距离(z)，
·比较z和Z高，和
·确定阻断的位置；
h)确定所述阻断的持续时间，
其中所述双链核酸结合蛋白与所述核酸序列的结合衍生自所述阻断的位置和所述阻断的持续时间。
该实施方案是特别有利的，因为它允许确定所述蛋白与双链核酸中包含的序列的结合。可以对所述蛋白所结合的分子直接测序，只需用适合于根据上述方法进行测序的缓冲液替换含有蛋白和任选的互补单链核酸的缓冲液，而不改变实验的设置。因此，用于确定蛋白与序列的结合的本方法可用于鉴定所述蛋白的结合位点。该方法尤其可以用于进行特定核酸结合蛋白(如，例如转录因子)的结合位点的全基因组图谱。在这种情况下，使用发夹的文库是特别有利的，其中所述发夹文库表示对应于全部基因组的核酸的整个群。
本发明方法的另一个具体应用是检测表观遗传修饰。本发明提供了一种检测核酸的表观遗传修饰的简便方法。“表观遗传修饰”，本文中是指在所述核酸分子合成之后发生的构成核酸分子的碱基的修饰。这种表观遗传修饰尤其包括在DNA中的4-甲基胞嘧啶(m4C)、5-甲基胞嘧啶(5mC)、5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-甲酰基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)、以及6-甲基腺苷(m6A)，和在RNA中的5-羟甲基尿嘧啶(5hmU)和N6-甲基腺苷(m6A)。
同样地，本发明的方法允许检测由核酸损伤产生的修饰的碱基，优选DNA损伤。由于化学物质(即插入剂)、辐射和其它诱变剂，DNA损伤不断发生。这些类型的DNA损伤导致的DNA碱基修饰是广泛传播的，并且在影响生理状态和疾病表型中起重要作用。示例包括8-氧基鸟嘌呤，8-氧基腺嘌呤(氧化损伤；衰老、阿尔茨海默氏症、帕金森氏病)、1-甲基腺嘌呤、6-O-甲基鸟嘌呤(烷基化；胶质瘤和结肠直肠癌)、苯并[a]芘二醇环氧化物(BPDE)、嘧啶二聚体(加合物形成；吸烟、工业化学物质暴露、紫外线暴露；肺癌和皮肤癌)和5-羟基胞嘧啶，5-羟基尿嘧啶，5-羟甲基尿嘧啶和胸腺嘧啶二醇(电离辐射损伤；慢性炎性疾病、前列腺癌、乳癌和结肠直肠癌)。
根据这些实施方案，通过上述方法，通过检测特异性识别所述修饰碱基的蛋白(例如，针对所述碱基的抗体)与所述发夹的结合，鉴定本发明的发夹中包含的感兴趣的序列中至少一种修饰的碱基的存在。
这些实施方案是特别有利的，因为可以因此准确地对基因组中所有出现的特定修饰进行鉴定和绘图(map)。在这种情况下，使用发夹文库是特别有利的，其中所述发夹文库表示对应于全部基因组的核酸的整个群。
用于检测蛋白与特定核酸序列的结合的本方法的另外的实施方案和应用可以在WO 2014/114687中找到。
除非另有说明，本发明的实施使用在本领域技术范围内的蛋白化学、分子病毒学、微生物学、重组DNA技术和药理学的常规技术。这些技术在文献中得到充分解释。(参见Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,Eds.,John Wiley&Sons,Inc.New York,1995；Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版,Mack PublishingCo.,Easton,Pa.,1985；以及Sambrook等人,Molecular cloning:A laboratory manual第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press-Cold Spring Harbor,NY,USA,1989)。
以下的实施例将能够实现本发明的其它特征和优点。
附图说明
图1：用于磁镊(magnetic tweezer)分析的DNA发夹的结构。显示典型的DNA发夹结构。粗体序列表示感兴趣的双链DNA区域，描述功能所需的各种DNA接头。接头1是小的DNA环，其永久地将ROI的一条链的5'末端附着至另一条链的3'末端。由于在接头2末端上合成生物素部分(显示为红点)，该结构将容易地结合包被链霉亲和素的珠。最后，通过与位于接头3末端的地高辛(绿点)的相互作用，允许其结合抗地高辛抗体包被的流动池表面。
图2：链侵入过程的原理。在最左边，显示了通用前体发夹-珠结构(HP1)，其可以批量制备并附着至流动池的表面。它具有附着至珠上的dsDNA接头，以序列D-A的ssDNA突出部分结束。第二个分子由具有地高辛标记的尾巴的dsDNA区域组成，允许其结合流动池的玻璃表面(由橙色方块表示dig)。另一末端为具有序列C(12nt)加上40nt与A互补的序列(Α')的ssDNA区域。可以将这两种分子(珠+接头和dig标记的接头)预先孵育，使得它们通过A和A'序列杂交在一起，形成前体发夹结构HP1。这种结构在正常条件下将是稳定的，但是采用大于几pN的力拉动磁珠，将拉开杂交区域并分解结构。该结构旁边显示了称为发夹前体HP2的结构。它由在一个末端连接至环(如右侧所示)和另一末端连接至适配体的待研究(双链)DNA组成(灰色)。适配体由通过A和A'序列杂交在一起的2个oligo组成(与左面所示发夹上的那些相同)。适配体还具有分别与HP1的序列C和D互补的序列D'和C'的突出部分单链区域。当这些发夹(HP2)的文库被引入到含有左面显示的多个结构的流动池中时，它们将通过它们的瓣(C'和D')杂交，各自形成具有2个缺口的Holiday交叉，这里称为HP3(如中间右面的所示)。当施加小的力(～5pN)至珠时，Holiday交叉迅速迁移，延长分子并导致稳定的发夹结构(如最右面所示)。右面显示的分子基本上与图1显示的分子相同；对于这样的发夹结构，它可以如通常拉上和拉开，并且适合用于所有的图谱和测序实验。注意，尽管在该分子中存在3个单链缺口，互补序列(AD-A'D'和CA'-C'A)的长度足够长以抵抗磁体的剪切力(与未侵入的Halliday结构上发现的互补序列的较小的长度相反(仅保持12bp的D-D'和C-C'在一起)。
图3：替代的链侵入过程。该实施例与图1显示的相似，差别仅在于侵入的发夹仅具有单个瓣(C')，其与粘着在表面上的原始(proto-)发夹结构结合。所得的链侵入发夹的结构与图2中的非常相似。
图4：采用寡核苷酸CGCCAC获得的指纹图谱的实施例。采用从pPS002消化获得的1.6kb的BsmBI片段产生发夹。珠上的力逐渐增加，直到达到分子被拉开的点。力的降低引起了分子的重新拉上。在没有任何寡核苷酸的情况下，闭合是迅速的(左面)。然而，当寡核苷酸存在于流动池中，并且该寡核苷酸的互补序列位于发夹上时，其阻断了重新拉上。这种寡核苷酸在发夹上具有3个结合位置，由于寡核苷酸的性质，只有一个(在位置794bp)显示阻断。在特定珠上的这种阻断获得的实验值为784bp。尽管在寡核苷酸与其靶序列之间的5'末端存在错配，然而由于位于PS046环寡核苷酸内的阻断位点，该寡核苷酸也阻断了发夹的重新形成。
图5：5-甲基胞嘧啶修饰的检测。采用来自pPS003的BsmBI消化片段通过FISI所产生的相同发夹，针对所述发夹用抗体测试其5-甲基胞嘧啶修饰(克隆33D3单克隆抗体用于本实验，并可从各种来源而商业获得，如Merck Millipore或Sigma-Aldrich)。预测该发夹在位置170和1046处含有2个潜在的Dcm甲基化位点。使用ssDNA阻断作为参照(第一个来自顶部)，实验阻断位置，经计算为135bp和1035bp。寡核苷酸和抗体均证实，DNA的片段实际起源于pPS003。
具体实施方式
实施例：实施例1：
制备含有一个瓣(flap)的HP1
使用pPS001载体(SEQ ID NO.1)克隆来自λ基因组DNA的1.5kb KpnI片段或者500bp的SalI片段，分别产生pPS002(SEQ ID NO.2)或pPS003(SEQ ID NO.3)。
为了在珠和前体HP1之间产生dsDNA接头，根据制造商的说明书使用DreamTaq DNA聚合酶。使用寡核苷酸PS079(SEQ ID NO.6)和PS080(SEQ ID NO.7)，各自以500nM浓度，且依据期望的接头的长度，pPS001、pPS002或pPS003载体用作模板(分别产生236、1724或737个碱基对的接头)。
寡核苷酸PS080在其5'末端含有生物素。寡核苷酸PS079具有12碳间隔(C12间隔)，其防止DNA聚合酶“复制”载体的5'末端，并留下5'单链尾巴。
PCR条件如下：
一直保持在4℃。
对于HP1和表面之间的适配体，根据制造商说明书，使用DreamTaq DNA聚合酶，在模板序列pPS003上采用寡核苷酸PS103(SEQ ID NO.8)和PS104(SEQ ID NO.9)。与前述使用相同的条件。
得到的序列如下(包括添加以产生BsaI限制性位点的序列，以绿色显示)：
SEQ ID NO.5
5’
attcgatcgtGGTCTCAGAATcctggtggtgagcaatggtttcaaccatgtaccggatgtgttctgccatgcgctcctgaaactcaaCatcgtcatcaaacgcacgggtaatggattttttgctggccccgtggcgttgcaaatgatcgatgcatagcgattcaaacaggtgctggggcaggccTttttccatgtcgtctgccagttctgcctctttctcttcacgggcgagctgctggtagtgacgcgcccagctctgagcctcaagacGCTTGGAGACCagctagccat 3’
然后根据制造商说明书，采用BsaI消化所得片段。然后在这些突出部分，按照如下，克隆两个不同的适配体：
·通过杂交寡核苷酸PS101(SEQ ID NO.10)和PS070(SEQ ID NO.11)获得这些适配体中的第一个。所得的PS101的5′突出部分与片段突出部分之一互补。
·通过杂交寡核苷酸PS101和PS0102(SEQ ID NO.12)获得第二适配体。PS102的两个末端延伸超过PS101。这些末端之一与片段的第二突出部分互补。
具体地，各自浓度为10μM的寡核苷酸PS101和PS070在CutSmart缓冲液(NEB，1×：50mM乙酸钾，20mM Tris-乙酸盐，10mM乙酸镁，100μg/ml BSA，pH 7.9@25℃)中退火。在加热块上将溶液在98℃加热并冷却至室温，对寡核苷酸PS101和PS102进行同样的程序。
因此产生两种不同的适配体，由于存在2种不同的非回文的位点，根据制造商的说明书，使用来自Enzymatics的T4DNA连接酶，可以定向连接至BsaI消化的PCR片段。
一旦连接，使用来自Enzymatics的Klenow exo-DNA聚合酶，PS070用作模板，扩增寡核苷酸PS101。调整反应混合物中dTTP的量，从而可以使用dig-dUTP。对于60％的dig-dUTP，比例为40％dTTP。
在琼脂糖凝胶上纯化最终片段后，计算两种片段的摩尔浓度。然后将两种片段以等摩尔浓度在CutSmart缓冲液中混合在一起。在C12间隔之后，寡核苷酸PS102的3′末端与寡核苷酸PS079的5′末端互补。
一旦退火，最终HP1分子被系列稀释并结合在采用链霉亲和素官能化的MyOne顺磁珠上。由于PS080寡核苷酸含有生物素，分子将和珠结合。然后将前体HP1加载到微流体室中，采用抗地高辛抗体对池(cell)的底部进行官能化。由于在HP1的第二部分存在地高辛，前体HP1结合流动池的底部。
HP2的制备
为了生产HP2，通过消化载体并从凝胶中纯化，而获得来自载体pPS002(SEQ IDNO.2)的BsmBI片段。得到的1.6kb的片段具有2种不同的非回文末端。
将寡核苷酸PS108(SEQ ID NO.13)和PS109(SEQ ID NO.14)以等浓度(10μM)在CutSmart缓冲液中混合，并在98℃加热。然后，将管缓慢冷却至室温，以允许2种寡核苷酸退火，因此产生具有与消化的BsmBI片段互补的突出部分的适配体。
PS046(SEQ ID NO.15)是自退火寡核苷酸，具有5个胸腺嘧啶的环和能够克隆至BsmBI消化的载体的5'突出部分。将PS046稀释至10μM，在98℃加热并在冰上迅速冷却，以促进小的发夹环结构的形成，其可连接至感兴趣的DNA区域的(形成HP2)。
一旦连接至BsmBI片段，将得到的HP2在琼脂糖凝胶上纯化，并洗脱至50μl的水中。将1μL该HP2与100μl钝化缓冲液混合，并加载在含有附着于表面的HP1的流体池上。将磁体靠近样品，使得力达到约5pN。这样保持样品30分钟，且力逐渐增加至15pN。如果来自HP2的ssDNA瓣(C')与HP1上的互补序列C杂交，则Holliday交叉将被分解。如果没有HP2附着至HP1，则珠将飞走。一旦分解，可以采用寡核苷酸或任何其它结合分子(如抗体或蛋白)询问(interrogate)发夹。
实施例2：
制备含有两个瓣的HP1分子。
对于该版本，感兴趣的发夹含有可以在叉的任一侧结合的两个ssDNA片段。
对于两个瓣的策略，除了使用的寡核苷酸略有不同外，程序基本相同。
对于生物素-间隔接头，没有改变。PS079和PS080用于pPS003载体。
对于dig接头，PS102被寡核苷酸PS115(SEQ ID NO.16)替代。然后将后者与PS101退火以产生适配体，从而适配体与采用PS103-PS104获得的BsaI消化的PCR片段进行连接。第二适配体PS101-PS070没有变化。然后如前所述，合成dig尾巴。
两种片段在琼脂糖凝胶上纯化，并以等量混合形成HP1。然后，它们被系列稀释，并结合到采用链霉亲和素包被的MyOne顺磁珠上。
为了制备HP2，采用由PS116(SEQ ID NO.17)-PS118(SEQ ID NO.18)组成的适配体替代PS107-PS108适配体，以制备两个瓣的HP2。将它们以10μM在CutSmart缓冲液中混合，在98℃加热，并缓慢冷却至室温。最后，将它们以及环PS046连接至来自pPS002载体的BsmBI片段。
将最终片段在琼脂糖凝胶上纯化，并将1μL所得洗脱物加载至含有HP1前体的流动池内。采用与前述相同的程序。
序列表
<110> 巴黎科学与文学联大-拉丁区
国家科学研究中心(CNRS)
皮埃尔和玛利居里大学
巴黎大学迪德罗特
<120> 使用力诱导的链侵入原位形成发夹
<130> B370375D34787
<150> 15305705.4
<151> 2015-05-07
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2966
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> pSP01
<400> 1
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180
caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300
cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360
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agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga 3060
gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga 3120
agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg 3180
catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc 3240
aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc 3300
gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca 3360
taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac 3420
caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg 3480
ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc 3540
ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg 3600
tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac 3660
aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat 3720
actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata 3780
catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa 3840
agtgccac 3848
<210> 5
<211> 291
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> PCR 片段
<400> 5
attcgatcgt ggtctcagaa tcctggtggt gagcaatggt ttcaaccatg taccggatgt 60
gttctgccat gcgctcctga aactcaacat cgtcatcaaa cgcacgggta atggattttt 120
tgctggcccc gtggcgttgc aaatgatcga tgcatagcga ttcaaacagg tgctggggca 180
ggcctttttc catgtcgtct gccagttctg cctctttctc ttcacgggcg agctgctggt 240
agtgacgcgc ccagctctga gcctcaagac gcttggagac cagctagcca t 291
<210> 6
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> PS079 (包括C12接头)
<220>
<221> misc_binding
<222> (42)..(43)
<223> C12 接头
<400> 6
gaagagcacc agaaagacca aaagacacac gggaaccgaa cttttcccag tcacgacgtt 60
g 61
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> PS080
<220>
<221> misc_binding
<222> (1)..(1)
<223> 生物素
<400> 7
ccatgattac gccaagctcg 20
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> PS103
<400> 8
attcgatcgt ggtctcagaa tcctggtggt gagcaatgg 39
<210> 9
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> PS104
<400> 9
atggctagct ggtctccaag cgtcttgagg ctcagagctg g 41
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> PS101
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' 磷酸化
<400> 10
gcttgaccat ctaaggttat c 21
<210> 11
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> PS070
<400> 11
ttggtgaaga aggaagatga ttatattata tatgtgatgg agttgttaag tatagaatga 60
atttattaag aggtattaaa tggtatatgt ggtgtatagg agtgataacc ttagatggtc 120
<210> 12
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> PS102
<400> 12
attcgataac cttagatggt caagcatgcc gcttttcggt tcccgtgtgt cttttggtct 60
ttctggtgct cttc 74
<210> 13
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> PS108
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' 磷酸化
<400> 13
attcgaagag caccagaaag accaaaagac acacgggaac cgaaaagcgg cat 53
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> PS109
<400> 14
ttcggttccc gtgtgtcttt tggtctttct ggtgctcttc 40
<210> 15
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> PS046
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' 磷酸化
<400> 15
gcttgccact tgaagatttt ttcttcaagt ggc 33
<210> 16
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> PS115
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' 磷酸化
<400> 16
attcgataac cttagatggt caagcagcat gccgcttgtg tgtcttttgg tctttctggt 60
gctcttc 67
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> PS116
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' 磷酸化
<400> 17
attcgaagag caccagaaag accaaaagac acacaagcgg catcg 45
<210> 18
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> PS118
<400> 18
ttcggttccc gtgtgtcttt tggtctttct ggtgctcttc 40
Claims (27)
1.一种制备包含感兴趣的序列的发夹的方法，所述方法包含以下步骤：
a)提供核酸HP1，所述核酸包含：
·与第一表面结合的第一末端；
·连接至所述第一末端的序列A的单链区域，
·与所述单链区域A杂交的序列A'的单链区域，其中所述单链区域A和所述单链区域A'不共价连接；
·与所述序列A'的单链区域连接的至少一个序列C的单链区域；
·与所述序列C的单链区域连接的第二末端，其中所述第二末端结合到第二表面；
·其中第一表面和第二表面之一是可移动的表面，
b)提供至少一种核酸HP2，所述核酸包含：
·包含感兴趣的序列的双链区域，
·与所述双链区域的第一末端连接的环，
·具有序列A的单链区域，其连接至所述双链区域的第二末端的第一链，所述序列A的区域连接至序列C'的单链区域，C'与C互补；
·具有序列A'的单链多核苷酸，其连接至所述双链多核苷酸分子的第二末端的第二链，其中序列A和序列A'的单链多核苷酸杂交；
c)在步骤b)的所述核酸HP2存在时，通过施加至少3pN的拉力移开表面，使步骤a)的所述核酸HP1变性；和
d)获得发夹。
2.根据权利要求1所述的方法，其中：
·所述核酸HP1的所述序列A的单链区域连接至序列D的单链区域，所述序列D的单链区域与所述第一表面结合；和
·核酸HP2的所述序列A'的单链区域连接至具有序列D'的单链区域，其中D'与D互补。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中步骤c)的变性包括施加至少4pN的拉力。
4.根据权利要求1或2任一项所述的方法，其中步骤c)的变性包括施加至少5pN的拉力。
5.根据权利要求1或2任一项所述的方法，其中步骤c)的变性包括施加至少6pN的拉力。
6.根据权利要求1或2任一项所述的方法，其中多于一种的核酸HP1被附着于至少一个表面。
7.根据权利要求1或2任一项所述的方法，其中使用多种不同的核酸HP2。
8.根据权利要求1或2任一项所述的方法，其中序列A和序列A'各自包含至少30个核苷酸。
9.根据权利要求1或2任一项所述的方法，其中序列A和序列A'各自包含至少35个核苷酸。
10.根据权利要求1或2任一项所述的方法，其中序列A和序列A'各自包含至少40个核苷酸。
11.根据权利要求1或2任一项所述的方法，其中序列A和序列A'各自包含至少45个核苷酸。
12.根据权利要求1或2任一项所述的方法，其中序列C和序列C'各自包含至少10个核苷酸。
13.根据权利要求1或2任一项所述的方法，其中序列C和序列C'各自包含至少12个核苷酸。
14.根据权利要求1或2任一项所述的方法，其中序列C和序列C'各自包含至少13个核苷酸。
15.根据权利要求1或2任一项所述的方法，其中序列C和序列C'各自包含至少14个核苷酸。
16.根据权利要求1或2任一项所述的方法，其中序列C和序列C'各自包含至少15个核苷酸。
17.根据权利要求2所述的方法，其中序列D和序列D'各自包含至少10个核苷酸。
18.根据权利要求2所述的方法，其中序列D和序列D'各自包含至少12个核苷酸。
19.根据权利要求2所述的方法，其中序列D和序列D'各自包含至少13个核苷酸。
20.根据权利要求2所述的方法，其中序列D和序列D'各自包含至少14个核苷酸。
21.根据权利要求2所述的方法，其中序列D和序列D'各自包含至少15个核苷酸。
22.权利要求1至21中任一项中所述的核酸HP1和/或核酸HP2。
23.一种发夹，其通过权利要求1至21中任一项所述的方法获得。
24.一种用于确定核酸序列的方法，所述方法包含以下步骤：
a)通过移开表面以变性根据权利要求23所述的发夹；
b)测量在步骤a)中获得的变性的发夹分子的两个末端之间的距离Z高；
c)将单链核酸分子、引物与步骤a)中获得的所述变性的发夹分子杂交；
d)使步骤d)的所述杂交的单链核酸分子/发夹分子复性；和
e)检测杂交的单链核酸分子/发夹分子的复性的阻断；和
f)确定所述阻断相对于发夹的一个末端的位置，所述确定包括以下步骤：
·测量附着至支持物上的发夹分子的两个末端之间的距离z，
·比较z和Z高，和
·确定阻断的位置；
其中所述核酸序列衍生自所述阻断的位置。
25.一种用于检测特定核酸序列的存在的方法，所述方法包括步骤：
a)通过移开表面以变性根据权利要求23所述的发夹；
b)测量在步骤a)中获得的变性的发夹分子的两个末端之间的距离Z高；
c)将单链核酸分子、引物与步骤a)中获得的所述变性的发夹分子杂交；
d)使步骤d)的所述杂交的单链核酸分子/发夹分子复性；和
e)检测杂交的单链核酸分子/发夹分子的复性的阻断；和
f)确定所述阻断相对于发夹的一个末端的位置，所述确定包含以下步骤：
·测量附着至支持物上的发夹分子的两个末端之间的距离z，
·比较z和Z高，和
·确定阻断的位置；
g)确定所述阻断的持续时间，
其中所述核酸序列的存在衍生自所述阻断的位置和所述阻断的持续时间。
26.一种用于确定单链核酸结合蛋白与核酸序列的结合的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过移开表面以变性根据权利要求23所述的发夹，所述发夹潜在地包含所述序列；
b)测量在步骤a)中获得的变性的发夹分子的两个末端之间的距离Z高；
c)使所述蛋白与步骤a)中获得的所述变性的发夹分子接触；
d)在所述蛋白存在时，使步骤d)的所述发夹分子复性；和
e)检测发夹分子的复性的阻断；和
f)确定所述阻断相对于发夹的一个末端的位置，所述确定包括以下步骤：
·测量附着至支持物上的发夹分子的两个末端之间的距离z，
·比较z和Z高，和
·确定阻断的位置；
g)确定所述阻断的持续时间，
其中所述单链核酸结合蛋白与所述核酸序列的结合衍生自所述阻断的位置和所述阻断的持续时间。
27.一种用于确定双链核酸结合蛋白与核酸序列的结合的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过移开表面以变性根据权利要求23所述的发夹，所述发夹潜在地包含所述序列；
b)测量在步骤a)中获得的变性的发夹分子的两个末端之间的距离Z高；
c)将单链核酸分子与步骤a)中获得的所述变性的发夹分子杂交，
d)使所述蛋白与步骤c)中的所述杂交的单链核酸分子/发夹分子接触；
e)在所述蛋白存在时，使步骤c)的所述杂交的单链核酸分子/发夹分子复性；和
f)检测发夹分子的复性的阻断；和
g)确定所述阻断相对于发夹的一个末端的位置，所述确定包括以下步骤：
·测量附着至支持物上的发夹分子的两个末端之间的距离z，
·比较z和Z高，和
·确定阻断的位置；
h)确定所述阻断的持续时间，
其中所述双链核酸结合蛋白与所述核酸序列的结合衍生自所述阻断的位置和所述阻断的持续时间。
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