CN114933970A - 缺失6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶1基因的弓形虫基因敲除虫株 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种弓形虫基因敲除虫株，该虫株缺失核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的弓形虫6‑磷酸葡萄糖酸脱氢酶1基因(Tg6PGDH1)。本发明还公开了该虫株的构建方法以及在制备弓形虫疫苗中的应用。所述弓形虫基因敲除虫株在体外可以正常培养，虫体可以正常生长复制，但是在体内毒力减弱且对动物具有很高的免疫保护力，有成为抗弓形虫基因工程疫苗的潜力。

Description

缺失6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶1基因的弓形虫基因敲除虫株

技术领域

本发明涉及一种弓形虫基因敲除虫株，具体是缺失6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶1基因(Tg6PGDH1基因)的弓形虫基因敲除虫株，本发明还涉及该虫株的构建方法以及用途。

技术背景

弓形虫是从属于顶复门的一种专性细胞内寄生原虫，感染包括人在内的几乎所有温血动物，入侵宿主各种有核细胞。弓形虫生活史复杂，其既可以在终末宿主猫中进行有性繁殖，又可以在人、猪、牛和羊等其他中间宿主中进行无性繁殖。弓形虫具有多种致病形态，如速殖子、缓殖子以及卵囊等。弓形虫感染严重危害人类健康和畜禽养殖业发展，造成巨大的社会问题和经济损失。但是，弓形虫病尚无理想的疫苗。当前仅有一个弱毒S48虫株被授权成为了商业疫苗，但是，该疫苗仅在绵羊中使用，且存在毒力返强的风险。因此，迫切需要发掘更多的疫苗设计靶点，研制新型抗弓形虫病的疫苗。

针对弓形虫病的防控手段有限，而虫体中重要的代谢途径可以成为潜在的疫苗设计靶点。磷酸戊糖代谢途径(PPP)是弓形虫葡萄糖分解代谢的主要途径之一，但是其受关注度低。本发明通过遗传学手段分析PPP代谢酶在弓形虫生长发育中的生物学作用，挖掘出了一个具有良好潜力的疫苗设计靶点，发现在II型野生型虫株ME49中缺失Tg6PGDH1后，虫体在体外可以正常传代培养，但是显著降低体内毒力，表明：弓形虫Tg6PGDH1是一个有良好应用潜力的疫苗设计靶点。ME49Δ6pgdh1是一株减毒的弓形虫候选疫苗虫株，其应用对于弓形虫病的防治具有重要价值和意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种弓形虫基因敲除虫株及其构建方法和应用，该虫株敲除了6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶1基因(Tg6PGDH1基因)，其在体外可以正常传代培养，但是具有毒力低，在动物体内繁殖少等优点，能提高动物对弓形虫的免疫能力，有制备抗弓形虫基因工程疫苗的潜力。

本发明的技术方案为：

(1)本发明所述弓形虫基因敲除减毒虫株(ME49Δ6pgdh1)的构建：构建pSAG1-Cas9-TgU6-sgTg6PGDH1质粒；制备Tg6PGDH1-5UTR::DHFR*::Tg6PGDH1-3UTR同源模板；将二者共电转至野生型ME49虫株中，经乙胺嘧啶药物筛选和PCR鉴定获得弓形虫基因敲除虫株ME49Δ6pgdh1。

(2)ME49Δ6pgdh1虫株的体外生长试验：ME49和ME49Δ6pgdh1虫体分别感染人成纤维细胞(HFF)，进行体外12天的空斑试验和24小时的复制试验。结果表明：ME49和ME49Δ6pgdh1在体外的空斑形成能力和复制能力没有显著差异，表明缺失Tg6PGDH1不影响虫体体外的正常生长。

(3)ME49Δ6pgdh1虫株的体内毒力试验：以野生型ME49虫株为对照，按照1×10²个弓形虫速殖子/小鼠(每组接20只)，或者按照1×10³个虫体/小鼠(每组接10只)，腹腔接种6周龄雌性ICR小鼠，记录30天内小鼠的存活情况。结果表明：感染1×10²个或者1×10³个ME49Δ6pgdh1虫体的小鼠30天内存活率为80％，而接种野生型ME49虫体的小鼠30内存活率在20％左右。表明：缺失Tg6PGDH1显著降低虫体体内毒力。

(4)ME49Δ6pgdh1虫株对小鼠的免疫保护力：以100个ME49Δ6pgdh1速殖子每只小鼠的感染量接种ICR小鼠，每组8只。30天后对免疫接种过ME49Δ6pgdh1的小鼠及空白ICR小鼠(每组8只)接种1×10⁴个野生型ME49虫体，观察并记录小鼠死亡情况，统计小鼠30天内的死亡率。结果表明：免疫接种ME49Δ6pgdh1虫株，对小鼠抵抗野生型虫体感染具有良好的免疫保护力。ME49Δ6pgdh1虫株有成为基因工程疫苗的潜力。

更详尽的技术方案参见具体实施例。

附图说明

图1：敲除弓形虫Tg6PGDH1的策略示意图。

图2：ME49Δ6pgdh1的单克隆虫株PCRs鉴定图。

图3：ME49Δ6pgdh1虫株体外空斑实验。

图4：ME49Δ6pgdh1虫株体外复制实验。

图5：感染1×10²个ME49Δ6pgdh1虫体对小鼠的毒力试验。

图6：感染1×10³个ME49Δ6pgdh1虫体对小鼠的毒力试验。

图7：ME49Δ6pgdh1虫株对小鼠的免疫保护力试验。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：弓形虫ME49Δ6pgdh1虫株的构建

(1)pSAG1-Cas9-TgU6-sg6PGDH1质粒的构建

①用gRNA在线设计网站(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)对Tg6PGDH1打靶位点进行设计，根据所设计的靶点序列设计如表1的引物：

表1.构建Tg6PGDH1特异性CRISPR/Cas9质粒所使用的引物

②以pSAG1-Cas9-TgU6-sgUPRT质粒(购自http://www.addgene.org)为模板，进行Tg6PGDH1特异性CRISPR/Cas9质粒的构建，PCR体系和反应条件如下：

PCR反应条件如下：

PCR结束以后，在PCR反应体系里直接加1μL DpnI，37℃进行消化45min。

③取新的灭菌PCR管，配制如下反应体系：

在PCR仪中，25℃反应15min；

④取全部反应产物转化入100μL的DH5α大肠杆菌感受态细胞中，涂LB/Amp⁺平板，37℃倒置培养8-12h；挑取单菌落置于1mL LB/Amp液体培养基中，37℃/180rpm振荡培养至菌液浑浊；取500μL菌液进行测序分析，若测序结果显示靶点序列已完全被替换，即pSAG1-Cas9-TgU6-sgTg6PGDH1质粒构建成功。

(2)Tg6PGDH1-5UTR::DHFR*::Tg6PGDH1-3UTR同源模板的制备

①利用表2中的引物，使用KD plus高保真酶分别从弓形虫ME49基因组DNA中扩增获得5’同源臂和3’同源臂片段；从带DHFR*的质粒(购自http://www.addgene.org)中扩增获得DHFR*片段；利用所设计的特异性引物线性化pUC19载体(购自http://www.addgene.org)，分别对上述目的片段进行回收，并利用NanoDrop2000测定回收产物浓度。

表2.构建pTg6PGDH1-5UTR::DHFR*::Tg6PGDH1-3UTR质粒引物

④根据回收产物的浓度配制如下反应体系：

充分混匀后，37℃反应30min，冰上放置5min；

⑤将10μL连接产物全部转化入100μL的DH5α感受态细胞中，涂LB/Amp⁺平板，37℃倒置培养10-12h；挑取单菌落置于含5mL LB/Amp⁺液体培养基的无菌PV玻璃瓶中，37℃/180rpm振荡培养10h至菌液浑浊；进行测序分析，若测序结果正确即可认为p6PGDH1-5UTR::DHFR*::6PGDH1-3UTR质粒构建成功，遂将鉴定正确的菌液进行质粒提取，-20℃保存，该正确质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

⑥利用高保真酶对p6PGDH1-5UTR::DHFR*::6PGDH1-3UTR质粒进行PCR扩增，扩增引物为U56PGDH1-Fw上游引物和U36PGDH1-Rw下游引物，对同源模板进行切胶回收并测定浓度，-20℃保存备用。

(3)弓形虫基因敲除虫株ME49Δ6pgdh1的构建

①收取新鲜的弓形虫ME49速殖子，利用无菌的3μm孔径滤膜过滤除掉宿主细胞碎片，3000rpm离心10min；弃上清，用Cytomix(120mM KCl,0.15mM CaCl₂,10mM K₂HPO₄/KH₂PO₄,25mM HEPES,2mM EGTA,5mM MgCl₂,pH＝7.6)重悬虫体沉淀至虫体量约为1×10⁷个速殖子/mL；

②取250μL左右的虫体悬液到电转杯中，加入pSAG1-Cas9-TgU6-sgTg6PGDH1质粒和p6PGDH1-5UTR::DHFR*::Tg6PGDH1-3UTR同源模板，其中质粒和同源模板DNA摩尔比＝5:1，转染DNA的总量约为10μg，总体积300μL左右；

③用移液枪将DNA和野生型ME49虫体混合均匀于4mm电转杯中，并去除气泡；将电转杯置于Bio-Rad电转仪内，设置1600V、25μF、50Ω、4mm条件，电击一次，1500V、25μF、50Ω、4mm条件，电击两次；

④在电转杯中立即加入1mL虫体培养液(DMEM+2％FBS+双抗)轻轻冲洗，再将该液体转移至新鲜的人成纤维细胞(HFF)细胞中进行培养和观察；

⑤在40-60％转染后的虫体逸出HFF宿主细胞后，用5mL注射器吹打细胞，将细胞裂解，使虫体从宿主细胞中释放出来；取500μL虫体悬液加入到新鲜的HFF宿主细胞中，在该培养基中加入1μM乙胺嘧啶筛选；

⑥在乙胺嘧啶作用3天后，可见宿主细胞内出现虫体增殖现象，在50％虫体从宿主细胞内逸出时将细胞裂解使虫体释放，取500μL虫体传到新鲜的HFF细胞中，再进行药物筛选；

⑦在经过3-4代药物筛选后，将虫体置于含有HFF细胞的96孔板中进行单克隆筛选，每孔接种1个弓形虫速殖子；剩余虫体可进行基因组gDNA的提取，并利用表3中的引物，图1所示方法检测同源臂整合效率和基因敲除效率，PCR1有条带说明Tg6PGDH1的5’同源臂整合入弓形虫基因组中，PCR2有条带说明Tg6PGDH1的3’同源臂整合入弓形虫基因组中，PCR3条带检测敲除基因Tg6PGDH1是否还在基因组中，若对照组ME49有PCR3条带，而转染实验组无PCR3条带，则说明Tg6PGDH1被成功敲除。

表3.ME49Δ6pgdh1的单克隆虫株PCRs鉴定引物

⑧在96孔板中培养10天后观察是否存在单克隆，利用无菌枪头将含有单克隆的宿主细胞从孔内刮下，加入到含有HFF宿主细胞的24孔板中，继续培养；当24孔板中有50％-60％的HFF细胞被裂解时，即可将孔内的虫子150μL传到新的24孔板中培养，其余的用于DNA提取以鉴定单克隆；

⑨利用PCR1，PCR2和PCR3对挑选的单克隆虫株进行检测，若PCR1和PCR2有特异性条带，而PCR3无目的带说明该单克隆虫株为基因敲除虫株ME49Δ6pgdh1；将确定为ME49Δ6pgdh1的虫株继续扩大培养至T25培养瓶；对T25培养瓶中的基因敲除虫株再次进行PCR1，PCR2和PCR3检测，PCR反应体系如下，若仍为敲除表型即可在扩大后进行冻存；

在灭菌PCR管中配制如下反应体系：

PCR反应条件如下：

⑩PCR产物鉴定：扩增完成后，取PCR产物10μL，加2μL的6×核酸上样缓冲液混匀，点样，1.0％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，120V，电泳30min，凝胶成像系统观察，PCR鉴定结果如图2所示，表明ME49Δ6pgdh1的单克隆虫株构建成功。

实施例2：弓形虫ME49Δ6pgdh1虫株的体外实验

2.1空斑实验

①对新鲜溢出的ME49和ME49Δ6pgdh1弓形虫速殖子用灭菌的3μm滤膜过滤、纯化和稀释，用细胞计数板对虫体进行计数；

②向长满HFF细胞的6孔板中接种虫体(100个弓形虫/每孔)，接种后的6孔板37℃、5％CO₂培养箱中培养12d；

③用PBS对6孔板洗1-2次，用4％多聚甲醛室温固定6孔板细胞20min，PBS洗1次；

④用0.1％结晶紫对细胞室温染色15min，PBS洗1次，室温晾干；

⑤用扫描仪扫描图片，用PS软件进行空斑面积的测量，进行Student's t test分析，结果如图3。

结果表明：缺失Tg6PGDH1不影响虫体体外噬斑的形成。

2.2弓形虫速殖子复制实验

①收集、过滤和纯化的新鲜溢出的ME49和ME49Δ6pgdh1虫体，接种至长满HFF细胞的24孔板爬片上，在37℃、5％CO₂培养箱中入侵HFF细胞1h；

②加入PBS洗2-3次，洗去未入侵虫体，在37℃、5％CO₂培养箱中继续培养虫体24h；

③培养24h后，用4％多聚甲醛对24孔板中的细胞进行固定15min；

④猪抗弓形虫阳性血清孵育20min，PBS洗3次；

⑤0.1％Triton X-100透化细胞20min；

⑥用10％的FBS在4℃条件下封闭过夜，PBS洗3次；

⑦兔抗弓形虫ALD孵育20min，PBS洗3次；

⑧羊抗猪二抗、羊抗兔二抗和Hoechst(1:1000稀释)作用15min，PBS洗3-5次；

⑨封片，荧光显微镜下观察，记录并统计纳虫泡中虫体个数为1个、2个、4个、8个、大于或等于16个的纳虫泡数量，每组统计至少100个纳虫泡，实验单独重复至少3次，进行two-way analysis of variance分析，结果如图4。

结果表明：缺失Tg6PGDH1不影响虫体体外的复制。

实施例3：弓形虫ME49Δ6pgdh1虫株的体内实验

3.1 ME49Δ6pgdh1虫体对小鼠毒力实验

①使用HFF细胞体外培养弓形虫速殖子，待有30-50％虫体逸出细胞，弃掉原培养瓶中的培养基，用PBS洗去已逸出的虫体和残留的培养基，加入新鲜不含FBS的DMEM稀释液。

②用一次性细胞刮将细胞刮下，5mL注射器反复吹打悬液8-10次，使纳虫泡破裂，虫体逸出，用无菌的3μm孔径滤膜过滤纯化虫体，用细胞计数板对虫体悬液进行计数。

③以无血清的DMEM溶液为注射液，按照1×10²个虫体/小鼠，腹腔接种6周龄雌性ICR小鼠(每组接20只)，或者按照1×10³个虫体/小鼠，腹腔接种6周龄雌性ICR小鼠(每组接10只)，每天记录小鼠的存活情况，30天后对结果进行统计，进行Gehan–Breslow–Wilcoxontests分析。结果如图5和图6所示：接种ME49Δ6pgdh1虫体的小鼠30天内存活率为80％，而接种野生型ME49虫体的小鼠30内存活率在20％左右。

结果表明：缺失Tg6PGDH1显著降低虫体体内毒力。

3.2 ME49Δ6pgdh1虫株对小鼠免疫保护力实验

①用无血清的DMEM溶液为注射液，以10²个ME49Δ6pgdh1速殖子每只小鼠的感染量接种ICR小鼠，每组8只。

②30天后对免疫过的小鼠及未经免疫的对照ICR小鼠(每组8只)接种1×10⁴个ME49野生型虫体。

③观察、记录小鼠死亡情况，30天后统计小鼠死亡率，进行Gehan–Breslow–Wilcoxon tests分析，如图7，对照组小鼠在14天内全部死亡，经ME49Δ6pgdh1免疫过的小鼠在30天内均没有死亡，说明免疫接种ME49Δ6pgdh1虫体对小鼠抵抗野生株虫株感染具有良好的免疫保护力。ME49Δ6pgdh1虫体有成为基因工程疫苗的潜力。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 缺失6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶1基因的弓形虫基因敲除虫株

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2560

<212> DNA

<213> 弓形虫(Toxoplasma gondii)

<400> 1

atgtcttgtg acgttggcat ttacggtctg gccgtaatgg gccttggact gtctctgaac 60

ctcgcgagtc ggggaattcg agtctctgtg tgcaatcgta catccacaaa agtagatgga 120

gcattgaaac aggcgaaaga cgagaatttc gaagaaaata tttttggagc tcggacactt 180

gaagactttg tgagtcacta ttttcccatt ccgccccgat gagcatgtgt ggcgaactcg 240

aatgttctac cgtgttcaaa atctgccgtc accatttctg tcggcatgtt acgcaggtgc 300

agtcgctgaa aaagccgcgt cgaattatca tggttattga ggtatgccac cagacgagtc 360

cctccgaagc gaacacatta aaaacgtgtt caaccgtttt tgcatctttt acgtgtttca 420

ggcaggagcc ccagtcgatg cgctcatcaa tcacctgcta ccaaagttag atgcaggtga 480

ctgccttgtg gatgctggaa atgagttctt tgaagtctcc gaaaaaaggg aacgactgtg 540

tgcttcgaaa ggcgtcctgt aagtacttcg gagacaaatt gtttacctgt ccagttatgc 600

cgatggttgc aacgtcctac ctaccatatt ctgtatactg cagttttatg gacgttggac 660

tctgcgcggg agagggcggc gctcggtctg ggcctccatt gacgccagga gggagccttg 720

aggcatggaa cctgatggag ccaattttcg ttcaactcgc cggaaagatt gacgcgtcga 780

agacaatacc tcttcctgga gccctcactg ttagcgatga agagaagcaa aatgcatgcg 840

tcagccatct aggaccctgc ggcgctggac attacgttaa aatggtccac aacggtataa 900

tgtatggcga catgcagctc attgccgagg taagacggtt tcgtatggcc tgaccacata 960

gcaaatccac aacaaacaat cataagaata gggggatcgg aaacaccccg taacctaatg 1020

gaaacgtcct attatttgtc cagcttacag ctttcttctg agtaacgaat aaaaaaaagt 1080

acggtggagc tatcgcatcc caataactca acacccgtaa atcattttta tgtacagcag 1140

taacttcaga aatggaccag gcgtagacca aaccgcgatg gaagaaaaac taatctgcaa 1200

tgattctcta gagaatttga ctgaaagagt tttgcccgcc taatacaaca ttttgcactt 1260

tcggcgcact actgttctgt acagctgtcc ttccgtttct gatttgacgc tctcgccagg 1320

ctcaccaact gctaaaattc gcttgtgatc tgagcaatga ggaacttcat gtcacgttta 1380

aaaagtggaa tgaagacgag cttcactcat atcttcttgg aattacggcc aacatcgtcc 1440

gcaagaagga tagctttacc ggaggtgagt tatttgcttt cacctgtccg caggcgtgtg 1500

gtatctgcaa caccatcagg cgcaggcgtc tgtgtgcgga tgccttcttc acacaggcta 1560

ccttttggat ttcattgccg acacagcggg atcaaaagga acaggcaaat ggaccatgca 1620

acaagcagca gagttgggtg ttgctgtgcc aaccatcaca gctgccctcg acatgcgata 1680

catatgctca aaccagcctt tgcggcagaa gatgaactgt ctttacgccc aaaactggtg 1740

ctctcttgtg aaaacagagg attccacgaa ggaacagcgc atcggtaaga ctagcagtat 1800

tttcgattga gttccatgat tcgatgtcgc agagttaatc ttgcgtttgg cgtgtgtgtg 1860

catttgtact aacatgtctc agagtccatc agacgagcgt tagtttgtgg aaggatatgc 1920

tgcttcgctc aaggcatgca cctcctacgt gttatatccg aacaaaaagg atggggagta 1980

gatctgtctg aggtctcacg aatttggcaa ggtgagatgg agctcgaaac tctccttgac 2040

atctgcaaca ttcgaaacgc ttgtcagttc acggaggtgc gagtccttac gtgctacgaa 2100

ttgccttgtt tattcagccg gttgcgtcat cgagtgcgac ttcctgaaag tcatgcaacg 2160

tgcgttccgg aagaagccgg acctggaaag cattctcctc tccgaagagt aagttcataa 2220

tttccctttt attatcgctg tttgacacac ttttctgcat gtttcccatc cttcgatgtt 2280

cgcgtacagg gtccacacga cggtccaaaa ctaccttccg gcattgcaag aagttatcag 2340

cttatcgcta ggaacagcaa cccccaggcc ggatgagccc tctgtcagaa ttacccttcc 2400

cacaccggca cattcagctt cgtataacta cctggcgtcc agttgtggcc tccgcctttc 2460

aatgaatctc gttcaagctc agcgtgattg ctttggtgca catcacttca agagaactga 2520

tcgggaagga aagtaccacg ttgaagactg gggggcctaa 2560

<210> 2

<211> 7870

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 2

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgaggacgat gagcagacgt 420

caagtcacta gcagttgacg cttcccgctc catctgattc ccttttctga gcatcacgtg 480

gccgtgtgac tcgacatgcc accccattaa tttatgtatt ggttccaagg acccaggcgt 540

gctggtcatc ttgtgtcaac ctcgcccgac agtcgacaga atgtttgagt ctgaccccca 600

accacagcac ggtcttcaca tttcattcac atgactattt tatctatcta cggaccaatt 660

gcgacaccag ttcatccgat ttctgcttat cttacaggtg gcctaaaaag cggtttaggg 720

aggtctcgac taagtcactt tgcaggagac ggccccaatt atcaactcca cggtagtcca 780

aaacatcggc agaaattaag acacggttgt catgtgcgca ggcgccgagt ggcccagaaa 840

aaccgtgcct tctatactcg aaggcggtga tccctctagt cattgccgat gaagctgttt 900

atgccgtctg tctacactac actatcagca cgaggaatcc agccgacctg ccgagcatgg 960

atggccatat gaagacacgg gcagctgttc tctgaaacga actccaccgt cagacctcac 1020

acgattctcg tcttaaacgt tctacttcac atctgtagcc atgaaatgtt ggctgtgtaa 1080

gaatttgtag cattttttag ctcacaggtt gaatttgttt tctcgcactg aggaaggcta 1140

tttcaaaacg attcctctgc gattcggcag acagccgcgg aggaagctgg ggtgaatcga 1200

tggcctattc gataccccac caacatcatc cgttgtacag agcttttaca tctgtcaacc 1260

tcggcgcact actcgttggc attttttcta taacttcgta tagcatacat tatacgaagt 1320

tatagaattc cgacaaaatg gaggtccata ctaaccaaga tccacttgac cctaggatga 1380

gaggatcggg atccatgggt tcagagggcc aggctgtaaa tcccgtgagt cgtcctcaca 1440

aatcatcaag caggtgtcct cagggagact gcctgactga gttatgctaa ttcctttcta 1500

ctttggcgtg gtcacggggg cgcgccggat ccttaattaa gtctagcatg tcattcgatt 1560

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gtgctgttcc atatgcgtga ctttcccgca attttttcag actttcagga aagacaggct 1680

ccggaacgat ctcgtccatg actggtaaat ccacgacacc gcaatggccc ccagcacctc 1740

tatctctcgt gccaggggac taacgttgta tgcgtctgcg tcttgtcttt ttgcattcgc 1800

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tctttttcga cagcacgaaa ccttgcattc aaacccgccc gcggaagatc cgatcttgct 1980

gctgttcgca gtcccagtag cgtcctgtcg gccgcgccgt ctctgttggt gggcagccgc 2040

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cttcattctt taaaagtatg cggaggtttc ctttttcttc tgttcgtttc tttttctcgg 2160

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attctgtcga ccagattttt gtcgtgggag gagcgggact gtacgaggca gcgctgtctc 2880

tgggcgttgc ctctcacctg tacatcacgc gtgtagcccg cgagtttccg tgcgacgttt 2940

tcttccctgc gttccccgga gatgacattc tttcaaacaa atcaactgct gcgcaggctg 3000

cagctcctgc cgagtctgtg ttcgttccct tttgtccgga gctcggaaga gagaaggaca 3060

atgaagcgac gtatcgaccc atcttcattt ccaagacctt ctcagacaac ggggtaccct 3120

acgactccgt ggttctcgag aagagaagga agactgacga cgcagccact gcggaaccga 3180

gcaacgcaat gagctccttg acgtccacga gggagacaac tcccgtgcac gggttgcagg 3240

ctccttcttc ggccgcagcc attgccccgg tgttggcgtg gatggacgaa gaagaccgga 3300

aaaaacgcga gcaaaaggaa ctgattcggg ccgttccgca tgttcacttt agaggccatg 3360

aagaattcca gtaccttgat ctcattgccg acattattaa caatggaagg acaatggatg 3420

accgaacggg cgttggtgtc atctccaaat tcggctgcac tatgcgctac tcgctggatc 3480

aggcctttcc acttctcacc acaaagcgtg tgttctggaa aggggtcctc gaagagttgc 3540

tgtggttcat tcgcggcgac acgaacgcaa accatctttc tgagaagggc gtgaagatct 3600

gggacaagaa tgtgacacgc gagttcctcg attcgcgcaa tctcccccac cgagaggtcg 3660

gagacatcgg cccgggctac ggcttccagt ggagacactt cggcgcggca tacaaagaca 3720

tgcacacaga ctacacaggg cagggcgtcg accagctgaa gaatgtgatc cagatgctga 3780

gaacgaatcc aacagatcgt cgcatgctca tgactgcctg gaatcctgca gcgctggacg 3840

aaatggcgct gccgccttgt cacttgttgt gccagttcta cgtgaacgac cagaaggagc 3900

tgtcgtgcat catgtatcag cggtcgtgcg atgtcggcct cggcgtcccc ttcaacatcg 3960

cttcctattc gcttttgacg ctcatggttg cacacgtctg caacctaaaa cctaaggagt 4020

tcattcactt catggggaac acgcatgtct acacgaacca tgtcgaggct ttaaaagagc 4080

agctgcggag agaaccgaga ccgttcccca ttgtgaacat cctcaacaag gaacgcatca 4140

aggaaatcga cgatttcacc gccgaggatt ttgaggtcgt gggctacgtc ccgcacggac 4200

gaatccagat ggagatggct gtctagcgga aatacagaag ctgcccgtct ctcgttttcc 4260

tctcttttcg gagggatcag ggagagtgcc tcgggtcgga gagagctgac gagggggtgc 4320

cagagacccc tgtgtccttt atcgaagaaa agggatgact cttcatgtgg catttcacac 4380

agtctcacct cgccttgttt tctttttgtc aatcagaacg aaagcgagtt gcgggtgacg 4440

cagatgtgcg tgtatccact cgtgaatgcg ttatcgttct gtatgccgct agagtgctgg 4500

actgttgctg tctgcccacg acagcagaca actttccttc tatgcacttg caggatgaat 4560

tcctacccag ctttcttgta caaagtggtc gtctctagtt tttttgacag accgctgacg 4620

gaatcaggga caccagcgac aagcgcgacc acgtgtgcca gcgcgaggtg gcctacgccc 4680

acagcgtgcc ccgcatcacc agcgccatcg gtagcgacga ggatatgcat agatcttaat 4740

taataacttc gtatagcata cattatacga agttataaaa tggtgagcaa gggcgaggta 4800

gatttcgccg aaatgcttac ccgcgcaaat attgccttcg acgtctctct ggcgactgct 4860

tggagtgggc ccttactacc tgtcactttt ccagctggaa tcattataag aggatcttgg 4920

gcagcgaagc cgatatgcgg ccagaattca ataacaacgt gacttcgtac tttatccggc 4980

accggattat cacctgattg gattttaaag cactgttaaa ccgccgaatt gctaggtgaa 5040

agttaatgtt cacctaatag aaatttatag cccgctgaac cagtggagca tttccaggac 5100

agcttcaaaa tcccgaaata tgcactcggc cacggtttca aagacacggc aaatgtatat 5160

gcacatgacc ttaagctttt tttacgtgcc gcgtcgcatc cagactctat tgaggggcag 5220

ttgtcctgaa tcgacgtaca acaacgatct gataccctga tgttcaactc aagcacgact 5280

tcctaaatgg tgcggcctca agaggtagcc tgacagtgac aagcagtatg atttaagact 5340

aaattacata agcggcagct tgtagattac cgatacacgc ttttccgccg tacttctttc 5400

acctctgctg tcacatccat aatgtatgct cggggccctc ctcacgttat acggatcagg 5460

ccttcggata cttcttggtt aaccaacacc gagagtggtg gtgctttcga aacacaatgc 5520

attgttagcc ttcacagcgc atagctcttt catccccaag cgtaggggtg cccctaatta 5580

cattgcctca actgtattaa gtactctgtg ctaatataca tgtcttggta tgctcaggcg 5640

taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 5700

atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 5760

ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 5820

taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 5880

tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 5940

aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 6000

aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 6060

ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 6120

acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 6180

ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 6240

tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 6300

tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 6360

gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 6420

agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 6480

tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 6540

agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 6600

tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 6660

acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 6720

tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 6780

agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 6840

tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 6900

acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 6960

tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 7020

ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 7080

agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 7140

tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 7200

acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 7260

agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 7320

actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 7380

tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc 7440

gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 7500

ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 7560

tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 7620

aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 7680

tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 7740

tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 7800

gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg 7860

ccctttcgtc 7870

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 3

aacttgacat ccccatttac 20

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 4

gggcctccat tgacgccagg gttttagagc tagaaatagc 40

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 5

cgacggccag tgaattcgag gacgatgagc agacgtcaag 40

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 6

gaaaaaatgc caacgagtag tgcgccgagg ttgacagatg t 41

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 7

taaaatggtg agcaagggcg aggtagattt cgccgaaatg c 41

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 8

gctatgacca tgattacgcc tgagcatacc aagacatgta t 41

Claims (10)

1.一种弓形虫基因敲除虫株，其特征在于：该虫株缺失核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的弓形虫6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶1基因(Tg6PGDH1基因)。

2.一种构建权利要求1所述弓形虫基因敲除虫株的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)以商业化的pSAG1-Cas9-TgU6-sgUPRT质粒为模板，设计Tg6PGDH1基因的打靶位点，根据打靶位点设计引物进行定点突变，将上述模板质粒中的sgUPRT替换为Tg6PGDH1基因靶点特异的gRNA，构建pSAG1-Cas9-TgU6-sg6PGDH1质粒；

(2)设计引物，构建包含Tg6PGDH1基因上下游同源臂的同源重组模板；

(3)将步骤(1)构建的pSAG1-Cas9-TgU6-sg6PGDH1质粒和步骤(2)构建的同源重组模板共电转至出发虫株，经药物筛选、PCR鉴定获得弓形虫Tg6PGDH1基因缺失虫株。

3.如权利要求2所述弓形虫基因敲除虫株的构建方法，其特征在于：所述Tg6PGDH1基因打靶位点的引物序列为：

引物名称 引物序列 gRNA-R 5’-AACTTGACATCCCCATTTAC-3’ gRNA-Tg6PGDH1-Fw 5’-GGGCCTCCATTGACGCCAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’。

4.如权利要求2所述弓形虫基因敲除虫株的构建方法，其特征在于：所述Tg6PGDH1基因上下游同源臂的引物序列为：

5.如权利要求2所述弓形虫基因敲除虫株的构建方法，其特征在于：所述同源重组模板的载体质粒是pUC19。

6.如权利要求2所述弓形虫基因敲除虫株的构建方法，其特征在于：所述同源重组模板中含有DHFR*药物筛选标签。

7.如权利要求2-6任一项所述弓形虫基因敲除虫株的构建方法，其特征在于：所述同源重组模板的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

8.如权利要求2所述弓形虫基因敲除虫株的构建方法，其特征在于：所述出发虫株是弓形虫ME49株。

9.权利要求1所述的弓形虫基因敲除虫株在制备弓形虫疫苗中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述弓形虫基因敲除虫株在体外可以正常培养，虫体可以正常生长复制，但是在体内毒力减弱且诱导动物产生免疫保护力。

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