CN109863166A - 具有降低的葡萄糖脱氢酶活性的产生鼠李糖脂的细胞 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞，其制备鼠李糖脂，且经遗传修饰，使得它们与其野生型相比具有降低的葡萄糖脱氢酶的活性，以及涉及用于使用根据本发明的细胞生产鼠李糖脂的方法。

Description

具有降低的葡萄糖脱氢酶活性的产生鼠李糖脂的细胞

技术领域

本发明涉及细胞，其制备鼠李糖脂，且经遗传修饰，使得它们与其野生型相比具有降低的葡萄糖脱氢酶的活性，以及涉及用于使用根据本发明的细胞生产鼠李糖脂的方法。

背景技术

DE102012201360描述了这样的细胞，其制备鼠李糖脂并经遗传修饰，使得它们与其野生型相比具有降低或增加的某些酶和酶组合的活性，意味着所述细胞有利地产生鼠李糖脂，以及描述了使用根据该发明的细胞生产鼠李糖脂的方法。

本发明的一个目的是提供具有基于所用的碳源的增加的鼠李糖脂产率的细胞。

发明内容

据发现，令人惊讶地，下面描述的细胞能够实现上面提及的目的。

本发明提供了细胞，其制备鼠李糖脂，且经遗传修饰，使得它们与其野生型相比具有降低的葡萄糖脱氢酶的活性。本发明进一步提供了用于使用前面提及的细胞作为生物催化剂生产鼠李糖脂的方法。

本发明的一个优点是可能使用非致病性且易于培养的生物体。

本发明的另一个优点是可能利用碳源的大量选择。

一个进一步优点是在所有情况下都不必使用油类作为唯一基质或共基质。

另一个优点是可能借助于本发明生产具有确定和可调节特性的鼠李糖脂。

一个进一步优点是与这些活性不改变的细胞相比，可能生产具有更高的时空和碳产率的鼠李糖脂。

因此，本发明提供了能够制备至少一种鼠李糖脂的细胞，优选分离的细胞，其特征在于其已被遗传修饰，使得与其野生型相比，其具有降低的至少一种酶E1的活性，其催化D-葡萄糖和醌转化为D-葡萄糖酸-1,5-内酯(D-glucono-1,5-lactone)和醌醇。

术语细胞的“野生型”在此表示其基因组以通过进化自然产生的状态存在的细胞。该术语用于整个细胞和个别基因。因此，术语“野生型”特别不包括其基因序列已通过重组技术至少部分被人修饰的那些细胞或基因。术语“野生型”特别表示在生物体的天然群体中最频繁出现的表型、基因型或基因。

在本发明的上下文中，术语“鼠李糖脂”应理解为意指通式(I)的化合物或其盐，

其中

m＝2、1或0，特别是1或0，

n＝1或0，特别是1，

R1＝具有2至24、优选5至13个碳原子的有机基团，特别是任选地支链的，任选地取代的，特别是羟基取代的，任选地不饱和的，特别是任选地单-、双-或三-不饱和的烷基基团，优选选自戊烯基、庚烯基、壬烯基、十一烯基和十三烯基和(CH₂)o-CH₃(其中o＝1至23，优选4至12)的基团，且

R2＝彼此独立、相同或不同的具有2至24、优选5至13个碳原子的有机基团，特别是任选地支链的，任选地取代的，特别是羟基取代的，任选地不饱和的，特别是任选地单-、双-或三-不饱和的烷基基团，优选选自戊烯基、庚烯基、壬烯基、十一烯基和十三烯基和(CH₂)o-CH₃(其中o＝1至23，优选4至12)的基团。

如果根据本发明的细胞能够制备鼠李糖脂(其中m＝1)，则优选经由R1和R2确定的基团是

衍生自3-羟基辛酰基-3-羟基辛酸(3-hydroxyoctanoyl-3-hydroxyoctanoicacid)、3-羟基辛酰基-3-羟基癸酸(3-hydroxyoctanoyl-3-hydroxydecanoic acid)、3-羟基癸酰基-3-羟基辛酸(3-hydroxydecanoyl-3-hydroxyoctanoic acid)、3-羟基辛酰基-3-羟基癸烯酸(3-hydroxyoctanoyl-3-hydroxydecenoic acid)、3-羟基癸烯酰基-3-羟基辛酸(3-hydroxydecenoyl-3-hydroxyoctanoic acid)、3-羟基辛酰基-3-羟基十二烷酸(3-hydroxyoctanoyl-3-hydroxydodecanoic acid)、3-羟基十二烷酰基-3-羟基辛酸(3-hydroxydodecanoyl-3-hydroxyoctanoic acid)、3-羟基辛酰基-3-羟基十二碳烯酸(3-hydroxyoctanoyl-3-hydroxydodecenoic acid)、3-羟基十二烯酰基-3-羟基辛酸(3-hydroxydodecenoyl-3-hydroxyoctanoic acid)、3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸(3-hydroxydecanoyl-3-hydroxydecanoic acid)、3-羟基癸酰基-3-羟基癸烯酸(3-hydroxydecanoyl-3-hydroxydecenoic acid)、3-羟基癸烯酰基-3-羟基癸酸(3-hydroxydecenoyl-3-hydroxydecanoic acid)、3-羟基癸烯酰基-3-羟基癸烯酸(3-hydroxydecenoyl-3-hydroxydecenoic acid)、3-羟基癸酰基-3-羟基十二烷酸(3-hydroxydecanoyl-3-hydroxydodecanoic acid)、3-羟基十二烷酰基-3-羟基癸酸(3-hydroxydodecanoyl-3-hydroxydecanoic acid)、3-羟基癸酰基-3-羟基十二碳烯酸(3-hydroxydecanoyl-3-hydroxydodecenoic acid)、3-羟基癸酰基-3-羟基十四碳烯酸(3-hydroxydecanoyl-3-hydroxytetradecenoic acid)、3-羟基十四烷酰基-3-羟基癸烯酸(3-hydroxytetradecanoyl-3-hydroxydecenoic acid)、3-羟基十二烯酰基-3-羟基癸酸(3-hydroxydodecenoyl-3-hydroxydecanoic acid)、3-羟基癸酰基-3-羟基十四烷酸(3-hydroxydecanoyl-3-hydroxytetradecanoic acid)、3-羟基十四烷酰基-3-羟基癸酸(3-hydroxytetradecanoyl-3-hydroxydecanoic acid)、3-羟基癸酰基-3-羟基十四碳烯酸(3-hydroxydecanoyl-3-hydroxytetradecenoic acid)、3-羟基十四烯酰基-3-羟基癸酸(3-hydroxytetradecenoyl-3-hydroxydecanoic acid)、3-羟基十二烷酰基-3-羟基十二烷酸(3-hydroxydodecanoyl-3-hydroxydodecanoic acid)、3-羟基十二烯酰基-3-羟基十二烷酸(3-hydroxydodecenoyl-3-hydroxydodecanoic acid)、3-羟基十二烷酰基-3-羟基十二碳烯酸(3-hydroxydodecanoyl-3-hydroxydodecenoic acid)、3-羟基十二烷酰基-3-羟基十四烷酸(3-hydroxydodecanoyl-3-hydroxytetradecanoic acid)、3-羟基十四烷酰基-3-羟基十二烷酸(3-hydroxytetradecanoyl-3-hydroxydodecanoic acid)、3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸(3-hydroxytetradecanoyl-3-hydroxytetradecanoic acid)、3-羟基十六烷酰基-3-羟基十四烷酸(3-hydroxyhexadecanoyl-3-hydroxytetradecanoic acid)、3-羟基十四烷酰基-3-羟基十六烷酸(3-hydroxytetradecanoyl-3-hydroxyhexadecanoicacid)或3-羟基十六烷酰基-3-羟基十六烷酸(3-hydroxyhexadecanoyl-3-hydroxyhexadecanoic acid)。

本领域技术人员明白，根据本发明的细胞还能够制备通式(I)的各种鼠李糖脂的混合物。

在这方面，优选的是，根据本发明的细胞能够制备通式(I)的鼠李糖脂的混合物，其特征在于n＝1，大于80重量％，优选大于90重量％，特别优选大于95重量％的制备的鼠李糖脂，且经由R1和R2确定的基团衍生自小于20重量％、优选小于15重量％的制备的鼠李糖脂中的3-羟基癸酰基-3-羟基辛酸或3-羟基辛酰基-3-羟基癸酸，

指定的重量％基于制备的所有通式(I)的鼠李糖脂的总和。

在本发明的上下文中列出的登录号对应于NCBI的蛋白库数据库条目，其中日期为26.01.2016；通常，在当前情况下，条目的版本号由“.数字”诸如例如“.1”标识。

除非另有说明，否则给出的所有百分比(％)均为质量百分比。

因此，所使用的表述“降低的酶Ex的活性”应理解为意指优选活性降低至少0.5倍，特别优选至少0.1倍，进一步优选至少0.01倍，仍进一步优选至少0.001倍，且最优选至少0.0001倍。表述“降低的活性”还包括没有可检测的活性(“活性为零”)。

用于降低微生物中的酶促活性的方法是本领域技术人员已知的。分子生物学技术在这里是尤其有用的。例如，某种酶的活性可以通过靶向突变或本领域技术人员已知降低某种酶的活性的其他措施来降低。用于修饰和降低蛋白表达和相关酶活性降低(特别是用于假单胞菌和伯克霍尔德氏菌，特别是用于中断特定基因)的说明可以由本领域技术人员在以下中找到：例如，Dubeau等人2009.BMC Microbiology 9:263；Singh&Microbiology.2008.154:797-809或Lee等人FEMS Microbiol Lett.2009.297(1):38-48。降低下文所述的酶E1的酶促活性的优选方法可以类似地优选用于在本发明的上下文中待降低的另外的酶活性。

根据本发明优选的细胞的特征在于通过遗传修饰编码酶E1的基因来实现酶促活性的降低，所述修饰选自下组，所述组包含、优选由以下组成：外源DNA插入基因，基因的至少部分的缺失，基因序列中的点突变，尤其是调节序列(诸如例如启动子和终止子或核糖体结合位点)中的或调节序列(诸如例如启动子和终止子或核糖体结合位点)的点突变。

在该上下文中，外源DNA被理解为意指对基因(而非生物体)“外源”的任何DNA序列，即内源DNA序列在该上下文中也可以充当“外源DNA”。在该上下文中，特别优选通过插入选择标记基因来中断基因；因此，外源DNA是选择标记基因，插入优选通过同源重组入基因座中而发生。

根据本发明可替代优选的细胞的特征在于通过编码酶E1的基因的靶向、转录或转录后基因沉默来实现酶促活性的降低，尤其是借助于至少一个结合编码酶E1的基因的启动子的阻遏子，通过无义介导的mRNA衰变(NMD)和RNA干扰(RNAi)(其中RNAi优选利用microRNA方法(miRNA)或小干扰RNA方法(siRNA))的方式，通过其中酶E1的mRNA被降解的方式。

根据本发明，优选的是，E1是EC 1.1.5.2的葡萄糖1-脱氢酶。特别优选的酶E1选自由gcd基因编码的酶以及具有多肽序列的酶，其中氨基酸残基的最多达25％、优选最多达20％、特别优选最多达15％、特别是最多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％通过缺失、插入、取代或其组合而相对于由gcd基因编码的酶被修饰，且其仍具备有具有由gcd基因编码的酶的参考序列的酶的酶促活性的至少10％、优选50％、特别是优选80％、特别是多于90％。

具体而言，酶E1选自这样的酶E1，其具有多肽序列AAN67066.1或具有其中氨基酸残基的最多达25％、优选最多达20％、特别优选最多达15％、特别是最多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％通过缺失、插入、取代或其组合而相对于AAN67066.1被修饰且仍具备有具有参考序列AAN67066.1的酶的酶促活性的至少10％、优选50％、特别是优选80％、特别是多于90％的多肽序列。

根据本发明的细胞可以是原核生物或真核生物。它们可以是哺乳动物细胞(诸如人细胞)、植物细胞或微生物诸如酵母、真菌或细菌，其中微生物是特别优选的，且细菌和酵母是最优选的。

此外，当根据本发明的细胞是作为野生型能够制备具有C6至C16的单链烷酸酯的链长的多羟基链烷酸酯时，其根据本发明是有利的。此类细胞是例如伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia sp.)，泰国伯克霍尔德氏菌(Burkholderia thailandensis)，假单胞菌属(Pseudomonas sp.)，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)，绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)，施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，香茅醇假单胞菌(Pseudomonas citronellolis)，树脂假单胞菌(Pseudomonas resinovorans)，睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)，嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)，钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)，广泛产碱菌(Alcaligenes latus)和真养罗尔斯通菌(Ralstonia eutropha)。在该上下文中，优选的本发明细胞经遗传修饰，使得它们与其野生型相比能够制备更少的多羟基链烷酸酯。

在细菌组内，尤其特别优选恶臭假单胞菌、大肠杆菌和泰国伯克霍尔德氏菌。

根据本发明的细胞的起始菌株可以是天然鼠李糖脂生产者，已经作为野生型产生鼠李糖脂的那些细胞，或其中已经仅通过基因技术生产鼠李糖脂的细胞。

在两种情况下，根据本发明优选的细胞受益于这样的事实：它们已经遗传修饰，使得它们与其野生型相比，具有增加的至少一种选自E2、E3和E4的酶的活性，酶E2能够催化3-羟基链烷酰基-ACP经由3-羟基链烷酰基-3-羟基链烷酸-ACP转化为羟基链烷酰基-3-羟基链烷酸，酶E3是鼠李糖基转移酶I并且能够催化dTDP-鼠李糖和3-羟基链烷酰基-3-羟基链烷酸酯转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基链烷酰基-3-羟基链烷酸酯，且酶E4是鼠李糖基转移酶II并且能够催化dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基链烷酰基-3-羟基链烷酸酯转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1-2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基链烷酰基-3-羟基链烷酸酯。

酶E2优选选自由rhlA基因编码的酶以及具有多肽序列的酶，其中氨基酸残基的最多达25％、优选最多达20％、特别优选最多达15％、特别是最多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％通过缺失、插入、取代或其组合而相对于由rhlA基因编码的酶被修饰，且其仍具备有具有由rhlA基因编码的酶的参考序列的酶的酶促活性的至少10％、优选50％、特别是优选80％、特别是多于90％。

酶E3优选选自由rhlB基因编码的酶以及具有多肽序列的酶，其中氨基酸残基的最多达25％、优选最多达20％、特别优选最多达15％、特别是最多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％通过缺失、插入、取代或其组合而相对于由rhlB基因编码的酶被修饰，且其仍具备有具有由rhlB基因编码的酶的参考序列的酶的酶促活性的至少10％、优选50％、特别是优选80％、特别是多于90％。

酶E4优选选自由rhlC基因编码的酶以及具有多肽序列的酶，其中氨基酸残基的最多达25％、优选最多达20％、特别优选最多达15％、特别是最多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％通过缺失、插入、取代或其组合而相对于由rhlC基因编码的酶被修饰，且其仍具备有具有由rhlC基因编码的酶的参考序列的酶的酶促活性的至少10％、优选50％、特别是优选80％、特别是多于90％。

对于E2、E3和E4特别优选的是：

酶E2选自：

至少一种酶E2a，其具有多肽序列ADP06387.1，或具有其中氨基酸残基的最多达25％、优选最多达20％、特别优选最多达15％、特别是最多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％通过缺失、插入、取代或其组合而相对于参考序列ADP06387.1被修饰且仍具备有具有参考序列ADP06387.1的酶的酶促活性的至少10％、优选50％、特别是优选80％、特别是多于90％的多肽序列，酶E2a的酶促活性被理解为意指3-羟基癸酰基-ACP经由3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸-ACP转化为羟基癸酰基-3-羟基癸酸的能力，

至少一种酶E2b，其具有多肽序列AIP29471.1、CBI71021.1、NP_252169.1、ABR81106.1、YP_439272.1、YP_111362.1、YP_110557.1、YP_105231.1、ZP_02461688.1、ZP_02358949.1、ZP_01769192.1、ZP_04893165.1、ZP_02265387.2、ZP_02511781.1、ZP_03456835.1、ZP_03794633.1、YP_990329.1、ZP_02408727.1、YP_002908243.1、ZP_04884056.1、YP_004348703.1、ZP_04905334.1、ZP_02376540.1、EGC99875.1、ZP_02907621.1、YP_001811696.1、ZP_02466678.1、ZP_02891475.1、YP_776393.1、YP_002234939.1、YP_001778804.1、YP_371314.1、ZP_04943305.1、YP_623139.1、ZP_02417235.1或ZP_04892059.1，或具有其中氨基酸残基的最多达25％、优选最多达20％、特别优选最多达15％、特别是最多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％通过缺失、插入、取代或其组合而相对于具体前面提及的登录号被修饰且仍具备有具有具体前面提及的登录号的酶的酶促活性的至少10％、优选50％、特别是优选80％、特别是多于90％的多肽序列，酶E2b的酶促活性被理解为意指3-羟基十四烷酰基-ACP经由3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸-ACP转化为羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸的能力，

酶E3选自：

至少一种酶E3a，其具有多肽序列ADP06388.1、YP_001347032.1、CBI71029.1、YP_002439138.1、CBI71031.1、NP_252168.1、CBI71034.1、CBI71028.1、AAA62129.1或ZP_04929750.1，或具有其中氨基酸残基的最多达25％、优选最多达20％、特别优选最多达15％、特别是最多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％通过缺失、插入、取代或其组合而相对于具体前面提及的登录号被修饰且仍具备有具有具体前面提及的登录号的酶的酶促活性的至少10％、优选50％、特别是优选80％、特别是多于90％的多肽序列，酶E3a的酶促活性被理解为意指dTDP-鼠李糖和3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸的能力，

至少一种酶E3b，其具有多肽序列AJY01590.1、ABR84881.1、NP_252168.1、FN601364.1、YP_440074.1、ZP_05590657.1、ZP_04520374.1、ZP_00438360.2、ZP_00438209.2、YP_001074761.1、ZP_04811084.1、YP_110558.1、YP_111361.1、ZP_02492857.1、YP_337246.1、YP_001061811.1、YP_105607.1、ZP_02371503.1、ZP_02503962.1、ZP_03456839.1、ZP_02461690.1、ZP_03794634.1、ZP_01769736.1、ZP_01769308.1、ZP_02358948.1、ZP_02487736.1、ZP_02408758.1、YP_002234937.1、ZP_02891477.1、YP_001778806.1、YP_623141.1、YP_838721.1、ZP_04943307.1、YP_776391.1、YP_004348704.1、ZP_02907619.1、YP_371316.1、ZP_02389948.1、YP_001811694.1、YP_002908244.1、ZP_02511808.1、ZP_02376542.1、EGC99877.1、ZP_02451760.1或ZP_02414414.1，或具有其中氨基酸残基的最多达25％、优选最多达20％、特别优选最多达15％、特别是最多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％通过缺失、插入、取代或其组合而相对于具体前面提及的登录号被修饰且仍具备有具有具体前面提及的登录号的酶的酶促活性的至少10％、优选50％、特别是优选80％、特别是多于90％的多肽序列，酶E3b的酶促活性被理解为意指dTDP-鼠李糖和3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸的能力，且

酶E4选自：

至少一种酶E4a，其具有多肽序列NP_249821.1，或具有其中氨基酸残基的最多达25％、优选最多达20％、特别优选最多达15％、特别是最多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％通过缺失、插入、取代或其组合而相对于参考序列NP_249821.1被修饰且仍具备有具有参考序列NP_249821.1的酶的酶促活性的至少10％、优选50％、特别是优选80％、特别是多于90％的多肽序列，酶E4a的酶促活性被理解为意指dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1-2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸的能力，

至少一种酶E4b，其具有多肽序列AJY02981.1、FN601387.1、FN601391.1YP_440071.1、ZP_02375899.1、ZP_02466676.1、YP_001075863.1、ZP_02408796.1、YP_335530.1、ZP_01769176.1、YP_105609.1、ZP_01770867.1、ZP_04520873.1、YP_110560.1、YP_001024014.1、ZP_03450125.1、YP_001061813.1、YP_111359.1、ZP_00440994.2、ZP_03456926.1、ZP_02358946.1、ZP_00438001.2、ZP_02461478.1、ZP_02503929.1、ZP_02511832.1、YP_004348706.1、ZP_04898742.1、YP_002908246.1、ZP_02382844.1、EGD05167.1、YP_001778808.1、YP_001811692.1、YP_002234935.1、YP_371318.1、YP_623143.1、YP_776389.1、ZP_02891479.1、ZP_02907617.1、ZP_02417424.1或ZP_04898743.1，或具有其中氨基酸残基的最多达25％、优选最多达20％、特别优选最多达15％、特别是最多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％通过缺失、插入、取代或其组合而相对于具体前面提及的登录号被修饰且仍具备有具有前面提及的登录号的酶的酶促活性的至少10％、优选50％、特别是优选80％、特别是多于90％的多肽序列，酶E4b的酶促活性被理解为意指dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1-2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸的能力。

显然，上文对酶E2a至E4b具体指明的活性仅仅是前面提及的酶的更宽活性谱的特定示例性选择；在每种情况下提及的活性是对于给定酶可获得可靠的测量方法的活性。因此，显然，转化具有未支链的饱和C10-烷基基团的底物的酶将同样转化-尽管可能具有降低的活性-具有C6-或C16-烷基基团的那些底物，其可能也可能是支链的或不饱和的。

根据本发明优选的细胞能够作为野生型不制备任何量或不制备可检测量的鼠李糖脂，并且，此外优选地，作为野生型，不具有酶E2、E3和E4的活性或不具有酶E2、E3和E4的可检测活性。

根据本发明，优选具有增加的以下酶组合的活性的细胞：

E2、E3、E4、E2E3、E2E4、E3E4和E2E3E4，

此组合中E3、E3E4和E2E3E4，特别是E2E3E4，是特别优选的。

在根据本发明的具有增加的酶组合E2E3E4的活性的细胞的一个优选实施方案中，n优选＝1。

在本发明的上下文中，术语“增加的酶的活性”优选应理解为意指增加的细胞内活性。

原则上，通过增加编码酶的基因序列的拷贝数，通过使用强启动子或改进的核糖体结合位点，通过减弱基因表达的负调节，例如，使用转录调节因子，或通过增强基因表达的正调节，例如使用转录调节因子，通过改变基因的密码子使用，通过以各种方式增加mRNA或酶的半衰期，通过改变基因的表达的调节或通过使用编码具有增加活性的相应酶的基因或等位基因和通过适当地组合这些量度，可以实现酶促活性的增加。根据本发明，通过与野生型相比增加编码酶的基因序列的拷贝数，优选增加活性的增加。先前未存在于野生型中的基因序列的拷贝的并入自身显然对应于拷贝数从0至1的增加。

例如通过转化、转导、缀合或这些方法的组合，用含有期望基因、该基因的等位基因或其部分和任选使得所述基因能够表达的启动子的载体产生根据本发明遗传修饰的细胞。具体而言，通过将基因或等位基因整合至细胞的染色体中或染色体外复制载体中来实现异源表达。

增加细胞中的酶活性的选项的概述在DE-A-100 31 999中通过实例的方式对于丙酮酸羧化酶给出，所述DE-A-100 31 999在此通过引用的方式引入并且其公开内容构成关于用于增加细胞中的酶活性的选项的本发明的公开内容的一部分。

上文指定的酶或基因以及下文指定的所有酶或基因的表达可借助于1维和2维蛋白凝胶分离以及随后使用适当的评估软件光学鉴定凝胶中的蛋白浓度来检测。如果酶活性的增加排他地基于相应基因表达的增加，则通过比较野生型和遗传修饰的细胞之间的1维或2维蛋白分离，可以以简单的方式定量所述酶活性的增加。在棒状细菌的情况下制备蛋白凝胶和鉴定所述蛋白的常规方法是Hermann等人(Electrophoresis,22:1712.23(2001))描述的程序。蛋白浓度同样可以通过如下分析：使用对待检测的蛋白特异性的抗体的Western印迹杂交(Sambrook等人,Molecular Cloning:a laboratory manual,2nd Ed.ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.USA,1989)和随后使用用于测定浓度的适当软件的光学评估(Lohaus和Meyer(1989)Biospektrum,5:32-39；Lottspeich(1999)Angewandte Chemie 111:2630-2647)。DNA-结合蛋白的活性可以通过DNA带迁移测定(也称为凝胶阻滞)的方式来测量(Wilson等人(2001)Journal ofBacteriology,183:2151-2155)。DNA-结合蛋白对其他基因的表达的影响可以通过各种充分描述的报告基因测定方法检测(Sambrook等人,Molecular Cloning:a laboratorymanual,第2版.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.USA,1989)。细胞内酶促活性可以通过各种描述的方法测定(Donahue等人(2000)Journal ofBacteriology 182(19):5624-5627；Ray等人(2000)Journal of Bacteriology 182(8):2277-2284；Freedberg等人(1973)Journal of Bacteriology 115(3):816-823)。如果在下面的解释中没有说明用于测定特定酶的活性的具体方法，则酶活性的增加以及酶活性的降低优选通过以下中描述的方法的方式测定：Hermann等人,Electophoresis,22:1712-23(2001),Lohaus等人,Biospektrum 5 32-39(1998),Lottspeich,Angewandte Chemie 111:2630-2647(1999)和Wilson等人,Journal of Bacteriology 183:2151-2155(2001)。

如果通过内源基因的突变实现酶促活性的增加，则根据经典方法以非定向方式，例如通过UV辐射或通过引起突变的化学品，或者特别地通过基因工程改造方法(诸如缺失、插入和/或核苷酸取代)的方式，可以产生此类突变。通过这些突变获得修饰的细胞。特别优选的酶的突变体还特别是不再经受反馈、产物或底物抑制或者与野生型酶相比至少更少的那些酶。

如果通过增加酶的合成来实现酶活性的增加，则例如相关基因的拷贝数增加或位于结构基因上游的启动子和调节区或核糖体结合位点被突变。并入结构基因上游的表达盒具有类似的效果。另外，通过诱导型启动子的方式，可以在任何期望时间增加表达。然而，此外，所谓的“增强子”也可以指定为酶基因作为调节序列，其同样经由RNA聚合酶和DNA之间的改进的相互作用引起基因表达增加。通过延长mRNA的寿命的措施也改进表达。此外，通过防止酶蛋白的降解，酶活性也得到加强。在这里，基因或基因构建体存在于不同拷贝数的质粒中或整合在染色体中并被扩增。或者，此外，可以通过改变培养基组合物和培养来实现相关基因的过表达。与其相关的说明可以由本领域技术人员尤其在Martin等人(Bio/Technology 5,137-146(1987))，Guerrero等人(Gene 138,35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(Bio/Technology 6,428-430(1988))，Eikmanns等人(Gene 102,93-98(1991))，EP-A-0 472 869，US 4,601,893，Schwarzer和Pühler(Bio/Technology 9,84-87(1991))，Reinscheid等人(Applied and Environmental Microbiology 60,126-132(1994))，LaBarre等人(Journal of Bacteriology175,1001-1007(1993))，WO-A-96/15246，Malumbres等人(Gene 134,15-24(1993))，JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58,191-195(1998))和已知的遗传学和分子生物学教科书中找到。上述措施，像突变一样，也导致遗传修饰的细胞。

为了增加特定基因的表达，使用例如附加型质粒。原则上，作为质粒或载体，本领域技术人员此目的可得的所有实施方案都是可能的。例如，此类质粒和载体可以从Novagen、Promega、New England Biolabs、Clontech或Gibco BRL的小册子中推断。进一步优选的质粒和载体可以在以下中找到：Glover,D.M.(1985)DNA cloning:a practicalapproach,Vol.I-III,IRL Press Ltd.,Oxford；Rodriguez,R.L.和Denhardt,D.T(编)(1988)Vectors:a survey of molecular cloning vectors and their uses,179-204,Butterworth,Stoneham；Goeddel,D.V.(1990)Systems for heterologous geneexpression,Methods Enzymol.185,3-7；Sambrook,J.；Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989),Molecular cloning:a laboratory manual,第2版,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York。

然后通过缀合或转化将含有待扩增的基因的质粒载体转移至期望菌株中。缀合的方法描述于例如等人,Applied and Environmental Microbiology 60:756-759(1994)。转化的方法描述于例如Thierbach等人,Applied Microbiology andBiotechnology 29:356-362(1988),Dunican和Shivnan,Bio/Technology 7:1067-1070(1989)和Tauch等人,FEMS Microbiology Letters 123:343-347(1994)。在通过“交叉”事件的方式同源重组之后，所得菌株包含至少两个拷贝的相关基因。

在本发明的上下文中，特别优选通过与野生型细胞相比增加编码所考虑的酶的区域的拷贝数(特别是与强启动子结合)，并且在已经存在于野生型中的酶的情况下，通过使用与野生型基因中存在的启动子相比更强的启动子，实现酶的活性的增加。

在上文和下文解释中使用的措辞“与其野生型相比增加的酶Ex的活性”应当优选总是被理解为意指特定酶Ex的活性增加至少2倍，特别是优选至少10倍，进一步优选至少100倍，仍进一步优选至少1000倍，且最优选至少10 000倍。此外，根据本发明的具有“与其野生型相比增加的酶Ex的活性”的细胞特别地还包括这样的细胞，其野生型没有或至少没有该酶Ex的可检测活性，并且其在例如通过过表达增加酶活性后，仅表现出该酶Ex的可检测活性。在该上下文中，在下面的解释中使用的术语“过表达”或措辞“表达增加”还包括这样的情况，起始细胞，例如野生型细胞，不展示或至少没有展示可检测的表达，并且酶Ex的可检测合成仅通过重组方法诱导。

不导致给定多肽的特性和功能的显著变化的给定多肽序列的氨基酸残基的修饰是本领域技术人员已知的。因此，例如，可以交换保守的氨基酸；此类合适的氨基酸取代的实例是：用Ser取代Ala；用Lys取代Arg；用Gln或His取代Asn；用Glu取代Asp；用Ser取代Cys；用Asn取代Gln；用Asp取代Glu；用Pro取代Gly；用Asn或Gln取代His；用Leu或Val取代Ile；用Met或Val取代Leu；用Arg或Gln或Glu取代Lys；用Leu或Ile取代Met；用Met或Leu或Tyr取代Phe；用Thr取代Ser；用Ser取代Thr；用Tyr取代Trp；用Trp或Phe取代Tyr；用Ile或Leu取代Val。还已知特别是在多肽的N或C末端以例如氨基酸插入或缺失的形式进行的修饰通常不会对多肽的功能具有显著影响。

与本发明的上下文中使用的酶有关的“氨基酸同一性”借助于已知方法确定。通常，使用具有考虑特定要求的算法的特殊计算机程序。

用于确定同一性的优选方法最初产生待比较的序列之间的最大比对。用于确定同一性的计算机程序包括但不限于GCG程序包，包括

GAP(Deveroy,J.等人,Nucleic Acid Research 12(1984),第387页),GeneticsComputer Group University of Wisconsin,Medicine(Wi)和BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.等人,Journal of Molecular Biology 215(1990),第403-410页)。BLAST程序可以从国家生物技术信息中心(NCBI)和其他来源(BLAST Handbook,Altschul S.等人,NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894；Altschul S.等人,上文)获得。

已知的Smith-Waterman算法同样可以用于确定同一性。

当使用BLASTP程序(Altschul,S.等人,Journal of Molecular Biology 215(1990),第403-410页)时，确定“氨基酸同一性”的优选参数是：

上述参数是用于氨基酸序列比较的默认参数。

GAP程序同样适用于用上述参数使用。

在本发明的上下文中，根据上述算法的60％的同一性意指60％同一性。这同样适用于更高同一性。

酶的活性可以通过如下测定：以本领域技术人员已知的方式破坏含有所述活性的细胞，例如借助于珠磨机、法式压榨机或超声波粉碎机，且然后除去完整的细胞、细胞碎片和破坏助剂，诸如玻璃珠，例如通过在11 000x g和4℃下离心10分钟。使用所得的无细胞粗提取物，然后可以实施酶测定，随后对产物进行LC-ESI-MS检测。或者，可以通过色谱方法(诸如镍-次氮基三乙酸亲和色谱、链霉抗生物素蛋白亲和色谱、凝胶-过滤色谱或离子交换色谱)以本领域技术人员已知的方式将所述酶富集或纯化至均一。

这是微不足道的，并且仅为了完整性而提及，为了测定与野生型细胞相比增加或减少的活性，使用野生型参考培养物，其已暴露于与待测定的样品相同的条件。

借助于来自Abcam的比色葡萄糖脱氢酶测定试剂盒(Art.#ab102532)，根据制造商的要求，使用无细胞提取物测定酶E1的活性。

使用如上所述获得的粗无细胞提取物测定酶E2的活性，如下：标准测定在120μL的最终体积中含有100μM大肠杆菌ACP，1mMβ-巯基乙醇，200μM丙二酰基-辅酶A，40μM辛酰基-辅酶A(用于E2a)或十二烷酰基-辅酶A(用于E2b)，100μM NADPH，2μg大肠杆菌FabD，2μg结核分枝杆菌FabH，1μg大肠杆菌FabG，0.1M磷酸钠缓冲液，pH 7.0，和5μg的酶E5。将ACP、β-巯基乙醇和磷酸钠缓冲液在37℃下预孵育30分钟，以完全降低ACP。通过添加酶E2开始反应。使用2ml已经使用HCl将其酸化至pH 2.0的水将反应停止，且然后使用2ml氯仿/甲醇(2:1(v:v))萃取两次。通过离心(16 100g,5min,RT)实施相分离。将下方有机相移取，在真空离心机中完全蒸发，并将沉降物溶于50μl甲醇中。通过离心沉降未溶解的成分(16 100g,5min,RT)，并通过LC-ESI-MS的方式分析样品。通过分析相应的质量迹线和MS²光谱来鉴定产物。

然后使用如上所述获得的无细胞粗提取物测定酶E3的活性，如下：标准测定可以由185μl 10mM Tris-HCl(pH 7.5)、10μl 125mM dTDP-鼠李糖和50μl粗蛋白提取物(约1mg总蛋白)或溶液中的纯化蛋白(5μg纯化蛋白)组成。通过添加10μl的3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸(对于E3a)或3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸(对于E3b)的10mM乙醇溶液开始反应，并在30℃下在摇动(600rpm)下孵育1小时。然后将反应物与1ml丙酮混合。通过离心沉降未溶解的成分(16 100g,5min,RT)，并通过LC-ESI-MS的方式分析样品。通过分析相应的质量迹线和MS2光谱来鉴定产物。

然后使用如上所述获得的粗无细胞提取物测定酶E4的活性，如下：标准测定可以由185μl 10mM Tris-HCl(pH 7.5)、10μl 125mM dTDP-鼠李糖和50μl粗蛋白提取物(约1mg总蛋白)或溶液中的纯化蛋白(5μg纯化蛋白)组成。通过添加10μl的α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸(对于E4a)或α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸(对于E4b)的10mM乙醇溶液开始反应，并在30℃下在摇动(600rpm)下孵育1小时。然后将反应物与1ml丙酮混合。通过离心沉降未溶解的成分(16 100g,5min,RT)，并通过LC-ESI-MS的方式分析样品。通过分析相应的质量迹线和MS2光谱来鉴定产物。

当另外对于E1，根据本发明的细胞已经遗传修饰，使得与其野生型相比，其具有增加的至少一种选自以下的酶的如下文详细给出的活性时是有利的：

至少一种酶E5，dTTP:α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷酰转移酶，EC2.7.7.24，特别选自由rmlA或rfbA基因编码或具有这样的多肽序列的酶，其中由rmlA或rfbA基因编码的酶的氨基酸残基的最多达25％、优选最多达20％、特别优选最多达15％、特别是最多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，且其仍具有由rmlA或rfbA基因编码的酶的酶促活性的至少10％、优选50％、特别是优选80％、特别是多于90％，酶E5的酶促活性被理解为意指将α-D-葡萄糖1-磷酸和dTTP转化为dTDP-葡萄糖的能力，

至少一种酶E6，dTDP-葡萄糖4,6-水解酶，EC 4.2.1.46，特别选自由rmlB或rfbB基因编码或具有这样的多肽序列的酶，其中由rmlB或rfbB基因编码的酶的氨基酸残基的最多达25％、优选最多达20％、特别优选最多达15％、特别是最多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，且其仍具有由rmlB或rfbB基因编码的酶的酶促活性的至少10％、优选50％、特别是优选80％、特别是多于90％，酶E6的酶促活性被理解为意指将dTDP-葡萄糖转化为dTDP-4-脱氢-6-脱氧-D-葡萄糖的能力，

至少一种酶E7，dTDP-4-脱氢鼠李糖3,5-差向异构酶，EC 5.1.3.13，特别选自由rmlC或rfbC基因编码或具有这样的多肽序列的酶，其中由rmlC或rfbC基因编码的酶的氨基酸残基的最多达25％、优选最多达20％、特别优选最多达15％、特别是最多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，且其仍具有由rmlC或rfbC基因编码的酶的酶促活性的至少10％、优选50％、特别是优选80％、特别是多于90％，酶E7的酶促活性被理解为意指将dTDP-4-脱氢-6-脱氧-D-葡萄糖转化为dTDP-4-脱氢-6-脱氧-L-甘露糖的能力，且

至少一种酶E8，dTDP-4-脱氢鼠李糖还原酶，EC 1.1.1.133，特别选自由rmlD或rfbD基因编码或具有这样的多肽序列的酶，其中由rmlD或rfbD基因编码的酶的氨基酸残基的最多达25％、优选最多达20％、特别优选最多达15％、特别是最多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，且其仍具有由rmlD或rfbD基因编码的酶的酶促活性的至少10％、优选50％、特别是优选80％、特别是多于90％，酶E8的酶促活性被理解为意指将dTDP-4-脱氢-6-脱氧-L-甘露糖转化为dTDP-6-脱氧-L-甘露糖的能力。

酶E5的活性使用如上对于酶E2至E4所述获得的样品通过如下测定：将α-D-葡萄糖1-磷酸(1.3mM)与dTTP(5mM)和5μg纯化的酶E5在50μl磷酸钠缓冲液(pH 8.5)中孵育，并在30℃下孵育5、10和20分钟之后通过添加20μl氯仿来终止反应。然后将混合物涡旋并在16000g和室温下离心5分钟。将水相转移至新的反应管中，并使用80μl水再次萃取有机相。合并两个水相并通过HPLC分析。这涉及使用Phenosphere ODS2柱(250x 4.6mm；Phenomenex,Torrance,USA)或Spheresorb ODS2柱(250x 4.6mm；Waters,Milford,USA)。使用0.5MKH₂PO₄(洗脱液A)以1ml min^–1的流速持续15分钟，随后为经14min的时段以0.7ml min^–1的流速的最高达80％洗脱液A和20％甲醇的线性梯度，洗脱分析物。然后将从ODS2柱洗脱的分析物注入Phenosphere SAX离子交换柱(250x 4.6mm；Phenomenex,Torrance,USA)中，并以1mlmin^–1的流速和用线性甲酸铵梯度(经25min，2至600mM)洗脱分析物。然后使用光电二极管阵列检测器(DAD)经由其UV吸收定量dTDP-葡萄糖。胸苷的吸收最大值为267nm。使用真实的核苷酸糖(Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)实施校准。

然后酶E6的活性使用如上对于酶E2至E4所述获得的样品通过如下测定：将dTDP-α-D-葡萄糖(1.3mM)与5μg纯化的酶E6在50μl磷酸钠缓冲液(pH 8.5)中孵育，并在30℃下孵育5、10和20分钟之后通过添加20μl氯仿来终止反应。然后将混合物涡旋并在16 000g和室温下离心5分钟。将水相转移至新的反应管中，并使用80μl水再次萃取有机相。合并两个水相并通过HPLC分析。这涉及使用Phenosphere ODS2柱(250x 4.6mm；Phenomenex,Torrance,USA)或Spheresorb ODS2柱(250x4.6mm；Waters,Milford,USA)。使用0.5M KH₂PO₄(洗脱液A)以1ml min^–1的流速持续15分钟，随后为经14min的时段以0.7ml min^–1的流速的最高达80％洗脱液A和20％甲醇的线性梯度，洗脱分析物。然后将从ODS2柱洗脱的分析物注入Phenosphere SAX离子交换柱(250x 4.6mm；Phenomenex,Torrance,USA)中，并以1ml min^–1的流速和用线性甲酸铵梯度(经25min，2至600mM)洗脱分析物。然后使用光电二极管阵列检测器(DAD)经由其UV吸收定量dTDP-葡萄糖和dTDP-4-脱氢-6-脱氧-D-葡萄糖。胸苷的吸收最大值为267nm。使用真实的核苷酸糖(Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)实施校准。

然后酶E7的活性使用如上对于酶E2至E4所述获得的样品通过如下测定：首先将dTDP-α-D-葡萄糖(1.3mM)与5μg纯化的酶E6在50μl磷酸钠缓冲液(pH 8.5)中在30℃下孵育10分钟。其后，添加0.5μg纯化的酶E7，并在30℃下孵育5、10和20分钟之后通过添加20μl氯仿来终止反应。然后将混合物涡旋并在16 000g和室温下离心5分钟。将水相转移至新的反应管中，并使用80μl水再次萃取有机相。合并两个水相并通过HPLC分析。这涉及使用Phenosphere ODS2柱(250x 4.6mm；Phenomenex,Torrance,USA)或Spheresorb ODS2柱(250x 4.6mm；Waters,Milford,USA)。使用0.5M KH₂PO₄(洗脱液A)以1ml min^–1的流速持续15分钟，随后为经14min的时段以0.7ml min^–1的流速的最高达80％洗脱液A和20％甲醇的线性梯度，洗脱分析物。然后将从ODS2柱洗脱的分析物注入Phenosphere SAX离子交换柱(250x 4.6mm；Phenomenex,Torrance,USA)中，并以1ml min^–1的流速和用线性甲酸铵梯度(经25min，2至600mM)洗脱分析物。然后使用光电二极管阵列检测器(DAD)经由其UV吸收定量dTDP-葡萄糖、dTDP-4-脱氢-6-脱氧-D-葡萄糖和dTDP-6-脱氧-L-甘露糖。胸苷的吸收最大值为267nm。使用真实的核苷酸糖(Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)实施校准。

然后酶E8的活性使用如上对于酶E2至E4所述获得的样品通过如下测定：首先将dTDP-α-D-葡萄糖(1.3mM)与5μg纯化的酶E6在50μl磷酸钠缓冲液(pH 8.5)中在30℃下孵育10分钟。其后，添加5μg纯化的酶E7和0.5μg纯化的酶E8以及NADPH(10mM)，并在30℃下孵育5、10和20分钟之后通过添加20μl氯仿来终止反应。然后将混合物涡旋并在16 000g和室温下离心5分钟。将水相转移至新的反应管中，并使用80μl水再次萃取有机相。合并两个水相并通过HPLC分析。这涉及使用Phenosphere ODS2柱(250x 4.6mm；Phenomenex,Torrance,USA)或Spheresorb ODS2柱(250x4.6mm；Waters,Milford,USA)。使用0.5M KH₂PO₄(洗脱液A)以1ml min^–1的流速持续15分钟，随后为经14min的时段以0.7ml min^–1的流速的最高达80％洗脱液A和20％甲醇的线性梯度，洗脱分析物。然后将从ODS2柱洗脱的分析物注入Phenosphere SAX离子交换柱(250x 4.6mm；Phenomenex,Torrance,USA)中，并以1ml min^–1的流速和用线性甲酸铵梯度(经25min，2至600mM)洗脱分析物。然后使用光电二极管阵列检测器(DAD)经由其UV吸收定量dTDP-葡萄糖、dTDP-4-脱氢-6-脱氧-D-葡萄糖、dTDP-6-脱氧-L-甘露糖和和dTDP-4-脱氢-6-脱氧-L-甘露糖。胸苷的吸收最大值为267nm。使用真实的核苷酸糖(Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)实施校准。

根据本发明，优选具有增加的以下酶组合的活性的细胞：

E5E6、E5E7、E5E8、E6E7、E6E8、E7E8、E5E6E7、E5E6E8、E6E7E8、E5E7E8、E5E6E7E8，

此组合中，E5E6E7E8是特别优选的。

特别优选地，前面提及的酶组合的增加活性可以与上述酶E2至E4的增加活性组合，其中组合E2E3E4E5E6E7E8是特别优选的。

当另外对于E1，根据本发明的细胞已经遗传修饰，使得与其野生型相比，其具有增加的至少一种酶E9(其为葡萄糖转运蛋白)的活性时是进一步有利且因此优选的。特别优选地，在此使用对于根据本发明的细胞是外源的葡萄糖转运蛋白，因此在野生型基因组中不存在的那些。

优选的酶E9特别选自由galP、glf、iolT1、glcP、gluP、SemiSWEET或glcU基因编码的酶和PTS系统(由组分酶I、HPr、酶IIA、酶IIB和酶IIC组成，酶IIA、IIB和IIC可能作为融合蛋白存在)或具有这样的多肽序列的酶，其中galP、glf、iolT1、glcP、gluP、SemiSWEET或glcU基因编码的酶和PTS系统的氨基酸残基的最多达25％、优选最多达20％、特别优选最多达15％、特别是最多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，且其仍具有galP、glf、iolT1、glcP、gluP、SemiSWEET或glcU基因编码的酶和PTS系统的酶促活性的至少10％、优选50％、特别是优选80％、特别是多于90％，酶E9的酶促活性被理解为意指使2-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基)-2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)进入细胞的能力。

对于前面提及的多肽序列，iolT1基因尤其是来自谷氨酸棒杆菌的iolT1基因，glcP基因尤其是来自耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、冷海希瓦氏菌(S.frigidimarina)或亚马逊希瓦氏菌(S.amazonensis)的glcP基因，其中gluP基因尤其是来自流产布鲁氏菌(B.abortus)的gluP基因，SemiSWEET基因是来自双曲钩端螺旋体(L.biflexa)的SemiSWEET基因，且glcU基因尤其是来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或木糖葡萄球菌(S.xylosus)的glcU基因。

酶E9的活性可以借助于来自Cayman Chemicals的葡萄糖摄取细胞-基质测定试剂盒，项目号600470，特别是根据2015年10月9日的制造商说明书来测定。

结合增加的至少一种酶E9的活性，当根据本发明的细胞作为野生型具有酶E10、ABC葡萄糖转运蛋白且其特征在于已经遗传修饰，使得与其野生型相比，其具有降低的酶E10(其使2-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基)-2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)进入细胞)的活性时，根据本发明可能是有利的，且因此是优选的。酶E10的活性可以如上对于E9所述测定。本领域技术人员清楚的是，为此目的，直接针对E10的活性降低的遗传修饰仅仅不同的细胞与彼此直接比较以确定活性是否存在差异。

特别优选地，前面提及的酶的修饰活性是组合

E2E3E4E9E10、E5E6E7E8E9E10和E2E3E4E5E6E7E8E9E10的修饰活性，其中E2E3E4E5E6E7E8E9E10是特别优选的。

此外，当根据本发明的细胞是作为野生型能够制备具有C6至C16的单链烷酸酯的链长的多羟基链烷酸酯时，其根据本发明是有利的。此类细胞是例如伯克霍尔德氏菌属，泰国伯克霍尔德氏菌，假单胞菌属，恶臭假单胞菌，铜绿假单胞菌，食油假单胞菌，施氏假单胞菌，荧光假单胞菌，香茅醇假单胞菌，树脂假单胞菌，睾丸酮丛毛单胞菌，嗜水气单胞菌，钩虫贪铜菌，广泛产碱菌和真养罗尔斯通菌。在该上下文中，优选的本发明细胞经遗传修饰，使得它们与其野生型相比能够制备更少的多羟基链烷酸酯。

此类细胞例如作为GPp121、GPp122、GPp123和GPp124描述于Ren等人,JournalApplied Microbiology and Biotechnology 1998Jun,49(6):743-50，作为GPp104描述于Huisman等人,J Biol Chem.1991Feb 5；266(4):2191-8，且作为KT42C1描述于De Eugenio等人,Environ Microbiol.2010.12(1):207-21，且作为KTOY01和KTOY02描述于Ouyang等人Macromol Biosci.2007.7(2):227-33。

这种与其野生型相比能够制备更少的多羟基链烷酸酯的细胞的特征在于，与其野生型相比，其具有降低的至少一种酶E11的活性，

E11是EC:2.3.1.-的多羟基链烷酸合成酶，其优选由phaC基因、尤其是phAc1或phaC2基因编码，或具有这样的多肽序列，其中由phaC基因、尤其是phAc1或phaC2基因编码的酶的氨基酸残基的最多达25％、优选最多达20％、特别优选最多达15％、特别是最多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，且其仍具有由phaC基因、尤其是phAc1或phaC2基因编码的酶的酶促活性的至少10％、优选50％、特别是优选80％、特别是多于90％，酶E11的酶促活性被理解为意指将3-羟基链烷酰基-辅酶A转化为多-3-羟基烷酸、尤其是3-羟基癸酰基-辅酶A转化为多-3-羟基癸酸的能力。

特别优选的酶E11选自这样的酶，其具有多肽序列AAM63407.1或AAM63409.1或具有其中氨基酸残基的最多达25％、优选最多达20％、特别优选最多达15％、特别是最多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％通过缺失、插入、取代或其组合而相对于具体前面提及的登录号被修饰且仍具备有具有具体前面提及的登录号的酶的酶促活性的至少10％、优选50％、特别是优选80％、特别是多于90％的多肽序列。

酶E11的活性可以通过分光光度法测定。在添加所有组分之后，测定混合物含有108mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0，在25℃)，33mM葡萄糖酸钠，0.22mM 2,6-二氯苯酚吲哚苯酚(钠盐)，1.3mM吩嗪硫酸甲酯和0.005％(w/v)牛血清白蛋白。将测定混合物在25℃下平衡，直至在600nm处的吸光度保持恒定。然后通过添加含有待测量的活性的无细胞提取物开始反应，并在600nm和25℃下记录吸光度的下降约5分钟。假设在600nm处的摩尔吸光系数为10mM^-1cm^-1，则通过分光光度法测定2,6-二氯苯酚吲哚苯酚的浓度。1单位的酶活性被定义为导致在25℃和pH6.0下每分钟还原1.0μmol的2,6-二氯苯酚吲哚苯酚的酶的量。

当另外对于E1，根据本发明的细胞已经遗传修饰，使得与其野生型相比，其具有降低的至少一种酶E12(其为EC 1.1.1.215的葡萄糖酸2-脱氢酶)的活性时是进一步有利且因此优选的。

优选的酶E12特别选自由gcd基因编码或具有这样的多肽序列的酶，其中由gcd基因编码的酶的氨基酸残基的最多达25％、优选最多达20％、特别优选最多达15％、特别是最多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰，且其仍具有由gcd基因编码的酶的酶促活性的至少10％、优选50％、特别是优选80％、特别是多于90％，酶E12的酶促活性被理解为意指将葡萄糖酸转化为2-脱氢葡糖酸的能力。

酶E12的活性可以通过定量3-羟基癸酰基-辅酶A的聚合中释放的辅酶A(CoA)来测定。测定混合物含有2mM 3-羟基癸酰基-CoA、40mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)、10mM 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)和1mg/ml牛血清白蛋白。通过添加含有待测量的活性的无细胞提取物开始反应，并在412nm和30℃下记录吸光度。假设在412nm处的摩尔吸光系数为13600M^-1cm^-1，则通过分光光度法测定CoA的浓度。1单位的酶活性被定义为导致在30℃和pH7.5下每分钟释放1.0μmol的CoA的酶的量。

当另外对于E1，根据本发明的细胞已经遗传修饰，使得与其野生型相比，其具有增加的至少一种酶E13(其催化通式(I)的鼠李糖脂从细胞输出至周围培养基中)的活性时是进一步有利且因此优选的。

在根据本发明优选的细胞的情况下，E13选自酶E13，其具有多肽序列AAG04520.1、AJY02996.1、ZP_05590661.1、YP_439278.1、YP_440069.1、ZP_04969301.1、ZP_04520234.1、YP_335528.1、YP_001075859.1、YP_001061817.1、ZP_02487499.1、YP_337251.1、ZP_04897712.1、ZP_04810190.1、YP_990322.1、ZP_02476924.1、ZP_04899735.1、ZP_04893873.1、ZP_02365982.1、YP_001062909.1、YP_105611.1、ZP_03794061.1、ZP_03457011.1、ZP_02385401.1、ZP_02370552.1、YP_105236.1、ZP_04905097.1、YP_776387.1、YP_001811690.1、YP_004348730.1、YP_004348708.1、YP_371320.1、YP_623145.1、YP_001778810.1、YP_002234933.1、CCE52909.1、YP_002908248.1、ZP_04954557.1、ZP_04956038.1、ZP_02408950.1、ZP_02375897.1、ZP_02389908.1、YP_439274.1、YP_001074762.1、YP_337247.1、YP_110559.1、ZP_02495927.1、YP_111360.1、YP_105608.1、ZP_02487826.1、ZP_02358947.1、YP_001078605.1、ZP_00438000.1、ZP_00440993.1、ZP_02477260.1、YP_371317.1、YP_001778807.1、ZP_02382843.1、YP_002234936.1、YP_623142.1、ZP_02907618.1、ZP_02891478.1、YP_776390.1、ZP_04943308.1、YP_001811693.1、ZP_02503985.1、YP_004362740.1、YP_002908245.1、YP_004348705.1、ZP_02408798.1、ZP_02417250.1、EGD05166.1、ZP_02458677.1、ZP_02465793.1、YP_001578240.1、ZP_04944344.1、YP_771932.1、ZP_02889166.1、YP_002232614.1、ZP_03574808.1、ZP_02906105.1、YP_001806764.1、YP_619912.1、、YP_001117913.1、YP_106647.1、YP_001763368.1、ZP_02479535.1、ZP_02461743.1、YP_560998.1、YP_331651.1、ZP_04893070.1、YP_003606714.1、ZP_02503995.1、ZP_06840428.1、YP_104288.1、ZP_02487849.1、ZP_02353848.1、YP_367475.1、ZP_02377399.1、ZP_02372143.1、YP_001897562.1、ZP_02361066.1、YP_440582.1、ZP_03268453.1、AET90544.1、YP_003908738.1、YP_004230049.1、ZP_02885418.1、CDH72316.1、WP_001297013.1、WP_010955775.1、WP_010955671.1、WP_010955672.1、WP_010955673.1、WP_010952401.1、WP_010952402.1、WP_010952403.1、WP_010952855.1、WP_010954573.1、WP_010954631.1、WP_010954632.1、WP_010954404.1、WP_004575310.1或ZP_02511831.1，或具有其中氨基酸残基的最多达25％、优选最多达20％、特别优选最多达15％、特别是最多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％通过缺失、插入、取代或其组合而相对于具体前面提及的登录号被修饰且仍具备有具有具体前面提及的登录号的酶的酶促活性的至少10％、优选50％、特别是优选80％、特别是多于90％，酶E13的酶促活性被理解为意指将通式(I)的鼠李糖脂从细胞输出至周围培养基的能力。

然后可以使用如上所述获得的粗无细胞提取物通过测定所制备的酶E13的量来测定酶E13的活性。这基于这样的假设：每个生物量单元更多的酶E13能够将更多通式(I)的鼠李糖脂从细胞输出至周围培养基中。这种定量可以通过借助对酶E13特异性的抗体的免疫学检测(参见Kurien,T.B.,Scofield,R.H(编).Protein Blotting and Detection:Methods and Protocols.Methods in Molecular Biology,Vol.536.第1版,HumanaPress.N.Y.USA,2009)或通过质谱法(参见Schmidt,A.,Kellermann,J.&Lottspeich,F.Anovel strategy for quantitative proteornics using isotope-coded proteinlabels.Proteomics5,4-15(2005))来实施。

或者，酶E13的活性还可以通过使用放射性标记的鼠李糖脂和由根据本发明的细胞产生的由内向外的囊泡实施摄取测定来测定。一般程序例如描述于Nies DH.Thecobalt,zinc,and cadmium efflux system CzcABC from Alcaligenes eutrophusfunctions as a cation-proton antiporter in Escherichia coli.JBacteriol.1995.177(10):2707-12或Lewinson O,Adler J,Poelarends GJ,MazurkiewiczP,Driessen AJ,Bibi E.The Escherichia coli multidrug transporter MdfAcatalyzes both electrogenic and electroneutral transport reactions.Proc NatlAcad Sci U S A.2003Feb 18；100(4):1667-72。

特别优选地，前面提及的酶的修饰活性是组合

E2E3E4E13、E2E3E4E9E10E13、E5E6E7E8E9E10E13和E2E3E4E5E6E7E8E9E10E13，

其中E2E3E4E5E6E7E8E9E10E13是特别优选的。

根据本发明的细胞可以有利地用于生产鼠李糖脂。

因此，本发明进一步提供了根据本发明的细胞用于产生通式(I)的化合物的用途。

本发明进一步提供了用于生产鼠李糖脂、特别是通式(I)的那些的方法，

其中

m＝2、1或0，特别是1或0，

n＝1或0，特别是1，

R1和R2＝互相独立、相同或不同的具有2至24、优选5至13个碳原子的有机基团，特别是任选地支链的，任选地取代的，特别是羟基取代的，任选地不饱和的，特别是任选地单-、双-或三-不饱和的烷基基团，优选选自戊烯基、庚烯基、壬烯基、十一烯基和十三烯基和(CH₂)o-CH₃(其中o＝1至23，优选4至12)的那些，

所述方法包括以下步骤

I)使根据本发明的细胞与含有碳源的培养基接触

II)在允许细胞从碳源制备鼠李糖脂的条件下培养细胞，和

III)任选地分离制备的鼠李糖脂。

根据本发明的遗传修饰的细胞可以与培养基接触，且因此出于产生上述产物的目的在分批方法或进料-分批方法或重复进料-分批方法中以连续或不连续方式培养。还可设想的是半连续方法，如GB-A-1009370中所述。已知培养方法的概述在Chmiel的教科书(“Bioprozesstechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik”[Bioprocesstechnology 1.Introduction to Bioprocess Technology](Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991))或Storhas的教科书(“Bioreaktoren und periphere Einrichtungen”[Bioreactors and Peripheral Devices](Vieweg Verlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994))中可得。

待使用的培养基必须以合适的方式满足特定菌株的需要。各种酵母菌株的培养基的描述例如包括在“Nonconventional yeast in biotechnology”(编辑Klaus Wolf,Springer-Verlag Berlin,1996)中。

使用的碳源可以是碳水化合物，诸如例如葡萄糖，蔗糖，阿拉伯糖，木糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉，纤维素和半纤维素，植物和动物油和脂肪，诸如例如大豆油，红花油，花生油，大麻油，麻疯树油，椰子油，南瓜籽油，亚麻籽油，玉米油，罂粟籽油，月见草油，橄榄油，棕榈仁油，棕榈油，油菜籽油，芝麻油，向日葵油，葡萄籽油，核桃油，小麦胚芽油和椰子油，脂肪酸，诸如例如辛酸，癸酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，棕榈油酸，硬脂酸，花生四烯酸，山萮酸，油酸，亚油酸，亚麻酸，γ-亚麻酸及其甲基或乙基酯，以及脂肪酸混合物，含有刚刚提及的脂肪酸的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯，醇类，诸如例如甘油，乙醇和甲醇，烃类诸如甲烷，含碳气体和气体混合物，诸如CO，CO₂，合成或烟道气，氨基酸诸如L-谷氨酸或L-缬氨酸或有机酸诸如例如乙酸。这些物质可以单独使用或作为混合物使用。特别优选使用碳水化合物，尤其是单糖、寡糖或多糖，作为碳源，如US 6,01,494和US 6,136,576中所述，以及烃类，尤其是烷烃、烯烃和炔烃以及由其衍生的一元羧酸和衍生自所述一元羧酸和甘油和乙酸酯的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯。非常特别优选含有甘油与辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、花生四烯酸、山萮酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和/或γ-亚麻酸的酯化产物的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯。

本发明的一个主要优点是根据本发明的细胞能够从最简单的碳源诸如例如葡萄糖、蔗糖或甘油制备鼠李糖脂，意味着在根据本发明的方法期间不必在介质中提供更长链的碳源。因此，在可得性不足的情况下，有利的是，根据本发明的方法的步骤I)中的介质不含或不含可检测量的具有大于6个碳原子的链长的羧酸或可由其衍生的酯或甘油酯。

使用的氮源可以是有机含氮化合物，诸如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素，或无机化合物，诸如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵、氨、氢氧化铵或氨水。氮源可以单独使用或作为混合物使用。

所使用的磷源可以是磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。此外，培养基必须含有金属盐，诸如例如生长所必需的硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上面提及的物质以外，还可以使用必需的生长物质诸如氨基酸和维生素。此外，可以将合适的前体添加至培养基中。上面提及的起始材料可以以单批的形式添加至培养物中，或者在培养期间适当地加料。

为了控制培养物的pH，适当地使用碱性化合物，诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或酸性化合物，诸如磷酸或硫酸。为了控制泡沫的发展，可以使用消泡剂，诸如例如脂肪酸聚乙二醇酯。为了维持质粒的稳定性，可以向培养基中添加合适的选择性物质，诸如例如抗生素。为了维持需氧条件，将氧或含氧气体混合物(例如空气)引入培养物中。

培养的温度通常高于20℃，优选高于25℃，并且其也可高于40℃，有利地不超过95℃，特别优选90℃，且最优选80℃的培养温度。

在根据本发明的方法的步骤III)中，由细胞制备的鼠李糖脂可以任选地从细胞和/或培养基分离，可以出于分离的目的使用本领域技术人员已知用于从复杂组合物分离低分子量物质的所有方法，诸如例如过滤、萃取、吸附(色谱)或结晶。

此外，产物相含有生物量的残余物和各种杂质，诸如油、脂肪酸和其他培养基成分。优选在无溶剂方法中除去杂质。例如，产物相可以用水稀释，以促进pH调节。然后可以通过借助酸或碱降低或升高pH将鼠李糖脂转移成水溶性形式将产物相和水相均质化。潜在地，可以通过在相对高的温度(例如在60至90℃)下孵育和持续混合来支持鼠李糖脂在水相中的溶解。由于随后借助碱或酸升高或降低pH，然后可以将鼠李糖脂再次转移成水不溶性形式，并且因此它们可以容易地与水相分离。然后可以将产物相另外用水洗涤一次或多次，以除去水溶性杂质。

例如，可以通过借助合适的溶剂，有利地借助有机溶剂萃取来除去油残余物。烷烃，诸如例如正己烷优选作为溶剂。

作为上述无溶剂方法的替代方案，可以使用合适的溶剂(例如酯，诸如例如乙酸乙酯或乙酸丁酯)从水相移取产物。所述提取步骤可以以任何期望的顺序实施。

在这里，优选使用溶剂，特别是有机溶剂。优选的溶剂是正戊醇。通过例如蒸馏除去溶剂。其后，可以进一步纯化冻干产物，例如借助色谱方法。此时可以提及的实例包括使用合适的溶剂进行沉淀，使用合适的溶剂进行提取，络合，例如借助环糊精或环糊精衍生物进行络合，结晶，通过色谱方法进行纯化或分离，或将鼠李糖脂转移至易于可除去的衍生物中。

方法步骤III)中特别合适的鼠李糖脂分离程序包括以下的方法子步骤

A)将鼠李糖脂转移至具有小于6的pH的水性介质中，

B)使介质与至少一种有机溶剂接触以获得多相体系并移取水相，

C)将pH增加至6或更高的pH，以获得多相有机体系，

D)移取富含鼠李糖脂的有机相，和

E)任选地进一步纯化鼠李糖脂。

在US20140148588中给出如何实施方法步骤III)的该优选实施方案的详细描述。

本发明同样提供了使用根据本发明的方法可获得的鼠李糖脂，特别是还提供了使用根据本发明的方法可获得的上述鼠李糖脂混合物。

有利地，使用根据本发明的方法可获得的鼠李糖脂和混合物可用于清洁剂、化妆品或药物制剂和作物保护制剂中。

因此，本发明进一步提供了使用根据本发明的方法获得的鼠李糖脂用于生产化妆品、皮肤病学或药物制剂、作物保护制剂以及护理产品和清洁剂和表面活性剂浓缩物的用途。

下文举出的实施例通过实施例的方式描述了本发明，但并不意图将本发明(其申请范围从整个说明书和权利要求中显而易见)限于实施例中指定的实施方案。

下图是实施例的组分：

图1：平行实验(运行#1-3)中菌株PP-155和PP-099[Δgcd]的总产率和平均值的比较

实施例：

实施例1(非本发明)：利用菌株BS-PP-155(恶臭假单胞菌KT2440Δupp+pACYCATh5-{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlABC_Pa]{Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk}；克隆1)。

菌株BS-PP-155的构建

为了异源表达均来自铜绿假单胞菌的基因rhlA、rhlB和rhlC以及基因rmlB、rmlD、rmlA和rmlC，构建质粒pACYCATh5-{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlABC_Pa]{Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk}。该质粒首先含有由来自铜绿假单胞菌DSM1128的基因rhlA和rhlB(编码鼠李糖基转移酶1)和rhlC(编码鼠李糖基转移酶2)组成的合成操纵子(SEQ ID No 1)，且其次含有由来自铜绿假单胞菌DSM 19880的基因rmlB(编码dTDP-D-葡萄糖4,6-脱水酶)、rmlD(编码dTDP-4-脱氢鼠李糖还原酶)、rmlA(编码葡萄糖-1-磷酸胸苷酰基转移酶)和rmlC(编码dTDP-4-脱氢鼠李糖3,5-差向异构酶)组成的操纵子(SEQ IDNo 2)。基因rhlABC处于鼠李糖诱导型P_Rha启动子的控制之下；rmlBDAC基因处于阿拉伯糖诱导型P_BAD启动子的控制之下。位于两个操纵子结构下游的是终止子序列(rrnB T1T2)。从铜绿假单胞菌DSM19880的基因组DNA扩增rmlBDAC基因，并通过基因合成获得合成的rhlABC操纵子。从基因组大肠杆菌DNA扩增P_Rha启动子盒(SEQ ID No 3)和P_BAD启动子盒(SEQ ID No4)以及终止子序列(SEQ ID No 5)。尽管rhlABC基因是合成二鼠李糖脂所需的，但rmlBDAC基因是提供活化的dTDP-L-鼠李糖所需的。

载体基于质粒pACYC184(New England Biolabs,Frankfurt am Main,Germany)并携带用于在大肠杆菌中复制的p15A复制起点和用于在恶臭假单胞菌中复制的pVS1复制起点。从假单胞菌质粒pVS1扩增pVS1复制起点(Itoh Y,Watson JM,Haas D,Leisinger T,Plasmid 1984,11(3),206-20)。使用市售的体外DNA装配试剂盒(例如，NEBuilder HiFiDNA装配克隆试剂盒，根据制造商的说明书(NEB；Frankfurt am Main,Germany)克隆载体部分和DNA片段。以本领域技术人员已知的方式转化化学感受态大肠杆菌10β细胞(NEB,Frankfurt am Main,Germany)。通过限制性分析检查靶基因的正确插入，并通过DNA测序证实引入的同源区的真实性。所得质粒pACYCATh5-{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlABC_Pa]{Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk}(SEQ ID No 6)的大小为17 337bp。

其后，将质粒引入恶臭假单胞菌KT2440Δupp中。该菌株用作用于在恶臭假单胞菌中构建无标记基因缺失的起始菌株(Graf&Altenbuchner,2011,Applied andEnvironmental Microbiology,Vol 77,No.15,5549-5552,DOI:10.1128/AEM.05055-11)。该方法基于恶臭假单胞菌的阴性反选择系统，其利用尿嘧啶磷酸核糖基转移酶的活性和恶臭假单胞菌对抗代谢物5-氟尿嘧啶的敏感性。upp基因的缺失对鼠李糖脂生物合成没有影响。

实施用载体pACYCATh5-{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlABC_Pa]{Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk}转化恶臭假单胞菌KT2440Δupp，如Iwasaki等人(Iwasaki K,Uchiyama H,Yagi O,Kurabayashi,T,Ishizuka K,Takamura Y,Biosci.Biotech.Biochem.1994.58(5):851-854)中所述。分离并分析来自10个克隆中每一个的质粒DNA。携带该质粒的菌株被称为恶臭假单胞菌KT2440Δupp pACYCATh5-{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlABC_Pa]{Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk}。

表面活性剂的生物技术生产在来自Eppendorf的8倍平行发酵系统“DASGIP”中实施。

对于发酵，使用1L反应器。借助用pH 4.0和pH 7.0的测量溶液的两点校准来校准pH探针。将反应器填充300mL水并在121℃下高压灭菌20分钟以确保无菌。第二天早上在干净工作台上除去水，并用无菌发酵培养基(高压灭菌：2.2g/L(NH₄)₂SO₄,0.02g/L NaCl,0.4g/L MgSO₄x 7H₂O,0.04g/L CaCl₂×2H₂O，分别灭菌：2g/L KH₂PO₄,15g/L葡萄糖,10mL/L痕量元素溶液M12[无菌过滤：0.2g/L ZnSO₄x 7H₂O,0.1g/L MnCl₂x 4H₂O,1.5g/L Na₃柠檬酸盐x 2H₂O,0.1g/L CuSO₄x 5H₂O,0.002g/L NiCl₂x 6H₂O,0.003g/L Na₂MoO₄x 2H₂O,0.03g/LH₃BO₃,1g/L FeSO₄x 7H₂O])替代。随后，借助一点校准(搅拌器：600rpm/通气：10sL/h空气)校准pO₂探针，并借助就地清洁来清洁进料、校正剂和诱导剂管线。为此，将软管用70％乙醇冲洗，然后用1M NaOH冲洗，然后用无菌软化水冲洗，且最后用特定介质填充。

使用来自低温培养物的100μL，首先将菌株(恶臭假单胞菌KT2440Δupp+pACYCATh5-{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlABC_Pa]{Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk}在含有50mg/L卡那霉素的250mL带挡板的烧瓶中在25mL LB1培养基(10g/L酪蛋白水解物、5g/L酵母提取物、1g/L NaCl)中在30℃和200rpm下过夜生长近似18h。在测量培养物的光密度之后，在500mL带挡板的烧瓶中使用0.2的起始OD₆₀₀从LB预培养物接种50mL无菌种子培养基(高压灭菌：4.4g/L Na₂HPO₄*2H₂O,1.5g/L KH₂PO₄,1g/L NH₄Cl,10g/L酵母提取物,分别灭菌：20g/L葡萄糖,0.2g/L MgSO₄*7H₂O,0.006g/L FeCl₃,0.015g/LCaCl₂,1mL/L痕量元素溶液SL6[无菌过滤：0.3g/L H₃BO₃,0.2g/L CoCl₂x 6H₂O,0.1g/LZnSO₄x 7H₂O,0.03g/L MnCl₂x 4H₂O,0.01g/L CuCl₂x 2H₂O,0.03g/L Na₂MoO₄x 2H₂O,0.02g/L NiCl₂x 6H₂O])，并在30℃和200rpm下孵育近似7小时。在近似OD₆₀₀ 8的光密度下，使用0.7的起始OD₆₀₀接种主培养物。

为了使用0.7的光密度接种反应器，将近似26mL填充在30mL注射器中，并借助针穿过隔膜接种反应器。

使用以下标准程序：

脚本
		触发激活的	31％DO(1/60h)
诱导，鼠李糖，阿拉伯糖	进料开始后3小时
		进料触发器	50％DO
进料速率	1.5[mL/h]

使用氨(12.5％)将pH单侧调节至pH 7.0。在培养和生物转化期间，培养物中的溶解氧经由搅拌速度和通气速率保持恒定在30％。发酵作为进料分批实施，其中从进料开始，经由DO峰触发借助500g/L葡萄糖进料用2.5g/Lh葡萄糖进料。在进料开始后3小时通过自动添加0.2％(w/v)鼠李糖和0.2％(w/v)阿拉伯糖来诱导重组引入的基因的表达。诱导糖的所需量基于发酵起始体积。对于两种糖，使用220g/L储备溶液。表面活性剂的生产从诱导时开始。所有在线测量数据，诸如pH、DO、CTR、OTR，以及基质的流速和量，诸如用于pH调节的氨溶液，葡萄糖进料或诱导物流速，由DASGIP发酵系统记录。

对于发酵分析，使用10mL注射器从每个容器中抽取并丢弃2mL作为预示。对于实际分析，这随后以6mL再一次进行。测定鼠李糖脂含量、葡萄糖浓度和干生物量。发酵在65小时之后结束。

借助HPLC测定鼠李糖脂浓度。将100μL发酵样品与900μL 70％(v/v)正丙醇在Eppendorf管中混合，并在Retsch研磨机中以30Hz摇动1分钟。其后，将样品以13 000rpm离心5分钟，并将上清液转移至新鲜的Eppendorf管中。在进一步稀释必需的情况下，这使用55％正丙醇进行。快速关闭所有管以避免蒸发。然后将样品转移至HPLC小瓶中并在-20℃下储存直至测量。

使用正排量式移液管(Combitip)将1ml丙酮装入2ml反应管中，并立即关闭反应管以使蒸发最小化。这随后添加1ml培养液。在涡旋培养液/丙酮混合物之后，将所述混合物以13 000rpm离心3分钟，并将800μl上清液转移至HPLC小瓶中。

蒸发光散射检测器(Sedex LT-ELSD Model 85LT)用于检测和定量鼠李糖脂。使用Agilent Technologies 1200系列(Santa Clara,California)和Zorbax SB-C8RapidResolution柱(4.6x 150mm,3.5μm,Agilent)实施实际测量。注射体积为5μl，且方法运行时间为20分钟。使用0.1％TFA水溶液(三氟乙酸，溶液A)和甲醇(溶液B)作为流动相。柱温为40℃。ELSD(检测器温度60℃)和DAD(二极管阵列，210nm)充当检测器。该方法中使用的梯度为：

t[min]	溶液B体积％	流速[ml/min]
			0.00	70％	1.00
15.00	100％	1.00
			15.01	70％	1.00
20.00	70％	1.00

通过将近似1ml样品移液至预先称重的Eppendorf管中并测定初始重量来测定干生物量。其后，将样品与近似1mL自来水掺和，混合，并以13 000rpm离心5分钟。弃去上清液并粗略擦拭Eppendorf管。再一次添加1mL自来水，并在Retsch研磨机中以30Hz实施再悬浮1分钟。其后，以13 000rpm实施离心10分钟，弃去上清液，且然后将Eppendorf管擦干，例如用棉签擦拭，同时不从Eppendorf管中取出生物量。将样品在105℃下干燥48小时并在冷却后重新称重。在每种情况下实施重复测定。

然后在Excel中实施干生物量计算：

在离心和无菌过滤发酵样品之后，借助于如制造商所规定的Roche Cedex Bio HT测量葡萄糖浓度。

实施3次实验，每次与实施例2平行。

实施例2：利用菌株BS-PP-099(恶臭假单胞菌KT2440ΔuppΔgcd+pACYCATh5-{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlABC_Pa]{Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk})

用于在恶臭假单胞菌KT2440Δupp中缺失gcd基因的载体的构建

通过PCR扩增gcd基因上游和下游近似680bp，制备用于从恶臭假单胞菌KT2440Δupp缺失编码葡萄糖脱氢酶的gcd基因的载体。

以下引物用于扩增gcd基因上游和下游的同源区域：

PCR 1：gcd上游的区域

4*54 5'-GCCGCTTTGGTCCCGGGTTTCAAGCTCAGCGG-3'(SEQ ID No 7)

4*57 5'-AAGGCGCGATCGCGGGTTAGAAACTGCTCTGG-3'(SEQ ID No 8)

PCR 2：gcd下游的区域

4*56 5'-CCGCGATCGCGCCTTGTGTCGCGTTTC-3'(SEQ ID No 9)

4*55 5'-GCTTGCATGCCTGCAATGCCGTAGGCTTTGACC-3'(SEQ ID No 10)

以下参数用于PCR：

为了扩增，根据制造商的推荐使用来自NEB(Frankfurt am Main,Germany)的Phusion^TM High-Fidelity Master Mix。然后在1％TAE琼脂糖凝胶上分离50μl的每种PCR反应。以本领域技术人员已知的方式进行PCR、琼脂糖凝胶电泳、DNA的溴化乙锭染色和PCR片段大小的测定。扩增预期大小的PCR片段(PCR 1,679bp(SEQ ID No 11)；PCR 2,682bp,(SEQID No 12))。使用来自Qiagen的“QIAquick PCR纯化试剂盒”如制造商所指明纯化PCR产物。根据制造商的说明书(NEB；Frankfurt am Main,Germany)使用NEBuilder HiFi DNA装配克隆试剂盒，将纯化的PCR产物克隆至BamHI-和SbfI-切割的pKOPp载体(SEQ ID No.13)中。以本领域技术人员已知的方式转化化学感受态大肠杆菌10β细胞(NEB,Frankfurt am Main,Germany)。通过限制性分析检查靶基因的正确插入，并通过DNA测序证实引入的同源区的真实性。所得敲除载体被称为pKOPp_gcd(SEQ ID No.14)。

菌株BS-PP-099的构建

借助于质粒pKOPp_gcd和Graf等人,2011(Graf N,Altenbuchner J,Appl.Environ.Micorbiol.,2011,77(15):5549；DOI:10.1128/AEM.05055-11)中描述的方法实施菌株恶臭假单胞菌KT2440ΔuppΔgcd的构建。缺失gcd之后的DNA序列描述于SEQ IDNo.15中。实施用载体pACYCATh5-{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlABC_Pa]{Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk}转化恶臭假单胞菌KT2440ΔuppΔgcd，如Iwasaki等人(Iwasaki K,Uchiyama H,Yagi O,Kurabayashi,T,Ishizuka K,Takamura Y,Biosci.Biotech.Biochem.1994.58(5):851-854)中所述.其后，将细胞铺板在补充有卡那霉素(50μg/ml)的LB琼脂板上。质粒pACYCATh5-{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlABC_Pa]{Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk}(SEQ ID No.6)已经描述于实施例1中。分离来自10个克隆中每一个的质粒DNA，并借助限制性分析进行分析。携带该质粒的菌株被称为恶臭假单胞菌KT2440ΔuppΔgcd pACYCATh5-{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlABC_Pa]{Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk}。

技术实现如实施例1中所述实施。

实施3次实验，每次与实施例1平行。

评估的是总产率，其被测定为生物量加上制备的鼠李糖脂的总和除以使用和消耗的葡萄糖。

从图1中可以看出，不仅含有rhlA、rhlB和rhlC、而且含有葡萄糖脱氢酶的天然基因的恶臭假单胞菌菌株平均达到0.258[(g生物量+g RL)/g葡萄糖]的总产率。相比之下，具有gcd基因的缺失的菌株平均达到0.283[(g生物量+g RL)/g葡萄糖]的总产率。

实施例3：菌株铜绿假单胞菌PAO1Δgcd的构建

菌株铜绿假单胞菌PAO1Δgcd的构建借助于Choi&Schweizer(Choi&Schweizer,MBC Microbiology,2005 5:30,DOI:10.1186/1471-2180-5-30)中描述的方法实施。该方法允许在铜绿假单胞菌中产生无标记基因缺失，并且基于使用同源重组的阴性反选择系统(sacB)和用于除去选择标记的Flp-FRT重组系统。缺失gcd之后的DNA序列描述于SEQ IDNo.16中。技术实现如实施例1所述实施，不同之处在于所有培养步骤都在37℃下实施。

实施3次实验，每次与菌株铜绿假单胞菌PAO1平行。

评估的是总产率，其被测定为生物量加上制备的鼠李糖脂的总和除以使用和消耗的葡萄糖。与具有gcd基因的缺失的菌株相比，仍然含有葡萄糖脱氢酶的天然基因的铜绿假单胞菌菌株平均实现较低的总产率[(g生物量+g RL)/g葡萄糖]。

实施例4(非本发明)：利用菌株恶臭假单胞菌KT2440Δupp+pACYCATh5-{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlAB_Pa]{Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk}；克隆1)。

菌株的构建：

为了异源表达均来自铜绿假单胞菌的基因rhlA和rhlB以及基因rmlB、rmlD、rmlA和rmlC，构建质粒pACYCATh5-{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlAB_Pa]{Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk}。该质粒首先含有由来自铜绿假单胞菌DSM1128的基因rhlA和rhlB(编码鼠李糖基转移酶1)组成的合成操纵子(SEQ ID No 17)，且其次含有由来自铜绿假单胞菌DSM 19880的基因rmlB(编码dTDP-D-葡萄糖4,6-脱水酶)、rmlD(编码dTDP-4-脱氢鼠李糖还原酶)、rmlA(编码葡萄糖-1-磷酸胸苷酰基转移酶)和rmlC(编码dTDP-4-脱氢鼠李糖3,5-差向异构酶)组成的操纵子(SEQ ID No 2)。rhlAB基因处于鼠李糖诱导型P_Rha启动子的控制之下；rmlBDAC基因处于阿拉伯糖诱导型P_BAD启动子的控制之下。位于两个操纵子结构下游的是终止子序列(rrnB T1T2)。尽管rhlAB基因是合成单鼠李糖脂所需的，但rmlBDAC基因是提供活化的dTDP-L-鼠李糖所需的。

所述质粒基于质粒pACYCATh5-{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlABC_Pa]{Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk}(SEQ ID No 6)(参见实施例1)。为了除去rhlC基因，用PacI和NsiI切割载体。除了rhlC以外，rhlC上游和下游的部分也通过限制被消除。通过PCR扩增这些缺失的区域。使用的模板是质粒pACYCATh5-{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlABC_Pa]{Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk}(SEQ ID No 6)(参见实施例1)。然后使用市售的体外DNA装配试剂盒(例如，NEBuilder HiFi DNA装配克隆试剂盒，根据制造商的说明书(NEB；Frankfurt/Main,Germany)克隆载体部分和两个DNA片段。以本领域技术人员已知的方式转化化学感受态大肠杆菌10β细胞(NEB,Frankfurt/Main,Germany)。通过限制性分析检查靶基因的正确插入，并通过DNA测序证实引入的同源区的真实性。所得质粒pACYCATh5-{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlAB_Pa]{Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk}(SEQ ID No 18)的大小为16 359bp。

其后，将质粒引入恶臭假单胞菌KT2440Δupp中。该菌株用作用于在恶臭假单胞菌中构建无标记基因缺失的起始菌株(Graf&Altenbuchner,2011,Applied andEnvironmental Microbiology,Vol 77,No.15,5549-5552,DOI:10.1128/AEM.05055-11)。该方法基于恶臭假单胞菌的阴性反选择系统，其利用尿嘧啶磷酸核糖基转移酶的活性和恶臭假单胞菌对抗代谢物5-氟尿嘧啶的敏感性。upp基因的缺失对鼠李糖脂生物合成没有影响。

实施用载体pACYCATh5-{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlAB_Pa]{Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk}转化恶臭假单胞菌KT2440Δupp，如Iwasaki等人(Iwasaki K,Uchiyama H,Yagi O,Kurabayashi,T,Ishizuka K,Takamura Y,Biosci.Biotech.Biochem.1994.58(5):851-854)中所述。分离并分析来自10个克隆中每一个的质粒DNA。携带该质粒的菌株被称为恶臭假单胞菌KT2440Δupp pACYCATh5-{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlAB_Pa]{Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk}。

实施例5(本发明)：利用菌株恶臭假单胞菌KT2440ΔuppΔgcd+pACYCATh5-{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlAB_Pa]{Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk})

菌株恶臭假单胞菌KT2440ΔuppΔgcd+pACYCATh5-{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlAB_Pa]{Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk})的构建

为了构建菌株恶臭假单胞菌KT2440ΔuppΔgcd+pACYCATh5-{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlAB_Pa]{Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk})，将质粒pACYCATh5-{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlAB_Pa]{Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk}引入菌株恶臭假单胞菌KT2440ΔuppΔgcd中。菌株的构建已经描述于实施例2中，且质粒构建已经描述于实施例4中。

如Iwasaki等人(Iwasaki K,Uchiyama H,Yagi O,Kurabayashi,T,Ishizuka K,Takamura Y,Biosci.Biotech.Biochem.1994.58(5):851-854)中所述实施转化。其后，将细胞铺板在补充有卡那霉素(50μg/ml)的LB琼脂板上。分离来自10个克隆中每一个的质粒DNA，并借助限制性分析进行分析。携带该质粒的菌株被称为恶臭假单胞菌KT2440upp gcdpACYCATh5-{PrhaSR}[rhaSR_Ec]{PrhaBAD}[rhlABC_Pa]{Talk}[araC_Ec]{ParaBAD}[rmlBDAC_Pa]{Talk}。

技术实现如实施例1中所述实施。

实施3次实验，每次与实施例4平行。

评估的是总产率，其被测定为生物量加上制备的鼠李糖脂的总和除以使用和消耗的葡萄糖。

与具有gcd基因的缺失的菌株相比，除了rhlA和rhlB以外含有葡萄糖脱氢酶的天然基因的恶臭假单胞菌菌株平均实现了较低的总产率[(g生物量+g RL)/g葡萄糖]。

序列表

<110> 赢创德固赛有限公司

<120> 具有降低的葡萄糖脱氢酶活性的产生鼠李糖脂的细胞

<130> 201500317

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3272

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic operon

<400> 1

ggcccaggag gggggatctg gcatttttgg gaggtgtgaa atgcggcgcg aaagtctgtt 60

ggtatcggtt tgcaagggcc tgcgggtaca tgtcgagcgc gttgggcagg atcccgggcg 120

cagcacggtg atgctggtca acggcgcgat ggcgaccacc gcctcgttcg cccggacctg 180

caagtgcctg gccgaacatt tcaacgtggt gctgttcgac ctgcccttcg ccgggcagtc 240

gcgtcagcac aacccgcagc gggggttgat caccaaggac gacgaggtgg aaatcctcct 300

ggcgctgatc gagcgcttcg aggtcaatca cctggtctcc gcgtcctggg gcggtatctc 360

cacgctgctg gcgctgtcgc gcaatccgcg cggcatccgc agctcggtgg tgatggcatt 420

cgcccctgga ctgaaccagg cgatgctcga ctacgtcggg cgggcgcagg cgctgatcga 480

gctggacgac aagtcggcga tcggccatct gctcaacgag accgtcggca aatacctgcc 540

gccgcgcctg aaagccagca accatcagca catggcttcg ctggccaccg gcgaatacga 600

gcaggcgcgc tttcacatcg accaggtgct ggcgctcaac gatcggggct acctggcttg 660

cctggagcgg atccagagcc acgtgcattt catcaacggc agctgggacg aatacaccac 720

cgccgaggac gcccgccagt tccgcgacta cctgccgcac tgcagtttct cgcgggtgga 780

gggcaccggg catttcctcg acctggagtc caagctggcc gcggtacgcg tgcaccgcgc 840

cctgctcgag cacctgctga agcaaccgga gccgcagcgg gcggaacgcg cggcgggatt 900

ccacgagatg gccatcggct acgcctgaac ccttgacctg cgaagacccg gcctggccgg 960

gctttgcggt tgcataacgc acggagtagc accatgcacg ccatcctcat cgccatcggc 1020

tcggccggcg acgtatttcc cttcatcggc ctggcccgga ccctgaaatt gcgcgggcac 1080

cgcgtgagcc tctgcaccat cccggtgttt cgcgacgcgg tggagcagca cggcatcgcg 1140

ttcgtcccgc tgagcgacga actgacctac cgccggacca tgggcgatcc gcgcctgtgg 1200

gaccccaaga cgtccttcgg cgtgctctgg caaaccatcg ccgggatgat cgagccggtc 1260

tacgagtacg tctcggcgca gcgccatgac gacatcgtgg tggtcggctc gctctgggcg 1320

ctgggcgcac gcatcgctca cgagaagtac gggattccct acctgtccgc gcaggtctcg 1380

ccatcgacct tgttgtcggc gcacctgccg ccggtacacc ccaagttcaa cgtgcccgag 1440

cagatgccgc tggcgatgcg caagctgctc tggcgctgca tcgagcgctt caagctggat 1500

cgcacctgcg cgccggatat caacgcggtg cggcgcaagg tcggcctgga gacgccggtg 1560

aagcgcatct tcacccaatg gatgcattcg ccgcagggcg tggtctgcct gttcccggcc 1620

tggttcgcgc cgccccagca ggattggccg caacccctgc acatgaccgg cttcccgctg 1680

ttcgacggca gtatcccggg gaccccgctc gacgacgaac tgcaacgctt tctcgatcag 1740

ggcagccggc cgctggtgtt cacccagggc tcgaccgaac acctgcaggg cgacttctac 1800

gccatggccc tgcgcgcgct ggaacgcctc ggcgcgcgtg ggatcttcct caccggcgcc 1860

ggccaggaac cgctgcgcgg cttgccgaac cacgtgctgc agcgcgccta cgcgccactg 1920

ggagccttgc tgccatcgtg cgccgggctg gtccatccgg gcggtatcgg cgccatgagc 1980

ctggccttgg cggcgggggt gccgcaggtg ctgctgccct gcgcccacga ccagttcgac 2040

aatgccgaac ggctggtccg gctcggctgc gggatgcgcc tgggcgtgcc attgcgcgag 2100

caggagttgc gcggggcgct gtggcgcttg ctcgaggacc cggccatggc ggcggcctgt 2160

cggcgtttca tggaattgtc acaaccgcac agtatcgctt gcggtaaagc ggcccaggtg 2220

gtcgaacgtt gtcataggga gggggatgcg cgatggctga aggctgcgtc ctgacctacg 2280

ggagaagaac gatcatggac cggatagaca tgggcgtgct ggtggtactg ttcaatcctg 2340

gcgacgacga cctggaacac cttggcgaac tggcggcggc gtttccgcaa ctgcgcttcc 2400

ttgccgtcga caactcaccg cacagcgatc cgcagcgcaa tgcccggctg cgcgggcaag 2460

gcatcgccgt gctgcaccac ggcaaccggc agggcatcgc cggcgccttc aaccagggac 2520

tcgacgcgct attccggcgt ggcgtgcagg gtgtgctgct gctcgaccag gactcccgtc 2580

ccggcggcgc cttcctcgcc gcccagtggc gcaacctgca ggcgcgcaac ggtcaggcct 2640

gcctgctcgg cccacggatc ttcgaccggg gtgaccggcg cttcctgccg gccatccatc 2700

tcgacggact gacgctcagg caattgtctc tggacggcct gacgaccccg cagcgcacct 2760

cgttcctgat ctcctccggc tgcctgctga cccgcgaggc ctaccagcgc ctcggccact 2820

tcgacgagga actgttcatc gaccacgtgg acaccgaata cagcctgcgc gcccaggcgc 2880

tggacgtgcc cctgtacgtc gacccgcggc tggtcctcga gcaccgcatc ggcacgcgca 2940

agacccgccg cctcggcggt ctcagcctca gcgcgatgaa ccacgccccg ctgcgccgct 3000

actacctggc gcgcaacggc ctgctggtcc tgcgccgcta cgcccggtcc tcgccgctgg 3060

ccctgctggc gaacctgccg accctgaccc agggcctcgc ggtgctcctg ctcgaacgcg 3120

acaagctgct caagctgcgc tgcctgggct ggggcctgtg ggacggcctg cggggacgcg 3180

gcggcgcgct ggagaccaac cgcccgcgcc tgctgaagcg cctcgccggc ccggccgtgg 3240

cgtccgtagc ttccggcaag gccaaggcct ag 3272

<210> 2

<211> 3413

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> synthetic operon

<400> 2

ttaattaaca ggaggaggta tgactcatga cgattctcgt gaccggcagc gccggcttca 60

tcggcgccaa tttcgtgctc gactggctgg ccctgcatga cgagccggtg gtcagcctcg 120

acaagctcac ctacgccggc aaccggcaga acctcgccag cctcgacggc gacgcccggc 180

acaccttcgt cgccggcgat atcggcgata gccagctggt agcccgcctg ctcgccgagc 240

accagccgcg ggcgatcctc aacttcgccg cggaatccca tgtggaccgc tcgatccacg 300

gccccgagga cttcatccag accaacatcg tcggcacctt ccgcctgctg gaagaagtgc 360

gcgcctactg gggcgcgctg gagccggaag cgaaggcggc attccgcttc ctccacgtct 420

ccaccgacga agtctatggc tcgctggcac cgagcgatcc ggccttcacc gagaacaacc 480

gctacgagcc gaacagtccc tactcggcgt ccaaggcggc ctccgaccac ctagtgcggg 540

cctatcacca cacctatggg ctgccggtgc tgaccaccaa ctgctcgaac aactacggcc 600

cgtaccactt cccggaaaag ctcatcccac tggtgatcca caacgccctg gccggcaagc 660

cgctgccgat ctacggcgac ggccagcaga tccgcgactg gctctacgtc aaggaccatt 720

gcagcgccat ccgccgggtc ctcgaagccg ggcaactggg cgagacctac aatgtcggcg 780

gctggaacga aaaggccaac ctcgacgtgg tcgagaccct ctgcgccatc ctcgaccagg 840

agcagccgcg cgccgacggc cgcagctatc gcgagcagat caccttcgtc aaggatcgtc 900

cgggccatga tcgccgctac gccatcgatg ccacgcgcct ggagcgcgag ctgggctgga 960

agccggcgga aaccttcgag accggcatcc gcaagaccgt gcgctggtac ctggacaacc 1020

aggactgggt ggccaacgta accagcggtg cctaccgcga gtgggtgggt aagcagtacg 1080

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cctggcgccg ctgggcgaac tgctggtctg tgaccgtcgg cgcgccgatc tcgccgaccc 1200

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cggagaagga ccgccagggc aaggcattcg ccgacgccga ctgcttcccc tga 3413

<210> 3

<211> 2028

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Promtor

<400> 3

ttaatctttc tgcgaattga gatgacgcca ctggctgggc gtcatcccgg tttcccgggt 60

aaacaccacc gaaaaatagt tactatcttc aaagccacat tcggtcgaaa tatcactgat 120

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<210> 4

<211> 1181

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Promotor

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<210> 5

<211> 107

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Terminator

<400> 5

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<210> 6

<211> 17337

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Vector

<400> 6

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gaacaaccat ctggcttctg ccttgcctgc ggcgcggcgt gccaggcggt agagaaaacg 720

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caccaggcgg ccgttcttgg ccttcttcgt acgctgcatg gcaacgtgcg tggtgtttaa 960

ccgaatgcag gtttctacca ggtcgtcttt ctgctttccg ccatcggctc gccggcagaa 1020

cttgagtacg tccgcaacgt gtggacggaa cacgcggccg ggcttgtctc ccttcccttc 1080

ccggtatcgg ttcatggatt cggttagatg ggaaaccgcc atcagtacca ggtcgtaatc 1140

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ggattctttg cggattcgat cagcggccgc ttgccacgat tcaccggggc gtgcttctgc 1440

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tggttaagta cagcgataac cttcatgcgt tccccttgcg tatttgttta tttactcatc 2640

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aaaagcgtcg aaaagtggtt actgtcgctg aatccacagc gataggcgat gtcagtaacg 7800

ctggcctcgc tgtggcgtag cagatgtcgg gctttcatca gtcgcaggcg gttcaggtat 7860

cgctgaggcg tcagtcccgt ttgctgctta agctgccgat gtagcgtacg cagtgaaaga 7920

gaaaattgat ccgccacggc atcccaattc acctcatcgg caaaatggtc ctccagccag 7980

gccagaagca agttgagacg tgatgcgctg ttttccaggt tctcctgcaa actgctttta 8040

cgcagcaaga gcagtaattg cataaacaag atctcgcgac tggcggtcga gggtaaatca 8100

ttttcccctt cctgctgttc catctgtgca accagctgtc gcacctgctg caatacgctg 8160

tggttaacgc gccagtgaga cggatactgc ccatccagct cttgtggcag caactgattc 8220

agcccggcga gaaactgaaa tcgatccggc gagcgataca gcacattggt cagacacaga 8280

ttatcggtat gttcatacag atgccgatca tgatcgcgta cgaaacagac cgtgccaccg 8340

gtgatggtat agggctgccc attaaacaca tgaatacccg tgccatgttc gacaatcaca 8400

atttcatgaa aatcatgatg atgttcagga aaatccgcct gcgggagccg gggttctatc 8460

gccacggacg cgttaccaga cggaaaaaaa tccacactat gtaatacggt catactggcc 8520

tcctgatgtc gtcaacacgg cgaaatagta atcacgaggt caggttctta ccttaaattt 8580

tcgacggaaa accacgtaaa aaacgtcgat ttttcaagat acagcgtgaa ttttcaggaa 8640

atgcggtgag catcacatca ccacaattca gcaaattgtg aacatcatca cgttcatctt 8700

tccctggttg ccaatggccc attttcctgt cagtaacgag aaggtcgcga attcaggcgc 8760

tttttagact ggtcgtaatg aacatttaaa tgaattccct tgggactcta gagatccgcg 8820

ggggcccagg aggggggatc tggcattttt gggaggtgtg aaatgcggcg cgaaagtctg 8880

ttggtatcgg tttgcaaggg cctgcgggta catgtcgagc gcgttgggca ggatcccggg 8940

cgcagcacgg tgatgctggt caacggcgcg atggcgacca ccgcctcgtt cgcccggacc 9000

tgcaagtgcc tggccgaaca tttcaacgtg gtgctgttcg acctgccctt cgccgggcag 9060

tcgcgtcagc acaacccgca gcgggggttg atcaccaagg acgacgaggt ggaaatcctc 9120

ctggcgctga tcgagcgctt cgaggtcaat cacctggtct ccgcgtcctg gggcggtatc 9180

tccacgctgc tggcgctgtc gcgcaatccg cgcggcatcc gcagctcggt ggtgatggca 9240

ttcgcccctg gactgaacca ggcgatgctc gactacgtcg ggcgggcgca ggcgctgatc 9300

gagctggacg acaagtcggc gatcggccat ctgctcaacg agaccgtcgg caaatacctg 9360

ccgccgcgcc tgaaagccag caaccatcag cacatggctt cgctggccac cggcgaatac 9420

gagcaggcgc gctttcacat cgaccaggtg ctggcgctca acgatcgggg ctacctggct 9480

tgcctggagc ggatccagag ccacgtgcat ttcatcaacg gcagctggga cgaatacacc 9540

accgccgagg acgcccgcca gttccgcgac tacctgccgc actgcagttt ctcgcgggtg 9600

gagggcaccg ggcatttcct cgacctggag tccaagctgg ccgcggtacg cgtgcaccgc 9660

gccctgctcg agcacctgct gaagcaaccg gagccgcagc gggcggaacg cgcggcggga 9720

ttccacgaga tggccatcgg ctacgcctga acccttgacc tgcgaagacc cggcctggcc 9780

gggctttgcg gttgcataac gcacggagta gcaccatgca cgccatcctc atcgccatcg 9840

gctcggccgg cgacgtattt cccttcatcg gcctggcccg gaccctgaaa ttgcgcgggc 9900

accgcgtgag cctctgcacc atcccggtgt ttcgcgacgc ggtggagcag cacggcatcg 9960

cgttcgtccc gctgagcgac gaactgacct accgccggac catgggcgat ccgcgcctgt 10020

gggaccccaa gacgtccttc ggcgtgctct ggcaaaccat cgccgggatg atcgagccgg 10080

tctacgagta cgtctcggcg cagcgccatg acgacatcgt ggtggtcggc tcgctctggg 10140

cgctgggcgc acgcatcgct cacgagaagt acgggattcc ctacctgtcc gcgcaggtct 10200

cgccatcgac cttgttgtcg gcgcacctgc cgccggtaca ccccaagttc aacgtgcccg 10260

agcagatgcc gctggcgatg cgcaagctgc tctggcgctg catcgagcgc ttcaagctgg 10320

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tgaagcgcat cttcacccaa tggatgcatt cgccgcaggg cgtggtctgc ctgttcccgg 10440

cctggttcgc gccgccccag caggattggc cgcaacccct gcacatgacc ggcttcccgc 10500

tgttcgacgg cagtatcccg gggaccccgc tcgacgacga actgcaacgc tttctcgatc 10560

agggcagccg gccgctggtg ttcacccagg gctcgaccga acacctgcag ggcgacttct 10620

acgccatggc cctgcgcgcg ctggaacgcc tcggcgcgcg tgggatcttc ctcaccggcg 10680

ccggccagga accgctgcgc ggcttgccga accacgtgct gcagcgcgcc tacgcgccac 10740

tgggagcctt gctgccatcg tgcgccgggc tggtccatcc gggcggtatc ggcgccatga 10800

gcctggcctt ggcggcgggg gtgccgcagg tgctgctgcc ctgcgcccac gaccagttcg 10860

acaatgccga acggctggtc cggctcggct gcgggatgcg cctgggcgtg ccattgcgcg 10920

agcaggagtt gcgcggggcg ctgtggcgct tgctcgagga cccggccatg gcggcggcct 10980

gtcggcgttt catggaattg tcacaaccgc acagtatcgc ttgcggtaaa gcggcccagg 11040

tggtcgaacg ttgtcatagg gagggggatg cgcgatggct gaaggctgcg tcctgaccta 11100

cgggagaaga acgatcatgg accggataga catgggcgtg ctggtggtac tgttcaatcc 11160

tggcgacgac gacctggaac accttggcga actggcggcg gcgtttccgc aactgcgctt 11220

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aggcatcgcc gtgctgcacc acggcaaccg gcagggcatc gccggcgcct tcaaccaggg 11340

actcgacgcg ctattccggc gtggcgtgca gggtgtgctg ctgctcgacc aggactcccg 11400

tcccggcggc gccttcctcg ccgcccagtg gcgcaacctg caggcgcgca acggtcaggc 11460

ctgcctgctc ggcccacgga tcttcgaccg gggtgaccgg cgcttcctgc cggccatcca 11520

tctcgacgga ctgacgctca ggcaattgtc tctggacggc ctgacgaccc cgcagcgcac 11580

ctcgttcctg atctcctccg gctgcctgct gacccgcgag gcctaccagc gcctcggcca 11640

cttcgacgag gaactgttca tcgaccacgt ggacaccgaa tacagcctgc gcgcccaggc 11700

gctggacgtg cccctgtacg tcgacccgcg gctggtcctc gagcaccgca tcggcacgcg 11760

caagacccgc cgcctcggcg gtctcagcct cagcgcgatg aaccacgccc cgctgcgccg 11820

ctactacctg gcgcgcaacg gcctgctggt cctgcgccgc tacgcccggt cctcgccgct 11880

ggccctgctg gcgaacctgc cgaccctgac ccagggcctc gcggtgctcc tgctcgaacg 11940

cgacaagctg ctcaagctgc gctgcctggg ctggggcctg tgggacggcc tgcggggacg 12000

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ggcgtccgta gcttccggca aggccaaggc ctagtcggcg aaacgcattc cctctagagt 12120

ttaaacacca ggtgcgatcg cgcggccgcg ctcgagcacg cgagagtagg gaactgccag 12180

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caacattgcg accgacggtg gcgataggca tccgggtggt gctcaaaagc agcttcgcct 12600

ggctgatacg ttggtcctcg cgccagctta agacgctaat ccctaactgc tggcggaaaa 12660

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acagcaaaat atcacccggt cggcaaacaa attctcgtcc ctgatttttc accaccccct 13140

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tcagagaaga aaccaattgt ccatattgca tcagacattg ccgtcactgc gtcttttact 13380

ggctcttctc gctaaccaaa ccggtaaccc cgcttattaa aagcattctg taacaaagcg 13440

ggaccaaagc catgacaaaa acgcgtaaca aaagtgtcta taatcacggc agaaaagtcc 13500

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tgaccggcag cgccggcttc atcggcgcca atttcgtgct cgactggctg gccctgcatg 13740

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gcctcgacgg cgacgcccgg cacaccttcg tcgccggcga tatcggcgat agccagctgg 13860

tagcccgcct gctcgccgag caccagccgc gggcgatcct caacttcgcc gcggaatccc 13920

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tccgcctgct ggaagaagtg cgcgcctact ggggcgcgct ggagccggaa gcgaaggcgg 14040

cattccgctt cctccacgtc tccaccgacg aagtctatgg ctcgctggca ccgagcgatc 14100

cggccttcac cgagaacaac cgctacgagc cgaacagtcc ctactcggcg tccaaggcgg 14160

cctccgacca cctagtgcgg gcctatcacc acacctatgg gctgccggtg ctgaccacca 14220

actgctcgaa caactacggc ccgtaccact tcccggaaaa gctcatccca ctggtgatcc 14280

acaacgccct ggccggcaag ccgctgccga tctacggcga cggccagcag atccgcgact 14340

ggctctacgt caaggaccat tgcagcgcca tccgccgggt cctcgaagcc gggcaactgg 14400

gcgagaccta caatgtcggc ggctggaacg aaaaggccaa cctcgacgtg gtcgagaccc 14460

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tggagcgcga gctgggctgg aagccggcgg aaaccttcga gaccggcatc cgcaagaccg 14640

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gcgcgccgat ctcgccgacc ccgaaggcct ggcgcgactg gttcgcgccg agcggccgca 14880

gttcatcgtc aacgccggtg cctacaccgc ggtggacaag gccgagagcg atgccgacaa 14940

cgcccgcctg atcaatgccc gcgccgtcgc ggtactggcc gaggaggccg cggcctgcgg 15000

cgcctggctg gtgcattact ccaccgacta cgtgttcgac ggcgcgggca gcgtgccttt 15060

cgccgaggac gcgccgaccg gcccgctgag cgtctacggg cagaccaagc tggaaggcga 15120

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cgcgcgcggc ggaaacttcg ccaagaccat gctgcgcctg gccgggcaac gcgacgaact 15240

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cgcccaggcc ctgcagcgcc tgtgctggga tgtcgagctg gcagcacggg ccagcggcac 15360

ctaccacctg gtcgccagcg gcgagacgtc ctggcacctc tatgcgcgct tcgtcatcga 15420

acaggcgctg gagcggggct gggagttgca ggcgacgccg cagcgggtcc tgccgatcgc 15480

caccgaggac tacccggtgc cggcgaagcg tccggccaat tcgcgcctcg acaaccgcaa 15540

gctgcaacag gtcttcggcc tggtactgcc agactggcgc taccatgccg gacgcatgat 15600

ccaggaactg agcgagcagg gaccactatg aaacgcaagg gcatcatcct cgccggaggc 15660

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gacaagccga tgatctacta cccgctcagt accctgatgc tggcgggcat ccgcgagata 15780

ctgatcatct cgaccccaca ggacacccca cgcttccagc agttgctggg cgacggttcg 15840

aactggggcc tggacctgca atatgccgtg caaccgtcgc cggacggcct ggcccaggcc 15900

ttcctgatcg gcgagtcgtt catcggcaac gacctcagcg cgctggtcct gggcgacaac 15960

ctctattacg gccacgactt ccacgagttg ctcggcagcg cttcgcagcg ccagaccggc 16020

gccagtgtct tcgcctacca cgtgctggac ccggagcgct acggcgtggt cgagttcgac 16080

cagggcggca aggccatcag cctggaagag aagccactgg agccgaagtc gaactacgcg 16140

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ctgctcgagg ccggccagtt catcgccacc ctggagaacc gccagggtct caaggtggcc 16380

tgcccggaag agatcgccta ccggcagaag tggatcgacg ccgcgcaact ggaaaaactc 16440

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ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt 17220

tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg agcggatttg aacgatgata 17280

agctgtcaaa catgagaatt cttgaactag ttgtacaaac gttcgtcaaa agggcga 17337

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 7

gccgctttgg tcccgggttt caagctcagc gg 32

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 8

aaggcgcgat cgcgggttag aaactgctct gg 32

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 9

ccgcgatcgc gccttgtgtc gcgtttc 27

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer

<400> 10

gcttgcatgc ctgcaatgcc gtaggctttg acc 33

<210> 11

<211> 679

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PCR product

<400> 11

gccgctttgg tcccgggttt caagctcagc ggcagcggca cccagggtgc ggtaatgccg 60

ttcgaactgg tatggacccc acgtatccaa ggcttgaaag gggaatatcg tgccggctac 120

tactacagta atgccaaggc acaagatgtt ctcaaggaca gcaacggtca gccggccgcc 180

ctcagcggcg ccgcctaccg cagcagttcg agcaagcacg gcttgtggat tggcgcccag 240

cagcaggtca cctcgctggc gtccgaccag tcgcgcggct tgagcgtgtt cgccaacgcc 300

acggtgcatg acaaaaagac caatgccatc gacaactatg tgcaggcagg actggtattc 360

aaagggcctt tcgatgcccg cgccaaggac gacatcggtt tcgccctggc ccgcgtgcac 420

gtcaaccctg cctatcgcaa gaacgcccgc ctggtcaacc aggccgccgg cctctatgac 480

tacgacaacc cgggcttcct gccagtgcag gacaccgagt acagcgccga gctgtattac 540

ggcattcact tggccgactg gctcacggta cgccccaacc tgcagtacat ccgccacccg 600

ggcggggtgt cgcaggtcga tggcgccctg atcggcggcc tgaagatcca gagcagtttc 660

taacccgcga tcgcgcctt 679

<210> 12

<211> 682

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PCR product

<400> 12

ccgcgatcgc gccttgtgtc gcgtttcggt cgcgcagcgg ccccaacgat ctagaatgct 60

ggatggattc tggggctgct gcgcagccca atcgcgacac aaggctgctc ccgaaccatt 120

gaaacccatc cctccccgcc ccatctaagc accatagtca ttcacgcagg tgccccatga 180

gcgaccagca ggatttcccc gaacaccctg acgaacacag cgaagtcgaa cacaccctcc 240

aggccgaagt cagccacgcc ctcgccctgc ccggtcaaca gctgccggac aaggtctacg 300

tcatcccgat ccacaaccgc ccgttcttcc cggcccaggt actgccggtg atcgtcaatg 360

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tgttcttcat ggacaccccg ccagaagacc accgccactt cgacacctcg gcactgccgc 480

agtacggcac gctggtcaag gtgcaccatg ccagccgcga aaacggcaaa ttgcagttcg 540

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<210> 13

<211> 4831

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Vector

<400> 13

atggcgcagg ggatcaagat ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga 60

acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga 120

ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg 180

gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga 240

ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt 300

tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct 360

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agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca 540

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cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc 1440

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<210> 14

<211> 6129

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Vector

<400> 14

atggcgcagg ggatcaagat ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga 60

acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga 120

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ccgttcttcc cggcccaggt actgccggtg atcgtcaatg aagagccctg ggccgaaacg 2220

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gtgcgcatcc gcaactggct caagcaccac cgcccgccct acctggtcga agtcgaatac 2460

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acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta 3360

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tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga 3540

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caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg 3720

cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt 3780

agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag 3840

acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc 3900

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ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca 4020

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ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg 4440

cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag 4500

gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac 4560

tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca 4620

tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag 4680

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aacacccgct cgcgggtggg cctactctaa gaaaccatta ttatcatgac attaacctat 4800

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gggccaggcg ctggttgatg tccggcgcga gcttttccag ataggtgtgg gcttcgaggg 5340

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cgccgtcgag catgccgatg ccggcgcgca ggatcggtac tacggtgatc ttcttgccgg 5460

cgattttttc aaccgagacc ttgccacacc agccgtcgat ctcgtaggtt tcgaggggca 5520

ggtcctgggt ggcttcatac gtcaggagcg cgccgacttc ctgggcgagt tcgcgaaaat 5580

tcttggtgct gatatcggca cggcgcatca ggccaagctt gtggcggatc agcggatggc 5640

ggatctcacg agtgggcata ggggagggct ccgaaaggcg ggcaaaaaaa ccgcgctaga 5700

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atctgtgacg agcggatgcg tacctttgcc cgcttttcca aaatgctagc cggctacgta 5820

tcgataagct tcacgctgcc gcaagcactc agggcgcaag ggctgctaaa ggaagcggaa 5880

cacgtagaaa gccagtccgc agaaacggtg ctgaccccgg atgaatgtca gctactgggc 5940

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atggcgatag ctagactggg cggttttatg gacagcaagc gaaccggaat tgccagctgg 6060

ggcgccctct ggtaaggttg ggaagccctg caaagtaaac tggatggctt tcttgccgcc 6120

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<210> 15

<211> 1316

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> k/o sequence

<400> 15

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accccacgta tccaaggctt gaaaggggaa tatcgtgccg gctactacta cagtaatgcc 120

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ctggtcaagg tgcaccatgc cagccgcgaa aacggcaaat tgcagttcgt cgcccagggc 1200

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<210> 16

<211> 4787

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> result of gene knock-out

<400> 16

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tgggcggacg gcgcggtcag ccggatcgac catgcgcgcc tgcgcgccgc ctgtccctgt 120

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cgcggtatct acccctggtc ctatctgcgc gacgaactct gaggcgggta ttgttccgct 300

cccggcaaca acgtgaagcg tgttcatggg tttcagattg ttgccaatcc ctgcgttgtc 360

cccgtcccgc cacggccacc acccgggtga cccgctcgga ggcccgccgc ctggcttcgt 420

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attcgcaacg aggaagcgtt cgcgtgaaat cccatcttct ccgcccggcc ctgcgccccg 660

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<212> DNA

<213> Pseudomonas aeruginosa

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> vector

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gccctgctcg agcacctgct gaagcaaccg gagccgcagc gggcggaacg cgcggcggga 9720

ttccacgaga tggccatcgg ctacgcctga acccttgacc tgcgaagacc cggcctggcc 9780

gggctttgcg gttgcataac gcacggagta gcaccatgca cgccatcctc atcgccatcg 9840

gctcggccgg cgacgtattt cccttcatcg gcctggcccg gaccctgaaa ttgcgcgggc 9900

accgcgtgag cctctgcacc atcccggtgt ttcgcgacgc ggtggagcag cacggcatcg 9960

cgttcgtccc gctgagcgac gaactgacct accgccggac catgggcgat ccgcgcctgt 10020

gggaccccaa gacgtccttc ggcgtgctct ggcaaaccat cgccgggatg atcgagccgg 10080

tctacgagta cgtctcggcg cagcgccatg acgacatcgt ggtggtcggc tcgctctggg 10140

cgctgggcgc acgcatcgct cacgagaagt acgggattcc ctacctgtcc gcgcaggtct 10200

cgccatcgac cttgttgtcg gcgcacctgc cgccggtaca ccccaagttc aacgtgcccg 10260

agcagatgcc gctggcgatg cgcaagctgc tctggcgctg catcgagcgc ttcaagctgg 10320

atcgcacctg cgcgccggat atcaacgcgg tgcggcgcaa ggtcggcctg gagacgccgg 10380

tgaagcgcat cttcacccaa tggatgcatt cgccgcaggg cgtggtctgc ctgttcccgg 10440

cctggttcgc gccgccccag caggattggc cgcaacccct gcacatgacc ggcttcccgc 10500

tgttcgacgg cagtatcccg gggaccccgc tcgacgacga actgcaacgc tttctcgatc 10560

agggcagccg gccgctggtg ttcacccagg gctcgaccga acacctgcag ggcgacttct 10620

acgccatggc cctgcgcgcg ctggaacgcc tcggcgcgcg tgggatcttc ctcaccggcg 10680

ccggccagga accgctgcgc ggcttgccga accacgtgct gcagcgcgcc tacgcgccac 10740

tgggagcctt gctgccatcg tgcgccgggc tggtccatcc gggcggtatc ggcgccatga 10800

gcctggcctt ggcggcgggg gtgccgcagg tgctgctgcc ctgcgcccac gaccagttcg 10860

acaatgccga acggctggtc cggctcggct gcgggatgcg cctgggcgtg ccattgcgcg 10920

agcaggagtt gcgcggggcg ctgtggcgct tgctcgagga cccggccatg gcggcggcct 10980

gtcggcgttt catggaattg tcacaaccgc acagtatcgc ttgcggtaaa gcggcccagg 11040

tggtcgaacg ttgtcatagg gagggggatg cgcgatggct gaaggctgcg tcctgaccta 11100

cgggagaaga acgatctcgg cgaaacgcat tccctctaga gtttaaacac caggtgcgat 11160

cgcgcggccg cgctcgagca cgcgagagta gggaactgcc aggcatcaaa taaaacgaaa 11220

ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct 11280

gagtaggaca aatccgccgg gagcggattt gaacgatgat aagctgtcaa acatgagaat 11340

tcttgaagac gaaagggcct cgtgtgtaca ataatatttg cccatggatt taaataaccc 11400

tatgctactc cgtcaagccg tcaattgtct gattcgttac caattatgac aacttgacgg 11460

ctacatcatt cactttttct tcacaaccgg cacggaactc gctcgggctg gccccggtgc 11520

attttttaaa tacccgcgag aaatagagtt gatcgtcaaa accaacattg cgaccgacgg 11580

tggcgatagg catccgggtg gtgctcaaaa gcagcttcgc ctggctgata cgttggtcct 11640

cgcgccagct taagacgcta atccctaact gctggcggaa aagatgtgac agacgcgacg 11700

gcgacaagca aacatgctgt gcgacgctgg cgatatcaaa attgctgtct gccaggtgat 11760

cgctgatgta ctgacaagcc tcgcgtaccc gattatccat cggtggatgg agcgactcgt 11820

taatcgcttc catgcgccgc agtaacaatt gctcaagcag atttatcgcc agcagctccg 11880

aatagcgccc ttccccttgc ccggcgttaa tgatttgccc aaacaggtcg ctgaaatgcg 11940

gctggtgcgc ttcatccggg cgaaagaacc ccgtattggc aaatattgac ggccagttaa 12000

gccattcatg ccagtaggcg cgcggacgaa agtaaaccca ctggtgatac cattcgcgag 12060

cctccggatg acgaccgtag tgatgaatct ctcctggcgg gaacagcaaa atatcacccg 12120

gtcggcaaac aaattctcgt ccctgatttt tcaccacccc ctgaccgcga atggtgagat 12180

tgagaatata acctttcatt cccagcggtc ggtcgataaa aaaatcgaga taaccgttgg 12240

cctcaatcgg cgttaaaccc gccaccagat gggcattaaa cgagtatccc ggcagcaggg 12300

gatcattttg cgcttcagcc atacttttca tactcccgcc attcagagaa gaaaccaatt 12360

gtccatattg catcagacat tgccgtcact gcgtctttta ctggctcttc tcgctaacca 12420

aaccggtaac cccgcttatt aaaagcattc tgtaacaaag cgggaccaaa gccatgacaa 12480

aaacgcgtaa caaaagtgtc tataatcacg gcagaaaagt ccacattgat tatttgcacg 12540

gcgtcacact ttgctatgcc atagcatttt tatccataag attagcggat cctacctgac 12600

gctttttatc gcaactctct actgtttctc catacccgat ttaaatgaat tcccttggga 12660

ctcttaatta acaggaggag gtatgactca tgacgattct cgtgaccggc agcgccggct 12720

tcatcggcgc caatttcgtg ctcgactggc tggccctgca tgacgagccg gtggtcagcc 12780

tcgacaagct cacctacgcc ggcaaccggc agaacctcgc cagcctcgac ggcgacgccc 12840

ggcacacctt cgtcgccggc gatatcggcg atagccagct ggtagcccgc ctgctcgccg 12900

agcaccagcc gcgggcgatc ctcaacttcg ccgcggaatc ccatgtggac cgctcgatcc 12960

acggccccga ggacttcatc cagaccaaca tcgtcggcac cttccgcctg ctggaagaag 13020

tgcgcgccta ctggggcgcg ctggagccgg aagcgaaggc ggcattccgc ttcctccacg 13080

tctccaccga cgaagtctat ggctcgctgg caccgagcga tccggccttc accgagaaca 13140

accgctacga gccgaacagt ccctactcgg cgtccaaggc ggcctccgac cacctagtgc 13200

gggcctatca ccacacctat gggctgccgg tgctgaccac caactgctcg aacaactacg 13260

gcccgtacca cttcccggaa aagctcatcc cactggtgat ccacaacgcc ctggccggca 13320

agccgctgcc gatctacggc gacggccagc agatccgcga ctggctctac gtcaaggacc 13380

attgcagcgc catccgccgg gtcctcgaag ccgggcaact gggcgagacc tacaatgtcg 13440

gcggctggaa cgaaaaggcc aacctcgacg tggtcgagac cctctgcgcc atcctcgacc 13500

aggagcagcc gcgcgccgac ggccgcagct atcgcgagca gatcaccttc gtcaaggatc 13560

gtccgggcca tgatcgccgc tacgccatcg atgccacgcg cctggagcgc gagctgggct 13620

ggaagccggc ggaaaccttc gagaccggca tccgcaagac cgtgcgctgg tacctggaca 13680

accaggactg ggtggccaac gtaaccagcg gtgcctaccg cgagtgggtg ggtaagcagt 13740

acgcatgaac cggatccttc tcctcggcgc caacggccag gtcggctggg agctgcagcg 13800

cgccctggcg ccgctgggcg aactgctggt ctgtgaccgt cggcgcgccg atctcgccga 13860

ccccgaaggc ctggcgcgac tggttcgcgc cgagcggccg cagttcatcg tcaacgccgg 13920

tgcctacacc gcggtggaca aggccgagag cgatgccgac aacgcccgcc tgatcaatgc 13980

ccgcgccgtc gcggtactgg ccgaggaggc cgcggcctgc ggcgcctggc tggtgcatta 14040

ctccaccgac tacgtgttcg acggcgcggg cagcgtgcct ttcgccgagg acgcgccgac 14100

cggcccgctg agcgtctacg ggcagaccaa gctggaaggc gagcaggcca tccgcgccag 14160

cggctgccgc cacctgatct tccgcaccag ctgggtctac gccgcgcgcg gcggaaactt 14220

cgccaagacc atgctgcgcc tggccgggca acgcgacgaa ctcaaggtcg tggccgacca 14280

gttcggcgcg cccaccagcg ccgagctgat cgccgacgtc accgcccagg ccctgcagcg 14340

cctgtgctgg gatgtcgagc tggcagcacg ggccagcggc acctaccacc tggtcgccag 14400

cggcgagacg tcctggcacc tctatgcgcg cttcgtcatc gaacaggcgc tggagcgggg 14460

ctgggagttg caggcgacgc cgcagcgggt cctgccgatc gccaccgagg actacccggt 14520

gccggcgaag cgtccggcca attcgcgcct cgacaaccgc aagctgcaac aggtcttcgg 14580

cctggtactg ccagactggc gctaccatgc cggacgcatg atccaggaac tgagcgagca 14640

gggaccacta tgaaacgcaa gggcatcatc ctcgccggag gctcgggcac ccgcctgcac 14700

ccggcaacgc tggccatctc caagcagttg ctgccggtgt acgacaagcc gatgatctac 14760

tacccgctca gtaccctgat gctggcgggc atccgcgaga tactgatcat ctcgacccca 14820

caggacaccc cacgcttcca gcagttgctg ggcgacggtt cgaactgggg cctggacctg 14880

caatatgccg tgcaaccgtc gccggacggc ctggcccagg ccttcctgat cggcgagtcg 14940

ttcatcggca acgacctcag cgcgctggtc ctgggcgaca acctctatta cggccacgac 15000

ttccacgagt tgctcggcag cgcttcgcag cgccagaccg gcgccagtgt cttcgcctac 15060

cacgtgctgg acccggagcg ctacggcgtg gtcgagttcg accagggcgg caaggccatc 15120

agcctggaag agaagccact ggagccgaag tcgaactacg cggtcaccgg cctgtatttc 15180

tacgaccagc aggtggtgga catcgccagg gacctgaagc cttcgccgcg cggcgagctg 15240

gagatcaccg acgtcaaccg cgcctatctg gagcgcggcc agctcagcgt ggagatcatg 15300

ggccgcggct acgcctggct ggataccggc acccacgatt cgctgctcga ggccggccag 15360

ttcatcgcca ccctggagaa ccgccagggt ctcaaggtgg cctgcccgga agagatcgcc 15420

taccggcaga agtggatcga cgccgcgcaa ctggaaaaac tcgccgcgcc gctggccaag 15480

aacggctacg gccaatacct caagcgcctg ctgaccgaga ccgtgtactg atgaaagcga 15540

cccgcctggc aattcccgac gtcatcctct tcgaaccccg ggtgttcggc gacgatcgcg 15600

gattcttctt cgaaagctac aaccagcgcg ccttcgagga agcctgcggt catccggtca 15660

gcttcgtcca ggacaaccat tcgcgttccg cccgtggcgt cctccgcggc ctgcactacc 15720

agatccggca agcccaggga aaactggtgc gcgccactct cggcgaggta ttcgacgtgg 15780

ccgtcgacct gcgtcgcggc tcgccgacct tcggccagtg ggtaggcgaa cgcctgagcg 15840

cggagaacaa gcgccagatg tggattccgg ccggcttcgc gcacggcttc gtggtgctca 15900

gcgaatacgc cgagttcctc tacaagacca ccgacttctg ggcgccggaa cacgaacgct 15960

gcatcgtctg gaacgatccc gagctgaaga tcgactggcc gctgcaggat gcccccctgc 16020

tttcggagaa ggaccgccag ggcaaggcat tcgccgacgc cgactgcttc ccctgaacgg 16080

cagggagcga ccggactcgg cgcaaggcgt ggtaatttag ggtttaaaca ccaggtgcga 16140

tcgcgcggcc gcgctcgagc acgcgagagt agggaactgc caggcatcaa ataaaacgaa 16200

aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctcc 16260

tgagtaggac aaatccgccg ggagcggatt tgaacgatga taagctgtca aacatgagaa 16320

ttcttgaact agttgtacaa acgttcgtca aaagggcga 16359

Claims (11)

1.能够制备至少一种鼠李糖脂的细胞，其特征在于其已被遗传修饰，使得与其野生型相比，其具有降低的至少一种酶E1的活性，所述酶E1催化D-葡萄糖和醌转化为D-葡萄糖酸-1,5-内酯和醌醇。

2.根据权利要求1所述的细胞，其特征在于其能够制备作为鼠李糖脂的通式(I)的化合物，

其中

m＝1，

n＝1或0，

且经由R1和R2确定的基团是

衍生自3-羟基辛酰基-3-羟基辛酸、3-羟基辛酰基-3-羟基癸酸、3-羟基癸酰基-3-羟基辛酸、3-羟基辛酰基-3-羟基癸烯酸、3-羟基癸烯酰基-3-羟基辛酸、3-羟基辛酰基-3-羟基十二烷酸、3-羟基十二烷酰基-3-羟基辛酸、3-羟基辛酰基-3-羟基十二碳烯酸、3-羟基十二烯酰基-3-羟基辛酸、3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸、3-羟基癸酰基-3-羟基癸烯酸、3-羟基癸烯酰基-3-羟基癸酸、3-羟基癸烯酰基-3-羟基癸烯酸、3-羟基癸酰基-3-羟基十二烷酸、3-羟基十二烷酰基-3-羟基癸酸、3-羟基癸酰基-3-羟基十二碳烯酸、3-羟基癸酰基-3-羟基十四碳烯酸、3-羟基十四烷酰基-3-羟基癸烯酸、3-羟基十二烯酰基-3-羟基癸酸、3-羟基癸酰基-3-羟基十四烷酸、3-羟基十四烷酰基-3-羟基癸酸、3-羟基癸酰基-3-羟基十四碳烯酸、3-羟基十四烯酰基-3-羟基癸酸、3-羟基十二烷酰基-3-羟基十二烷酸、3-羟基十二烯酰基-3-羟基十二烷酸、3-羟基十二烷酰基-3-羟基十二碳烯酸、3-羟基十二烷酰基-3-羟基十四烷酸、3-羟基十四烷酰基-3-羟基十二烷酸、3-羟基十四烷酰基-3-羟基十四烷酸、3-羟基十六烷酰基-3-羟基十四烷酸、3-羟基十四烷酰基-3-羟基十六烷酸或3-羟基十六烷酰基-3-羟基十六烷酸。

3.根据权利要求1或2所述的细胞，其特征在于E1是EC1.1.5.2的葡萄糖1-脱氢酶。

4.根据前述权利要求中至少一项的细胞，其特征在于其选自伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia sp.)，泰国伯克霍尔德氏菌(Burkholderia thailandensis)，假单胞菌属(Pseudomonas sp.)，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)，施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)，绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)，荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，香茅醇假单胞菌(Pseudomonas citronellolis)，树脂假单胞菌(Pseudomonas resinovorans)，睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)，嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)，钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)，广泛产碱菌(Alcaligenes latus)和真养罗尔斯通菌(Ralstonia eutropha)。

5.根据前述权利要求中至少一项的细胞，其特征在于其已经遗传修饰，使得与其野生型相比，其具有增加的至少一种选自E2、E3和E4的酶的活性，

酶E2能够催化3-羟基链烷酰基-ACP经由3-羟基链烷酰基-3-羟基链烷酸-ACP转化为羟基链烷酰基-3-羟基链烷酸，

酶E3是鼠李糖基转移酶I并且能够催化dTDP-鼠李糖和3-羟基链烷酰基-3-羟基链烷酸酯转化为α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基链烷酰基-3-羟基链烷酸酯，且

酶E4是鼠李糖基转移酶II并且能够催化dTDP-鼠李糖和α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基链烷酰基-3-羟基链烷酸酯转化为α-L-吡喃鼠李糖基-(1-2)-α-L-吡喃鼠李糖基-3-羟基链烷酰基-3-羟基链烷酸酯。

6.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于E2、E3和E4分别由rhlA基因、rhlB基因和rhlC基因编码，或者是具有以下多肽序列的酶，其中氨基酸残基的最多达25％、优选最多达20％、特别优选最多达15％、特别是最多达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％通过缺失、插入、取代或其组合而相对于由rhl基因编码的酶被修饰，且其仍具备有具有由rhl基因编码的酶的参考序列的酶的酶促活性的至少10％、优选50％、特别是优选80％、特别是多于90％。

7.根据权利要求5或6所述的细胞，其特征在于其具有增加的以下选自E3、E3E4和E2E3E4的酶组合的活性。

8.根据前述权利要求中至少一项的细胞，其特征在于与其野生型相比，其具有增加的至少一种选自以下的酶的活性：

至少一种酶E5，EC2.7.7.24的dTTP:α-D-葡萄糖-1-磷酸胸苷酰基转移酶，

至少一种酶E6，EC4.2.1.46的dTDP-葡萄糖4,6-水解酶，

至少一种酶E7，EC5.1.3.13的dTDP-4-脱氢鼠李糖3,5-差向异构酶，

至少一种酶E8，EC1.1.1.133的dTDP-4-脱氢鼠李糖还原酶。

9.根据前述权利要求中至少一项的细胞，其特征在于与其野生型相比，其具有增加的至少一种酶E13的活性，所述酶E13催化鼠李糖脂从细胞输出至周围培养基中，所述酶E13选自这样的酶，其具有多肽序列AAG04520.1、AJY02996.1、ZP_05590661.1、YP_439278.1、YP_440069.1、ZP_04969301.1、ZP_04520234.1、YP_335528.1、YP_001075859.1、YP_001061817.1、ZP_02487499.1、YP_337251.1、ZP_04897712.1、ZP_04810190.1、YP_990322.1、ZP_02476924.1、ZP_04899735.1、ZP_04893873.1、ZP_02365982.1、YP_001062909.1、YP_105611.1、ZP_03794061.1、ZP_03457011.1、ZP_02385401.1、ZP_02370552.1、YP_105236.1、ZP_04905097.1、YP_776387.1、YP_001811690.1、YP_004348730.1、YP_004348708.1、YP_371320.1、YP_623145.1、YP_001778810.1、YP_002234933.1、CCE52909.1、YP_002908248.1、ZP_04954557.1、ZP_04956038.1、ZP_02408950.1、ZP_02375897.1、ZP_02389908.1、YP_439274.1、YP_001074762.1、YP_337247.1、YP_110559.1、ZP_02495927.1、YP_111360.1、YP_105608.1、ZP_02487826.1、ZP_02358947.1、YP_001078605.1、ZP_00438000.1、ZP_00440993.1、ZP_02477260.1、YP_371317.1、YP_001778807.1、ZP_02382843.1、YP_002234936.1、YP_623142.1、ZP_02907618.1、ZP_02891478.1、YP_776390.1、ZP_04943308.1、YP_001811693.1、ZP_02503985.1、YP_004362740.1、YP_002908245.1、YP_004348705.1、ZP_02408798.1、ZP_02417250.1、EGD05166.1、ZP_02458677.1、ZP_02465793.1、YP_001578240.1、ZP_04944344.1、YP_771932.1、ZP_02889166.1、YP_002232614.1、ZP_03574808.1、ZP_02906105.1、YP_001806764.1、YP_619912.1、、YP_001117913.1、YP_106647.1、YP_001763368.1、ZP_02479535.1、ZP_02461743.1、YP_560998.1、YP_331651.1、ZP_04893070.1、YP_003606714.1、ZP_02503995.1、ZP_06840428.1、YP_104288.1、ZP_02487849.1、ZP_02353848.1、YP_367475.1、ZP_02377399.1、ZP_02372143.1、YP_001897562.1、ZP_02361066.1、YP_440582.1、ZP_03268453.1、AET90544.1、YP_003908738.1、YP_004230049.1、ZP_02885418.1或ZP_02511831.1，或具有其中氨基酸残基的最多达25％通过缺失、插入、取代或其组合而相对于具体前面提及的登录号被修饰且仍具备有具有具体前面提及的登录号的酶的酶促活性的至少10％的多肽序列。

10.用于生产鼠李糖脂的方法，所述方法包括以下步骤

I)使根据权利要求1至9中至少一项所述的细胞，将这些措施适当地组合，接触含有碳源的介质，

II)在允许细胞从碳源制备鼠李糖脂的条件下培养细胞，和

III)任选地分离制备的鼠李糖脂。

11.使用根据权利要求10所述的方法获得的鼠李糖脂用于生产化妆品、皮肤病学或药物制剂、作物保护制剂以及护理产品和清洁剂和表面活性剂浓缩物的用途。