DE10031999A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien - Google Patents
Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer BakterienInfo
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- C12Y604/01—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4.1)
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure durch Fermentation coryneformer Bakterien, bei dem man Bakterien einsetzt, in denen man die für die Pyruvat-Carboxylase (EC-Nummer 6.4.1.1.) codierende Nucleotidsequenz (pyc-Gen) verstärkt, insbesondere überexprimiert, wobei man folgende Schritte ausführt: DOLLAR A a) Fermentation der D-Pantothensäure produzierenden Bakterien, in denen zumindest das für Pyruvat-Carboxylase codierende Gen verstärkt wird. DOLLAR A b) Anreicherung der D-Pantothensäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien und DOLLAR A c) Isolieren der produzierten D-Pantothensäure.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen
Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung
coryneformer Bakterien, in denen zumindest das pyc-Gen
verstärkt ist.
Die Pantothensäure stellt ein kommerziell bedeutendes
Vitamin dar, das in der Kosmetik, der Medizin, der
Humanernährung und in der Tierernährung Anwendung findet.
Pantothensäure kann durch chemische Synthese oder
biotechnisch durch Fermentation geeigneter Mikroorganismen
in geeigneten Nährlösungen hergestellt werden. Bei der
chemischen Synthese ist das DL-Pantolacton eine wichtige
Zwischenstufe. Es wird in einem mehrstufigen Verfahren aus
Formaldehyd, Isobutylaldehyd und Cyanid hergestellt. In
weiteren Verfahrensschritten wird das racemische Gemisch
aufgetrennt, D-Pantolacton mit β-Alanin kondensiert und so
die gewünschte D-Pantothensäure erhalten.
Der Vorteil der fermentativen Herstellung durch
Mikroorganismen liegt in der direkten Bildung der
gewünschten stereoisomeren D-Form, die frei von L-
Pantothensäure ist.
Verschiedene Arten von Bakterien, wie z. B. Escherichia
coli, Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium
erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes und auch Hefen,
wie z. B. Debaromyces castellii können wie in EP-A 0 493
060 gezeigt, in einer Nährlösung, die Glucose, DL-
Pantoinsäure und β-Alanin enthält, D-Pantothensäure
produzieren. EP-A 0 493 060 zeigt weiterhin, daß bei
Escherichia coli durch Amplifikation von Pantothensäure-
Biosynthesegenen aus E.coli, die auf den Plasmiden pFV3 und
pFV5 enthalten sind, in einer Nährlösung, die Glucose, DL-
Pantoinsäure und β-Alanin enthält, die Bildung von D-
Pantothensäure verbessert wird.
EP-A 0 590 857 und US-Patent 5,518,906 beschreiben von
Escherichia coli Stamm IFO3547 abgeleitete Mutanten, wie
FV5714, FV525, FV814, FV521, FV221, FV6051 und FV5069, die
Resistenzen gegen verschiedene Antimetabolite wie
Salizylsäure, α-Ketobuttersäure, β-Hydroxyasparaginsäure,
O-Methylthreonin und α-Ketoisovaleriansäure tragen. Sie
produzieren in einer Nährlösung, die Glucose enthält,
Pantoinsäure, und in einer Glucose- und β-Alanin-haltigen
Nährlösung D-Pantothensäure. In EP-A 0 590 857 und US-
Patent 5,518,906 wird weiterhin gezeigt, daß nach
Amplifikation der Pantothensäure-Biosynthesegene, die auf
dem Plasmid pFV31 enthalten sind, in den oben genannten
Stämmen in glucose-haltigen Nährlösungen, die Produktion
von D-Pantoinsäure und in einer Nährlösung, die Glucose und
β-Alanin enthält, die Produktion von D-Pantothensäure
verbessert wird.
Die Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue
Grundlagen für verbesserte Verfahren zur fermentativen
Herstellung von Pantothensäure mit coryneformen Bakterien
bereitzustellen.
Das Vitamin Pantothensäure stellt ein kommerziell
bedeutendes Produkt dar, das in der Kosmetik, der Medizin,
der Humanernährung und in der Tierernährung Anwendung
findet. Es besteht ein allgemeines Interesse daran,
verbesserte Verfahren zur Herstellung von Pantothensäure
bereitzustellen.
Wenn im Folgenden D-Pantothensäure oder Pantothensäure oder
Pantothenat erwähnt werden, sind damit nicht nur die freien
Säuren, sondern auch die Salze der D-Pantothensäure wie
z. B. das Calcium-, Natrium-, Ammonium- oder Kaliumsalz
gemeint.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur
fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter
Verwendung von coryneformen Bakterien, in denen die für das
Enzym Pyruvat-Carboxylase (EC-Nummer 6.4.1.1.) kodierende
Nucleotidsequenz (pyc-Gen) verstärkt, insbesondere
überexprimiert wird.
Die eingesetzten Stämme produzieren gegebenenfalls bereits
vor der Verstärkung des pyc-Gens D-Pantothensäure.
Bevorzugte Ausführungsformen finden sich in den Ansprüchen.
Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang
die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder
mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die
entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise
die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken
Promotor verwendet oder ein Gen verwendet, das für ein
entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität kodiert und
gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden
Erfindung sind, können D-Pantothensäure aus Glucose,
Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke,
Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es
handelt sich um Vertreter coryneformer Bakterien,
insbesondere der Gattung Corynebacterium. Bei der Gattung
Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium
glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre
Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere
der Art Corynebacterium glutamicum, sind beispielsweise die
bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte, D-Pantothensäure produzierende Mutanten.
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte, D-Pantothensäure produzierende Mutanten.
Es wurde gefunden, daß coryneforme Bakterien nach
Überexpression des für die Pyruvat-Carboxylase (EC-Nummer
6.4.1.1.) kodierenden pyc-Gens in verbesserter Weise
Pantothensäure produzieren.
Das pyc-Gen codiert für das Enzym Pyruvat-Carboxylase (EC-
Nummer 6.4.1.1.), welches die Carboxylierung von Pyruvat zu
Oxalacetat katalysiert. Die Nukleotidsequenz des pyc-Gens
ist in der DE-A-198 31 609 offengelegt und wurde ebenfalls
von Koffas et al. (Applied Microbiology and Biotechnology
50, 346-352 (1998)) und Peters-Wendisch et al. (
Microbiology 144, 915-927 (1998)) beschrieben. Sie ist bei
der Nukleotidsequenzdaten-Bank des National Center for
Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) unter
der accession number Y09548 allgemein verfügbar. Das in den
angegebenen Textstellen beschriebene pyc-Gen kann
erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele
des pyc-Gens verwendet werden, die sich aus der
Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch
funktionsneutrale Sinnmutationen (sense mutations) ergeben.
Zur Erzielung einer Verstärkung (z. B. Überexpression)
erhöht man z. B. die Kopienzahl der entsprechenden Gene
oder mutiert die Promotor- und Regulationsregion oder die
Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des
Strukturgens befindet. In gleicher Weise wirken
Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens
eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es
zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe der
fermentativen Pantothensäure-Bildung zu steigern. Durch
Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird
ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch
Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die
Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte
liegen dabei entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher
Kopienzahl vor oder sind im Chromosom integriert und
amplifiziert. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression
der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammen
setzung und Kulturführung erreicht werden.
Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei
Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), bei
Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und
Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns
et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), in der Europäischen
Patentschrift EPS 0 472 869, im US Patent 4,601,893, bei
Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), bei
Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology
60, 126-132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of
Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), in der Patentanmeldung
WO 96/15246, bei Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993),
in der japanischen Offenlegungsschrift JP-A-10-229891, bei
Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58,
191-195 (1998)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik
und Molekularbiologie.
Ein Beispiel für ein Plasmid mit Hilfe dessen die Pyruvat-
Carboxylase überexprimiert wird, ist das Plasmid pVWEx1pyc,
das in der DE-A-198 31 609 offengelegt ist und auf dem
Ausgangsvektor pVWEx1 beruht. Plasmid pVWEx1 enthält als
Bestandteile unter anderem Sequenzen des Plasmids pBL1, den
tac-Promotor und das lacIq-Allel. Andere in C. glutamicum
replizierbare Plasmidvektoren, wie z. B. pEKEx1 (Eikmanns et
al., Gene 102: 93-98 (1991)) oder pZ8-1 (Europäische
Patentschrift 0 375 889), können in gleicher Weise
verwendet werden.
Zusätzlich kann es für die Produktion von Pantothensäure
vorteilhaft sein, neben dem fpr die Pyruvat-Carboxylase
codierende Gen ein oder mehrere weitere für Enzyme des
Pantothensäure-Biosyntheseweges oder des Keto-
Isovaleriansäure-Biosyntheseweges codierende Gene wie z. B.
- - das für die Aspartat-Decarboxylase kodierende panD-Gen (Dusch et al., Applied and Environmental Microbiology 65, 1530-1539 (1999)) oder
- - das für die Ketopantoat-Hydroxymethyltransferase kodierende panB-Gen (Sahm et al., Applied and Environmental Microbiology, 65, 1973-1979 (1999)) oder
- - das für die Pantothenat-Synthetase kodierende panC-Gen (Sahm et al., Applied and Environmental Microbiology, 65, 1973-1979 (1999)) oder
- - das für die Dihydroxysäure-Dehydratase kodierende ilvD- Gen
zu verstärken, insbesondere zu überexprimieren.
Weiterhin kann es für die Produktion von Pantothensäure
vorteilhaft sein, neben der Überexpression der Pyruvat-
Carboxylase unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten
(Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro
organisms", in: Overproduction of Microbial Products,
Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London,
UK, 1982).
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können
kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren
(Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder
repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren)
zum Zwecke der Pantothensäure-Produktion kultiviert werden.
Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden
sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1.
Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer
Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas
(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag,
Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den
Ansprüchen der jeweiligen Mikroorganismen genügen.
Beschreibungen von Kulturmedien verschiedenener
Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for
General Bacteriology" der American Society for Bacteriology
(Washington D. C., USA, 1981) enthalten. Als
Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B.
Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse,
Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl,
Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z.
B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie
z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B.
Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln
oder als Mischung verwendet werden. Als Stickstoffquelle
können organische, Stickstoffhaltige Verbindungen wie
Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt,
Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder
anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat,
Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und
Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen
können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als
Phosphorquelle können Kaliumdihydrogenphosphat oder
Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-
haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß
weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B.
Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum
notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe,
wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben
genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium
können überdies zur zusätzlichen Steigerung der
Pantothensäure-Produktion Vorstufen der Pantothensäure, wie
Aspartat, β-Alanin, Ketoisovalerat, Ketopantoinsäure oder
Pantoinsäure, und gegebenenfalls deren Salze zugesetzt
werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in
Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in
geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert
werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen
wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder saure
Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in
geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der
Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B.
Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur
Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem
Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, z. B.
Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen
aufrechtzuerhalten werden Sauerstoff oder Sauerstoff
haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur
eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise
bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die
Kultur wird solange fortgesetzt bis sich ein Maximum an
Pantothensäure gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise
innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die Konzentration an gebildeter Pantothensäure kann mit
bekannten Verfahren (Velisek; Chromatographic Science 60,
515-560 (1992)) bestimmt werden.
Folgender Mikroorganismus wurde bei der Deutschen Sammlung
für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig,
Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:
Corynebacterium glutamicum DG52-5/pVWEx1pyc als DSM12893
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von
Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Zu diesem Zweck wurden Versuche mit dem Isoleucin-
bedürftigen Stamm ATCC13032ΔilvA durchgeführt, der als
DSM12455 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und
Zellkulturen in Braunschweig (Deutschland) gemäss
Budapester Vertrag hinterlegt worden ist.
Durch Elektroporation (Tauch et. al., 1994, FEMS
Microbiological Letters, 123: 343-347) des Plasmids
pVWEx1pyc (DE-A-198 31 609) in den C. glutamicum Stamm
ATCC13032ΔilvA und anschließender Selektion auf LB-Agar
(Lennox, 1955, Virology, 1: 190-206) + 25 µg/ml Kanamycin
wurde der Stamm ATCC13032ΔilvA/pVWEx1pyc erhalten.
Die Bildung von Pantothenat durch die C. glutamicum Stämme
ATCC13032ΔilvA und ATCC13032ΔilvA/pVWEx1pyc wurde in
Medium CGXII (Keilhauer et al., 1993, Journal of
Bacteriology, 175: 5595-5603; Tabelle 4), das mit 25 µg/ml
Kanamycin und 25 µg/ml Isoleucin supplementiert wurde,
geprüft. Dieses Medium wird im Folgenden als C. glutamicum-
Testmedium bezeichnet. Je 50 ml frisch angesetztes C.
glutamicum-Testmedium wurden aus einer 16 Stunden alten
Vorkultur des gleichen Mediums dergestalt angeimpft, daß
die optische Dichte der Kultursuspension (o.D.580) bei
Inkubationsbeginn 0,1 betrug. Nach 24stündiger Inkubation
bei 30°C und 175 U/min wurde die optische Dichte (o.D.580)
der Kultur bestimmt und anschließend die Zellen durch
10minütige Zentrifugation bei 5000 g entfernt und der
Überstand sterilfiltriert.
Zur Bestimmung der optischen Dichte wurde ein Novaspec II
Photometer der Firma Pharmacia (Freiburg, Deutschland) bei
einer Messwellenlänge von 580 nm eingesetzt.
Die Quantifizierung des D-Pantothenats im Kulturüberstand
erfolgte mittels Lactobacillus plantarum ATCC 8014 nach
Angaben des Handbuchs der Firma DIFCO (DIFCO MANUAL, 10th
Edition, S. 1100-1102; Michigan, USA). Für die Kalibrierung
wurde das Hemicalciumsalz von Pantothenat der Firma Sigma
(Deisenhofen, Deutschland) verwendet.
Die Ergebnisse der Pantothenat-Produktion durch die Stämme
ATCC13032ΔilvA und ATCC13032ΔilvA/pVWEx1pyc sind in
Tabelle 1 zusammengefasst.
Als Ausgangsvektor zur Konstruktion des E. coli-C.
glutamicum-Shuttle-Expressionsvektors pEC-XT99A wurde der
E.coli-Expressionsvektor pTRC99A (Amann et al. 1988, Gene
69: 301-315) verwandt. Nach BspHI-Restriktionsspaltung
(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland,
Produktbeschreibung BspHI, Product No. 1467123) und
anschließender Klenow-Behandlung (Amersham Pharmacia
Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Klenow
Fragment of DNA Polymerase I, Product No. 27-0928-01;
Methode nach Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A
laboratory Manual, Cold Spring Harbor) wurde das
Ampicillin-Restenzgen (bla) gegen das Tetracyclin-
Resistenzgen des C. glutamicum Plasmids pAG1 (GenBank
Accession No. AF121000) ausgetauscht. Hierzu wurde der
Resistenzgen-tragende Bereich als AluI-Fragment (Amersham
Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung AluI, Product No. 27-0884-01) in den
linearisierten E.coli-Expressionsvektor pTRC99A kloniert.
Die Ligation wurde wie von Sambrook et al. (1989, Molecular
Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor)
beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit T4-
Ligase (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Product No. 27-0870-04)
über Nacht inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde
anschließend in den E, coli-Stamm DH5αmcr (Grant, 1990,
Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A.,
87: 4645-4649) elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS
Microbiology Letters, 123: 343-7). Der konstruierte E. coli-
Expressionsvektor wurde mit pXT99A bezeichnet.
Als Basis zur Klonierung eines Minimalreplikons aus
Corynebacterium glutamicum wurde das Plasmid pGA1 (Sonnen
et al. 1991, Gene, 107: 69-74) verwandt. Durch BalI/PstI-
Restriktionsspaltung (Promega GmbH, Mannheim, Deutschland,
Produktbeschreibung BalI, Product No. R6691; Amersham
Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland
Produktbeschreibung PstI, Product No. 27-0976-01) des
Vektors pGA1 konnte ein 3484 bp großes Fragment in den mit
SmaI und PstI (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung SmaI, Product No. 27-0942-
02, Produktbeschreibung PstI, Product No. 27-0976-01)
fragmentierten Vektor pK18mob2 (Tauch et al., 1998,
Archives of Microbiology 169: 303-312) kloniert werden.
Mittels BamHI/XhoI-Restriktionsspaltung (Amersham Pharmacia
Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI,
Product No. 27-086803, Produktbeschreibung XhoI, Product
No. 27-0950-01) und anschließender Klenow-Behandlung
(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung Klenow Fragment of DNA Polymerase I,
Product No. 27-0928-01; Methode nach Sambrook et al., 1989,
Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor)
wurde ein 839 bp großes Fragment deletiert. Aus dem mit T4-
Ligase (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Product No. 27-0870-04)
religierten Konstrukt konnte das C. glutamicum
Minimalreplikon als 2645 bp großes Fragment in den E.coli-
Expressionsvektor pXT99A kloniert werden. Hierzu wurde die
DNA des Minimalreplikon-tragenden Konstruktes mit den
Restriktionsenzymen KpnI (Amersham Pharmacia Biotech,
Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung KpnI, Product
No. 27-0908-01) und PstI (Amersham Pharmacia Biotech,
Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung PstI, Product
No. 27-0886-03) gespalten und anschließend mittels Klenow-
Polymerase (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung Klenow Fragment of DNA
Polymerase I, Product No. 27-0928-01) eine 3'-5'-
Exonukleasebehandlung (Sambrook et al., 1989, Molecular
Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor)
durchgeführt.
In einem parallelen Ansatz wurde der E.coli-
Expressionsvektor pXT99A mit dem Restriktionsenzym RsrII
(Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland,
Produktbeschreibung RsrII, Product No. 1292587) gespalten
und mit Klenow-Polymerase (Amersham Pharmacia Biotech,
Freiburg, Deutschland, Klenow Fragment of DNA Polymerase I,
Product No. 27-0928-01) zur Ligation vorbereitet. Die
Ligation des Minimalreplikons mit dem Vektorkonstrukt
pXT99A wurde wie von Sambrook et al. (1989, Molecular
Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor)
beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit T4-
Ligase (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Product No. 27-0870-04)
über Nacht inkubiert wurde.
Der so konstruierte E. coli-C. glutamicum-Shuttle-
Expressionsvektor pEC-XT99A wurde mittels Elektroporation
(Liebl et al., 1989, FEMS Microbiology Letters, 53: 299-303)
in C. glutamicum DSM5715 transferiert. Die Selektion der
Transformanten erfolgte auf LBHIS Agar bestehend aus 18,5
g/l Brain-Heart Infusion Boullion, 0,5 M Sorbitol, 5 g/l
Bacto-Trypton, 2,5 g/l Bacto-Yeast-Extract, 5 g/l NaCl und
18 g/l Bacto-Agar, der mit 5 mg/l Tetracyclin
supplementiert worden war. Die Inkubation erfolgte für 2
Tage bei 33°C.
Plasmid DNA wurde aus einer Transformante nach den üblichen
Methoden isoliert (Peters-Wendisch et al., 1998,
Microbiology, 144, 915-927), mit der
Restriktionsendonuklease HindIII geschnitten und das
Plasmid durch anschließende Agarosegel-Elektrophorese
überprüft.
Das so erhaltene Plasmidkonstrukt wurde als pEC-XT99A
bezeichnet und ist in Fig. 1 dargestellt. Der durch
Elektroporation des Plasmides pEC-XT99A in den
Corynebacterium glutamicum Stamm DSM5715 erhaltene Stamm
wurde DSM5715/pEC-XT99A genannt und als DSM12967 bei der
Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen
(DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag
hinterlegt.
Ausgehend von den Nucleotidsequenzen des
Pantothenatbiosynthese Gens panD von C. glutamicum ATCC
13032 (Dusch et al. (Applied and Environmental Microbiology
65(4), 1530-1539 (1999)) und DE 198 55 313.7) wurden PCR-
Primer so ausgewählt, daß das amplifizierte Fragment das
Gen mit seiner nativen Ribosomen-Bindestellen enthält. Das
mit den PCR-Primer panD-Cg1 (5'-CATCTCACGCTATGAATTCT-3')
und panD-Cg2 (5'-ACGAGGCCTGCAGCAATA-3) amplifizierte 405 bp
große Fragment wurde den Herstellerangaben zufolge in den
Vektor pCR®2.1 (Original TA Cloning Kit, Invitrogene (Leek,
Niederlande), Produktbeschreibung Original TA Cloning® Kit,
Cat. no. KNM2030-01) ligiert und anschließend in den E.
coli Stamm TOP10F' (Katalog "Invitrogen 2000" der Firma
Invitrogen, Groningen, Niederlande) transformiert. Die
Selektion auf Transformanten erfolgte durch Inkubation bei
37°C für 24 Stunden auf LB-Agarplatten mit 100 µg/ml
Ampicillin und 40 µg/ml X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-
β-D-Galaktosid).
DNA des so konstruierten Plasmids pCR-D2 wurde nach der
üblichen Methode aus einer Transformante isoliert, mit den
Restriktionsendonukleasen SacI und XbaI verdaut und in den
ebenso gespaltenen Vektor pEC-XT99A ligiert. Da die zweite
XbaI-Schnittstelle, welche in der panD-Kodierregion liegt,
in dem E. coli Wirt Top10F' methyliert vorliegt, wurde
diese Spaltstelle nicht geschnitten und das Gen wurde
folglich intakt durch die flankierenden SacI und XbaI
Schnittstellen aus dem Plasmid pCR-D2 herausgespalten. Nach
der Ligation wurde der Ansatz in den Stamm E. coli DH5αmcr
elektroporiert. Die Selektion erfolgte auf LB-Agarplatten
mit 50 µg/ml Kanamycin. Plasmid-DNA aus einer so erhaltenen
Transformante wurde isoliert, mit den
Restriktionsendonukleasen SacI und XbaI gespalten und die
Fragmente wurden anschließend durch Agarose-
Gelelektrophorese überprüft. Das so konstruierte Plasmid
wurde als pXT-panD bezeichnet und ist in Fig. 2
dargestellt.
Das in Beispiel 3 beschriebene Plasmid pXT-panD wurde in
den C. glutamicum Stamm ATCC13032ΔilvA/pVWEx1pyc
elektroporiert. Nach zweitägiger Selektion bei 30°C auf LB-
Agar, der mit 10 µg/ml Tetracyclin und 25 µg/ml Kanamycin
supplementiert worden war, wurde der Stamm
ATCC13032ΔilvA/pVWEx1pyc,pXT-panD erhalten.
Die Bildung von Pantothenat durch die C. glutamicum Stämme
ATCC13032ΔilvA/pVWEx1pyc,pXT-panD und ATCC13032ΔilvA/pXT-
panD wurde in Medium CGXII (Keilhauer et al., 1993, Journal
of Bacteriology, 175: 5595-5603; Tabelle 2) geprüft, das mit
10 µg/ml Tetracyclin, 2 mM Isoleucin und im Falle des
Stammes ATCC13032ΔilvA/pVWEx1pyc,pXT-panD mit zusätzlich 25
µg/ml Kanamycin supplementiert worden war.
Dieses Medium wird im Folgenden als C. glutamicum-
Testmedium bezeichnet. Je 50 ml frisch angesetztes C.
glutamicum-Testmedium wurden aus einer 16 Stunden alten
Vorkultur des gleichen Mediums dergestalt angeimpft, daß
die optische Dichte der Kultursuspension (o.D.580) bei
Inkubationsbeginn 0,1 betrug. Die Kulturen wurden bei 30°C
und 130 U/min bebrütet. Nach 5 stündiger Inkubation wurde
IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactosid) in einer
Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt. Nach 48stündiger
Inkubation wurde die optische Dichte (o.D.580) der Kultur
bestimmt und anschließend die Zellen durch 10minütige
Zentrifugation bei 5000 g entfernt und der Überstand
sterilfiltriert.
Zur Bestimmung der optischen Dichte wurde ein Novaspec II
Photometer der Firma Pharmacia (Freiburg, Deutschland) bei
einer Messwellenlänge von 580 nm eingesetzt.
Die Quantifizierung des D-Pantothenats im Kulturüberstand
erfolgte mittels Lactobacillus plantarum ATCC 8014 nach
Angaben des Handbuchs der Firma DIFCO (DIFCO MANUAL, 10th
Edition, S. 1100-1102; Michigan, USA). Für die Kalibrierung
wurde das Hemicalciumsalz von Pantothenat der Firma Sigma
(Deisenhofen, Deutschland) verwendet.
Das Ergebnis ist in Tabelle 3 dargestellt.
Folgende Figuren sind beigefügt:
Fig. 1 Restriktionskarte des Plasmids pEC-XT99A,
Fig. 2 Restriktionskarte des Plasmids pXT-panD.
Bei der Angabe der Basenpaarzahlen handelt es sich um ca.
Werte, die im Rahmen der Reproduzierbarkeit erhalten
werden.
Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben
folgende Bedeutung:
'lacZ: 3'-Terminus des lacZα Genfragmentes
lacIq: LacIq Allel des lac Repressorgens
lacZ': 5'-Terminus des lacZα Genfragmentes
oriV: Replikationsursprung V
panD: Aspartat-Decarboxylase Gen
per: Gen zur Kontrolle der Kopienzahl
Ptrc: trc-Promotor
rep: Replikationsregion für C. glutamicum
T1: Transkriptionsterminator T1
T2: Transkriptionsterminator T2
Tet: Tetracyclinresistenzgen
BamHI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BamHI
DraI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms DraI
EcoRI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
EcoRV: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRV
HindIII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms HindIII
KpnI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms KpnI
NdeI Schnittstelle des Restriktionsenzyms NdeI
NotI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms NotI
NruI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms NruI
PstI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms PstI
SacI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SacI
SalI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SalI
SmaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SmaI
XbaI**: Methylierte Schnittstelle XbaI
XbaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms XbaI
'lacZ: 3'-Terminus des lacZα Genfragmentes
lacIq: LacIq Allel des lac Repressorgens
lacZ': 5'-Terminus des lacZα Genfragmentes
oriV: Replikationsursprung V
panD: Aspartat-Decarboxylase Gen
per: Gen zur Kontrolle der Kopienzahl
Ptrc: trc-Promotor
rep: Replikationsregion für C. glutamicum
T1: Transkriptionsterminator T1
T2: Transkriptionsterminator T2
Tet: Tetracyclinresistenzgen
BamHI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BamHI
DraI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms DraI
EcoRI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
EcoRV: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRV
HindIII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms HindIII
KpnI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms KpnI
NdeI Schnittstelle des Restriktionsenzyms NdeI
NotI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms NotI
NruI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms NruI
PstI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms PstI
SacI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SacI
SalI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SalI
SmaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SmaI
XbaI**: Methylierte Schnittstelle XbaI
XbaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms XbaI
Claims (13)
1. Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure durch
Fermentation coryneformer Bakterien,
dadurch gekennzeichnet,
daß man Bakterien einsetzt, in denen man die für die
Pyruvat-Carboxylase (EC-Nummer 6.4.1.1.) codierende
Nucleotidsequenz (pyc-Gen) verstärkt, insbesondere
überexprimiert.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man Bakterien einsetzt, in denen man zusätzlich
weitere Gene des Biosyntheseweges der D-Pantothensäure
verstärkt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man Bakterien einsetzt, in denen die
Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet
sind, die die Bildung der D-Pantothensäure verringern.
4. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß man einen mit einem Plasmidvektor transformierten
Stamm einsetzt, und der Plasmidvektor die für die
Pyruvat-Carboxylase codierende Nucleotidsequenz trägt.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet,
daß man mit dem Plasmid pVwEx1pyc transformierte
Bakterien einsetzt.
6. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man gleichzeitig das für die Asparat-Decarboxylase
kodierende panD-Gen verstärkt.
7. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man gleichzeitig das für die Ketopantoat-
Hydroxymethyltransferase kodierende panB-Gen
verstärkt.
8. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man gleichzeitig das für die Pantothenat-
Synthetase kodierende panC-Gen verstärkt.
9. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man gleichzeitig das für die Dihydroxysäure-
Dehydratase kodierende ilvD-Gen verstärkt.
10. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß man die genannten Gene in coryneformen Bakterien
verstärkt, die bereits D-Pantothensäure produzieren.
11. Verfahren zur fermentativen Herstellung von
D-Pantothensäure gemäß einem oder mehreren der
vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß man folgende Schritte durchführt:
- a) Fermentation der D-Pantothensäure produzierenden Bakterien, in denen zumindest das für die Pyruvat-Carboxylase codierende Gen verstärkt wird.
- b) Anreicherung der D-Pantothensäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien und
- c) Isolieren der produzierten D-Pantothensäure.
12. Coryneforme Bakterien, in denen die für die Pyruvat-
Carboxylase (EC-Nummer 6.4.1.1.) codierende
Nucleotidsequenzen (pyc-Gen) verstärkt, insbesondere
überexprimiert.
13. Corynebacterium glutamicum DG 52-5/pVWEx1pyc
hinterlegt unter der Nummer DSM 12893 bei der DSMZ,
Braunschweig.
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SK1320-2000A SK13202000A3 (sk) | 1999-09-09 | 2000-09-04 | Spôsob fermentatívnej výroby kyseliny d-pantoténovej za použitia koryneformných baktérií |
BR0004000-2A BR0004000A (pt) | 1999-09-09 | 2000-09-05 | Processo para a preparação fermentativa de ácido d-pantotênico usando bactéria corineforme |
JP2000270569A JP2001112489A (ja) | 1999-09-09 | 2000-09-06 | コリネフォルム細菌を使用するd−パントテン酸の発酵的製法 |
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