CN112626266A

CN112626266A - 新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测引物组及应用

Info

Publication number: CN112626266A
Application number: CN202011167529.4A
Authority: CN
Inventors: 仝舟; 高山; 杨勃; 任斌知; 薛莹; 尚丽娜
Original assignee: Shanxi Institute Of Higher Innovation
Current assignee: Shanxi Institute Of Higher Innovation
Priority date: 2020-10-27
Filing date: 2020-10-27
Publication date: 2021-04-09

Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的检测引物组，以及包括含有上述检测引物组的溶液的检测试剂盒，本发明还公开了一种新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的检测方法，所述检测方法利用上述检测引物组和检测试剂盒，采用环介导等温扩增检测技术。本发明可以直接通过肉眼或紫外观察最后液体的颜色来判断待测样品中是否含有新型冠状病毒，检测方法直观快速；使用的基因引物组稳定性高，根据新型冠状病毒与其他人冠状病毒不同的序列区域设计，增加了实验的特异性，避免交叉和假阳性，同时对其中的引物进行了优化，进一步增加特异性和稳定性；同时利用上述引物组通过试剂的不同配比，通过以上的体系和程序，得出稳定且快速的实验结果。

Description

新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测引物组及应用

技术领域

本发明涉及病毒核酸检测领域，具体涉及一种新型冠状病毒 SARS-CoV-2的检测引物组及应用。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)疫情的快速蔓延，导致疑似感染者和密切接触者数量激增。尽早进行病毒检测，不仅可以使感染者获得及时治疗，降低死亡风险，还能有效控制传染源。因此，为满足SARS-CoV-2检测的需求，需要增加快速、准确的检测方法。

环介导等温扩增检测技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification， LAMP)是一种高效准确的DNA等温扩增技术，能在60～65℃下实现DNA 的指数扩增，其扩增效率是PCR的10～1000倍。此外，由于LAMP针对标靶DNA链的6个区段设计了4～6条特异性引物，特异性也非常高。

自从LAMP技术发明以来，已经有许多的科研团队建立了针对各种病原体的LAMP检测技术，近年来LAMP技术的研究进展主要集中在两个领域，一个是现有LAMP技术成果在临床上的应用和评价，在经过大量严谨的临床试验之后，通过特异性、敏感性、重复性、准确性等一系列的分析来认证该技术是否满足临床诊断的需求。二是针对进一步简化LAMP实验步骤，时期成为现场化的、快速、应需、整合的分子诊断技术，能更好的满足临床及时检测的需求所进行的大量的基础研究。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种新型冠状病毒 SARS-CoV-2的检测引物组及应用，具体为一种新型冠状病毒SARS-CoV-2 的检测引物组，以及采用环介导等温扩增检测技术的检测方法，具有检测快速和准确度高的优势。

为此，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测引物组，包括N1、 N2、E1或E2基因引物组中的一种，

所述N1基因引物组为：

外侧引物：

引物F3：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

引物B3：核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

内侧引物：

引物FIP：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

引物BIP：核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

环状引物：

引物LF：核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

引物LB：核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述N2基因引物组为：

外侧引物：

引物F3：核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

引物B3：核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

内侧引物：

引物FIP：核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

引物BIP：核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

环状引物：

引物LF：核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

引物LB：核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

所述E1基因引物组为：

外侧引物：

引物F3：核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

引物B3：核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

内侧引物：

引物FIP：核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；

引物BIP：核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；

所述E2基因引物组为：

外侧引物：

引物F3：核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；

引物B3：核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；

内侧引物：

引物FIP：核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；

引物BIP：核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；

环状引物

引物LB：核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。

本发明还提供一种新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测试剂盒，包括含有上述检测引物组的溶液，所述检测引物组的溶液为将引物组中每项引物稀释到10-40μmol/L的溶液。

上述检测试剂盒还包括100mmol/L的MgSO₄，5mol/L的甜菜碱， 2.5mmol/L的dNTPs、40U/μL的Bst DNA聚合酶和/或10×buffer。

进一步地，上述各组分的体积分别为，

N1基因引物组溶液共18ul、dNTPs 3ul、甜菜碱2ul、MgSO₄ 2ul、Bst DNA聚合酶0.5ul、10×buffer 3ul、模板2ul，用DEPC水补足体积至30ul；其中，N1基因引物组溶液中，每个引物的溶液为3ul；

或，

N2基因引物组溶液共10ul、dNTPs 2ul、甜菜碱2ul、MgSO₄ 2ul、Bst DNA聚合酶1ul、10×buffer 2.5ul、模板1ul，用DEPC水补足体积至25ul；其中N2基因引物组溶液中，外侧引物中每个引物的溶液为1ul，内侧引物和环状引物中每个引物的溶液为2ul；

或，

E1基因引物组溶液共12ul、dNTPs 3ul、甜菜碱2ul、MgSO₄ 2ul、Bst DNA聚合酶0.5ul、10×buffer 2ul、模板1ul，用DEPC水补足体积至30ul；其中，E1基因引物组溶液中，每个引物的溶液的体积为3ul；

或，

E2基因引物组溶液共9ul、dNTPs 2.5ul、甜菜碱2ul、MgSO₄ 2.5ul、 Bst DNA聚合酶0.5ul、10×buffer 2.5ul、模板1ul，用DEPC水补足体积至 20ul；其中，外侧引物和内侧引物中每个引物的溶液的体积为2ul，环状引物的溶液的体积为1ul，

其中，对应每种基因引物组溶液的溶液各3组，每组所述模板分别为待测样品、阴性对照和阳性对照。

进一步地，所述阴性对照为任意阴性质粒；

所述阳性对照为，若基因引物组为N基因，所述阳性模板为 SARS-CoV-2的N基因全长DNA连接至pUC57载体筛选鉴定的阳性重组质粒，其中1ug质粒拷贝数为2.454×10¹¹；

或，若基因引物组为E基因，所述阳性模板为SARS-CoV-2的E基因全长DNA连接至pUC57载体筛选鉴定的阳性重组质粒，1μg质粒拷贝数： 3.305×10¹¹

本发明还公开一种新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

S1：取样；

S2：利用所述的检测引物组和/或所述的检测试剂盒和将取得的样品配制 LAMP反应体系，置入反应管，混匀离心；

S3：将反应管在62-64℃恒温扩增50-60分钟，然后85℃反应5分钟终止反应；

S4：在自然光下观察最终的反应液的颜色，判定待测样品中是否含有新型冠状病毒SARS-CoV-2。

进一步地，S3步骤中，在检测N1基因时，为64℃恒温扩增60分钟；

在检测N2基因时，为62℃恒温扩增50分钟；

在检测E1基因时，为63℃恒温扩增60分钟；

在检测E2基因时，为63℃恒温扩增50分钟。

进一步地，S4中判定的方法为向反应液中加入SYBR Green I染料，若反应液的颜色变为荧光绿，则判定待测样品中含有新型冠状病毒 SARS-CoV-2；若反应液颜色仍为原来的黄色，则判定待测样品中不含新型冠状病毒SARS-CoV-2。

本发明还提供上述检测引物组和/或检测试剂盒在制备检测新型冠状病毒SARS-CoV-2产品中的用途；

优选的，在检测新型冠状病毒SARS-CoV-2中N1基因、N2基因、E1 基因或E2基因。

本发明技术方案，具有如下优点：

(1)本申请使用采用环介导等温扩增检测技术，可以直接通过肉眼或紫外观察最后液体的颜色来判断待测样品中是否含有新型冠状病毒，检测方法直观快速。

(2)本申请采用4组不同基因引物组，本发明使用的基因引物组稳定性高，同时为根据新型冠状病毒与其他人冠状病毒不同的序列区域设计，增加了实验的特异性，避免交叉和假阳性，同时对内引物，外引物和环状引物进行了优化，比如引物TM值和自成环以及二聚体的产生等，增加扩增的特异性和稳定性。

(3)本申请利用上述引物组通过试剂的不同配比，结合扩增的温度和时间，调整出了相对稳定，敏感性好的实验体系和流程。通过以上的体系和程序，能够在1h内得到相对稳定的结果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1样品制得的系列样品按实施例1检测方法得到的最后液体的照片；

图2为实施例1样品制得的系列样品按实施例1检测方法得到的最后液体的紫外照片；

图3为实施例1样品制得的系列样品按实施例1检测方法得到的最后液体的核酸胶图；

图4为实施例2样品制得的系列样品按实施例2检测方法得到的最后液体的核酸胶图；

图5为实施例3样品制得的系列样品按实施例3检测方法得到的最后液体的照片；

图6为实施例3样品制得的系列样品按实施例3检测方法得到的最后液体的紫外照片；

图7为pUC57载体质粒图谱。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。

本发明使用的试剂和仪器如下：

PCR仪：ABI Applied BiosystemsVeriti 96-Well Thermal Cycler；

本申请使用的样品来自金唯智生物科技有限公司合成；

下述实施例中的引物组均由金唯智生物科技有限公司合成；

使用的阳性对照均由金唯智生物科技有限公司合成，其中， SARS-CoV-2的N基因全长DNA连接至pUC57载体(图谱如图7所示) MCS区域后获得的阳性重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示， SARS-CoV-2的E基因全长DNA连接至pUC57载体(图谱如图7所示)MCS区域后获得的阳性重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；

下述各实施例中的待测样品为该实施例中的阳性模板稀释到每μg拷贝数为1.0×10¹⁰的样品；

10×buffer由天根生物科技有限公司生产；

其余试剂均为市售标准试剂。

以下具体实施例是对本发明的进一步说明，所举案例并不能列举出本发明的全部实施方式，仅以其中部分实施方式为例进行说明，具体实施例如下：

实施例1

本实施例提供一种新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测方法，包括：

使用N1基因引物组，具体为：

外侧引物：

引物F3：TGGACCCCAAAATCAGCG；(见序列表中SEQ ID NO.1)

引物B3：GCCTTGTCCTCGAGGGAAT；(见序列表中SEQ ID NO.2)

内侧引物：

引物FIP：CCACTGCGTTCTCCATTCTGGTTAAATGCACCCCGCATT ACG；(见序列表中SEQ IDNO.3)

引物BIP：CGCGATCAAAACAACGTCGGCCCTTGCCATGTTGAGTG AGA；(见序列表中SEQ IDNO.4)

环状引物：

引物LF：TGAATCTGAGGGTCCACCAAA；(见序列表中SEQ ID NO.5)

引物LB：GGTTTACCCAATAATACTGCGTCTT(见序列表中SEQ ID NO.6)。

还包括利用新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测试剂盒，所述试剂盒包括：

将上述的N1基因引物组中每项引物稀释到10μmol/L，制得N1基因引物组溶液；

还包括100mmol/L的MgSO₄，5mol/L的甜菜碱，2.5mmol/L的dNTPs、 40U/μL的BstDNA聚合酶和/或10×buffer。

具体步骤如下：

S1：取样；

S2：利用上述的引物组溶液和试剂盒配制LAMP反应体系，具体见下表 1：

表1、LAMP反应体系

名称	体积(μL)
		引物F3(10μM)	3
引物F3(10μM)	3
		引物FIP(10μM)	3
引物BIP(10μM)	3
		引物LF(10μM)	3
引物LB(10μM)	3
		dNTPs(2.5mM each)	3
甜菜碱(5mol/L)	2
		硫酸镁(100mmol/L)	2
Bst DNA聚合酶(40U/μL)	0.5
		10×buffer	3
模板	2
		dd水	0
总计	30.5μL

将上述配制的LAMP反应体系混匀离心；其中，所述模板为3组平行体系，分别为待测样品，阳性对照和阴性对照，其中，阳性对照为SARS-CoV-2 的N基因全长DNA连接至pUC57载体筛选鉴定的阳性重组质粒，其中1ug 质粒拷贝数为2.454×10¹¹；阴性对照是293T细胞的质粒DNA；

S3：将反应管在64℃恒温扩增60分钟，然后85℃反应5分钟终止反应；

S4：向反应液中加入SYBR Green I染料，然后在自然光下观察最后液体的颜色变为荧光绿，判定待测样品中含有新型冠状病毒SARS-CoV-2。

实施例2

本实施例提供一种新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测方法，包括：

使用N2基因引物组，具体为：

外侧引物：

引物F3：AGATCACATTGGCACCCG；(见序列表中SEQ ID NO.7)

引物B3：CCATTGCCAGCCATTCTAGC；(见序列表中SEQ ID NO.8)

内侧引物：

引物FIP：TGCTCCCTTCTGCGTAGAAGCCAATGCTGCAATCGTGC TAC；(见序列表中SEQ IDNO.9)

引物BIP：GGCGGCAGTCAAGCCTCTTCCCTACTGCTGCCTGGAGT T；(见序列表中SEQ IDNO.10)

环状引物：

引物LF：GCAATGTTGTTCCTTGAGGAAGTT；(见序列表中SEQ ID NO.11)

引物LB：TCGTTCCTCATCACGTAGTCG(见序列表中SEQ ID NO.12)。

将上述的N2基因引物组中，F3和B3引物稀释到10μmol/L，BIP和 FIP引物稀释到20μmol/L，LF和LB引物稀释到40μmol/L，制得N2基因引物组溶液；

具体步骤如下：

S1：取样；

S2：利用上述的引物组溶液和试剂盒配制LAMP反应体系，具体见下表 2：

表2、LAMP反应体系

名称	体积(μL)
		引物F3(10μM)	1
引物B3(10μM)	1
		引物BIP(20μM)	2
引物FIP(20μM)	2
		引物LF(40μM)	2
引物LB(40μM)	2
		dNTP(2.5mM each)	2
Bst DNA聚合酶(40U/μL)	1
		MgSO<sub>4</sub>(100mM)	2
10×buffer	2.5
		甜菜碱(5M)	2
模板	1
		ddH<sub>2</sub>0	4.5
总体积	25

将上述配制的LAMP反应体系混匀离心；其中，所述模板为3组平行体系，分别为待测样品，阳性对照和阴性对照，其中，阳性对照为SARS-CoV-2 的N基因全长DNA连接至pUC57载体筛选鉴定的阳性重组质粒，其中1ug 质粒拷贝数为2.454×10¹¹；阴性对照293T细胞的质粒DNA；

S3：将反应管在62℃恒温扩增50分钟，然后85℃反应5分钟终止反应；

实施例3

本实施例提供一种新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测方法，包括：

使用E1基因引物组，具体为：

外侧引物

引物F3：GTACGTTAATAGTTAATAGCGTACT，(见序列表中SEQ ID NO.13)；

引物B3：ACCAGAAGATCAGGAACTCT，(见序列表中SEQ ID NO.14)；

内侧引物

引物FIP：GAAGCGCAGTAAGGATGGCTCTTTTTCTTGCTTTCGTG G，(见序列表中SEQ IDNO.15)；

引物BIP：GTGCGTACTGCTGCAATATTGTTAACAGAAGAATTCAG ATTTTTAACACG，(见序列表中SEQ ID NO.16)。

将上述的E1基因引物中的每项引物稀释到10μmol/L制得E1基因引物组溶液。

具体步骤如下：

S1：取样；

S2：利用上述的引物组溶液和试剂盒配制LAMP反应体系，具体见下表 3：

表3、LAMP反应体系

名称	体积(μL)
		引物F3(10μM)	3
引物B3(10μM)	3
		引物FIP(10μM)	3
引物BIP(10μM)	3
		dNTP(2.5mM each)	3
Bst DNA聚合酶(40U/μL)	0.5
		MgSO<sub>4</sub>(100mM)	2
10×buffer	2
		甜菜碱(5M)	2
模板	1
		ddH<sub>2</sub>0	7.5
总体积	30

将上述配制的LAMP反应体系混匀离心；其中，所述模板为3组平行体系，分别为待测样品，阳性对照和阴性对照，其中，阳性对照为SARS-CoV-2 的E基因全长DNA连接至pUC57载体筛选鉴定的阳性重组质粒，1μg质粒拷贝数：3.305×10¹¹；阴性对照293T细胞的质粒DNA；

S3：将反应管在63℃恒温扩增60分钟，然后85℃反应5分钟终止反应；

实施例4

本实施例提供一种新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测方法，使用E2基因引物组，具体为：

引物F3：TTTCGGAAGAGACAGGTAC，(见序列表中SEQ ID NO.17)；

引物B3：AGGAACTCTAGAAGAATTCAGA，(见序列表中SEQ ID NO.18)；

内侧引物

引物FIP：CGCAGTAAGGATGGCTAGTGTAGCGTACTTCTTTTTCT TGCTT，(见序列表中SEQID NO.19)；

引物BIP：TCGATTGTGTGCGTACTGCTGTTTTTAACACGAGAGTA AACGT，(见序列表中SEQID NO.20)；

环状引物

引物LB：GCTGCAATATTGTTAACGTGAGTC，(见序列表中SEQ ID NO.21)。

将上述E2基因引物组中的每项引物稀释到10μmol/L制得E2基因引物组溶液。

具体步骤如下：

S1：取样；

S2：利用上述的引物组溶液和试剂盒配制LAMP反应体系，具体见下表4：

表4、LAMP反应体系

名称	体积(μL)
		引物F3(10μM)	2
引物B3(10μM)	2
		引物FIP(10Μm)	2
引物BIP(10Μm)	2
		引物LB(10Μm)	1
dNTP(2.5mM each)	2.5
		Bst DNA聚合酶(40U/μL)	0.5
MgSO<sub>4</sub>(100mM)	2.5
		10×buffer	2.5
甜菜碱(5M)	2
		模板	1
ddH<sub>2</sub>0	6
		总体积	26

S3：将反应管在63℃恒温扩增50分钟，然后85℃反应5分钟终止反应；

试验例

本试验例中，分别将实施例1-4中的待测样品稀释10¹⁰、10⁹、10⁸、10⁷、 10⁶、10⁵、10⁴、10³倍得到系列样品，由于1μg待测样品拷贝数为1.0×10¹⁰，因此分别将稀释后的系列样品记为10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷，然后重复实施例中的检测方法。

图1、图2和图3分别为实施例1待测样品制得的系列样品按实施例1 检测方法得到的最后液体的照片、紫外照片和核酸胶图，图1和图2的点样顺序从左边往右依为水、阴、10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷，图3 为从左边往右依为marker、水、阴、10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷，其中阴为1.0×10⁶拷贝数293T细胞质粒，随着拷贝数的增加，图1液体的颜色逐渐加深，图2液体的颜色逐渐变成荧光绿，图3核酸胶图出现了LAMP 条带，测试结果为10⁰和10¹为阴性，10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶和10⁷为阳性。

图4为实施例2样品制得的系列样品按实施例2检测方法得到的最后液体的核酸胶图，点样顺序从左边往右依为Marker、水、10¹⁰、10⁷、10⁶、10⁵、 10⁴、10¹、10²、10³、阴1、阴2，其中阴1为1.0×10⁶拷贝数293T细胞质粒，阴2为随机选取的1.0×10⁶拷贝数其他任意阴性质粒，随着拷贝数的减少图4 核酸胶图LAMP条带逐渐减弱，测试结果为10¹、10²、10³为阴性，10⁴、10⁵、 10⁶、10⁷和10¹⁰为阳性。

图5和图6为实施例3样品制得的系列样品按实施例3检测方法得到的最后液体的照片和紫外照片，点样顺序从左边往右依为水、阴、10⁰、10¹、 10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷，其中阴为1.0×10⁶拷贝数293T细胞质粒，随着拷贝数的增加，图5液体的颜色逐渐加深，图6液体的颜色逐渐变成荧光绿，测试结果为10⁰、10¹、10²、10³、10⁴和10⁵为阴性，10⁶、10⁷为阳性。

将实施例4样品制得的系列样品按实施例4检测方法得到的最后液体，检测结果为，10⁰、10¹、10²、10³和10⁴为阴性，10⁵、10⁶和10⁷为阳性。

由以上实验可以得到，10⁶、10⁷样品为阳性，即本发明将样品稀释10⁴倍时仍有很高的准确性。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 山西高等创新研究院

<120> 新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测引物组及应用

<160> 23

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tggaccccaa aatcagcg 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gccttgtcct cgagggaat 19

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccactgcgtt ctccattctg gttaaatgca ccccgcatta cg 42

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgcgatcaaa acaacgtcgg cccttgccat gttgagtgag a 41

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgaatctgag ggtccaccaa a 21

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggtttaccca ataatactgc gtctt 25

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agatcacatt ggcacccg 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccattgccag ccattctagc 20

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgctcccttc tgcgtagaag ccaatgctgc aatcgtgcta c 41

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggcggcagtc aagcctcttc cctactgctg cctggagtt 39

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gcaatgttgt tccttgagga agtt 24

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcgttcctca tcacgtagtc g 21

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gtacgttaat agttaatagc gtact 25

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

accagaagat caggaactct 20

<210> 15

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gaagcgcagt aaggatggct ctttttcttg ctttcgtgg 39

<210> 16

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gtgcgtactg ctgcaatatt gttaacagaa gaattcagat ttttaacacg 50

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tttcggaaga gacaggtac 19

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aggaactcta gaagaattca ga 22

<210> 19

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cgcagtaagg atggctagtg tagcgtactt ctttttcttg ctt 43

<210> 20

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tcgattgtgt gcgtactgct gtttttaaca cgagagtaaa cgt 43

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gctgcaatat tgttaacgtg agtc 24

<210> 22

<211> 3970

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420

tgcatctaga tatcggatcc catgtctgat aatggacccc aaaatcagcg aaatgcaccc 480

cgcattacgt ttggtggacc ctcagattca actggcagta accagaatgg agaacgcagt 540

ggggcgcgat caaaacaacg tcggccccaa ggtttaccca ataatactgc gtcttggttc 600

accgctctca ctcaacatgg caaggaagac cttaaattcc ctcgaggaca aggcgttcca 660

attaacacca atagcagtcc agatgaccaa attggctact accgaagagc taccagacga 720

attcgtggtg gtgacggtaa aatgaaagat ctcagtccaa gatggtattt ctactaccta 780

ggaactgggc cagaagctgg acttccctat ggtgctaaca aagacggcat catatgggtt 840

gcaactgagg gagccttgaa tacaccaaaa gatcacattg gcacccgcaa tcctgctaac 900

aatgctgcaa tcgtgctaca acttcctcaa ggaacaacat tgccaaaagg cttctacgca 960

gaagggagca gaggcggcag tcaagcctct tctcgttcct catcacgtag tcgcaacagt 1020

tcaagaaatt caactccagg cagcagtagg ggaacttctc ctgctagaat ggctggcaat 1080

ggcggtgatg ctgctcttgc tttgctgctg cttgacagat tgaaccagct tgagagcaaa 1140

atgtctggta aaggccaaca acaacaaggc caaactgtca ctaagaaatc tgctgctgag 1200

gcttctaaga agcctcggca aaaacgtact gccactaaag catacaatgt aacacaagct 1260

ttcggcagac gtggtccaga acaaacccaa ggaaattttg gggaccagga actaatcaga 1320

caaggaactg attacaaaca ttggccgcaa attgcacaat ttgcccccag cgcttcagcg 1380

ttcttcggaa tgtcgcgcat tggcatggaa gtcacacctt cgggaacgtg gttgacctac 1440

acaggtgcca tcaaattgga tgacaaagat ccaaatttca aagatcaagt cattttgctg 1500

aataagcata ttgacgcata caaaacattc ccaccaacag agcctaaaaa ggacaaaaag 1560

aagaaggctg atgaaactca agccttaccg cagagacaga agaaacagca aactgtgact 1620

cttcttcctg ctgcagattt ggatgatttc tccaaacaat tgcaacaatc catgagcagt 1680

gctgactcaa ctcaggccta agggcccgtc gactgcagag gcctgcatgc aagcttggcg 1740

taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 1800

atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 1860

ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 1920

taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 1980

tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 2040

aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 2100

aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 2160

ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 2220

acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 2280

ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 2340

tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 2400

tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 2460

gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 2520

agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 2580

tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 2640

agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 2700

tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 2760

acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 2820

tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 2880

agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 2940

tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 3000

acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 3060

tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 3120

ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 3180

agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 3240

tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 3300

acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 3360

agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 3420

actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 3480

tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc 3540

gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 3600

ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 3660

tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 3720

aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 3780

tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 3840

tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 3900

gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg 3960

ccctttcgtc 3970

<210> 23

<211> 2948

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420

tgcatctaga tatcggatcc cgacacatgt actcattcgt ttcggaagag acaggtacgt 480

taatagttaa tagcgtactt ctttttcttg ctttcgtggt attcttgcta gttacactag 540

ccatccttac tgcgcttcga ttgtgtgcgt actgctgcaa tattgttaac gtgagtcttg 600

taaaaccttc tttttacgtt tactctcgtg ttaaaaatct gaattcttct agagttcctg 660

atcttctggt ctaagtgtcg ggcccgtcga ctgcagaggc ctgcatgcaa gcttggcgta 720

atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat 780

acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt 840

aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta 900

atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc 960

gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa 1020

ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa 1080

aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 1140

ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 1200

aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 1260

gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 1320

tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 1380

tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga 1440

gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag 1500

cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta 1560

cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag 1620

agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg 1680

caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac 1740

ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc 1800

aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag 1860

tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc 1920

agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac 1980

gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc 2040

accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg 2100

tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag 2160

tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc 2220

acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac 2280

atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag 2340

aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac 2400

tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg 2460

agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc 2520

gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact 2580

ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg 2640

atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa 2700

tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt 2760

tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg 2820

tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga 2880

cgtctaagaa accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc 2940

ctttcgtc 2948

Claims

1.一种新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测引物组，其特征在于，包括N1、N2、E1或E2基因引物组中的一种，

所述N1基因引物组为：

外侧引物：

引物F3：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

引物B3：核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

内侧引物：

引物FIP：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

引物BIP：核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

环状引物：

引物LF：核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

引物LB：核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述N2基因引物组为：

外侧引物：

引物F3：核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

引物B3：核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

内侧引物：

引物FIP：核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

引物BIP：核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

环状引物：

引物LF：核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

引物LB：核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

所述E1基因引物组为：

外侧引物：

引物F3：核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

引物B3：核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

内侧引物：

引物FIP：核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；

引物BIP：核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；

所述E2基因引物组为：

外侧引物：

引物F3：核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；

引物B3：核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；

内侧引物：

引物FIP：核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；

引物BIP：核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；

环状引物

引物LB：核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。

2.一种新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测试剂盒，其特征在于，包括含有权利要求1中的检测引物组的溶液，所述检测引物组的溶液为将引物组中每项引物稀释到10-40μmol/L的溶液。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括100mmol/L的MgSO₄，5mol/L的甜菜碱，2.5mmol/L的dNTPs、40U/μL的Bst DNA聚合酶和/或10×buffer。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，上述各组分的体积分别为，

或，

E2基因引物组溶液共9ul、dNTPs 2.5ul、甜菜碱2ul、MgSO₄ 2.5ul、Bst DNA聚合酶0.5ul、10×buffer 2.5ul、模板1ul，用DEPC水补足体积至20ul；其中，外侧引物和内侧引物中每个引物的溶液的体积为2ul，环状引物的溶液的体积为1ul，

其中，对应每种基因引物组溶液的溶液各3组，每组模板分别为待测样品、阴性对照和阳性对照。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为任意阴性质粒；

所述阳性对照为，若基因引物组为N基因，所述阳性模板为SARS-CoV-2的N基因全长DNA连接至pUC57载体筛选鉴定的阳性重组质粒，其中1ug质粒拷贝数为2.454×10¹¹；

或，若基因引物组为E基因，所述阳性模板为SARS-CoV-2的E基因全长DNA连接至pUC57载体筛选鉴定的阳性重组质粒，1μg质粒拷贝数为3.305×10¹¹。

6.一种新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：

S1：取样；

S2：利用权利要求1的检测引物组和/或权利要求2-5任一项所述的检测试剂盒和将取得的样品配制LAMP反应体系，置入反应管，混匀离心；

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，S3步骤中，在检测N1基因时，为64℃恒温扩增60分钟；

在检测N2基因时，为62℃恒温扩增50分钟；

在检测E1基因时，为63℃恒温扩增60分钟；

在检测E2基因时，为63℃恒温扩增50分钟。

8.根据权利要求6或7所述的检测方法，其特征在于，S4中判定的方法为向反应液中加入SYBR Green I染料，若反应液的颜色变为荧光绿，则判定待测样品中含有新型冠状病毒SARS-CoV-2；若反应液颜色仍为原来的黄色，则判定待测样品中不含新型冠状病毒SARS-CoV-2。

9.权利要求1的检测引物组和/或权利要求2-5任一项所述的检测试剂盒在制备检测新型冠状病毒SARS-CoV-2产品中的用途；优选的，在检测新型冠状病毒SARS-CoV-2中N1基因、N2基因、E1基因或E2基因。